СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К ГИПОКСИИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПО УРОВНЮ ПРОДУКЦИИ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ КЛЕТКАМИ КРОВИ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины и иммунологии, и может быть использовано для определения исходной устойчивости лабораторных животных к гипоксии. Предложен принципиально новый подход к определению предрасположенности организма к гипоксическому воздействию (устойчивости к гипоксии), основанный на оценке уровня цитокинов in vitro, и позволяющий прогнозировать реакцию организма на недостаток кислорода на основании лабораторного исследования периферической крови. Применение данного способа позволяет определять устойчивость организма к гипоксии без непосредственного воздействия на животных недостатка кислорода в барокамере.

Существующие подходы к оценке исходной устойчивости организма к гипоксии предполагают непосредственное воздействие на организм условий гипоксии в барокамере, то есть in vivo. При таких способах оценки, как правило, используется сублетальная гипоксическая нагрузка, которая может приводить к патологическим изменениям в головном мозге и внутренних органах, поэтому разные авторы рекомендуют включать животных в эксперимент не ранее, чем через 12-15 дней (Каркищенко Н.Н., 2017) или месяц после гипоксического воздействия в барокамере (Лукьянова и соавт., 2009, 2011; Джалилова Д.Ш. и Макарова О.В., 2022). Альтернативного метода выделения особей с высокой и низкой устойчивостью к гипоксии в настоящее время не существует. В связи с этим требуется разработка доступных, неинвазивных диагностических критериев устойчивости организма к гипоксическому воздействию.

Из патента РФ 2563059 известен способ оценки устойчивости к гипобарической гипоксии мелких лабораторных животных в барокамере, основанный на применении формулы, использующей полуколичественную оценку угнетения двигательной активности в зависимости от высоты в баллах, по сумме которых делают вывод об устойчивости животного к гипоксии. Данный способ определения степени устойчивости мелких лабораторных животных к острой гипобарической гипоксии включает подъем в барокамере, регистрацию времени восстановления после спуска с высоты, и отличается тем, что подъем осуществляют на «высоту» 9000 м без промежуточных остановок со скоростью 50 м/с, при подъеме регистрируют высоту, на которой возникают признаки угнетения двигательной активности с оценкой в баллах, а именно: угнетение двигательной активности на высоте 4000 м оценивают как 30 баллов, 5000 м - как 25 баллов, 6000 м - как 20 баллов, 7000 м - как 15 баллов, 8000 м - как 10 баллов, 9000 м оценивают как 5 баллов; на высоте 9000 м животных выдерживают 10 минут, затем при спуске регистрируют высоту, на которой возобновляется двигательная активность с оценкой в баллах, а именно: возобновление двигательной активности на высоте 8000 м оценивают как 5 баллов, 7000 м - как 10 баллов, 6000 м - как 15 баллов, 5000 м - как 20 баллов, 4000 м оценивают как 25 баллов; после спуска животного проводят неврологическое тестирование и регистрируют время восстановления позных реакций с оценкой в баллах, а именно: восстановление корковых рефлексов - реакции постановки лап на опору и хватания на 1 минуте оценивают как 1 балл, на 2 минуте - как 4 балла, на 3 минуте - как 8 баллов, на 5 минуте - как 12 баллов, на 7 минуте - как 24 балла, на 10 минуте оценивают как 48 баллов; восстановление рефлексов, замыкающихся на уровне среднего мозга и варолиева моста - рефлексов переворачивания и равновесия на 1 минуте - оценивают как 1 балл, на 2 минуте - как 6 баллов, на 3 минуте - как 12 баллов, на 5 минуте - как 24 балла, на 7 минуте - как 48 баллов, на 10 минуте оценивают как 96 баллов, затем полученные баллы суммируют и при значении суммы 25 баллов и менее животных относят к высокоустойчивым, 26-70 баллов - к среднеустойчивым, 71-116 баллов - к низкоустойчивым, 117-199 баллов - к неустойчивым к гипоксии животным, при этом животных, у которых отмечаются судороги, признают неустойчивыми к гипоксии независимо от количества набранных баллов. Способ обеспечивает повышение точности исследования при снижении вероятности гипоксического повреждения ЦНС в результате тестирования. К недостаткам данного способа следует отнести субъективность оценки и повреждающее воздействие гипоксии на организм.

