СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОБНОГО ПОЛИМЕРА, СОДЕРЖАЩЕГО ФУКОЗУ, ПОЛИМЕР И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2016 года по МПК C12P19/04 C08B37/00 C12R1/01 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение относится к микробному биополимеру, который содержит фукозу в своем составе. Более того, настоящее изобретение касается процесса производства биополимера, содержащего фукозу, посредством бактерии Enterobacter A47 (DSM 23139). Таким образом, данное изобретение применяется в нескольких отраслях промышленности (например, фармацевтическая промышленность, косметическая промышленность и промышленность по переработке сельскохозяйственных пищевых продуктов) и в обработке промышленных отходов (например, нефтеотдача и извлечение металлов).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полисахариды представляют собой высокомолекулярные полимерные биоматериалы (10⁴-10⁷), образованные через полимеризацию повторяющихся звеньев моносахаридов. Они обладают большим структурным разнообразием в результате разнообразия повторяющихся звеньев, задействованного типа гликозидных связей и степени разветвленности. Многие полисахариды содержат несахарные компоненты, такие как органические ацильные группы (например, ацетат, сукцинат, пируват) и неорганические группы (например, фосфат, сульфат) (Sutherland, 2001) (Сатерленд, 2001 г.).

С другой стороны, полисахариды часто образуют третичные структуры через внутримолекулярные или межмолекулярные не ковалентные связи, которые наделяют большей жесткостью макромолекулу и играют важную роль в определении свойств полимера в твердом состоянии и в растворе (Kumar et al, 2007) (Кумар и др., 2007 г.).

Благодаря своим физическим и химическим свойствам, а именно:

влагоудерживающей способности, реологии и/или пленкообразующей способности, полисахариды используются в широком ассортименте пищевых продуктов и в промышленных применениях, включая текстильные изделия, лакокрасочные материалы, фармацевтические препараты и косметические препараты, в качестве эмульгирующих, стабилизирующих и сгущающих веществ (Могепо et al., 1998) (Морено и др., 1998 г.). Являясь материалами, получаемыми из живых организмов, полисахариды обычно являются нетоксичными и биоразрушаемыми, что делает их биоматериалами, приемлемыми для устойчивого развития.

Основные направления применения полисахаридов промышленного значения как натуральных (например, альгинат, каррагенан, гуаровая камедь, пектины, ксантан, геллан), так и полусинтетических производных (например, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилгуар), основаны на их способности модифицировать физические свойства водных систем (гидроколлоиды - соединения, способные модифицировать физические свойства водных систем), используются в основном в пищевой промышленности, за которой следует нефтедобывающая и фармацевтическая промышленности. Некоторые из данных полисахаридов (например, альгинат, пектины, пуллуллан, производные крахмала, производные целлюлозы) дополнительно обладают способностью образовывать биоразрушаемые пленки, при использовании в производстве упаковок, емкостей и листовых материалов, а также в некоторых сельскохозяйственных пищевых продуктах, фармацевтических и промышленных применениях.

В настоящее время большинство полисахаридов, используемых в промышленности, получают из растений (например, гуаровая камедь, аравийская камедь), водорослей (например, альгинат, каррагенан) или ракообразных (например, хитин) с микробными полисахаридами (например, ксантан, геллан, микробный альгинат), представляющих только маленькую долю рынка биополимеров (Canilha et al., 2005) (Канилха и др., 2005 г.). Тем не менее, в последние годы наблюдался растущий интерес в идентификации и выделении новых микробных полисахаридов, которые могут конкурировать с традиционными микробными полисахаридами благодаря своим усиленным физико-химическим свойствам, а именно: более высокой эмульгирующей и флоккулирующей активностям, более высокой устойчивости к органическим растворителям, биологической активности (например, противоопухолевая или иммунологическая стимуляции) и улучшенным реологическим свойствам (например, более высокая вязкость для более низких концентраций полимеров, более высокая устойчивость относительно более широких диапазонов рН, температуры и ионной силы) (Kumaret al., 2007; Sutherland, 2001) (Кумар и др., 2007 г.; Сутерленд, 2001 г.).

Микробное производство полисахаридов обладает преимуществами по сравнению с их извлечением из растений, водорослей или животных, поскольку микроорганизмы обычно проявляют более высокие темпы роста и являются более поддающимися манипуляции условий культивирования (Moreno et al., 1998) (Морено и др., 1998 г.). Жизненные циклы растений, водорослей и животных составляют один год и более, являясь производственным циклом обычно сезонным. С другой стороны, темпы роста микроорганизмов исчисляются часами или несколькими днями тогда, как темпы роста растений, водорослей и животных исчисляются месяцами или годами.

Основным фактором, ограничивающим промышленное производство микробных полисахаридов, является высокая стоимость субстратов, главным образом Сахаров, особенно глюкозы, крахмала и сахарозы. В указанных биопроцессах стоимость субстратов составляет 20-40% от общих производственных затрат (Kumar and Mody, 2009) (Кумар и Моди, 2009 г.).

Следовательно, поиск менее дорогостоящих субстратов с адекватной производительностью является существенным для снижения производственных затрат. Глицерин, побочный продукт нескольких промышленных процессов, главным образом, биодизельной промышленности, является хорошим кандидатом. Вследствие огромного роста биодизельной промышленности в последние годы, он производится в количествах намного превышающих его потребление в настоящее время в традиционных областях применения глицерина. Для биодизельной промышленности или для любой другой промышленности, в которой Глицерин присутствует в качестве побочного продукта, он представляет проблему по причине своей низкой промышленной ценности и ввиду того, что его ликвидация является затратным процессом. Следовательно, существует острая необходимость развития интересного применения для данного промышленного побочного продукта, с использованием того факта, что глицерин является нетоксичным и биоразрушаемым соединением (Celik et al, 2008).

В дополнение к своей способности модифицировать физические свойства водных систем полисахариды, содержащие фукозу, имеют повышенный потенциал для промышленных применений вследствие того, что фукоза представляет собой один из редких, трудных для получения Сахаров. С другой стороны, наличие фукозы снижает возможность аллергических реакций, что делает возможным использование данных биополимеров, например, в фармацевтических и косметических препаратах.

Фукозу можно синтезировать через ее химическую конверсию из других более распространенных моносахаридов, таких как галактоза или глюкоза. Однако большинство химических процессов являются сложными, включающими несколько промежуточных продуктов, и имеют низкую продуктивность. Альтернативным вариантом химическому синтезу фукозы является химический или ферментативный гидролиз полисахаридов, содержащих фукозу. Данные полимеры можно обнаружить в растениях, водорослях и микроорганизмах.

В растениях фукоза (L-фукоза и метилированная фукоза) встречается, например, в клеточных стенках картофеля и киви, соевых бобах, в клейком веществе молодых листьев Plantago lanceolata, в корнях Lepidium sativum и Glycyrrhiza uralensis, в экссудатах Astragalus microcephalus, A. gummifer и A. kurdicus, а также в листьях Lupinus albus (Vanhooren e Vandamme, 1999)

В морских водорослях фукоза обнаружена в фукоидане, который представляет собой гомополисахарид, состоящий из сульфатированной L-фукозы. Фукозу можно извлечь из морских водорослей как, например, Pelvetia canaliculata, Fucus vesiculosus и Ascophyllum nodosum. В указанных видах содержание L-фукозы варьируется между 9,0 и 11,2%. Количество общего извлечения L-фукозы из морских водорослей является достаточно низким (около 7,6%) (Vanhooren e Vandamme, 1999).

Некоторые микроорганизмы, а именно: бактерии, грибы и микроскопические водоросли, синтезируют внеклеточные полисахариды (EPS), которые содержат L-фукозу. Данные полимеры включают в себя оба гомо и гетерополисахариды, последние являются наиболее распространенными, содержащими переменные количества фукозы, а также другие сахарные остатки (например, глюкоза, галактоза, манноза, рамноза и/или арабиноза). Внеклеточные полисахариды (EPS), содержащие L-фукозу, производятся бактериями, принадлежащими к нескольким родам, включающими в себя наряду с прочим Aerobacter, Azotobacter, Klebsiella, Erwinia, Enterobacter, Pseudomonas, Clavibacter, Bacillus и Salmonella. В грибах фукозу можно обнаружить во внеклеточных полисахаридах (EPS), произведенных видами, принадлежащими к роду Candida, Mucor, Polyporus, Rhodotorula e Sporobolomyces, среди прочего.

