СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ УСТОЙЧИВОСТИ К ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ МЕЛКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2015 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и может быть использовано для определения степени устойчивости мелких лабораторных животных (крыс) к гипобарической (гипоксической) гипоксии путем оценки динамики неврологических расстройств.

Известен способ определения индивидуальной устойчивости к гипоксической гипоксии путем определения высотного порога (аналог №1), заключающийся в том, что животные поднимаются в барокамере со скоростью 165 м/с до начальной площадки 9000 м, пребывают на этой высоте 5 мин, затем вновь поднимаются со скоростью 165 м/с до следующей площадки на 1000 выше и так далее до фиксирования агонального дыхания [Е.Б. Шустов, Н.Н. Каркищенко, В.Н. Каркищенко, Х.Х. Семенов. Анализ параметров индивидуальной устойчивости лабораторных животных к гипоксии в интересах биологического моделирования нейропротекторного и антигипоксического действия лекарственных средств // Биомедицина, №4. - 2013, с. 149-157]. Высота, на которой фиксируется агональное дыхание, является индивидуальным высотным порогом. Для популяции здоровых крыс такое тестирование выявляет следующую структуру высотной устойчивости: до 10% крыс имеет низкую устойчивость, 15% - высокую, остальные 75% - среднюю, что свидетельствует о его недостаточной точности, поскольку разброс показателей в средней зоне оказывается весьма значительным. Кроме того, предъявляются высокие требования к качеству оборудования, так как требуется поддержание разреженности воздуха, соответствующее 15000 м, тогда как для большинства барокамер этот показатель не превышает 10000 м.

Вторым аналогом изобретения является способ оценки индивидуального уровня гипоксической устойчивости методом балльного шкалирования [там же, с. 149-157]. Исследование ведется до появления агонального дыхания. Большинством исследователей значимость времени жизни оценивается выше других показателей, поэтому именно для «времени жизни» вводится весовой коэффициент 2. Оценка индивидуальной устойчивости животных к гипоксии проводится путем присвоения баллов экспериментально полученным данным с учетом весовых коэффициентов и их суммирования. До 9 баллов включительно - низкая устойчивость к гипоксии (17% наблюдений), от 10 до 14 баллов включительно - средняя устойчивость к гипоксии (63% наблюдений), 15 и более баллов - повышенная устойчивость к гипоксии (20% наблюдений).

Прототипом изобретения является способ определения индивидуальной устойчивости к гипоксической гипоксии путем комплексной оценки показателей, фиксируемых при барокамерном подъеме животных со скоростью 165 м/с на критическую высоту (для крыс 11500 м): время первого падения (ВПП) - переход в лежачее положение, время жизни (ВЖ) на высоте до появления атонального состояния, время восстановления позы (ВВП) после «спуска» с высоты [Лукьянова Л.Д. Фармакологическая коррекция митохондриальной дисфункции при гипоксии // Проблемы гипоксии: молекулярные, физиологические и медицинские аспекты. - М., 2004. - С. 456]. Мерой оценки чувствительности животного к острой гипобарической гипоксии служит время жизни на высоте. По результатам тестирования животных делят на две группы - высокоустойчивых и низкоустойчивых. К высокоустойчивым относят животных, которые выдерживают в барокамере острую гипобарическую гипоксию не менее 1200 сек (ВЖ>1200 сек). К низкоустойчивым - животные, выдерживающие острую гипоксию менее 150 сек (ВЖ<150 сек).

Кроме невысокой точности, к недостаткам описанных способов тестирования следует отнести неизбежно возникающее гипоксическое повреждение ЦНС (поскольку исследование ведется до появления атонального дыхания), что при дальнейшем моделировании экстремальной гипоксии путем пережатия сосудисто-нервного пучка косвенно подтверждается увеличением летальности на 27% в группе низкоустойчивых и на 16,5% в группе высокоустойчивых крыс. Таким образом, данные методики тестирования не отвечают требованиям моделирования экстремальной гипоксии

Резюмируя вышесказанное, отметим, что общепринятые способы определения устойчивости к гипоксии являются недостаточно точными и оказывают повреждающее действие на ЦНС.

