СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИЗКОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ГИПОКСИИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ IN VITRO ПО УРОВНЮ СПОНТАННОЙ И СТИМУЛИРОВАННОЙ ПРОДУКЦИИ IL-1β КЛЕТКАМИ КРОВИ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины и иммунологии, и может быть использовано для определения исходной низкой устойчивости лабораторных животных к гипоксии. Предложен принципиально новый подход к определению высокой предрасположенности организма к гипоксическому воздействию (низкой устойчивости к гипоксии), основанный на оценке спонтанного и стимулированного липополисахаридом, конканавалином А и фитогемагглютинином уровня продукции провоспалительного цитокина IL-1β in vitro, и позволяющий прогнозировать реакцию организма на недостаток кислорода на основании лабораторного исследования периферической крови. Применение данного способа обеспечивает определение низкой устойчивости организма к гипоксии без непосредственного воздействия на животных, что позволяет избежать повреждения организма сублетальной гипоксической нагрузкой в барокамере.

Существующие подходы к оценке исходной устойчивости организма к гипоксии предполагают только непосредственное воздействие на организм условий гипоксии в барокамере, то есть in vivo. При таких способах оценки, как правило, используется сублетальная гипоксическая нагрузка, которая может приводить к патологическим изменениям в головном мозге и внутренних органах, поэтому разные авторы рекомендуют включать животных в эксперимент не ранее, чем через 12-15 дней (Каркищенко Н.Н., 2017) или месяц после гипоксического воздействия в барокамере (Лукьянова и соавт., 2009, 2011; Джалилова Д.Ш. и Макарова О.В., 2022). Альтернативного метода выделения особей с высокой или низкой устойчивостью к гипоксии в настоящее время не существует. В связи с этим требуется разработка диагностических критериев устойчивости организма к гипоксии без воздействия сублетальной гипоксической нагрузки.

Известен способ оценки устойчивости животных к недостатку кислорода (патент РФ 2022526) путем взятия мозга после тренировки к гипоксии, определения в мозге содержания АМФ и оценки устойчивости по направленности изменения АМФ относительно нормы, отличающийся тем, что тренировку проводят однократно, затем дополнительно в мозге определяют содержание АТФ, а содержание АМФ определяют по формуле. Однако данный способ предполагает выведение животных из эксперимента и взятие образцов мозга.

Известен способ известен способ оценки устойчивости к гипобарической гипоксии (патент РФ 2563059) мелких лабораторных животных в барокамере, основанный на применении формулы, использующей полуколичественную оценку угнетения двигательной активности в зависимости от высоты в баллах, по сумме которых делают вывод об устойчивости животного к гипоксии. Данный способ определения степени устойчивости мелких лабораторных животных к острой гипобарической гипоксии включает подъем в барокамере, регистрацию времени восстановления после спуска с высоты, и отличается тем, что подъем осуществляют на «высоту» 9000 м без промежуточных остановок со скоростью 50 м/с, при подъеме регистрируют высоту, на которой возникают признаки угнетения двигательной активности с оценкой в баллах, а именно: угнетение двигательной активности на высоте 4000 м оценивают как 30 баллов, 5000 м - как 25 баллов, 6000 м - как 20 баллов, 7000 м - как 15 баллов, 8000 м - как 10 баллов, 9000 м оценивают как 5 баллов; на высоте 9000 м животных выдерживают 10 минут, затем при спуске регистрируют высоту, на которой возобновляется двигательная активность с оценкой в баллах, а именно: возобновление двигательной активности на высоте 8000 м оценивают как 5 баллов, 7000 м - как 10 баллов, 6000 м - как 15 баллов, 5000 м - как 20 баллов, 4000 м оценивают как 25 баллов; после спуска животного проводят неврологическое тестирование и регистрируют время восстановления позных реакций с оценкой в баллах, а именно: восстановление корковых рефлексов - реакции постановки лап на опору и хватания на 1 минуте оценивают как 1 балл, на 2 минуте - как 4 балла, на 3 минуте - как 8 баллов, на 5 минуте - как 12 баллов, на 7 минуте - как 24 балла, на 10 минуте оценивают как 48 баллов; восстановление рефлексов, замыкающихся на уровне среднего мозга и варолиева моста - рефлексов переворачивания и равновесия на 1 минуте - оценивают как 1 балл, на 2 минуте - как 6 баллов, на 3 минуте - как 12 баллов, на 5 минуте - как 24 балла, на 7 минуте - как 48 баллов, на 10 минуте оценивают как 96 баллов, затем полученные баллы суммируют и при значении суммы 25 баллов и менее животных относят к высокоустойчивым, 26-70 баллов - к среднеустойчивым, 71-116 баллов - к низкоустойчивым, 117-199 баллов - к неустойчивым к гипоксии животным, при этом животных, у которых отмечаются судороги, признают неустойчивыми к гипоксии независимо от количества набранных баллов. Способ обеспечивает повышение точности исследования при снижении вероятности гипоксического повреждения ЦНС в результате тестирования. К недостаткам данного способа следует отнести субъективность оценки и повреждающее воздействие гипоксии на организм.