В последние десятилетия сообщалось о производстве полисахаридов, содержащих L-фукозу, некоторыми бактериальными родами, главным образом, из рода Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas и Clavibacter.

Некоторые штаммы Klebsiella pneumoniae синтезируют несколько разных внеклеточных полисахаридов (EPS), содержащих L-фукозу, D-галактозу и галактуроновую кислоту, которые отличаются между собой по степени ацетилирования полимерной цепи. Внеклеточные полисахариды (EPS), производимые К. pneumoniae 1-1507 (US 5876982), нашли применение в косметической промышленности благодаря своим психосенсорным качествам, гидратирующим и самоэмульгирующимся свойствам (Guetta et al., 2003a) (Гуетта и др., 2003a). Были описаны другие внеклеточные полисахариды (EPS), обладающие очень похожим составом, а именно: внеклеточные полисахариды (EPS), производимые Klebsiella K-63 (Joseleau and Marais, 1979) (Джозело и Марэ, 1979 г.) и К. pneumoniae ATCC 31646 (US 4298691). Полимер данного изобретения отличается от указанных внеклеточных полисахаридов (EPS) тем, что помимо фукозы и галактозы он также содержит глюкозу. С другой стороны, полимер данного изобретения содержит в своем составе существенные количества заместителей ацильных групп (примерно до 25% от сухого веса внеклеточных полисахаридов (EPS), которые не рассматриваются в качестве компонентов внеклеточных полисахаридов (EPS) Klebsiella.

К. pneumoniae ATCC 12657 (ранее известный как штамм A3 Aerobacter aerogenes) производит внеклеточные полисахариды (EPS), состоящие из фукозы, глюкозы, галактозы и глюкуроновой кислоты в примерно эквимолярных количествах (Vanhooren e Vandamme, 1999) (Ванхурен и Вандамм, 1999 г.). Фукоза составляет 18,9% от веса очищенных внеклеточных полисахаридов (EPS) (Guetta et al, 2003b). Данный полисахарид отличается от полимера данного изобретения по высокому содержанию глюкуроновой кислоты и наличия ацильных групп, которые не описаны в отношении внеклеточных полисахаридов (EPS) К. pneumoniae ATCC 12657. Более того, в процессе, описанном в настоящем изобретении, не используются виды Klebsiella для микробной культивирования.

Сообщалось также о продуцировании штаммами Enterobacter внеклеточных полисахаридов (EPS), содержащих фукозу, галактозу, глюкозу и глюкуроновую кислоту. Примеры включают в себя: Enterobacter sp. CNCM 1-2744, который продуцирует внеклеточный полисахарид (EPS), в котором присутствуют мономеры в соотношении 2:2:1:1 (FR2840920); Enterobacter sp.SSYL (KCTC 0687BP), который продуцирует внеклеточный полисахарид (EPS) с молекулярным весом между 10⁵ и 10⁶, в котором фукоза составляет 8-10% от содержания сахара, где главным компонентом является глюкуроновая кислота (40-70%) (US 2002115158); и £ sakazakii, штаммы АТСС 53017, АТСС 29004 и АТСС 12868, который продуцирует внеклеточный полисахарид (EPS) с молекулярным весом 2×10⁶, в котором фукоза составляет 13-22%, а содержание маннозы составляет до 8%, соответственно (US 4806636). Данные полисахариды отличаются от полимера данного изобретения разным содержанием сахарных мономеров и ацильных групп. Более того, полимер данного изобретения обычно имеет более высокий молекулярный вес в пределах 10⁶-10⁷.

Было описано несколько штаммов Clavibacter michiganensis, которые продуцируют внеклеточные полисахариды (EPS), содержащие L-фукозу. Данные внеклеточные полисахариды (EPS) содержат другие нейтральные сахара, такие как галактозу, глюкозу и/или маннозу и заместители ацильных групп, такие как пируват, сукцинат и/или ацетат. С.michiganensis подвид michiganensis Cm 542 (NCPPB 1064) производит высокомолекулярный внеклеточный полисахарид (EPS) (10⁶-10⁷), состоящий из фукозы, галактозы и глюкозы (2:1:1), а также пирувата, сукцината и ацетата (1:0,5:1,5) (van den Bulk et al, 1991) (ван ден Балк и др., 1991 г.). Несмотря на то, что полимер данного изобретения обладает похожим составом, он отличается от внеклеточного полисахарида (EPS) С, michiganensis относительной долей ацильных групп. Более высокое содержание сукцината полимера данного изобретения придает ему более сильное анионное свойство.

В документе WO 2008/127134 описан процесс производства полисахарида, обогащенного галактозой, посредством бактерии Pseudomonas oleovorans при использовании субстратов, обогащенных глицерином. Однако внеклеточный полисахарид (EPS), полученный при помощи данного процесса, содержит только остаточные количества фукозы (0-4%).

В свете изложенного настоящее изобретение описывает высокомолекулярный биополимер, содержащий фукозу, с полиэлектролитным свойством, производимый посредством микробной культивирования, предпочтительно, при использовании Enterobacter A47 (DSM 23139) и процесс его производства. Упомянутый процесс делает возможным получение полимера изобретения при использовании недорогих субстратов и простым путем. Полимер изобретения можно использовать в нескольких отраслях промышленности, таких как промышленность по переработке сельскохозяйственных пищевых продуктов, обработка сточных вод и фармацевтическая промышленность благодаря его реологии, пленкообразующей способности, полиэлектролитному свойству и эмульгирующим, флоккулирующим способностям.

ОБЩЕЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение касается производства биополимера, главным компонентом которого является высокомолекулярный полисахарид (10⁶-10⁷), в котором фукоза составляет, по меньшей мере, 10% от его состава, и содержащий в качестве заместителей ацильные группы, включающие в себя пируват, сукцинат и ацетат. Биополимер получают посредством микробной культивирования, предпочтительно, при помощи бактерии Enterobacter A47 (DSM 23139) при использовании глицерина или субстратов, содержащих глицерин, в качестве предпочтительных источников углерода.

Соответственно, в настоящем изобретении предложен процесс приготовления полимера, содержащий шаги культивирования микробной культуры, содержащей бактериальный штамм Enterobacter A47 (DSM 23139), и обеспечение упомянутой культуры источником углерода, содержащим глицерин.

1. Характеристика микробной культуры

Полимер, содержащий фукозу, настоящего изобретения производится посредством бактерий рода Pseudomonas, Klebsiella, Methylobacterium, Erwinia, Alcaligenes или Enterobacter, предпочтительно, посредством бактерии Enterobacter A47, депонированной в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH) согласно Будапештскому договору с номером доступа DSM 23139. Более того, микроорганизм, использованный в настоящем изобретении, характеризуется другими аспектами, а именно: биохимическим профилем, генетическим секвенированием и филогенетической древовидной диаграммой, представленными в таблицах 1 и 2 и на фигуре 1, соответственно.

Микроорганизм, использованный в данном изобретении, может быть штаммом дикого типа, вариантом или мутантом, пока он обладает способностью синтезировать полимер, содержащий фукозу. Возможно использование чистой культуры или смешанной культуры, состоящей из нескольких микроорганизмов, среди которых, по меньшей мере, один способен производить полимер, содержащий фукозу, предпочтительно, бактерия Enterobacter A47 (DSM 23139),

2. Характеристика процесса производства полимера

Полимер настоящего изобретения производится в биореакторе в перемешиваемой и аэрированной водной среде. Среда культивирования содержит источник углерода, источник азота и неорганические соли. Предпочтительным источником углерода является глицерин или субстраты, содержащие глицерин. Тем не менее, процесс производства полимера изобретения предусматривает использование других источников углерода, в качестве альтернативного варианта глицерин или в сочетании с глицерином, как, например, сахара, спирты, органические кислоты или алканы, а также пищевые и промышленные отходы или побочные продукты, как, например, побочный продукт глицерина от биодизельной промышленности, сахарные мелассы, сыворотка или отходы производства оливкового масла.

Процесс производства полимера, содержащего фукозу, состоит из культивирования микроорганизма в питательной аэрированной водной среде. Температура поддерживается между 15 и 45°С, предпочтительно, между 26 и 37°С. Значение рН поддерживается между 5,0 и 9,0, предпочтительно, между 6,5 и 7,0.

