КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ β-МОДИФИКАЦИЯ 2,3-БИС-(ГИДРОКСИМЕТИЛ)ХИНОКСАЛИН-N,N'-ДИОКСИДА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕЁ ОСНОВЕ Российский патент 2015 года по МПК C07D241/52 A61K31/4985 A61P31/04 

Изобретение относится к органической химии и касается новой кристаллической модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида (диоксидина), названной авторами β-модификацией, способа ее получения и фармацевтической композиции на основе этой модификации, которая может быть использована в фармацевтической промышленности и медицине в качестве противомикробного, антибактериального и бактерицидного средства.

Известна кристаллическая модификация 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида (диоксидин - международное непатентованное название) и способ ее получения [А.С. СССР №207917, опубл. в Б.И. №3,19, 1968; Химико-фармацевтический журнал, т. 24, с. 80-84, 1990]. Эта модификация характеризуется: методом рентгенофазового анализа (РФА) -определенным набором дифракционных максимумов (d, Å), углов 2θ и их интенсивностью (I_отн, %) (табл. 1, фиг. 1), а также ИК - спектроскопическими исследованиями в области от 400 до 4000 см^-1 - определенными частотами характеристических полос поглощения [Фармакопейная Статья 42-2308-97] (фиг. 3). Эту модификацию получают гидролизом хиноксидина [2,3-бис-(ацетоксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида] в присутствии метанола и каталитического количества КОН с последующим выделением диоксидина из спиртового раствора.

Известная кристаллическая модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида представляет собой желто-зеленые кристаллы без запаха, горького вкуса, мало растворимые в воде, этаноле и хлороформе.

Сходство заявляемой кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида с известной модификацией диоксидина заключается в идентичности их химических составов.

Отличие заявляемой кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида от известной кристаллической модификации диоксидина заключается в различии их дифрактограмм рентгенофазового анализа: определенного набора межплоскостных расстояний (d, Å), углов 2θ, ⁰ и их интенсивностей (I_отн,=I_i/I_max×100, %).

Отличие способа получения заявляемой кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида от способа получения известной модификации диоксидина состоит в том, что выделение кристаллитов проводят из водного раствора диоксидина, имеющего температуру от 20°C до 100°C, замораживанием при скорости не менее 60 град/мин с последующей сублимационной сушкой в течение 22-27 часов.

Отличие заявляемой фармацевтической композиции, содержащей кристаллическую β-модификацию 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида, обладающей противомикробной, антибактериальной и бактерицидной активностью, от известной композиции [ФСП 42-0008-4523-05] состоит в том, что в качестве действующего вещества используют терапевтически эффективное количество не известной ранее кристаллической β-модификации диоксидина.

Целью изобретения является получение не известной ранее кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида, разработка способа ее получения и применение ее для приготовления фармацевтической композиции, обладающей противомикробной, антибактериальной и бактерицидной активностью.

Поставленная цель достигнута настоящим изобретением, а именно кристаллической β-модификацией 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида, характеризующейся следующим набором межплоскостных расстояний (d, Å) и соответствующих им интенсивностей (I_отн,=I_i/I_max×100, %): 8,740 - 100,0%; 8,026 - 94,2%; 7,546 - 22,3%; 6,899 - 57,8%; 6,681 - 24,4%; 6,288 - 50,9%; 5,978 - 43,4%; 5,723 - 9,7%; 5,371 - 11,5%; 5,177 - 17,1%; 4,952 - 29,5%; 4,498 - 19,4%; 4,345 - 23,9%; 4,072 - 25,3%; 4,013 - 17,6%; 3,905 - 20,5%; 3,678 - 28,4%; 3,526 - 12,7%; 3,440 - 30,0%; 3,358 - 99,3%; 3,304 - 67,6%; 3,206 - 31,6%; 3,145 - 18,3%; 2,981 - 11,4%; 2,890 - 12,9%; 2,793 - 9,7%; 2,677 - 7,5%; 2,613 - 9,8%; 2,535 - 8,9%; 2,470 - 8,1%; 2,370 - 9,9%; 2,287 - 7,5%; 2,244 - 9,0%; 2,079 - 7,1%; 1,963 - 6,7%; 1,703 - 7,0%.