Известен способ определения устойчивости животных к гипоксии в барокамере в условиях, соответствующих критической «высоте» 11000 м (патент РФ 2217043), при которых ведут непрерывное мониторирование электрокардиограммы животных. При появлении в течение 5-6 мин наблюдения приходящего подъема сегмента ST на 2 мм и выше от исходной величины, или приходящих экстрасистол, или приходящей блокады 11 степени диагностируют индивидуальную неустойчивость животного к гипоксии. При отсутствии вышеуказанных патологических изменений на ЭКГ в течение 7-10 мин наблюдения диагностируют индивидуальную устойчивость животного к гипоксии. Недостатком данного способа является повреждающее действие на организм сублетальной гипоксической нагрузки, необходимость наличия оборудования для мониторирования электрокардиограммы животных и специалиста для расшифровки ЭКГ, что предполагает низкую производительность метода.

В статье Кондашевской М.В. и соавт. (2021) по данным лабораторного исследования показателей состава клеток периферической крови до гипоксического воздействия не выявлено различий у животных с разной устойчивостью к гипоксии. Предложен интегративный индекс устойчивости к гипоксии, рассчитываемый по ряду показателей крови, определяемых до и после гипоксического воздействия. Указанный способ определения устойчивости к гипоксии предполагает исследование животных до и после сублетального гипоксического воздействия, оказывающего повреждающее действие на клетки и организм в целом.

К недостаткам всех описанных способов определения устойчивости животных к гипоксии следует отнести неизбежно возникающее гипоксическое повреждение органов, что может влиять на результаты дальнейших экспериментов (Лукьянова и соавт., 2009, 2011; Каркищенко Н.Н., 2017). Таким образом, данные методики определения устойчивости к недостатку кислорода не являются физиологическими и предполагают воздействие на организм тяжелой гипоксии.

В качестве ближайшего аналога рассматривается патент РФ 2098816, предполагающий способ прогнозирования эффективности гипокситерапии у больных с бронхообструктивным синдромом, заключающийся в проведении сеансов гипоксического воздействия в течение курса лечения, отличающийся тем, что у больного берут пробу крови до и после первого сеанса физиологического гипоксического воздействия, выделяют нейтрофилы, определяют уровень спонтанной и индуцированной in vitro опсонизированным зимозаном люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов до и после первого сеанса гипоксического воздействия, вычисляют отношение первого уровня ко второму и при величине этого отношения, большей или равной 0,9, прогнозируют положительный, а меньшей или равной 0,6 отрицательный эффекты гипокситерапии.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа выявления низкой исходной устойчивости к гипоксии путем in vitro оценки изменения продукции провоспалительного цитокина IL-1β клетками крови при стимуляции провоспалительными факторами – липополисахаридом (ЛПС), конканавалином А (конА) и фитогемагглютинином (ФГА) по сравнению со спонтанной продукцией, который не предполагает непосредственное воздействие недостатка кислорода на организм человека или лабораторного животного.

Задача решается с помощью предложенного авторами способа определения низкой устойчивости к гипоксии путем оценки уровня продукции цитокинов клетками крови до и после стимуляции ЛПС, конА и ФГА. Способ оценки низкой устойчивости к гипоксии лабораторных животных включает: i) отбор 1 мл крови из хвостовой вены в пробирку с 15 МЕ/мл гепарина; ii) помещение 100 мкл первой пробы крови в 24-луночный планшет, добавление к ней 900 мкл полной ростовой среды DMEM с L-глутамином, 1 мг/мл глюкозы и 100 мкг/мл гентамицина; iii) помещение 100 мкл второй пробы крови в 24-луночный планшет, добавление к ней 900 мкл полной ростовой среды DMEM с L-глутамином, 1 мг/мл глюкозы, 100 мкг/мл гентамицина, ЛПС, конА и ФГА в конечных концентрациях 2 мкг, 4 мкг и 4 мкг, соответственно; iiii) инкубацию обеих проб в течение 24 ч при 5% СО₂ и 37ᵒС; iiiii) определение содержания в культуральной жидкости IL-1β способом иммуноферментного анализа с последующим определением животных с низкой устойчивостью к гипоксии. При выявлении повышения уровня продукции IL-1β во второй пробе по сравнению с первой животных относят к низкоустойчивым к гипоксии.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. Определение устойчивости к гипоксии крыс Вистар