Вначале культивирования концентрация растворенного кислорода в среде культивирования устанавливается выше 70%. Впоследствии концентрация растворенного кислорода постепенно снижается, сопровождаемая ростом клеток, контролируемая ниже 30% или, предпочтительно, ниже 20% или, более предпочтительно, ниже 10% или даже при анаэробных условиях. Полимер, содержащий фукозу, производится при условиях азотного ограничения, например, в количестве ниже, чем 0,3 г/л или ниже, чем 0,2 г/л или ниже, чем 0,1 г/л или даже без источника азота и наличия углерода, одновременно с низкой концентрацией растворенного кислорода, как описано выше. Наличие углерода обеспечивается посредством предоставления культуре среды культивирования, содержащей высокую концентрацию глицерина (>100 г/л). Скорость потока добавления такой среды во время данной подпитываемой фазы необходимо регулировать для согласования потребления углерода культурой.

Культуральный бульон, полученный в конце культивирования в биореакторе, можно использовать непосредственно без какой либо обработки или после сушки. В качестве альтернативного варианта полимер, содержащий фукозу, можно осадить из бульона посредством добавления осаждающего вещества (например, этанол, ацетон), продуцирующего нативный полимер.

Процесс извлечения полимера изобретения состоит из удаления клеток (например, посредством центрифугирования бульона) с последующим осаждением полимера посредством добавления осаждающего вещества. Очистка полимера включает в себя использование одного или нескольких дополнительных процессов (например, диализ).

В зависимости от условий культивирования в биореакторе, времени культивирования и процедур, использованных для извлечения/очистки полимера, процесс дает выход 50 г/л нативного полимера или 20 г/л очищенного полимера.

3. Характеристика полимера

Обычно полимер изобретения содержит фукозу, которая составляет по меньшей мере 10% от его сахарного состава. Полимер, содержащий фукозу, имеет в своем составе другие нейтральные сахара, а именно: глюкозу и галактозу, а также может содержать в следовых количествах (<5%) другие сахара, как, например, маннозу, рамнозу, арабинозу, фруктозу, глюкуроновую кислоту и/или глюкозамин.

4. Применения полимера

Полимер изобретения демонстрирует флоккулирующую и эмульгирующую активность, он образует высоковязкие водные растворы с псевдопластическим поведением жидкости, а также производит биоразрушаемые пленки при смешивании с другими полимерами. Следовательно, он может заменять другие полисахариды, такие как ксантан, альгинат, каррагенан, гуаровую камедь и аравийскую камедь во многих их применениях, а именно: в промышленности по переработке сельскохозяйственных пищевых продуктов, в фармацевтической и косметической промышленности. Более того, наличие фукозы в полимере изобретения дополнительно способствует его использованию в медицинских и косметических применениях. Более того, наличие остатков пирувата и сукцината придает полимеру анионное свойство. Как следствие, он способен иммобилизовать токсичные металлы.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 - представлена филогенетическая древовидная диаграмма бактерии Enterobacter A47 (DSM 23139).

На фигуре 2 - представлена кажущаяся вязкость водного раствора (0,8% в/в) полимера, содержащего фукозу (измеренная при комнатной температуре).

На фигуре 3 - представлена динамика потребления источника углерода (глицерина) и источника азота (аммония), производство биомассы и внеклеточного полисахарида (EPS), содержащего фукозу, во время процесса культивирования для производства полимера изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Характеристика микроорганизма

Полимер, содержащий фукозу, получают посредством культивирования бактерии Enterobacter A47 (DSM 23139). Микроорганизм может быть штаммом дикого типа, вариантом или мутантом, пока он обладает способностью синтезировать полимер, содержащий фукозу. Можно использовать чистую культуру или в качестве альтернативного варианта можно использовать смешанную культуру, в которой, по меньшей мере, один микроорганизм способен производить полимер изобретения.

Предпочтительным микроорганизмом для получения полимера изобретения является бактерия Enterobacter A47 (DSM 23139) с нижеследующими описанными характеристиками. Биохимическая и генетическая характеристика микроорганизма осуществлена посредством Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH).

1.1. Морфологическая характеристика бактерии Enterobacter M7 (DSM 23139)

Бактерия Enterobacter A47 (DSM 23139) представляет собой палочку с нижеследующими размерами: 0,7-0,8 мкм×1,2-2,5 мкм. Она является грамотрицательной подвижной бактерией.

1.2. Биохимический профиль бактерии Enterobacter M7 (DSM 23139)

Бактерия Enterobacter A47 (DSM 23139) имеет нижеследующий биохимический профиль, который является типичным для рода Enterobacter (таблица 1):

Таблица 1 Биохимический профиль бактерии Enterobacter M7 (DSM 23139) ("+" и "-" представляют положительную или отрицательную реакцию, соответственно, по проведенному испытанию). Испытание Результат Лизис посредством 3% КОН + Аминопептидаза (Сегпу) + Каталаза + Анаэробный рост + Газ из глюкозы + H₂S - Индол - Метил красный - Расщепление:   Желатин - Твин 80 - ДНК - Мочевина + Цитрат (Simmons) + Использование малоната + VP + ONPG + ADH + LDC - ODC + Кислота из (ASS):   Глюкозы + Фруктозы + Маннозы + Мальтозы + D-ксилозы + Сахарозы +

Трегалозы + L-арабинозы + Рамнозы + Галактозы + Адонитола + Дульцита - Эритритола - Инозитола - Глицерина +

1.3. Нуклеотидная последовательность гена 16S рДНК бактерии Enterobacter A47(DSM23139)

Нуклеотидная последовательность гена бактерии Enterobacter M7 (DSM 23139) (таблица 2) определена посредством прямого секвенирования ПЦР-амплифицированной 16S рДНК. Извлечение геномной ДНК, ПЦР (полимеразная цепная реакция) опосредованная амплификация 16S рДНК и очистка продукта ПЦР проведены, как описано Rainey et al (1996 г.). Очищенные продукты ПЦР секвенированы при использовании комплекта быстрого запуска CEQ™DTCS (Beckman Coulter), как указано в протоколе изготовителя. Последовательность реакций подверглись электрофорезу при использовании системы генетического анализа CEQ™8000. Данные о полученной последовательности были помещены в программу редактора выравнивания ае2 (Maidak et al, 1999), выровняли вручную и сравнили с репрезентативными нуклеотидными последовательностями гена 16S рРНК организмов, принадлежащих Enterobacteriaeceae (Maidak et al, 1999). Для сравнения последовательности 16S были получены из баз данных EMBL, RDP или DSMZ.

Таблица 2 Нуклеотидная последовательность гена 16S рДНК бактерии Enterobacter   A47 (DSM 23139) - SEQ ID NO 1 1 TGATCCTGGC TCAGATTGAA CGCTGGCGGC AGGCCTAACA CATGCAAGTC GAACGGTAAC 61 AGGAAGCAGC TTGCTGCTTC GCTGACGAGT GGCGGACGGG TGAGTAATGT CTGGGAAACT 121 GCCTGATGGA GGGGGATAAC TACTGGAAAC GGTAGCTAAT ACCGCATAAY GTCGCAAGAC 181 CAAAGAGGGG GACCTTCGGG CCTCTTGCCA TCGGATGTGC CCAGATGGGA TTAGCTAGTA 241 GGTGGGGTAA CGGCTCACCT AGGCGACGAT CCCTAGCTGG TCTGAGAGGA TGACCAGCCA 301 CACTGGAACT GAGACACGGT CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA ATATTGCACA 361 ATGGGCGCAA GCCTGATGCA GCCATGCCGC GTGTATGAAG AAGGCCTTCG GGTTGTAAAG 421 TACTTTTCAGC GGGGAGGAAG GCGATAAGGT TAATAACCTT GTCGATTGAC GTTACCCGCA 481 GAAGAAGCAC CGGCTAACTC CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGGAGGGT GCACGCGTTA 541 ATCGGAATTA CTGGGCGTAA AGCGCACGCA GGCGGTCTGT CAAGTCGGAT GTGAAATCCC 601 CGGGCTCAAC CTGGGAACTG CATTCGAAAC TGGCAGGCTA GAGTCTTGTA GAGGGGGGTA 661 GAATTCCAGG TGTAGCGGTG AAATGCGTAG AGATCTGGAG GAATACCGGT GGCGAAGGCG 721 GCCCCCTGGA CAAAGACTGA CGCTCAGGTG CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT 781 ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGATGTC GACTTGGAGG TTGTGCCCTT GAGGCGTGGC