Поставленная цель достигнута также разработкой способа получения новой, не известной ранее кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида, который состоит в том, что водный раствор диоксидина, имеющий температуру от 20°C до 100°C, замораживают при скорости не менее 60 град/мин с последующей сублимационной сушкой в течение 22-27 часов.

Кроме того, поставленная цель достигнута применением кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида для приготовления фармацевтической композиции, обладающей противомикробной, антибактериальной и бактерицидной активностью, содержащей терапевтически эффективное количество кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида, и, по крайней мере, один фармацевтически приемлемый растворитель.

Из патентной и научно-технической литературы не известны кристаллическая β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида, способ ее получения и применение ее для приготовления фармацевтической композиции, обладающей противомикробной, антибактериальной и бактерицидной активностью.

Авторами обнаружена новая кристаллическая β-модификация 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида, характеризующаяся определенным набором дифракционных максимумов (d, Å) и их интенсивностью (I_отн, %) (табл. 2, фиг. 2), предложены способ ее получения и применение ее для приготовления фармацевтической композиции, обладающей противомикробной, антибактериальной и бактерицидной активностью.

Заявляемая новая β-модификация 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида представляет собой легкий пушистый порошок от желтоватого до белого цвета, без запаха, горького вкуса, мало растворимый в воде, этаноле и хлороформе.

Для пояснения сущности заявляемого технического решения к описанию приложены следующие таблицы и фигуры.

Таблица 1. Углы 2Θ, межплоскостные расстояния (d, Å) и их интенсивности (I_отн, %) известной модификации диоксидина - исходной фармакопейной субстанции 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида.

Таблица 2. Углы 2Θ, межплоскостные расстояния (d, Å) и их интенсивности (I_отн., %) новой, не известной ранее кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида.

Таблица 3. Величины зон подавления роста тест микроорганизмов при использовании исходной субстанции диоксидина и полученной из нее новой, не известной ранее, кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида.

Таблица 4. Величины зон подавления роста тест микроорганизмов при использовании фармацевтических композиций на основе исходной субстанции диоксидина и полученной из нее новой, не известной ранее, кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида.

Фиг. 1. Дифрактограмма исходной фармакопейной субстанции диоксидина.

Фиг. 2. Типичная дифрактограмма новой, не известной ранее кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида.

Фиг. 3. ИК-спектр исходной фармакопейной субстанции диоксидина.

Фиг. 4. Типичный ИК-спектр не известной ранее кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида.

Фиг. 5. Термограмма исходной фармакопейной субстанции диоксидина.

Фиг. 6. Типичная термограмма новой, не известной ранее кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида.

Фиг. 7. ЯМР ¹H - спектр исходной фармакопейной субстанции диоксидина.

Фиг. 8. ЯМР ¹H - спектр новой, не известной ранее кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида.

Для идентификации полученного вещества был проведен комплекс физико-химических методов анализа.

Первоначально, методами ядерного магнитного резонанса (ЯМР-¹H) и газовой хроматографии была установлена идентичность химических формул исходной субстанции диоксидина по ФС 42-2308-97 и новой кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида.

Определение химических сдвигов исходного и полученного вещества было проведено в его насыщенном растворе в дейтерированной воде (D₂O) на ЯМР-спектрометре высокого разрешения VXR-400 фирмы "VARIAN" (США). Полученные данные приведены на фиг. 7 и 8. Сравнение результатов, представленных на фиг. 7 (исходная субстанция диоксидина), с данными, приведенными на фиг. 8 (новая кристаллическая β-модификация 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида), показывает, что ЯМР - ¹H - спектры исходного и полученного авторами вещества идентичны, т.е. полученное вещество является 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксидом.

Хроматографическую подвижность исходной субстанции диоксидина и полученной из него кристаллической β-модификации определяли методом газовой хроматографии на газовом хроматографе «КристаллЛюкс - 4000» (хроматографическая колонка - набивная, фаза - SE - 30, длина 3 м; температура испарителя - 220°C; температура детектора - 245°C; газ-носитель - азот, скорость потока газа-носителя - 30 см³/мин). Для хроматографирования образцов использовали насыщенный спиртовой раствор исходного диоксидина и новой кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида.