У половозрелых самцов крыс Вистар (n=30) проводили отбор крови из хвостовой вены в пробирки с 15 МЕ/мл гепарина. Первую пробу инкубировали с культуральной средой в течение 24 ч при 5% СО₂ и 37ᵒС, ко второй пробе добавляли ЛПС, конА и ФГА. В культуральной жидкости определяли содержание цитокина IL-1β с помощью иммуноферментного анализа, получили значения искомых показателей (табл. 1). Затем животных поместили в барокамеру и определили устойчивость к гипоксии по стандартно принятому способу по «времени жизни» на высоте 11500 м до бокового положения (Лукьянова и соавт., 2009, 2011; Dzhalilova et al., 2019). Разделили животных на высокоустойчивых к гипоксии, «время жизни» которых на высоте было более 240 сек (n=6), и низкоустойчивых, «время жизни» которых на высоте было менее 45 сек (n=8). Полученные данные по «времени жизни» сопоставили с показателями содержания в культуральной жидкости цитокина IL-1β. У животных, «время жизни» которых на «высоте» было менее 45 сек, содержание IL-1β во второй пробе при стимуляции по сравнению с первой пробой без стимуляции возрастало более чем в 2 раза. Их отнесли к низкоустойчивым к гипоксии.

Таблица 1.

Результаты иммуноферментного анализа уровня продукции IL-1β нестимулированными и стимулированными клетками крови крыс Вистар, Ме (25%,75%)

пг/мл Высокоустойчивые p^1-2 Низкоустойчивые p^3-4 p^1-3 p^2-4 Нестимулированные Стимулированные Нестимулированные Стимулированные IL-1β 47,0
(31,3-79,9)¹ 76,5
(47,0-86,9)² 0,26 31,3
(18,3-44,3)³ 86,9
(64,3-130,7)⁴ 0,005 0,27 0,60

Таким образом, предлагаемый способ определения лабораторных животных с низкой устойчивостью к гипоксии путем оценки спонтанной и стимулированной продукции клетками крови провоспалительного цитокина IL-1β позволяет при определении устойчивости к недостатку кислорода избежать тяжелого повреждающего организм гипоксического воздействия, а, значит, устранить его эффекты при проведении экспериментальных исследований.

Пример 2.

Крыса 1. Проводили отбор 1 мл крови из хвостовой вены в пробирку с 15 МЕ/мл гепарина («Славянская аптека», Россия) под эфирным наркозом. Первую пробу крови в объеме 100 мкл помещали в 24-луночный планшет, к ней добавляли 900 мкл полной ростовой среды DMEM с L-глутамином, 1 мг/мл глюкозы и 100 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия). 100 мкл второй пробы крови помещали в 24-луночный планшет, к ней добавляли 900 мкл полной ростовой среды DMEM с L-глутамином, 1 мг/мл глюкозы и 100 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия), ЛПС, конА и ФГА в конечных концентрациях 2 мкг, 4 мкг и 4 мкг, соответственно («Sigma», США). Образцы инкубировали в течение 24 ч при 5% СО₂ и 37ᵒС. Определяли содержание в культуральной жидкости IL-1β способом иммуноферментного анализа с использованием набора фирмы «Invitrogen» (США) в соответствии с протоколом производителя на приборе Anthos 2010 (Австрия). Определяли устойчивость к гипоксии в барокамере по «времени жизни» на высоте. «Время жизни» на высоте 11500 м составило 41 сек. Показатель IL-1β в первой пробе без стимуляции составил 31,3 пг/мл, во второй пробе после стимуляции – 139,2 пг/мл, то есть он увеличивался в 4,4 раза. Животное отнесено к низкоустойчивому к гипоксии.

Пример 3.