841 TTCCGGAGCT AACGCGTTAA GTCGACCGCC TGGGGAGTAC GGCCGCAAGG TTAAAACTCA 901 AATGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG GTTTAATTCG ATGCAACGCG 961 AAGAACCTTA CCTACTCTTG ACATCCAGAG AACTTTCCAG AGATGGATTG GTGCCTTCGG 1021 GAACTCTGAG ACAGGTGCTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTTGTGAAAT GTTGGGTTAA 1081 GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTATCCTTT GTTGCCAGCG GTYAGGCCGG GAACTCAAAG 1141 GAGACTGCCA GTGATAAACT GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAGTCATC ATGGCCCTTA 1201 CGAGTAGGGC TACACACGTG CTACAATGGC GCATACAAAG AGAAGCGACC TCGCGAGAGC 1261 AAGCGGACCT CATAAAGTGC GTCGTAGTCC GGATTGGAGT CTGCAACTCG ACTCCATGAA 1321 GTCGGAATCG CTAGTAATCG TGGATCAGAA TGCCACGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT 1381 ACACACCGCC CGTCACACCA TGGGAGTGGG TTGCAAAAGA AGTAGGTAGC TTAACCTTCG 1441 GGAGGGCGCT TACCACTTTG TGATTCATGA CTGGGGTGAA GTCGTAACAA GGTAACCGTA 1501 GGGAACCTGC GGGCTGGATC ACC

1.4. Филогенетическая древовидная диаграмма бактерии Enterobacter A47 (DSM23139).

Филогенетическая древовидная диаграмма бактерии Enterobacter A47 (DSM 23139) построена при использовании пакета БРА (Pruesse et al, 2007). На основании эволюционных дистанционных значений филогенетическое дерево построено посредством метода объединения соседних пар (Jukes and Cantor, 1969) при использовании исправлений Saitou e Nei (1987 г.). Корень дерева определен путем включения нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК Klebsiella pneumoniae в анализ. Масштабная полоска ниже древовидной диаграммы указывает 1 нуклеотидную замену на 100 нуклеотидов.

Нуклеотидная последовательность гена 16S рДНК бактерии Enterobacter A47 (DSM 23139) показывает самое высокое сходство с бактериями Enterobacter pyrinus (98,3%), Enterobacter hormaechei (99,0%) и Enterobacter asburiae (98,9%). Критерий по идентификации данного микроорганизма в пределах известного вида определяется, как имеющий сходство, по меньшей мере, >90% или, желательно,>99,5% с типом штамма для указанного вида (Janda and Abbott, 2007).

С этой целью, микробной культурой, используемой в процессе производства полимера изобретения, может являться любой микроорганизм, который имеет сходство, по меньшей мере, 99,0±0,5% с последовательностью SEQ ID NO 1 da Enterobacter A47 (DSM 23139) согласно таблице 2, полученный путем генетической манипуляции, мутации, вариации или непосредственно из природы.

2. Характеристика процесса производства полимера

Полимер настоящего изобретения производится в перемешиваемом, аэрируемом биореакторе с регулированием значения рН и температуры. Процесс производства полимера инициируется посредством инокуляции микроорганизма в питательной водной среде, содержащей источник углерода, источник азота и неорганические соли. Процесс включает фазу начальной загрузки с последующей фазой подпитки, в ходе которой минеральная среда вводится в биореактор.

2.1. Среда культивирования

Среда культивирования для производства полимера, содержащего фукозу, состоит из питательной водной среды, содержащей источник углерода, источник азота и неорганических солей.

2.1.1. Источник углерода

Предпочтительным источником углерода является глицерин и смеси, содержащие глицерин. В качестве альтернативного варианта источником углерода может являться мономерный, димерный или олигомерный сахар, спирт, органическая кислота, алкан или смеси, содержащие два или более из указанных соединений.

Источником углерода также могут являться пищевые или промышленные отходы или побочный продукт, содержащий одно или несколько из вышеуказанных соединений, как, например, побочный продукт глицерина от биодизельной промышленности, сахарные мелассы, сыворотку или отходы от производства оливкового масла. Побочный продукт глицерина от биодизельной промышленности состоит главным образом из неочищенного глицерина и содержит переменные количества метанола (5-50%), помимо некоторых других примесей, связанных с промышленным процессом (например, NaOH, насыщенные абсорбционные масла, некоторые сложные эфиры, сера, белки и минералы). Сахарные мелассы представляют собой побочный продукт сахарного завода, обогащенный сахарами (сахароза, глюкоза и фруктоза) (>50%). Сыворотка представляет собой побочный продукт сыродельной промышленности, состоящий главным образом из лактозы. Органическая фракция отходов от производства оливкового масла включает в себя сахара, таннины, полифенолы, полиспирты, пектины и липиды. Другие пищевые или промышленные отходы и побочные продукты, которые имеют в своем составе соединения, такие как сахара, спирты, органические кислоты и/или липиды, можно использовать в качестве субстратов для микробной культивирования и производства полимера, содержащего фукозу.

В процессе производства полимера, содержащего фукозу, согласно изобретению, источник углерода должен составлять от 2 до 10% (вес/об) водной питательной среды во время фазы загрузки с целью надлежащего обеспечения клеточного роста. В ходе последующей фазы подпитки источник углерода необходимо поддерживать выше 0,1% (поровый объем), предпочтительно, выше 0,5 (поровый объем) с целью обеспечения наличия углерода для синтеза полимера.

2.1.2. Источник азота

Источником азота для микробной культивирования может являться неорганическая соль (например, (NH₄)₂НРО₄, NH₄OH, (NH₄)₂SO₄, NH₄Cl) или органическое азотное соединение (например, мочевина, аминокислоты), их смеси, пищевые или промышленные отходы или побочный продукт, содержащий азотные соединения (например, соевая мука, дрожжевой экстракт, пшеничные отруби).

В процессе производства полимера, содержащего фукозу, источник азота должен иметь начальную концентрацию между 0,6 и 3,0 г/л во время фазы загрузки для того, чтобы обеспечить клеточный рост. В ходе последующей фазы подпитки источник азота необходимо поддерживать ниже 0,3 г/л, предпочтительно, ниже 0,1 г/л, создавая, таким образом, азотное ограничение. Следовательно, во время подпитки клеточный рост ограничивается или ограничивается посредством азотного ограничения, которое одновременно с наличием углерода, индуцирует синтез полимера, содержащего фукозу.

2.1.3. Неорганические соли

Среда культивирования также включает в себя в следовых количествах катионы металлов, а именно: натрий, калий, магний, железо, марганец, кобальт, медь и цинк. Каждый из указанных катионов должен присутствовать в среде культивирования в концентрациях между 0,001 и 100 мМ, за исключением натрия, который может присутствовать в более высоких количествах особенно для регулирования рН.

2.2. Условия культивирования

Культивирование в биореакторе инициируется посредством инокуляции микроорганизма в вышеописанной водной питательной среде, аэрируемой при помощи сжатого воздуха. Объем инокулята должен составлять от 10 до 30% от общей реакционной среды в начале культивирования.

Во время культивирования температура регулируется между 15 и 45°С, предпочтительно, между 26 и 37°С, а значение рН регулируется между 5,0 и 9,0, предпочтительно, между 6,5 и 7,0.

Концентрация растворенного кислорода является высокой (>70%) в начале культивирования, она постепенно снижается во время фазы загрузки одновременно с клеточным ростом. В ходе фазы подпитки концентрация растворенного кислорода регулируется ниже 30%, предпочтительно, ниже 10% или даже при анаэробных условиях. Расход воздуха можно поддерживать постоянной между 0,1 и 2,0 объем/объем/мин, концентрация растворенного кислорода регулируется посредством автоматического изменения скорости перемешивания между 0 и 2000 оборотами в минуту, предпочтительно, между 400 и 800 оборотами в минуту. В качестве альтернативного варианта расход подачи воздуха может изменяться в течение культивирования между 0 и 2,0 объем/объем/мин при поддержании постоянной скорости перемешивания. Концентрацию растворенного кислорода в ходе фазы подпитки также можно регулировать посредством добавления субстрата. В данном случае скорость перемешивания и скорость подачи воздуха можно поддерживать постоянными при значении между 0 и 2000 оборотами в минуту и между 0 и 2,0 объем/объем/мин.