Оказалось, что времена удерживания 3,96 мин для исходной субстанции и 3,95 мин для полученного из нее вещества, а также хроматографические индексы удерживания Ковача j=1218 для исходной субстанции и j=1218 для полученного из нее модификации одинаковы. Это свидетельствует о том, что химические составы исходной субстанции диоксидина и полученного из него вещества идентичны друг другу и отвечают составу 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида. Кроме того, на хроматограммах исходной субстанции и полученного из него вещества, кроме хроматографических пиков растворителя и диоксидина, других пиков, которые показывают наличие примесей, на хроматограммах не обнаружено.

Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что при получении кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида из исходной субстанции диоксидина распада вещества не происходит. Экспериментальные результаты ядерного магнитного резонанса (ЯМР-¹H) и газовой хроматографии однозначно свидетельствуют о том, что полученное из исходного фармакопейного диоксидина вещество является 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксидом.

Для подтверждения того, что полученное вещество является новой кристаллической модификацией 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида, названной авторами β-модификацией, были проведены рентгенофазовый анализ (РФА), ИК-спектроскопические и термоаналитические исследования.

Рентгенофазовый анализ (РФА) исходной субстанции диоксидина и полученного из нее вещества проводили на дифрактометре Rigaku D/MAX-2500 (Rigaku, Япония) на CuKα излучении (λ=1,54056 Å). Полученные результаты для исходной субстанции приведены в табл. 1 и на фиг. 1, а для полученного из него вещества - в табл. 2 и на фиг. 2. Сравнение полученных данных, представленных в табл. 1 и табл. 2, а также на фиг. 1 и фиг. 2 свидетельствует о том, что полученный порошок диоксидина является новой, не известной ранее, кристаллической β-модификацией 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида.

ИК-спектры исходной субстанции диоксидина и полученной из нее кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида получали на ИК-фурье-спектрометре марки "Икар" опытного производства ФИАН РАН. Регистрацию ИК спектров порошкообразных образцов осуществляли по стандартной методике в прессованных таблетках бромистого калия. Содержание диоксидина по массе в смеси с бромистым калием составляло 0,6 мас. %, толщина таблетки 0,5 мм. Полученные результаты приведены на фиг. 3 и фиг. 4. Видно, что в диапазоне 800-1500 см^-1 спектры различаются.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что использование ИК-спектроскопии позволяет различать исходную субстанцию и полученную из нее новую кристаллическую β-модификацию 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида и позволяют идентифицировать новую модификацию диоксидина.

Термоаналитические исследования проводили на термоанализаторе STA 449 С Jupiter (NETZSCH) в токе аргона при повышении температуры 10 град/мин. В качестве держателей образцов использовали алюминиевые кюветы. Навески проб составляли 3,9-6,0 мг. Полученные данные приведены на фиг. 5 и фиг. 6. Видно, что кривые ДСК исходной субстанции диоксидина (фиг. 5) и полученной из него новой кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида (фиг. 6) различаются положением и величиной: эндотермических эффектов плавления, а также экзотермических эффектов термического разложения. Для исходной субстанции диоксидина плавление происходит при температуре (175,5±0,5)°C с тепловым эффектом - (99,8±0,4) Дж/г, а термолиз протекает при температуре (199,2±0,5)°C с тепловым эффектом (1135±4) Дж/г. Для новой кристаллической β-модификации диоксидина плавление происходит при температуре (171,7±0,5)°C с тепловым эффектом - (38,8±0,4) Дж/г, а термолиз протекает при температуре (186,0±0,5)°C с тепловым эффектом (1243±4) Дж/г.

Таким образом, проведенные термоаналитические эксперименты показали, что полученная новая кристаллическая β-модификация диоксидина более активна к процессам плавления и термического разложения. Кроме того, термоаналитические исследования позволяют различать исходную субстанцию диоксидина и полученную из нее новую кристаллическую β-модификацию 2,3-бис-(гидроксиметил) хиноксалин-N,N′-диоксида.