Крыса 2. Проводили отбор 1 мл крови из хвостовой вены в пробирку с 15 МЕ/мл гепарина («Славянская аптека», Россия) под эфирным наркозом. 100 мкл первой пробы крови помещали в 24-луночный планшет, к ней добавляли 900 мкл полной ростовой среды DMEM с L-глутамином, 1 мг/мл глюкозы и 100 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия). 100 мкл второй пробы крови помещали в 24-луночный планшет, к ней добавляли 900 мкл полной ростовой среды DMEM с L-глутамином, 1 мг/мл глюкозы и 100 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия), ЛПС, конА и ФГА в конечных концентрациях 2 мкг, 4 мкг и 4 мкг, соответственно («Sigma», США). Образцы инкубировали в течение 24 ч при 5% СО₂ и 37ᵒС. Определяли содержание в культуральной жидкости IL-1β способом иммуноферментного анализа с использованием набора фирмы «Invitrogen» (США) в соответствии с протоколом производителя на приборе Anthos 2010 (Австрия). Определяли устойчивость к гипоксии в барокамере по «времени жизни» на высоте. «Время жизни» на высоте 11500 м составило 41 сек. Показатель IL-1β в первой пробе без стимуляции составил 10,4 пг/мл, во второй пробе после стимуляции – 125,0 пг/мл, то есть он увеличивался в 12 раз. Животное отнесено к низкоустойчивому к гипоксии.

Таким образом, предлагаемый способ определения низкой устойчивости лабораторных животных к гипоксии путем оценки спонтанной продукции цитокинов клетками крови в условиях in vitro в отличие от существующих позволяет избежать тяжелого повреждающего гипоксического воздействия на организм.

Литература

Джалилова Д.Ш., Макарова О.В. Устойчивость к гипоксии и системный воспалительный ответ. – М.: Группа МДВ, 2022. – 200 с., ил., табл.

Каркищенко Н.Н. Биомедицинское (доклиническое) изучение антигипоксической активности лекарственных средств. Методические рекомендации. М.: ФМБА России, 2017. 98 с.

Кондашевская М.В., Артемьева К.А., Алексанкина В.В., Тихонова Н.Б., Болтовская М.Н. Индикаторы устойчивости к гипоксии, определяемые по клеточным элементам крови крыс. Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2021;57(6):475-483.

Лукьянова Л.Д., Германова Э.Л., Копаладзе Р.А. Закономерности формирования резистентности организма при разных режимах гипоксического прекондиционирования: роль гипоксического периода и реоксигенации. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009;147(4):380–384.

Лукьянова Л.Д., Кирова Ю.И. Влияние гипоксического прекондиционирования на свободнорадикальные процессы в тканях крыс с различной толерантностью к гипоксии. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011;151(3):263–268.

Dzhalilova D.Sh., Kosyreva A.M., Diatroptov M.E., Ponomarenko E.A., Tsvetkov I.S., Zolotova N.A., Mkhitarov V.A., Khochanskiy D.N., Makarova O.V. Dependence of the severity of the systemic inflammatory response on resistance to hypoxia in male Wistar rats. Journal of Inflammation Research. 2019;12:73–86. doi: 10.2147/JIR.S194581.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу определения низкой устойчивости к гипоксии лабораторных животных, представляющих собой крыс, по уровню спонтанной и стимулированной продукции IL-1β клетками крови. Указанный способ включает отбор проб крови из хвостовой вены и инкубацию первой пробы крови в течение 24 ч при 5% СО₂ и 37°С, добавление ко второй пробе липополисахарида, конканавалина А и фитогемагглютинина и инкубацию второй пробы в течение 24 ч при 5% СО₂ и 37°С с последующим определением в культуральной жидкости содержания IL-1β способом иммуноферментного анализа, по результатам которого животных относят к низкоустойчивым к гипоксии при увеличении уровня продукции IL-1β во второй пробе более чем в два раза по сравнению с первой. Настоящее изобретение обеспечивает высокую точность определения низкой устойчивости организма к гипоксии без непосредственного воздействия недостатка кислорода на организм животного. 1 табл., 3 пр.

Способ определения низкой устойчивости к гипоксии лабораторных животных, представляющих собой крыс, включающий отбор проб крови из хвостовой вены и инкубацию первой пробы крови в течение 24 ч при 5% СО₂ и 37°С, добавление ко второй пробе липополисахарида, конканавалина А и фитогемагглютинина и инкубацию второй пробы в течение 24 ч при 5% СО₂ и 37°С с последующим определением в культуральной жидкости содержания IL-1β способом иммуноферментного анализа, по результатам которого животных относят к низкоустойчивым к гипоксии при увеличении уровня продукции IL-1β во второй пробе более чем в два раза по сравнению с первой.