Синтез полимера инициируется во время фазы загрузки, но он происходит главным образом во время фазы подпитки, когда клеточный рост замедляется или прекращается вследствие азотного ограничения, заданного биореактору. В ходе фазы подпитки в биореактор вводится питательная среда, которая создает условия наличия углерода и азотного ограничения. Концентрация азота в данной фазе поддерживается ниже 0,3 г N/L, предпочтительно, ниже 0,1 г N/L. При данных условиях клеточный рост ограничивается и производится полимер до тех пор, пока существует наличие углерода для его потребления культурой.

Синтез полимера в биореакторе может продолжаться в течение 4-7 дней или до того момента, когда бульон становится слишком вязким и больше невозможно поддерживать гомогенное распределение кислорода, температуры и питательных веществ. Данная ситуация возникает, когда кажущаяся вязкость бульона достигает примерно 2,0 Па.с (измеренная при температуре 30°С при скорости сдвига 5 с^-1).

В качестве альтернативного варианта, производство полимера изобретения можно поддерживать в непрерывном процессе или в периодическом процессе подпитки. В непрерывном процессе питательная среда постоянно вводится в биореактор, являясь бульоном, содержащим полимер, который также постоянно извлекается. В периодическом процессе подпитки вышеописанный эксплуатационный режим биореактора (начальная фаза загрузки с последующей фазой подпитки) циклично повторяется. Примерно 10-30% объема бульона остается в биореакторе и служит в качестве инокулята для следующего цикла. Данных два альтернативных эксплуатационных режима биореактора позволяют оптимизировать процесс, поскольку непроизводительные периоды, а именно: подготовка нового инокулята и подготовка биореактора, упразднены.

2.3. Извлечение и очистка продуктов культивирования

Бульон культивирования, получаемый в конце культивирования, можно непосредственно использовать без какой-либо обработки. В качестве альтернативного варианта необработанный полимер можно получить посредством высушивания бульона при температуре до 80°С или посредством сушки вымораживанием.

В качестве альтернативного варианта нативную форму полимера можно выделить из бульона в конце культивирования, предпочтительно, путем осаждения, которое достигается посредством добавления смешиваемого с водой растворителя, в котором полимер не растворяется, как, например, спирт (например, этанол, изопропанол) или кетон (например, ацетон). Полимер, содержащий фукозу, осаждается при добавлении 1-3 объемов осаждающего вещества на каждый литр бульона. Полимер высаживается вместе с клетками, белками, солями и другими компонентами бульона, которые не растворяются в осаждающем веществе. Высаженный полимер можно высушить при температуре вплоть до 80°С или высушить замораживанием. Данный нативный полимер, а также вышеописанные бульон и необработанный полимер, можно использовать в применениях, как, например, обработка сточных вод или корм для животных.

В альтернативной процедуре извлечения полимер изобретения можно частично очистить при помощи процесса, который включает в себя удаление клеток посредством центрифугирования (10000-20000 оборотов в минуту, 30-60 минут) с последующим добавлением осаждающего вещества (1-3 литра осаждающего вещества на каждый литр бульона). Осаждающим веществом может являться любой из вышеупомянутых растворителей (например, этанол, изопропанол, ацетон).

Бульон культивирования является высоковязким в конце культивирования, отделение клеток, таким образом, облегчается посредством разбавления его (добавление 1-4 литров деионизированной воды на каждый литр бульона) до центрифугирования. Осажденный полимер можно высушить при температуре до 80°С или высушить замораживанием. Данный полуочищенный полимер можно использовать в нескольких областях применения, как, например, в промышленности по переработке сельскохозяйственных пищевых продуктов, косметической промышленности, бумажной промышленности, лакокрасочной промышленности или нефтедобывающей промышленности, среди прочих.

Чистый полимер можно получить посредством дополнительного использования одного или более из нижеследующих способов:

1) Повторное осаждение полимера из разбавленных водных растворов полуочищенных полимеров (0,1-5,0 г/Л), является степенью чистоты, увеличивающейся с количеством проведенных повторных осаждений;

2) Последовательное осаждение разными осаждающими веществами, а именно: этанолом, ацетоном и/или изопропанолом или их смесями, обеспечивая, таким образом, удаление разных примесей, растворимых в каждом растворителе;

3) Промывание полуочищенного полимера растворителями, в которых полимер не растворяется (например, гексан), но которые растворяют одну или более примесь;

4) Использование протеолитических ферментов (например, трипсин), добавление веществ, высаживающих белок (например, трихлоруксусная кислота), или денатурация белковоподобных материалов посредством нагревания при температуре между 60 и 80°С;

5) Диализ, ультрафильтрация или диафильтрация водных растворов полуочищенных полимеров с уменьшенными концентрациями (0,1-5,0 г/Л), что приводит к высокой степени чистоты, поскольку высокомолекулярный полимер отделяется от всех низкомолекулярных примесей.

Чистый полимер, полученный при помощи любой из данных процедур, можно высушить при температуре вплоть до 80°С или высушить замораживанием. Высокая степень чистоты данного полимера позволяет использовать его в пищевой, фармацевтической и косметической промышленностях, среди прочих.

Несколько разных комбинаций упомянутых способов можно использовать для извлечения/очистки полимера, содержащего фукозу, в соответствии со степенью чистоты и специальным применением, для которого он предназначается.

3. Характеристика полимера

3.1. Состав

Полимер настоящего изобретения образуется в основном посредством высокомолекулярного полисахарида (10⁶-10⁷) с содержанием фукозы, по меньшей мере, 10% от общего содержания сахара. Данный полимер состоит также из глюкозы и галактозы (20-70% и 10-40% от общего содержания сахара, соответственно). Относительный состав упомянутых Сахаров в полимере, фукозе, галактозе и глюкозе зависит от времени культивирования и от эксплуатационного режима биореактора.

Более того, полимер данного изобретения также может содержать другие нейтральные сахара в маленьких количествах (<5%), такие как манноза, рамноза, ксилоза, рибоза, арабиноза, глюкуроновая кислота и/или глюкозамин.

Упомянутый полимер также содержит несахарные компоненты, а именно: ацильные группы, которые составляют вплоть до 25% сухого веса полимера. Основные обнаруженные ацильные группы представляли собой сукцинат, пируват и ацетат.

Обычно ацетат и пируват составляют между 0,5 и 5% от сухого веса полимера тогда, как сукцинат присутствует в более высоких количествах, обычно между 1 и 20%. Состав полимера изобретения относительно каждой ацильной группы зависит от эксплуатационного режима реактора и от времени культивирования. Наличие осадков пирувата и сукцината сообщает анионное свойство полимеру. Как следствие, он способен фиксировать токсические металлы, делая возможным свое применение в удалении токсических металлов (тяжелые металлы и радионуклеотиды) из зараженных грунтов и воды.

В зависимости от способа извлечения/очистки полученный полимер может содержать помимо полимера, содержащего фукозу, другие компоненты, присутствующие в бульоне культивирования, а именно: белки и неорганические соединения. Максимальное содержание данных компонентов обнаружено в нативном полимере (15-30% белков и 25-40% неорганических соединений), тогда как минимальное количество (<1%) обнаружено в очищенном полимере, полученном посредством диализа.

3.2. Средний молекулярный вес полимера

Средний молекулярный вес очищенного полимера, определенный посредством гельпроникающей хроматографии, находится в диапазоне 10⁶-10⁷. Обычно, когда производство полимера инициируется в ходе фазы микробного роста, его средний молекулярный вес составляет примерно 10⁵, увеличиваясь с течением времени в ходе культивирования вплоть до относительно постоянного значения в диапазоне 10⁶-10⁷.

3.3. Свойства полимера

3.3.1. Растворимость

Полимер изобретения не растворяется в широком диапазоне органических растворителей при комнатной температуре, включающих в себя ацетон, изопропанол, ДМСО, гексан, этиловый эфир, ксилол и тетрахлорэтилен, среди прочих. Данная характеристика полимера допускает возможность его применения в подготовке мембран стойких к растворителям, которые используются в разделительных процессах. Однако наблюдалось, что полимер является растворимым в некоторых органических растворителях, а именно: в тетрахлорэтане.

Полимер изобретения является устойчивым при взаимодействии с испытанными органическими растворителями, сохраняя свой состав относительно сахарных компонентов и ацильных групп после воздействия на них указанных растворителей. Более того, средний молекулярный вес также не был изменен.

