РЕАССОРТАНТНЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/СЕРЕБРИСТАЯ ЧАЙКА/САРМА/06/887 (H6N1) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ Российский патент 2017 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики гриппозной инфекции, вызванной эпидемическим штаммом вируса гриппа. Профилактику осуществляют интраназальной живой гриппозной вакциной (ЖГВ) из штамма вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А - A/17/серебристая чайка/Сарма/06/887(Н6N1).

Известен вакцинный штамм A(H6N1) Teal НК 97/АА [K.R. Talaat, Vaccine. - Apr 12, 2011; 29(17): 3144-3148], отличающийся от настоящего изобретения тем, что подготовлен на основе американского донора аттенуации А/Энн Ар-бор/6/60(H2N2) с использованием вируса птичьего гриппа, выделенного в 1997 г. В заявляемом изобретении для получения реассортантного вакцинного штамма подтипа A(H6N1) мы использовали холодоадаптированный (ХА) донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2N2), который применяется для подготовки вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины (ЖГВ) для иммунизации взрослых и детей от 3 лет [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. - Л., 1986. - С. 66-83].

Преимуществом донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) является более высокий уровень генетической стабильности, обусловленный меньшим числом замещений в полимеразных генах по сравнению с донором Арбор/6/60(H2N2) [A.I. Klimov et al. Proc. Options for the Control of Influenza IV, Excerpta Medica, 2001, p. 951-954]. Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) является хорошо охарактеризованным и документировано безвредным для людей, включая детей раннего возраста [.Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. - Л., 1986. - С. 66-83]. На основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) получены реассортантные вакцинные штаммы, содержащие поверхностные антигены апатогенных вирусов гриппа птиц, таких как A(H5N2), A(H7N3), A(H9N2), но они неспособны защитить человека от инфекции в случае появления в циркуляции вируса гриппа подтипа A(H6N1). В качестве источника поверхностных антигенов для вакцинного кандидата подтипа A(H6N1) мы использовали апатогенный птичий вирус А/Серебристая чайка/Сарма/51с/2006(H6N1), выделенный в 2006 г., имеющий признак апатогенности, заключающийся в отсутствии полиосновной аминокислотной вставки в сайте протеолитического расщепления (см. фиг.), где представлен сайт протеолитического расщепления апатогенных птичьих вирусов подтипа Н6 (фрагмент А) в сравнении с вирулентными вирусами подтипа Н5 (фрагмент В).

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение нового реассортантного вакцинного штамма A/17/серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1), предназначенного для профилактики гриппа A(H6N1) в случае появления в циркуляции вирусов гриппа соответствующего подтипа.

Использование в качестве источника поверхностных антигенов апатогенного вируса гриппа птиц А/Серебристая чайка/Сарма/51с/2006 (H6N1) и его реассортация с ХА штаммом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) в качестве донора аттенуации привели к получению вакцинного кандидата новой антигенной разновидности A(H6N1).

В настоящее время вакцинные штаммы ЖГВ получают методом реассортации современных эпидемических вирусов с холодоадаптированными (ХА) донорскими штаммами, в результате чего образуются реассортанты, имеющие смешанный геном. Гены, кодирующие гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального эпидемического штамма, а шесть генов внутренних и неструктурных белков (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS) - от безвредного XA донора аттенуации.

Для определения инфекционной активности реассортанта был сделан ряд падающих десятикратных разведений исследуемого вирусного материала, зараженные РКЭ инкубировали при оптимальной (34°C), пониженной до 25-26°C или повышенной до 39-40°C температуре. К числу температурочувствительных (имеющих ts фенотип) относили вирусы, которые репродуцировались при повышенной температуре по сравнению с оптимальной с разностью в 5,0-6,0 lg ЭИД₅₀ и более. Если разница титров при оптимальной и пониженной до 26°C температуре не превышала 3,0-3,5 lg ЭИД₅₀, вирусы относили к ХА группе. При изучении репродукции штамма A/17/серебристая чайка/Сарма/06/887(Н6N1) в куриных эмбрионах было показано, что вакцинный кандидат, подобно донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2), проявляет высокий уровень репродукции при пониженной до 26°C и плохо репродуцируется при повышенной до 39,0°C температуре.