Задачей изобретения является разработка способа определения степени устойчивости мелких лабораторных животных к острой гипобарической гипоксии, не допускающего появления агонального дыхания, являющегося признаком развития глубокого торможения на уровне продолговатого и спинного мозга, которое сопровождается гипоксическим повреждением структур мозга, в первую очередь корковых.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности способа и снижение вероятности гипоксического повреждения ЦНС при тестировании.

Предлагаемый способ определения степени устойчивости мелких лабораторных животных к острой гипобарической гипоксии реализуется следующим образом. Животных помещают в барокамеру, поднимают на высоту 9000 м без промежуточных остановок со скоростью 50 м/с. Высота 9000 м является пороговой величиной устойчивости для животных с наличием заболеваний [Е.Б. Шустов, Н.Н. Каркищенко, В.Н. Каркищенко, Х.Х. Семенов. Анализ параметров индивидуальной устойчивости лабораторных животных к гипоксии в интересах биологического моделирования нейропротекторного и антигипоксического действия лекарственных средств // Биомедицина. - 2013. - №4. - С. 149-157]. При подъеме регистрируют высоту, на которой возникают первые признаки угнетения двигательной активности. На площадке 9000 м животных выдерживают 10 мин (среднее время экспозиции, определенное экспериментальным путем). При спуске регистрируют высоту, на которой возобновляется двигательная активность. После спуска животного проводят неврологическое тестирование и фиксируют время восстановления позных реакций. Каждый признак оценивают в баллах:

угнетение двигательной активности на высоте 4000 м оценивают как 30 баллов, 5000 м - как 25 баллов, 6000 м - как 20 баллов, 7000 м - как 15 баллов, 8000 м - как 10 баллов, 9000 м оценивают как 5 баллов (таблица 1);

возобновление двигательной активности на высоте 8000 м оценивают как 5 баллов, 7000 м - как 10 баллов, 6000 м - как 15 баллов, 5000 м - как 20 баллов, 4000 м оценивают как 25 баллов (таблица 2);

восстановление корковых рефлексов - реакции постановки лап на опору и хватания на 1 минуте оценивают как 1 балл, на 2 минуте - как 4 балла, на 3 минуте - как 8 баллов, на 5 минуте - как 12 баллов, на 7 минуте - как 24 балла, на 10 минуте оценивают как 48 баллов (таблица 3);

восстановление рефлексов, замыкающихся на уровне среднего мозга и Варолиева моста - рефлексов переворачивания и равновесия на 1 минуте - оценивают как 1 балл, на 2 минуте - как 6 баллов, на 3 минуте - как 12 баллов, на 5 минуте - как 24 балла, на 7 минуте - как 48 баллов, на 10 минуте оценивают как 96 баллов (таблица 4).

Полученные баллы суммируют. При значении суммы 25 баллов и менее животных относят к высокоустойчивым, 26-70 баллов - к среднеустойчивым, 71-116 баллов - к низкоустойчивым, 117-199 баллов - к неустойчивым к гипоксии животным. Животных, у которых отмечаются судороги, признают неустойчивыми к гипоксии независимо от количества набранных баллов.

Сущность изобретения поясняется следующим примером.

Пять крыс поместили в барокамеру, подняли на высоту 9000 м без промежуточных остановок со скоростью 50 м/с. На площадке 9000 м выдерживали 10 минут. У крысы №1 признаки угнетения двигательной активности были зарегистрированы на высоте 6000 м. Возобновление двигательной активности при спуске было зарегистрировано на высоте 5000 м. После спуска восстановление корковых рефлексов произошло на 5 минуте, рефлексов переворачивания и равновесия на 7 минуте. Сумма баллов составила: 20+20+12+48=100, следовательно, крыса №1 относится к группе низкоустойчивых к гипобарической гипоксии.