Определение активности исходной субстанции диоксидина и полученной из нее новой кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида осуществляли по изучению устойчивости микроорганизмов диско-диффузионным методом [Определение чувствительности к антибактериальным препаратам. Под ред. Онищенко Г.Г. «Клиническая микробиология, антимикробная химиотерапия», 2004 г., том 6, №4, с. 306-359]. В качестве тест культур использовали бактерии, полученные из коллекции культур кафедры микробиологии, биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова: Escherichia coli 52 и Mycobacterium cyaneum 98. Эксперименты проводили в стерильных чашках Петри, содержащих по 20 мл агаризованной (ПД - агар) питательной среды (толщина слоя 4 мм), выдержанной в течение суток. Приготовление бактериальной суспензии исследуемого тест микроорганизма и посев ею среды проводили следующим образом. Одну или две полные микробиологические петли с культурой вносили в 5 мл стерильной дистиллированной воды, взбалтывали полученную суспензию в течение 30 секунд и определяли ее концентрацию по оптической плотности [спектрофотометр ПЭ - 530 ВИ (РФ)] при λ=625 нм, сравнивали полученную величину с оптической плотностью приготовленного предварительно 0,5 стандарта МакФарланда (эквивалентна 1,5×10⁸ КОЕ/мл). После этого 100 мкл суспензии культуры помещали на поверхность среды в чашки Петри, тщательно растирали стерильным шпателем, через 15 мин в них вносили исходную субстанцию диоксидина или, полученную из нее, новую кристаллическую β-модификацию 2,3-бис-(гидроксиметил) хиноксалин-N,N′-диоксида в виде дисков диаметром (6,00±0,02) мм, высотой (3,11±0,06) мм и массой (96±2) мг, помещали в термостат и инкубировали при 30°C. Для получения надежных результатов в параллельных сериях опытов использовали не менее 5-ти дисков. Контроль результатов роста тест культур и измерение зон подавления их роста проводили через 16, 24 и 48 часов инкубации. Диаметр зон подавления роста (ЗПР) измеряли линейкой в 3-х направлениях для каждого диска, с точностью до 0,5 мм. Полученные в микробиологических экспериментах результаты приведены в табл. 3. Видно, что зоны подавления роста тест культур новой кристаллической β-модификацией 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида больше при всех временах инкубации, чем при использовании дисков из исходной субстанции диоксидина и, следовательно, полученная авторами новая модификация более активна к процессам подавления роста микроорганизмов, то есть обладает более выраженным противомикробным, антибактериальным и бактерицидным действием.

Таким образом, экспериментальные результаты рентгенофазового анализа, ИК-спектроскопии, дифференциальной сканирующей калориметрии и микробиологических опытов однозначно свидетельствуют о том, что полученное вещество является новой, не известной ранее, кристаллической β-модификацией 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида. Она характеризуется отличными от других набором межплоскостных расстояний (d, Å) и соответствующих им интенсивностей (I_отн, %): 8,740 - 100,0%; 8,026 - 94,2%; 7,546 - 22,3%; 6,899 - 57,8%; 6,681 - 24,4%; 6,288 - 50,9%; 5,978 - 43,4%; 5,723 - 9,7%; 5,371 - 11,5%; 5,177 - 17,1%; 4,952 - 29,5%; 4,498 - 19,4%; 4,345 - 23,9%; 4,072 - 25,3%; 4,013 - 17,6%; 3,905 - 20,5%; 3,678 - 28,4%; 3,526 - 12,7%; 3,440 - 30,0%; 3,358 - 99,3%; 3,304 - 67,6%; 3,206 - 31,6%; 3,145 - 18,3%; 2,981 - 11,4%; 2,890 - 12,9%; 2,793 - 9,7%; 2,677 - 7,5%; 2,613 - 9,8%; 2,535 - 8,9%; 2,470 - 8,1%; 2,370 - 9,9%; 2,287 - 7,5%; 2,244 - 9,0%; 2,079 - 7,1%; 1,963 - 6,7%; 1,703 - 7,0%, а также определенными ПК - спектрами в области от 400 до 4000 см^-1 и, конкретно, в диапазоне 800 - 1500 см^-1, определенными значениями эндотермического эффекта плавления, равного (38,8±0,4) Дж/г при температуре (171,7±0,5)°C, экзотермического эффекта термического разложения, равного (1243±4) Дж/г при температуре (186,0±0,5)°C. Кроме того, новая кристаллическая β-модификация 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида отличается повышенной противомикробной, антибактериальной и бактерицидной активностью по сравнению с исходной субстанцией диоксидина.

Способ получения новой кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида заключается в том, что выделение кристаллитов проводят из водного раствора диоксидина, имеющего температуру от 20°C до 100°C, замораживают при скорости не менее 60 град/мин с последующей сублимационной сушкой в течение 22-27 часов.