3.3.2. Вязкость водных растворов полимера

Водные растворы, приготовленные с полимером изобретения, не являются ньютоновскими жидкостями, обладающими псевдопластическим поведением жидкости (фигура 2). Кажущаяся вязкость 0,8% (об/об) раствора полимера составляет 0,21 Па.с, измеренная при температуре 25°С при скорости сдвига 5 с^-1, снижается до 0,02 Па.с при скорости сдвига 500 с^-1. Гистерезисные явления не наблюдаются, поскольку вязкость незамедлительно восстанавливается при снижении скорости сдвига. Псевдопластическое поведение жидкости растворов полимера наделяет данный материал способностью модифицировать физические свойства водных систем и потенциальной возможностью применяться в качестве загустителя и уплотнителя, а именно: в пищевой, фармацевтической и косметической промышленностях.

Кажущаяся вязкость водных растворов полимеров снижается с увеличением температуры, но псевдопластическое поведение жидкости сохраняется. Кажущаяся вязкость 0,8% (в/в) раствора полимера, измеренная при скорости сдвига 5 s^-1, составляет 0,32 Па.с при температуре 15°С, снижаясь до 0,05 Па.с при температуре 65°С.

Было изучено влияние последующих стадий нагревания и охлаждения на динамическое свойство и свойство стационарного сдвига очищенного раствора внеклеточного полисахарида (EPS), осуществляя циклы последовательных шагов нагревания и охлаждения. После регистрации данных механического спектра и установившегося режима при температуре 25°С, тот же образец нагрели до 40, 55, 70 и 80°С.Наблюдалось, что модуль кажущейся вязкости и динамический модуль (G' и G"), зарегистрированные при температуре 25°С в конце каждого цикла, практически совпали. Отсюда мы может сделать вывод, что образец полимера является достаточно устойчивым при температурных колебаниях, сохраняя свои свойства в последующем осцилляторном испытании и испытании в установившемся режиме при температуре 25°С после воздействия увеличивающихся температур до 80°С. Данные характеристики позволяют нам думать, что полимер можно использовать в водосодержащих составах (например, пищевые продукты), которые подвержены температурным колебаниям во время обработки.

В отношении вязкоупругих свойств, водные растворы полимера, содержащего фукозу, представляют поведение вязкой жидкости (G">G' в полном диапазоне изученных частот). Образование геля не обнаружено при испытуемых условиях.

3.3.3. Эмульгирующая активность

Полимер изобретения обладает эмульгирующей активностью, которая означает, что он способен стабилизировать эмульсии с содержанием капель воды в гидрофобных соединениях, таких как масла (например, оливковое масло, парафин) и углеводороды (например, гексан, толуол). Таким образом, полимер можно использовать в качестве биоэмульгирующего или стабилизирующего вещества, он обладает потенциалом заменять синтетические эмульгаторы в широком диапазоне применений, таких как нефтяная промышленность, промышленность по производству моющих средств, текстильная промышленность, бумажная промышленность, лакокрасочная промышленность, косметическая промышленность, фармацевтическая промышленность и пищевая промышленность.

Эмульгирующая активность не ограничивается очищенным полимером. Другие формы, а именно: необработанная, нативная и полуочищенная, обнаружили способность стабилизировать эмульсии с содержанием воды в гидрофобных соединениях. Данную способность проверили при использовании растворов полимера изобретения с концентрацией между 0,05 и 1,5% при смешивании с несколькими углеводородами (например, гексадекан, гексан, толуол и ксилол) и маслами (оливковое масло и парафин). Созданные эмульсии оставались достаточно устойчивыми в течение нескольких недель. Более того, они проявили себя очень устойчивыми к температуре, стойкими к нагреванию от комнатной температуры до 40, 50, 60 и 100°С.

3.3.4. Флоккулирующая активность

Полимер изобретения представляет также существенную флоккулирующую активность и может быть использован в качестве натурального биофлоккулирующего вещества. Флоккулирующие вещества полезны в стимулировании агрегации клеток и коллоидов, которые широко используются в промышленных применениях, таких как обработка сточных вод, питьевой воды и в пищевых продуктах. Биоразрушаемость и безопасность полимера изобретения представляют преимущества по сравнению с синтетическими флоккулянтами, которые представляют опасность для здоровья человека и чья разрушаемость в окружающей среде затруднена.

При комнатной температуре и нейтральном уровне рН флоккулирующая активность полимера изобретения снижается с 70 до 60% с увеличением концентрации полимера с 0,1 до 0,8% (об/об). Данная флоккулирующая активность сравнена с флоккулирующей активностью коммерческих полисахаридов, а именно: ксантаном, альгинатом, гуаровой камедью и карбоксиметилцеллюлозой. Полимер изобретения проявил себя, как хорошее флоккулирующее вещество с похожим действием флоккулирующего вещества коммерческих продуктов при одинаковой концентрации полимера.

3.3.5. Приготовление биоразрушаемых пленок

Полимер, содержащий фукозу, можно использовать для производства биоразрушаемых композитных пленок посредством его смешивания с другими биополимерами, такими как крахмал, пектин, альгинат, каррагенан, глютен, геллан и хитозан. Данные пленки можно применять в качестве мембран в процессах с органическими растворителями и в упаковочных материалах.

Полисахариды, такие как хитозан, крахмал и гуаровая камедь, были испытаны в приготовлении микросфер для контролируемого высвобождения лекарственных средств. Полимер данного изобретения можно также использовать для данной цели как самого по себе, так и в сочетании с другими биополимерами.

4. Применения полимера настоящего изобретения

Полимер данного изобретения проявляет эмульгирующую и флоккулирующую активность и образует высоковязкие водные растворы с псевдопластическим поведением жидкости. Как следствие, он может заменять другие полисахариды, такие как ксантан, альгинат, гуаровая камедь и аравийская камедь, в широком диапазоне применений, а именно: загуститель, уплотнитель или вяжущее вещество, в пищевой, фармацевтической и косметической промышленностях.

Полимер, содержащий фукозу, можно использовать для производства биоразрушаемых композитных пленок посредством его смешивания с другими биополимерами, такими как крахмал, пектин, альгинат, каррагенан, глютен, геллан и хитозан. Данные пленки можно применять в качестве мембран в процессах с органическими растворителями (например, дегидратация растворителя посредством предварительного упаривания) и в упаковочных материалах, как упаковка для пищевых продуктов, с низкой проницаемостью для газов (кислород и углекислый газ).

Полимер, содержащий фукозу, также можно использовать как источник олигосахаридов, получаемых из исходного полимера посредством применения физических обработок (например, микроволн, нагревания, облучения или ультразвуковой обработки), химических процессов (например, кислотный гидролиз), ферментных обработок (например, гидролазы и лиазы) или биологических процессов (при использовании микробных веществ, способных разрушать деполимер и использовать все сахара в качестве источника углерода за исключением фукозы). Полученная фукоза и фукоолигосахариды, а также исходный полимер, выделенные или смешанные, обладают большим потенциалом в медицинских применениях в качестве антиканцерогенных и противовоспалительных веществ при лечении, например, ревматоидного артрита (Vanhooren e Vandamme, 1999; Peterszegi et al, 2003b). Более того, благодаря наличию фукозы в своем составе, полимер изобретения также обладает большим потенциалом для использования в косметических препаратах в качестве увлажняющей и антивозрастной добавки (Peterszegi et al, 2003a) (Петержеги и др., 2003а).

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Производство полимера, содержащего фукозу, посредством культивирования бактерий Enterobacter A47 (DSM 23139) при использовании побочного продукта глицерина от биодизельной промышленности

Культура Enterobacter A47 (DSM 23139) была инокулирована в 8 л культурной среды с составом, представленным в таблице 3. Биореактор (BioStat B-plus, Sartorius) эксплуатировался при нижеследующих условиях: регулируемая температура 30°С;

регулируемый уровень рН 6,80±0,05, автоматическая добавка NaOH 1M и постоянная скорость аэрации 1,6 л/мин (0,2 об/об/мин). По мере микробного роста концентрация растворенного кислорода снизилась с 80% насыщения в начале цикла культивирования примерно до 20% через 1 день.

С этого момента непрерывная подача (примерно 20 мл/ч) вводилась в реактор. Ее состав представлен в таблице 3, но с разной концентрацией Глицерина (200 г/л). Данные эксплуатационные режимы ограничили концентрацию азота в ферментативном бульоне (ниже 0,1 г N/L) и одновременно обеспечили хорошую доступность источника углерода.