У крысы №2 признаки угнетения двигательной активности зарегистрированы на высоте 9000 м. Сразу же после начала спуска на высоте 8000 м двигательная активность возобновилась. Корковые рефлексы восстановились на 2 минуте, рефлексы переворачивания и равновесия на 3 минуте. Сумма баллов составила: 5+5+4+12=26, таким образом, крыса №2 относится к группе среднеустойчивых.

У крысы №3 признаки угнетения двигательной активности появились на 4-ой минуте пребывания на высоте 9000 м. Сразу же после начала спуска на высоте 8000 м двигательная активность возобновилась. Корковые реакции восстановились на 1 минуте, рефлексы переворачивания и равновесия на 2 минуте. Сумма баллов составила 5+5+1+6=17, таким образом, крыса №3 относится к группе высокоустойчивых.

У крысы №4 торможение двигательной активности началось уже на высоте 4000 м. Возобновление двигательной активности было зафиксировано при спуске на высоте 5000 м. Спустя 7 мин после спуска корковые рефлексы, хотя и не уверенно, но воспроизводились, рефлексы переворачивания и равновесия полностью восстановились к 10 минуте наблюдения. Сумма баллов: 30+20+24+96=170, что позволяет по предлагаемой шкале отнести животное к группе неустойчивых к гипоксии.

Крыса №5 в начале тестирования довольно легко переносила условия гипоксии: торможение двигательной активности произошло на высоте 8000 м, возобновление ее на высоте 6000 м, корковые рефлексы восстановились на 5 минуте, рефлексы переворачивания и равновесия на 7 минуте. Сумма баллов составила 10+15+12+48=85, что соответствует группе низкоустойчивых. Однако на 9 минуте после спуска у крысы начались судороги, в связи с чем она была отнесена к группе неустойчивых к гипоксии.

Проведенные нами экспериментальные исследования на 220 животных убедительно показали надежность использования предлагаемого способа и высокую точность определения устойчивости крыс к гипобарической гипоксии. Об этом свидетельствуют результаты проведенных нами экспериментов. Так, при первоначальном тестировании по методу Лукьяновой Л.Д. (прототип) высокая степень устойчивости к гипоксии была определена у 57% крыс, низкая степень устойчивости у 43% крыс. Повторное тестирование этих же крыс по этой же методике выявило сдвиг значений показателя на 10-15% в сторону уменьшения устойчивости. Аналогичные закономерности сдвига в сторону меньших значений устойчивости к гипоксии наблюдались и в случае проведения исследований с применением методики аналога №2, что свидетельствует об определенном гипоксическом повреждении, возникающем при этих методиках тестирования.

Использование предлагаемого способа определения устойчивости крыс к гипоксии выявило следующие 4 группы: неустойчивые (14%), низкоустойчивые (38%), среднеустойчивые (30%), высокоустойчивые (18%). Повторное применение этой методики не выявило статистически достоверных сдвигов процентного содержания перечисленных групп. Это свидетельствует о том, что заявляемый способ не только позволяет распределить животных по степени устойчивости на 4 группы, но и является более физиологичным.

Таким образом, предлагаемый способ определения устойчивости мелких лабораторных животных к гипобарической гипоксии путем балльной оценки динамики неврологических расстройств позволяет повысить точность определения устойчивости, а значит и всего экспериментального исследования, а также снизить вероятность гипоксического повреждения ЦНС при более щадящем способе тестирования.