Отличиями предложенного способа получения заявляемой кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида являются: температура водного раствора диоксидина от 20°C до 100°C, скорость замораживания не менее 60 град/мин и время сублимационной сушки в течение 22-27 часов.

Приготовление раствора исходного диоксидина при повышенных температурах было использовано для ускорения процесса его растворения.

Уменьшение температуры водного раствора диоксидина ниже комнатной температуры (20°C) не целесообразно поскольку требует дополнительных затрат энергии на охлаждение системы.

Увеличение температуры водного раствора диоксидина выше 100°C также не целесообразно из-за необходимости применения специального оборудования.

При уменьшении скорости замораживания менее 60 град/мин скорость криокристаллизации раствора диоксидина уменьшается и приближается к равновесному процессу. Это приводит к частичному получению уже известной кристаллической модификации. Новую кристаллическую β-модификацию 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида в чистом виде получить не удается.

Уменьшение времени сублимационной сушки меньше 22 ч приводит к получению невысохшего продукта: «порошок диоксидина - его замороженный раствор». Система при комнатной температуре плавится, порошок частично растворяется и перекристаллизовывается, частично образуя известную кристаллическую модификацию. Новую кристаллическую β-модификацию 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида в чистом виде получить не удается.

Увеличение времени сублимационной сушки больше 27 ч нецелесообразно, так как не приводит к увеличению выхода целевого продукта - новой кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида и лишь удорожает процесс.

Возможность осуществления предлагаемого изобретения иллюстрируется следующими примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. 1,00 г диоксидина растворяют при комнатной температуре в 99,00 г дистиллированной воды при интенсивном перемешивании. Полученный раствор при комнатной температуре (20°C) наливают в поддон из нержавеющей стали и замораживают его со скоростью 60 град/мин погружением дна поддона в смесь «ацетон - сухой лед» (Т=-78°C). Полученный замороженный продукт на поддоне переносят в сублимационную камеру и подвергают сублимационной сушке при температурах: на конденсаторе -50…-55°C; на продукте -196…+40°C и остаточном давлении в камере (8-6)·10^-2 Торр в течение 22 ч. Выход продукта составил 0,98 г (98 масс. %). По данным РФА полученное вещество является новой кристаллической β-модификацией 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида. Оно характеризуется типичной дифрактограммой, представленной на фиг. 2 и набором межплоскостных расстояний и их интенсивностями, совпадающих с соответствующими значениями для новой кристаллической β-модификации диоксидина, представленными в табл. 2. По результатам ИК - спектроскопии полученный порошок характеризуется ИК - спектрами, присущими новой кристаллической β-модификации диоксидина (фиг. 4). Термоаналитические исследования полученного вещества показали, что эндотермический эффект плавления равен (38,7±0,4) Дж/г при температуре (171,8±0,5)°C, а экзотермический эффект термического разложения равен (1244±4) Дж/г при температуре (186,1±0,5)°C, что совпадает с величинами эндотермического и экзотермического эффектов и их температурами, характерными для новой кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида (фиг. 6).

Пример 2. 8,00 г диоксидина растворяют при температуре 100°C в 192,00 г дистиллированной воды при интенсивном перемешивании и замораживают его со скоростью (3-4)×10² град/мин вливанием раствора в предварительно охлажденный и наполненный жидким азотом (Т_кип=-196°C) поддон из нержавеющей стали. Полученный замороженный продукт на поддоне переносят в сублимационную камеру и подвергают сублимационной сушке при температурах: на конденсаторе -50…-55°C; на продукте - 196…+30°C, и остаточном давлении в камере (4-6)·10^-2 Торр в течение 27 ч. Выход продукта составил 7,78 г (97,2 масс. %). По данным РФА полученное вещество является новой кристаллической β-модификацией 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида. Оно характеризуется типичной дифрактограммой, представленной на фиг. 2, и набором межплоскостных расстояний и их интенсивностями, совпадающих с соответствующими значениями для новой β-модификации диоксидина, представленными в табл. 2. По результатам ИК-спектроскопии полученный порошок характеризуется ИК-спектрами, присущими новой кристаллической β-модификации диоксидина (фиг. 4). Термоаналитические исследования полученного вещества показали, что эндотермический эффект плавления равен (38,8±0,4) Дж/г при температуре (171,7±0,5)°C, а экзотермический эффект термического разложения равен (1243±4) Дж/г при температуре (185,9±0,5)°C, что совпадает с величинами эндотермического и экзотермического эффектов и их температурами, характерными для новой кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида (фиг. 6).