Из патента РФ 2217043 известен способ определения устойчивости животных к гипоксии в барокамере в условиях, соответствующих критической «высоте» 11000 м, при которых ведут непрерывное мониторирование электрокардиограммы животных. При появлении в течение 5-6 мин наблюдения приходящего подъема сегмента ST на 2 мм и выше от исходной величины, или приходящих экстрасистол, или приходящей блокады 11 степени диагностируют индивидуальную неустойчивость животного к гипоксии. При отсутствии вышеуказанных патологических изменений на ЭКГ в течение 7-10 мин наблюдения диагностируют индивидуальную устойчивость животного к гипоксии. Недостатком данного способа является обладающая повреждающим действием сублетальная гипоксическая нагрузка, необходимость наличия специального оборудования для мониторирования электрокардиограммы животных и специалиста, что предполагает низкую производительность.

В статье Кондашевской М.В. и соавт. (2021) по данным лабораторного исследования показателей состава клеток периферической крови до гипоксического воздействия не выявлено различий у животных с разной устойчивостью к гипоксии. Предложен интегративный индекс устойчивости к гипоксии ряда показателей крови, при этом при расчете использованы значения показателей до и после гипоксического воздействия, поэтому указанный способ определения устойчивости к гипоксии предполагает исследование животных до и после сублетального гипоксического воздействия, оказывающего повреждающее действие на клетки и организм в целом.

К недостаткам описанных способов определения устойчивости к гипоксии следует отнести неизбежно возникающее гипоксическое повреждение органов, что может вносить вклад в результаты дальнейших экспериментов (Лукьянова и соавт., 2009, 2011; Каркищенко Н.Н., 2017). Таким образом, данные методики определения устойчивости к недостатку кислорода не являются физиологическими и предполагают воздействие на организм тяжелой гипоксии.

За прототип (ближайший аналог) данного исследования взят патент РФ 2098816, предполагающий способ прогнозирования эффективности гипокситерапии у больных с бронхообструктивным синдромом, заключающийся в проведении сеансов гипоксического воздействия в течение курса лечения, отличающийся тем, что у больного берут пробу крови до и после первого сеанса физиологического гипоксического воздействия, выделяют нейтрофилы, определяют уровень индуцированной опсонизированным зимозаном люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов до и после первого сеанса гипоксического воздействия, вычисляют отношение первого уровня ко второму и при величине этого отношения, большей или равной 0,9, прогнозируют положительный эффект, а меньшей или равной 0,6 отрицательный.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа оценки индивидуальной исходной устойчивости к гипоксии путем оценки продукции цитокинов клетками крови, который не предполагает непосредственное воздействие недостатка кислорода на организм человека или лабораторного животного.

Задача решается с помощью предложенного авторами способа определения устойчивости к гипоксии путем оценки уровня спонтанной продукции цитокинов клетками периферической крови после инкубации в течение 24 ч в СО₂-инкубаторе. Способ оценки устойчивости к гипоксии лабораторных животных включает: i) отбор 1 мл крови из хвостовой вены в пробирку с 15 МЕ/мл гепарина; ii) помещение 100 мкл пробы крови в 24-луночный планшет, добавление к ней 900 мкл полной ростовой среды DMEM с L-глутамином, 1 мг/мл глюкозы и 100 мкг/мл гентамицина; iii) инкубацию пробы в течение 24 ч при 37°С в СО₂-инкубаторе; iii) определение содержания в культуральной жидкости IL-6, IL-10 и TNFα способом иммуноферментного анализа с последующим ранжированием устойчивости животных к гипоксии по двум категориям:

- при содержании IL-10 выше 50 пг/мл, IL-6 – выше 10 пг/мл, TNFα – выше 10 пг/мл животных относят к низкоустойчивым к гипоксии;

- при содержании IL-10 ниже 15 пг/мл, IL-6 – ниже 9 пг/мл, TNFα – ниже 7 пг/мл животных относят к высокоустойчивым к гипоксии.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1.