Таблица 3 Состав культурной среды. Компонент Концентрация Побочный продукт Глицерина 25 г/л K₂HPO₄ 5,8 г/л KH₂PO₄ 3,7 г/л (NK₄)₂HPO₄ 3,3 г/л Минеральный раствор⁽¹⁾ 1,0 мл/л MgSO₄ 100 мМ 10 мл/л ⁽¹⁾ состав минерального раствора (для 1 литра HCl 1N): FeSO₄·7H₂O, 2,78 г; MnCl₂·4H₂O, 1,98 г; CoSO₄·7H₂O, 2,81 г; CaCl₂H₂O, 1,67 г; CuCl₂·2H₂O, 0,17 г; ZnSO₄·7H₂O, 0,29 г)

Концентрация растворенного кислорода постепенно снизилась до 10% насыщения, значение получено через 2 дня культивирования. С этого момента, концентрацию регулировали ниже 10% посредством автоматического изменения скорости перемешивания между 400 и 800 оборотами в минуту. Через 1 день при данных условиях вязкость ферментативного бульона быстро увеличилась, что было связано с производством полимера.

По истечении 4 дней культивирования концентрация полимера составила около 13,3 г/л, что означает, что полимер извлечен и определено его количество в полуочищенной форме (фигура 3). Вязкость ферментативного бульона значительно увеличилась между 4 и 7 днем, несмотря на то, что производство полимера прекратилось. Продуктивность достигла значения 3,6 г л^-1 день^-1 и выход продукта из Глицерина составил 0,47 г г^-1 с учетом промежутка времени, в течение которого произошло производство полимера (с 1 дня по 4 день).

Цикл культивирования был остановлен на 7 день, когда вязкость ферментативного бульона достигла 3,0 Па.с при скорости сдвига 5 см^-1 и Т=30°С.

Пример 2: Извлечение и очистка полимера, содержащего фукозу, произведенного посредством Enterobacter A47 (DSM 23139) из побочного продукта глицерина

По завершении цикла культивирования, описанного в Примере 1, полимер, содержащий фукозу, извлекли из ферментативного бульона в форме трех разных

продуктов с разными степенями чистоты: нативный, полуочищенный и очищенный полимер.

Нативный полимер был получен посредством добавления ацетона непосредственно в ферментативный бульон (3:1). Концентрация нативного полимера составила 20,6 г/л.

Для получения полуочищенного полимера ферментативный бульон сначала разбавили для снижения вязкости (2 л деионизированной воды на 1 л ферментативного бульона), а затем биомассу отделили посредством центрифугирования (20000 оборотов в минуту, 30 мин). После этого бесклеточный супернатант медленно добавили к ацетону (1: 3) при слабом перемешивании, стимулируя осаждение полимера. Осадок растворили в деионизированной воде и высушили замораживанием. Концентрация полуочищенного полимера составила 11,6 г/л.

С целью получения очищенного полимера водный раствор полуочищенного полимера обрабатывали посредством диализа во взаимодействии с деионизированной водой в течение 24 ч при использовании мембраны 3500 MWCO (Складчатая диализная трубка 68035 SnakeSkinTM - Thermo Scientific). Азид натрия добавили (6 частей на миллион) с целью предупреждения микробиологического разрушения полимера. После этого полимер высадили посредством добавления ацетона, повторно растворенного в воде, и высушили замораживанием. Концентрация очищенного полимера составила 5,5 г/л.

В качестве альтернативного варианта полимер можно извлечь/очистить посредством нижеследующего метода: разбавления ферментативного бульона и отделения биомассы посредством центрифугирования; нагревания при температуре 60°С в течение 1 часа с целью инактивации ферментов, присутствующих в супернатанте, которые могут отвечать за частичное разрушение полимера; диализа супернатанта во взаимодействии с деионизированной водой и в завершение высушивание замораживанием. При помощи данного способа было извлечено 5,0 г/л очищенного полимера.

Пример 3: Химический анализ полимера, содержащего фукозу, произведенного посредством Enterobacter A47 (DSM 23139)

Полимеру, произведенному, как описано в Примере 1, и извлеченному, как описано в Примере 2, дана характеристика в отношении его химического состава, а именно касательно его сахарного состава, содержания ацильных групп и количества несахарных остатков (белки и золы) при использовании способов, описанных Freitas et al (2009 г.). Химический состав всех степеней чистоты полимера (нативный, полуочищенный и очищенный посредством диализа) проанализирован в течении времени в протекания цикла культивирования.

Через 1 день после культивирования полимер состоял в основном из глюкозы (77%) и галактозы (15%) с более низкими количествами фукозы (6%). По мере продолжения культивирования относительная пропорция данных сахарных мономеров существенно изменилась: содержание глюкозы постепенно снизилось до 40% на 4 день, а относительное количество галактозы и фукозы увеличилось до 26% и 28%, соответственно.

Сахарный состав остался практически неизменным в течение последних 3 дней операции (глюкоза 40-44%; фукоза 26-30%; галактоза 28-29%).

Также наблюдалось изменение относительной пропорции ацильных групп с течением времени: она варьировалась от 2,4% сукцината, 0,2% пирувата и 0,3% ацетата в 1 день до 20% сукцината, 2,4% пирувата и 2,0% ацетата на 4 день. Впоследствии на 7 день наблюдалось снижение содержания сукцината до 3,9% наряду с увеличением пирувата (4,9%) и ацетата (3,6%).

Состав в отношении компонентов сахара и ацильных групп является похожим для полимеров с разной степенью чистоты. Это не происходит в случае с белками и золами. Содержание данных компонентов снижается от нативного до полуочищенного полимера и от полу-очищенного до очищенного полимера.

Пример 4: Производство полимера, содержащего фукозу, посредством культивирования бактерий Enterobacter A47 (DSM 23139) при использовании побочного продукта глицерина от биодизельной промышленности при разных температурах и значениях рН

Культуру Enterobacter A47 (DSM 23139) культивировали в 2 л биореакторах, как описано в примере 1 за исключением температуры и рН, которые регулировались при разных значениях в соответствии с таблицей 4. В конце каждого цикла полимер извлекали, как описано в примере 2.

Таблица 4 Значения испытанных температур и рН Цикл Температура (°С) РН µ (ч^-1) X_max (г/л) EPS_max (г/л) г_р (г/л.д) γ_p/s (г.г^-1) 1 30,0 7,0 0,30 7,14 8,37 5,00 0,17 2 30,0 7,0 0,32 7,58 10,13 4,94 0,21 3 20,0 6,0 0,14 7,41 0,82 0,19 0,01 4 40,0 6,0 0,34 9,20 2,59 0,81 0,03 5 20,0 8,0 0,13 8,39 4,40 2,54 0,10 6 40,0 8,0 0,22 5,63 1,62 1,34 0,04 7 15,9 7,0 0,08 8,17 1,12 0,33 0,02 8 44,1 7,0 - 0,21 0,23 0,06 0,02 9 30,0 5,6 0,10 10,62 7,50 2,05 0,09 10 30,0 8,4 0,07 3,01 2,67 2,38 0,09

Условиями, которые минимизируют клеточный рост, производство полимера и продуктивность признаны температуры между 25 и 34°С и регулируемое значение рН между 6,5 и 7,5 (таблица 5). Более того, в пределах данных диапазонов температур и рН содержание срукозы в полимере являлось максимальным. Вне данных диапазонов культура синтезировала полимеры с разным составом, как, например: сокращение содержания фукозы (<14%), сопровождаемое увеличением содержания глюкозы (>50%) и добавлением новых мономеров (например, рамноза и глюкозамин) в качестве основных компонентов (до 20% и до 10%, соответственно). Глюкуроновая кислота также была обнаружена в данных полимерах с содержанием до 15%. На содержание ацильных групп также повлияла температура и рН во время культивирования, снизив их до уровней ниже 10% от сухой массы полимеров.

ЛИТЕРАТУРА

Canilha L, Silva DDV, Carvalho W, Mancilha M (2005) Revista Analytica 20, 332-341.

Celik E, Ozbay N, Oktar N, Calik P (2008) Ind Eng Chem Res 47, 2985 - 2990.

Freitas F, Alves VD, Carvalheira M, Costa N, Oliveira R, Reis МАМ (2009) Carbohydr Pol 78,549 - 556.