Пример 3. 6,00 г диоксидина растворяют в 294,00 г дистиллированной воды при интенсивном перемешивании при температуре 60°C и замораживают его со скоростью 2×10³ град/мин распылением раствора пневматической форсункой при избыточном давлении 0,7 кг/см² в реактор, наполненный жидким азотом (Т_кип.=-196°C). Полученный замороженный продукт на поддоне переносят в сублимационную камеру и подвергают сублимационной сушке при температурах: на конденсаторе -50…-55°C; на продукте -196…+50°C, и остаточном давлении в камере (5-6)·10^-2 Торр в течение 25 ч. Выход продукта составил 5,95 г (99,2 мас. %). По данным РФА полученное вещество является новой кристаллической β-модификацией 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида. Оно характеризуется типичной дифрактограммой, представленной на фиг. 2, и набором межплоскостных расстояний и их интенсивностями, совпадающих с соответствующими значениями для новой β-модификации диоксидина, представленными в табл. 2. По результатам ПК-спектроскопии полученный порошок характеризуется ПК-спектрами, присущими новой кристаллической β-модификации диоксидина (фиг. 4). Термоаналитические исследования полученного вещества показали, что эндотермический эффект плавления равен (38,8±0,4) Дж/г при температуре (171,7±0,5)°C, а экзотермический эффект термического разложения равен (1243±4) Дж/г при температуре (186,0±0,5)°C, что совпадает с величинами эндотермического и экзотермического эффектов и их температурами, характерными для новой кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида (фиг. 6).

Пример 4. Фармацевтическая композиция. Для приготовления 100,0 г композиции: «Диоксидин раствор для инъекций 0,5% и 1%» (ФСП 420036145701), включающей в качестве действующего вещества кристаллическую β-модификацию 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида и вспомогательные вещества в соотношении (мас. %):

Диоксидин 0,5 или 1,0 Вода для инъекций 99,5 или 99,0

(ФС 42-2620-97)

1,00 г новой, не известной ранее, кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида растворяют в 99,00 г воды для инъекций (ФС 42-2620-97) при 40°C. Полученный раствор охлаждали до комнатной температуры и в дальнейшем использовали в микробиологических опытах.

Определение активности фармацевтических композиций, включающих исходную субстанцию диоксидина или полученную из нее новую кристаллическую β-модификацию 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида, осуществляли по изучению устойчивости микроорганизмов диско-диффузионным методом [Определение чувствительности к антибактериальным препаратам. Под ред. Онищенко Г.Г. «Клиническая микробиология, антимикробная химиотерапия», 2004 г., том 6, №4, с. 306-359]. В качестве тест-культур использовали бактерии, полученные из коллекции культур кафедры микробиологии, биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова: Escherichia coli 52. Эксперименты проводили в стерильных чашках Петри, содержащих по 20 мл агаризованной (ПД - агар) питательной среды (толщина слоя 4 мм), выдержанной в течение суток. Приготовление бактериальной суспензии исследуемого тест микроорганизма и посев ею среды проводили следующим образом. Одну или две полные микробиологические петли с культурой вносили в 5 мл стерильной дистиллированной воды, взбалтывали полученную суспензию в течение 30 секунд и определяли ее концентрацию, по оптической плотности [спектрофотометр ПЭ - 530ВИ (РФ)] при λ=625 нм и сравнивали полученную величину с оптической плотностью приготовленного предварительно 0,5 стандарта МакФарланда (эквивалентна 1,5×10⁸ КОЕ/мл). После этого 100 мкл суспензии культуры помещали на поверхность среды в чашки Петри, тщательно растирали стерильным шпателем, через 15 мин в них вносили исходный диоксидин или полученную из него новую кристаллическую β-модификацию 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида в виде дисков диаметром (6,0±0,1) мм из стерильной фильтровальной бумаги, пропитанных соответствующими растворами с концентрацией 2 мг/мл (0,2 мас. %), помещали в термостат и инкубировали при 30°C. Для получения надежных результатов в параллельных сериях опытов использовали не менее 5-ти дисков. Контроль результатов роста культур и измерение зон подавления их роста проводили через 24 и 40 часов инкубации. Диаметр зон подавления роста измеряли линейкой в 3 направлениях для каждого диска с точностью до 0,5 мм. Полученные в микробиологических экспериментах результаты приведены в табл. 4. Видно, что зоны подавления роста культур дисками, пропитанными фармацевтической композицией, содержащей новую кристаллическую β-модификацию 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида, больше, чем при использовании дисков, пропитанных фармацевтической композицией, содержащей исходную субстанцию диоксидина и, следовательно, полученная авторами новая β-модификация более активна к процессам подавления роста микроорганизмов, то есть обладает более выраженным противомикробным, антибактериальным и бактерицидным действием при использовании ее в фармацевтической композиции.