У половозрелых самцов крыс Вистар (n=40) проводили отбор крови из хвостовой вены в пробирки с 15 МЕ/мл гепарина. Пробы крови инкубировали с культуральной средой в течение 24 ч в СО₂-инкубаторе при 37°С. В пробах определяли содержание цитокинов IL-6, IL-10 и TNFα с помощью иммуноферментного анализа, получили значения искомых показателей (табл. 1). Затем животных поместили в барокамеру и определили устойчивость к гипоксии по стандартно принятому способу по «времени жизни» на высоте 11500 м до бокового положения (Лукьянова и соавт., 2009, 2011; Dzhalilova et al., 2019). Разделили животных на высокоустойчивых к гипоксии, «время жизни» которых на высоте было более 240 сек (n=7), и низкоустойчивых, «время жизни» которых на высоте было менее 60 сек (n=11). Сопоставили полученные данные по «времени жизни» и содержанию цитокинов в культуральной жидкости. У животных, «время жизни» которых на «высоте» было менее 60 сек, содержание IL-10 было выше 50 пг/мл, IL-6 – выше 10 пг/мл, TNFα – выше 10 пг/мл. Их отнесли к низкоустойчивым к гипоксии. У животных, «время жизни» которых на «высоте» было более 240 сек, содержание IL-10 было ниже 15 пг/мл, IL-6 – ниже 9 пг/мл, TNFα – ниже 7 пг/мл, их отнесли к высокоустойчивым к гипоксии.

Таблица 1

Результаты иммуноферментного анализа уровня продукции цитокинов клетками периферической крови крыс Вистар

Цитокины, пг/мл Устойчивость к гипоксии p Высокая,
«время жизни» на высоте от 240 сек Низкая,
«время жизни» на высоте от 20 до 60 сек IL-10 12,5
(12,5-49,9) 62,4
(37,4-74,9) 0,03 IL-6 7,6
(7,3-8,9) 15,3
(10,6-20,9) 0,04 TNFα 3,1
(2,5-7,0) 17,1
(14,6-20,3) 0,0006

Таким образом, предлагаемый способ определения устойчивости лабораторных животных к гипобарической гипоксии путем оценки спонтанной продукции цитокинов позволяет избежать тяжелого гипоксического воздействия при определении устойчивости к недостатку кислорода, а, значит, устранить его эффекты при проведении экспериментальных исследований.

Пример 2.

Крыса 1. Проводили отбор 1 мл крови из хвостовой вены в пробирку с 15 МЕ/мл гепарина («Славянская аптека», Россия) под эфирным наркозом. 100 мкл пробы крови помещали в 24-луночный планшет, к нему добавляли 900 мкл полной ростовой среды DMEM с L-глутамином, 1 мг/мл глюкозы и 100 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия). Образец инкубировали в течение 24 ч при 37°С в СО₂-инкубаторе. Определяли содержание в культуральной жидкости IL-6, IL-10 и TNFα способом иммуноферментного анализа с использованием наборов фирм «Invitrogen», США (IL-10) и «Cloud-Clone», США (IL-6, TNFα) на приборе Anthos 2010 (Австрия). Определяли устойчивость к гипоксии в барокамере по «времени жизни» на высоте. «Время жизни» на высоте 11500 м составило 20 сек. Показатели IL-10 – 74,8 пг/мл, IL-6 – 23,0 пг/мл, TNFα – 20,3 пг/мл. Животное отнесено к низкоустойчивому к гипоксии.

Пример 3.

Крыса 2. Проводили отбор 1 мл крови из хвостовой вены в пробирку с 15 МЕ/мл гепарина («Славянская аптека», Россия) под эфирным наркозом. 100 мкл пробы крови помещали в 24-луночный планшет, к нему добавляли 900 мкл полной ростовой среды DMEM («ПанЭко», Россия) с L-глутамином, 1 мг/мл глюкозы и 100 мкг/мл гентамицина. Образец инкубировали в течение 24 ч при 37°С в СО₂-инкубаторе. Определяли содержание в культуральной жидкости IL-6, IL-10 и TNFα способом иммуноферментного анализа с использованием наборов фирм «Invitrogen», США (IL-10) и «Cloud-Clone», США (IL-6, TNFα) на приборе Anthos 2010 (Австрия). Определяли устойчивость к гипоксии в барокамере по «времени жизни» на высоте. «Время жизни» на высоте 11500 м составило более 240 сек. Показатели IL-10 – 12,5 пг/мл, IL-6 – 7,3 пг/мл, TNFα – 4,4 пг/мл. Животное отнесено к высокоустойчивому к гипоксии.