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может быть использовано для определения степени устойчивости мелких лабораторных животных к острой гипобарической гипоксии. Для этого осуществляют подъём животного в барокамере и регистрацию времени восстановления после спуска с высоты. Подъём животного осуществляют на высоту 9000 м без промежуточных остановок со скоростью 50 м/с. При подъеме регистрируют высоту, на которой возникают признаки угнетения двигательной активности с оценкой в баллах. При этом угнетение двигательной активности на высоте 4000 м оценивают как 30 баллов, 5000 м - как 25 баллов, 6000 м - как 20 баллов, 7000 м - как 15 баллов, 8000 м - как 10 баллов, 9000 м оценивают как 5 баллов. На высоте 9000 м животных выдерживают 10 минут. После этого при спуске с высоты регистрируют высоту, на которой возобновляется двигательная активность с оценкой в баллах. Возобновление двигательной активности на высоте 8000 м оценивают как 5 баллов, 7000 м - как 10 баллов, 6000 м - как 15 баллов, 5000 м - как 20 баллов, 4000 м оценивают как 25 баллов. После спуска животного проводят неврологическое тестирование и регистрируют время восстановления позных реакций с оценкой в баллах. При этом восстановление корковых рефлексов - реакции постановки лап на опору и хватания на 1 минуте - оценивают как 1 балл, на 2 минуте - как 4 балла, на 3 минуте - как 8 баллов, на 5 минуте - как 12 баллов, на 7 минуте - как 24 балла, на 10 минуте оценивают как 48 баллов. Восстановление рефлексов, замыкающихся на уровне среднего мозга и Варолиева моста - рефлексов переворачивания и равновесия на 1 минуте - оценивают как 1 балл, на 2 минуте - как 6 баллов, на 3 минуте - как 12 баллов, на 5 минуте - как 24 балла, на 7 минуте - как 48 баллов, на 10 минуте оценивают как 96 баллов. После этого полученные баллы суммируют. Если полученная сумма баллов составляет 25 баллов и менее животных относят к высокоустойчивым к острой гипобарической гипоксии. При значении полученной суммы 26-70 баллов животных относят к среднеустойчивым. Если сумма баллов составляет 71-116 баллов, животных относят к низкоустойчивым. При результате 117-199 баллов животных относят к неустойчивым к гипоксии. При этом животных, у которых отмечаются судороги, признают неустойчивыми к гипоксии независимо от количества набранных баллов. Способ обеспечивает повышение точности исследования при снижении вероятности гипоксического повреждения ЦНС в результате тестирования. 4 табл.

Способ определения степени устойчивости мелких лабораторных животных к острой гипобарической гипоксии, включающий подъем в барокамере, регистрацию времени восстановления после спуска с высоты, отличающийся тем, что подъем осуществляют на высоту 9000 м без промежуточных остановок со скоростью 50 м/с, при подъеме регистрируют высоту, на которой возникают признаки угнетения двигательной активности с оценкой в баллах, а именно: угнетение двигательной активности на высоте 4000 м оценивают как 30 баллов, 5000 м - как 25 баллов, 6000 м - как 20 баллов, 7000 м - как 15 баллов, 8000 м - как 10 баллов, 9000 м оценивают как 5 баллов; на высоте 9000 м животных выдерживают 10 минут, затем при спуске регистрируют высоту, на которой возобновляется двигательная активность с оценкой в баллах, а именно: возобновление двигательной активности на высоте 8000 м оценивают как 5 баллов, 7000 м - как 10 баллов, 6000 м - как 15 баллов, 5000 м - как 20 баллов, 4000 м оценивают как 25 баллов; после спуска животного проводят неврологическое тестирование и регистрируют время восстановления позных реакций с оценкой в баллах, а именно: восстановление корковых рефлексов - реакции постановки лап на опору и хватания на 1 минуте оценивают как 1 балл, на 2 минуте - как 4 балла, на 3 минуте - как 8 баллов, на 5 минуте - как 12 баллов, на 7 минуте - как 24 балла, на 10 минуте оценивают как 48 баллов; восстановление рефлексов, замыкающихся на уровне среднего мозга и Варолиева моста - рефлексов переворачивания и равновесия на 1 минуте - оценивают как 1 балл, на 2 минуте - как 6 баллов, на 3 минуте - как 12 баллов, на 5 минуте - как 24 балла, на 7 минуте - как 48 баллов, на 10 минуте оценивают как 96 баллов, затем полученные баллы суммируют и при значении суммы 25 баллов и менее животных относят к высокоустойчивым, 26-70 баллов - к среднеустойчивым, 71-116 баллов - к низкоустойчивым, 117-199 баллов - к неустойчивым к гипоксии животным, при этом животных, у которых отмечаются судороги, признают неустойчивыми к гипоксии независимо от количества набранных баллов.