Таким образом, авторами обнаружена новая кристаллическая β-модификация 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида, предложены способ ее получения и применение ее для приготовления фармацевтической композиции, обладающей противомикробной, антибактериальной и бактерицидной активностью.

Полученная кристаллическая β-модификация 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида характеризуется отличным от исходной субстанции диоксидина набором межплоскостных расстояний (d, Å) и соответствующих им интенсивностей (I_отн, %): 8,740 - 100,0%; 8,026 - 94,2%; 7,546 - 22,3%; 6,899 - 57,8%; 6,681 - 24,4%; 6,288 - 50,9%; 5,978 - 43,4%; 5,723 - 9,7%; 5,371 - 11,5%; 5,177 - 17,1%; 4,952 - 29,5%; 4,498 - 19,4%; 4,345 - 23,9%; 4,072 - 25,3%; 4,013 - 17,6%; 3,905 - 20,5%; 3,678 - 28,4%; 3,526 - 12,7%; 3,440 - 30,0%; 3,358 - 99,3%; 3,304 - 67,6%; 3,206 - 31,6%; 3,145 - 18,3%; 2,981 - 11,4%; 2,890 - 12,9%; 2,793 - 9,7%; 2,677 - 7,5%; 2,613 - 9,8%; 2,535 - 8,9%; 2,470 - 8,1%; 2,370 - 9,9%; 2,287 - 7,5%; 2,244 - 9,0%; 2,079 - 7,1%; 1,963 - 6,7%; 1,703 - 7,0%.

Кроме того, новая кристаллическая β-модификация 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида отличается повышенной противомикробной, антибактериальной и бактерицидной активностью как в виде спрессованного порошка, так и в составе фармацевтической композиции по сравнению с действием исходной субстанцией диоксидина.

Из вышеизложенного можно сделать вывод о том, что заявляемая кристаллическая β-модификация 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида, способ ее получения и применение ее для приготовления фармацевтической композиции, обладающей противомикробной, антибактериальной и бактерицидной активностью, являются новыми и удовлетворяют критериям «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Таблица 1 № п/п Угол 2Θ d, Å I_отн., % № п/п Угол 2Θ d, Å I_отн, % 1 10,20 8,638 100,0 13 26,32 3,373 7,3 2 11,16 7,897 21,8 14 26,92 3,299 24,8 3 11,74 7,508 68,4 15 27,50 3,231 14,9 4 12,88 6,846 12,2 16 27,84 3,192 6,4 5 14,14 6,239 6,2 17 28,92 3,075 5,5 6 14,80 5,962 4,6 18 29,74 2,992 5,1 7 17,62 5,013 6,5 19 30,90 2,882 5,0 8 19,70 4,489 12,7 20 33,28 2,682 4,9 9 20,40 4,336 7,1 21 36,36 2,461 5,6 10 22,22 3,985 5,5 22 40,06 2,242 16,8 11 23,62 3,752 11,5 23 40,98 2,194 5,8 12 25,92 3,424 10,3        