Guetta O, Mazeau К, Auzely R, Milas M, Rinaudo M (2003a) Biomacromol 4, 1362-1371. Guetta 0, Milas M, Rinaudo M (2003b) Biomacromol 4, 1372-1379. Janda JM, Abbot SL (2007) O Clin Microbiol 45 (9), 2761-2764. Joseleau JP, Marais MF (1979) Carbohydr Res 77, 183-190.

Jukes TH, Cantor CR (1969) In Mammalian protein metabolism, N Munro, Academic Press, New York, pp 21-132.

KumarAS, Mody K, Jha В (2007) J Basic Microbiol 47, 103-117.

Kumar AS, Mody К (2009) Microbial Production of Biopolymers and Polymer Precursors - Applications and Perspectives. Caister Academic Press, Chapter 10.

Maidak BL, Cole JR, Parker CT, Garrity GM, Larsen N, Li B, Lilburn TG, McCaughey MJ Olsen GJ, Overbeek R, Pramanik S, Schmidt S, Tiedje JM, Woese CR (1999) Nucl Acids Res 27, 171-173.

Moreno J, Vargas MA, Olivares H, Rivas J, Guerrero MG (1998) J Biotechnol 60, 175-182.

Peterszegi G, Isnard N, Robert AM, Robert L (2003a) Biomedicine Pharmacotherapy 57,187-194.

Peterszegi G, Fodil-BourahIa I, Robert AM, Robert L (2003b) Biomedicine Pharmacotherapy 57,240-245.

Pruesse E, Quast C, Knittel, Fuchs B, Ludwig W, Peplies J, Glockner FO (2007) Nucl Acids Res 35, 7188-7196.

Rainey FA, W-R N, Kroppenstedt RM, Stackenbrandt E (1996) Int J Sys Bacteriol 46, 1088-1092.

Saitou N, Nei M (1987) Mol Biol Evol 4, 406-425. Sutherland IW (2001) Int Dairy J 11, 663-674.

van den Bulk RW, Zevenhuizen LPTM, Cordewener JHG, Dons JJM (1991) Phytopathol 81 (6), 619-623.

Vanhooren PT, Vandamme EJ (1999) J Chem Technol Biotechnol 74, 479-497.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способы получения полимера, включающего фукозу, полимер, содержащий фукозу, и его применения. Полимер получают посредством культивирования бактерии Enterobacter DSM 23139 в одном варианте при использовании в качестве источника углерода глицерина или смесей, обогащенных глицерином. В другом варианте в качестве источников углерода используют пищевые или промышленные отходы, содержащие одно или несколько таких соединений, как сахар, спирт, органическая кислота, алкан. В фазе загрузки бактерии культивируют в биореакторе с перемешиванием и аэрацией в среде, содержащей источник углерода, включающий глицерин, источник азота и неорганические соли. Затем в фазе подпитки бактерии культивируют в условиях наличия источника углерода и ограничения азота. Полученный полимер обладает флоккулирующей и эмульгирующей активностью, используют в качестве загустителя. Полимер применяют в качестве антиканцерогенного или противовоспалительного агента, в качестве увлажняющей или антивозрастной добавки, а также для получения биоразлагаемых композитных пленок и микросфер для регулируемого высвобождения лекарственных препаратов. 9 н. и 16 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 4 пр.

1. Способ получения полимера, включающего полисахарид, содержащий фукозу, где полимер получают путем культивирования бактерии Enterobacter А47 с номером доступа DSM 23139 при использовании глицерина или смесей, содержащих глицерин, в качестве источников углерода, способ, включающий:
- фазу загрузки, включающую культивирование микробной культуры в культуральной среде в перемешиваемом и аэрируемом биореакторе, где культуральная среда содержит источник углерода, содержащий глицерин или смеси, содержащие глицерин, источник азота и неорганических солей; и
- фазу подпитки, включающую культивирование микробной культуры в условиях наличия источника углерода и ограничения азота.

2. Способ по п.1, в котором начальная концентрация растворенного кислорода в бактериальной культуральной среде составляет больше чем 70%; где упомянутая концентрация растворенного кислорода регулируется до уровней ниже 30% при поддержании источника азота, ограниченного до количеств ниже чем 0,1 г/л, и при обеспечении источником углерода для подбора скорости микробного потребления.

3. Способ по п.1, в котором минеральная среда вводится в биореактор во время стадии подпитки.

4. Способ по п.1, в котором температура стадии культивирования находится между 15 и 45°C, и значение pH находится между 5,0 и 9,0.

5. Способ по п.1, в котором культуральный бульон в конце стадии культивирования высушивается при температуре вплоть до 80°C или высушивается замораживанием.

6. Способ по п.5, в котором клетки удаляют из культурального бульона с получением свободного от клеток супернатанта и полимер высаживают из освобожденного от клеток супернатанта посредством добавления 1-3 объемов осаждающего вещества на каждый литр бульона.

7. Способ по п.6, в котором полимер дополнительно очищается посредством диализа, ультрафильтрацией или диафильтрацией.

8. Способ по п.1, в котором объем среды, вводимой с бактерией Enterobacter А47 с номером доступа DSM 23139, составляет от 10 и до 30% от общего объема реакционной среды в начале культивирования.

9. Способ получения полимера, включающего полисахарид, содержащий фукозу, где полимер получают путем культивирования бактерии Enterobacter А47 с номером доступа DSM 23139 при использовании пищевых или промышленных отходов, или побочного продукта, содержащего одно или несколько таких соединений, как сахар, спирт, органическая кислота, алкан или их смеси, содержащие два или более из указанных соединений, в качестве источников углерода, способ, включающий:
- фазу загрузки, включающую культивирование микробной культуры в культуральной среде в перемешиваемом и аэрируемом биореакторе, где культуральная среда содержит источник углерода, содержащий глицерин или смеси, содержащие глицерин, источник азота и неорганических солей; и
- фазу подпитки, включающую культивирование микробной культуры в условиях наличия источника углерода и ограничения азота.

10. Способ по п.1, в котором источник углерода составляет от 2 и до 10% (вес./об.) от культуральной среды во время фазы загрузки и больше 0,1% (порового объема) в фазе подпитки.

11. Способ по п.1, в котором источник азота имеет начальную концентрацию от 0,6 и до 3,0 г/л во время фазы загрузки и составляет ниже 0,3 г/л в фазе подпитки.

12. Способ по п.1, в котором полученный полимер имеет средний молекулярный вес 10⁶-10⁷, определенный с помощью гель-проникающей хроматографии, и который содержит фукозу в количестве по меньшей мере 10% от общего содержания углеводов и ацильные группы, составляющие вплоть до 25% от сухого веса полимера.

13. Способ по п.12, в котором ацильные группы представляют собой сукцинат, и/или пируват, и/или ацетат, или их комбинации.

14. Способ п.12, в котором полученный полимер содержит количество глюкозы между 20-70% от общего количества углеводов и количество галактозы между 10-40% от общего содержания углеводов.

15. Способ по п. 13, в котором сукцинат содержится вплоть до 20% от сухого веса полимера, пируват содержится вплоть до 5% от сухого веса полимера и ацетат содержится вплоть до 5% от сухого веса полимера.

16. Способ по п.12, в котором полимер обладает псевдопластическим поведением жидкости в водной среде с устойчивой вязкостью при температурах до 80°C, значении pH между 3-10 и ионной силой до 20% NaCl.

17. Способ по п.12, в котором полимер является нерастворимым в органических растворителях.

18. Способ по п.12, в котором полимер обладает способностью образовывать и стабилизировать эмульсии с несколькими гидрофобными соединениями, такими как растительные и минеральные масла и углеводороды, при этом эмульсии устойчивы при нагревании до температуры 100°C.

19. Полимер, полученный способом по пп.1-11, обладающий флоккулирующей активностью.

20. Биоразлагаемая композитная пленка для применения в качестве мембран или в упаковочных материалах, содержащая полимер, описанный в п.19.

21. Микросферы для регулируемого высвобождения лекарственных препаратов, содержащие полимер, описанный в п.19.

22. Применение полимера по п.19 в качестве загустителя или эмульгирующего агента в сельскохозяйственных пищевых продуктах.

23. Применение полимера по п.19 в качестве антиканцерогенного или противовоспалительного агента в фармацевтической композиции.

24. Применение полимера по п.19 в качестве увлажняющей или антивозрастной добавки в косметической композиции.

25. Применение полимера по п.19 в качестве флоккулирующего и эмульгирующего агента при обработке отходов.