Реассортантный вакцинный штамм A/17/серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1) был получен методом классической генетической реассортации апатогенного вируса птичьего гриппа вируса А/Серебристая чайка/Сарма/51с/2006 (H6N1) и ХА донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) с последующей селекцией при пониженной до 26°C температуре в присутствии иммунной антисыворотки к штамму А/Ленинград/134/17/57(H2N2).

Анализ генома полученного вакцинного кандидата был выполнен методом HRM-анализа (анализ кривых плавления продуктов ПЦР высокого разрешения) с подтверждением рестрикционным анализом ДНК-копий сегментов РНК, полученных с помощью обратно-транскриптазной полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР) [Klimov A.I., J. Virol. Method. - 1995. - №55. - P. 445-446].

Принадлежность гемагглютинина родительскому вирусу А/Серебристая чайка/Сарма/51 c/2006(H6N1) птичьего гриппа подтверждена в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). РТГА проводили в 96-луночных планшетах для иммунологических реакций, в которые вносили последовательные падающие разведения иммунных антисывороток с шагом 2, соответствующие антигены в стандартной дозе (4 агглютинирующих единицы) и 1% взвесь куриных эритроцитов. Титр антигемагглютинирующих антител выражали как величину, обратную наибольшему разведению сыворотки, при котором наблюдалось торможение агглютинации. Было установлено, что вакцинный штамм A/17/серебристая чайка/Сарма/06/887(H6N1) антигенно идентичен родительскому вирусу птичьего гриппа.

Принадлежность нейраминидазы N1 вакцинного кандидата определяли в ОТ-ПЦР с помощью специфичных праймеров: H6N1_Sarma_NA_F101 и H6N1_Sarma_NA_R605

Таким образом было подтверждено, что реассортант А/17/серебристая чайка/Сарма/06/887(Н6N1) имеет формулу генома 6:2.

Вакцинный штамм А/17/серебристая чайка/Сарма/06/887(Н6N1) проявляет свойства температурочувствительности и холодовой адаптации, характерные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2).

Пример 1. При культивировании в куриных эмбрионах было показано, что вакцинный штамм А/17/серебристая чайка/Сарма/06/887(H6N1) плохо репродуцируется при повышенной до 39°C (разность титров при оптимальной температуре 33°C и 39°C составила 7,0 lgЭИД₅₀/мл), то есть является температурочувствительным, подобно аттенуированному донорскому штамму А/Ленинград/134/17/57(H2N2). Так же, как и донорский штамм А/Ленинград/134/17/57(H2N2), вакцинный кандидат А/17/серебристая чайка/Сарма/06/887(Н6N1) хорошо репродуцировался при пониженной до +26°C температуре (разница в показателях репродукции при пониженной и оптимальной температуре не превышала 3,0 lg ЭИД₅₀/), то есть был холодоадаптированным (Табл. 1) в отличие от родительского штамма птичьего гриппа А/Серебристая чайка/Сарма/51c/2006(H6N1).

Вакцинный штамм А/17/серебристая чайка/Сарма/06/887(Н6N1) является аттенуированным для мышей и вызывает иммунный ответ при однократном интраназальном введении.

Пример 2. При интраназальном введении мышам в дозе 10⁶ ЭИД₅₀ вакцинный штамм А/17/серебристая чайка/Сарма/06/887(H6N1) выделялся из легких в среднем титре, не превышающем уровня репродукции ХА донорского штамма (табл. 2). В то же время вакцинный штамм А/17/серебристая чай-ка/Сарма/06/887(H6N1) хорошо репродуцировался в носовых ходах мышей, где температура существенно ниже, чем в легких, и вызывал системный иммунный ответ, определяемый по уровню антигемагглютинирующих антител в сыворотках крови в среднегеометрическом титре 17,4 через 3 недели после однократного введения, что соответствовало показателям иммуногенности родительского вируса птичьего гриппа А/Серебристая чайка/Сарма/51с/2006(H6N1).

Таким образом, представленный вакцинный штамм А/17/серебристая чайка/Сарма/06/887(H6N1) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: с одной стороны - антигенной специфичностью гемагглютинина родительского вируса А/Серебристая чайка/Сарма/51с/2006(H6N1); с другой стороны - температурочувствительностью, холодоадаптированностью, аттенуацией для лабораторных животных, что коррелирует с документированной безвредностью для детей, характерной для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2). Структура генома вакцинного кандидата А/17/серебристая чайка/Сарма/06/887(Н6N1) является оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов - (6:2).

Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ Федерального научно-исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ под №2807.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛУЧЕННОГО РЕАССОРТАНТНОГО ШТАММА

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33°C в течение 48 часов - 9,2 lg ЭИД₅₀/мл.

Гемагглютинирующая активность - 150 ГАЕ/50 мкл.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз). Характеристики штамма отражены в паспорте на вакцинный штамм А/17/серебристая чайка/Сарма/06/887(H6N1).

ПАСПОРТ ШТАММА

вируса гриппа А/17/серебристая чайка/Сарма/06/887(H6N1)

1. Название вируса, штамма (семейство, таксономическая и антигенная группа):

семейство Orthomyxoviridae, род Influenzavirus А, подтип H6N1, штамм А/17/серебристая чайка/Сарма/06/887(H6N1)

2. Выделен (год, место выделения, от кого и из какого материала):

штамм получен в апреле 2014 года методом классической генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах. Характеристика родительских вирусов:

а) вирус гриппа птиц - А/серебристая чайка/Сарма/51с/06(H6N1);

б) донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2)

3. Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа

4. Генетические признаки

Состав генома: НА и NA от вируса гриппа птиц А/серебристая чайка/Сарма/51c/06(H6N1); 6 сегментов РНК, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS), от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) (формула генома 6:2).

5. Антигенные свойства

Антигенно идентичен гемагглютинину вируса А/серебристая чайка/Сарма/51с/06 (H6N1) по данным РТГА с крысиной антисывороткой. Нейраминидаза идентична NA вируса гриппа птиц А/серебристая чайка/Сарма/51с/06(Н6N1) по данным ОТ-ПЦР-анализа.

6. Прочие свойства

Штамм А/17/серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1) обладает температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом: разность в показателях эмбриональной инфекционной активности при 33°C и 39°C - 7,3 lgЭИД₅₀/мл; разность в показателях эмбриональной инфекционной активности при 33°C и 26°C - 3,1 lgЭИД₅₀/мл.

7. Количество пассажей

8 в процессе реассортации; затем 1 накопительный пассаж в системе развивающихся куриных эмбрионов при температуре инкубации 33°C

8. Оптимальный титр

Оптимальный титр достигается при культивировании штамма в 10-11 дневных развивающихся куриных эмбрионах при 33°C в течение 48 часов, при этом инфекционная активность штамма составляет 9,2 lg ЭИД₅₀/0,2 мл, гемагглютинирующая активность с 0,5% взвесью куриных эритроцитов составляет 150 ГАЕ/50 мкл

9. Режим высушивания

Вирус лиофилизирован 6 мая 2014 г. Объем материала в ампуле - 1,0 мл

10. Условия хранения

Вирус хранят в виде лиофилизированной суспензии при температуре не выше +4°C. Для восстановления инфекционных свойств необходимы 1-2 пассажа на куриных эмбрионах. Инфекционная активность штамма после лиофилизации - 8,25 ЭИД₅₀/0,2 мл, гемагглютинирующая активность - 64 ГАЕ/50 мкл.

11. Патогенность для человека

Относится к микроорганизмам III группы патогенности.

12. Чувствительность к экспериментальной инфекции (животные, эмбрионы, членистоногие и клеточные культуры)

Авторами штамма являются сотрудники отдела вирусологии ФГБНУ «ИЭМ» Дешева Ю.А., Смолоногина Т.А., Руденко Л.Г.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма вируса гриппа. Предложен реассортантный вакцинный штамм А/17/серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1). Штамм получен путем скрещивания вируса А/Серебристая чайка/Сарма/51с/2006 (H6N1) со штаммом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для взрослых и детей. Штамм А/17/серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1) активно размножается в развивающихся куриных эмбрионах при оптимальной температуре 33°С, характеризуется температурочувствительностью, холодоадаптированностью и аттенуацией и иммуногенностью для лабораторных животных. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ Федерального научно-исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Η.Ф. Гамалеи Минздрава РФ под № 2807. Изобретение может быть использовано для получения живой гриппозной вакцины. 1 ил., 2 табл., 2 пр.

Реассортантный штамм вируса гриппа А/17/серебристая чайка/Сарма/06/887 (H6N1), полученный на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2), депонированный в Государственной коллекции вирусов ФГБУ Федерального научно-исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Η.Ф. Гамалеи Минздрава РФ под № 2807 для получения живой гриппозной вакцины.