Таблица 2 № п/п Угол 2Θ d, Å I_отн, % № п/п Угол 2Θ d, Å I_отн, % 1 10,08 8,740 100,0 19 25,8 3,440 30,0 2 10,98 8,026 94,2 20 26,44 3,358 99,3 3 11,68 7,546 22,3 21 26,88 3,304 67,6 4 12,78 6,899 57,8 22 27,72 3,206 31,6 5 13,20 6,681 24,4 23 28,26 3,145 18,3 6 14,06 6,288 50,9 24 29,86 2,981 11,4 7 14,76 5,978 43,4 25 30,82 2,890 12,9 8 15,42 5,723 9,7 26 31,92 2,793 9,7 9 16,44 5,371 11,5 27 33,34 2,677 7,5 10 17,06 5,177 17,1 28 34,18 2,613 9,8 11 17,84 4,952 29,5 29 35,26 2,535 8,9 12 19,66 4,498 19,4 30 36,22 2,470 8,1 13 20,36 4,345 23,9 31 37,82 2,370 9,9 14 21,74 4,072 25,3 32 39,24 2,287 7,5 15 22,06 4,013 17,6 33 40,02 2,244 9,0 16 22,68 3,905 20,5 34 43,36 2,079 7,1 17 24,10 3,678 28,4 35 46,06 1,963 6,7 18 25,16 3,526 12,7 36 53,62 1,703 7,0

Таблица 3 Модификация диоксидина Время инкубирования, час Escherichia coli 52 Mycobacterium cyaneum 98 Средний диаметр ЗПР, мм Ошибка определения, мм Средний диаметр ЗПР, мм Ошибка определения, мм Исходная субстанция диоксидина 16 34,0 ±1,0 26,3 ±0,6 Новая β-модификация диоксидина 38,3 ±0,6 36,3 ±0,6 Исходная субстанция диоксидина 24 32,7 ±1,2 26,0 ±1,2 Новая β-модификация диоксидина 37,7 ±0,6 36,3 ±0,6 Исходная субстанция диоксидина 48 32,7 ±0,6 26,0 ±0,6 Новая β-модификация диоксидина 37,7 ±1,5 36,0 ±1,0

Таблица 4 Модификация диоксидина Время инкубирования, час Escherichia coli 52 Средний диаметр ЗПР, мм Ошибка определения, мм Исходная субстанция диоксидина 24 4,6 ±0,5 Новая β-модификация диоксидина 7,2 ±0,8 Исходная субстанция диоксидина 40 3,8 ±0,6 Новая β-модификация диоксидина 5,7 ±0,6

Изобретение относится к кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида (диоксидина), способу ее получения и ее применению для приготовления фармацевтической композиции, обладающей противомикробным, антибактериальным и бактерицидным средством. Кристаллическая β-модификация диоксидина обладает повышенной противомикробной, антибактериальной и бактерицидной активностью по сравнению с действием исходной субстанции диоксидина. 3 н.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл., 4 пр.

1. Кристаллическая β-модификация 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N-диоксида, характеризующаяся следующим набором межплоскостных расстояний (d, Å) и соответствующих им интенсивностей (I_отн, %): 8,740 - 100,0%; 8,026 - 94,2%; 7,546 - 22,3%; 6,899 - 57,8%; 6,681 - 24,4%; 6,288 - 50,9%; 5,978 - 43,4%; 5,723 - 9,7%; 5,371 - 11,5%; 5,177 - 17,1%; 4,952 - 29,5%; 4,498 - 19,4%; 4,345 - 23,9%; 4,072 - 25,3%; 4,013 - 17,6%; 3,905 - 20,5%; 3,678 - 28,4%; 3,526 - 12,7%; 3,440 - 30,0%; 3,358 - 99,3%; 3,304 - 67,6%; 3,206 - 31,6%; 3,145 - 18,3%; 2,981 - 11,4%; 2,890 - 12,9%; 2,793 - 9,7%; 2,677 - 7,5%; 2,613 - 9,8%; 2,535 - 8,9%; 2,470 - 8,1%; 2,370 -9,9%; 2,287 - 7,5%; 2,244 - 9,0%; 2,079 - 7,1%; 1,963 - 6,7%; 1,703 - 7,0%.

2. Способ получения кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида по п. 1, отличающийся тем, что выделение кристаллитов проводят из водного раствора диоксидина, имеющего температуру от 20°С до 100°С, замораживанием при скорости не менее 60 град/мин с последующей сублимационной сушкой в течение 22-27 часов.

3. Применение кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида по п. 1 для приготовления фармацевтической композиции, обладающей противомикробной, антибактериальной и бактерицидной активностью, содержащей терапевтически эффективное количество кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N′-диоксида по п. 1 и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый растворитель.