Таким образом, предлагаемый способ определения устойчивости лабораторных животных к гипоксии путем оценки спонтанной продукции цитокинов клетками крови в условиях in vitro в отличие от существующих позволяет избежать тяжелого повреждающего гипоксического воздействия на организм.

Литература

Джалилова Д.Ш., Макарова О.В. Устойчивость к гипоксии и системный воспалительный ответ. – М.: Группа МДВ, 2022. – 200 с., ил., табл.

Каркищенко Н.Н. Биомедицинское (доклиническое) изучение антигипоксической активности лекарственных средств. Методические рекомендации. М.: ФМБА России, 2017. 98 с.

Кондашевская М.В., Артемьева К.А., Алексанкина В.В., Тихонова Н.Б., Болтовская М.Н. Индикаторы устойчивости к гипоксии, определяемые по клеточным элементам крови крыс. Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2021;57(6):475-483.

Лукьянова Л.Д., Германова Э.Л., Копаладзе Р.А. Закономерности формирования резистентности организма при разных режимах гипоксического прекондиционирования: роль гипоксического периода и реоксигенации. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009;147(4):380–384.

Лукьянова Л.Д., Кирова Ю.И. Влияние гипоксического прекондиционирования на свободнорадикальные процессы в тканях крыс с различной толерантностью к гипоксии. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011;151(3):263–268.

Dzhalilova D.Sh., Kosyreva A.M., Diatroptov M.E., Ponomarenko E.A., Tsvetkov I.S., Zolotova N.A., Mkhitarov V.A., Khochanskiy D.N., Makarova O.V. Dependence of the severity of the systemic inflammatory response on resistance to hypoxia in male Wistar rats. Journal of Inflammation Research. 2019;12:73–86. doi: 10.2147/JIR.S194581.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу определения устойчивости к гипоксии лабораторных животных, представляющих собой крыс, по уровню продукции цитокинов клетками крови. Указанный способ включает отбор проб крови из хвостовой вены у животных, инкубацию проб в течение 24 ч при 37°С в СО₂-инкубаторе и определение содержания IL-6, IL-10 и TNFα способом иммуноферментного анализа с последующим ранжированием устойчивости животных к гипоксии по двум категориям: при содержании IL-10 выше 50 пг/мл, IL-6 – выше 10 пг/мл, TNFα – выше 10 пг/мл животных относят к низкоустойчивым к гипоксии, при содержании IL-10 ниже 15 пг/мл, IL-6 – ниже 9 пг/мл, TNFα – ниже 7 пг/мл животных относят к высокоустойчивым к гипоксии. Настоящее изобретение обеспечивает способ оценки индивидуальной исходной устойчивости к гипоксии путем оценки продукции цитокинов клетками крови, который не предполагает непосредственное воздействие недостатка кислорода на организм животного. 1 табл., 3 пр.

Способ определения устойчивости к гипоксии лабораторных животных, представляющих собой крыс, включающий отбор проб крови из хвостовой вены у животных, инкубацию проб в течение 24 ч при 37°С в СО₂-инкубаторе и определение содержания IL-6, IL-10 и TNFα способом иммуноферментного анализа с последующим ранжированием устойчивости животных к гипоксии по двум категориям: при содержании IL-10 выше 50 пг/мл, IL-6 – выше 10 пг/мл, TNFα – выше 10 пг/мл животных относят к низкоустойчивым к гипоксии, при содержании IL-10 ниже 15 пг/мл, IL-6 – ниже 9 пг/мл, TNFα – ниже 7 пг/мл животных относят к высокоустойчивым к гипоксии.