СПОСОБ СНИЖЕНИЯ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЭНРОФЛОКСАЦИНА НА КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ С ПРИМЕНЕНИЕМ ГОМЕОПАТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ in vitro Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано в лабораторной работе по изучению способа снижения токсического действия энрофлоксацина на клеточный иммунитет с применением гомеопатических препаратов in vitro.

Известно, что антибактериальный препарат энрофлоксацин снижает уровень IgG, тем самым оказывает угнетающее действие на иммунную систему (S. Tokarzewski Influence of enrofloxacin and chloramphenicol on the level of IgG in serum and egg yolk after immunostimulation of hens with salmonella enteritidis antigens/ Pol. J. Vet. Sci. 2002. -V. 5(3). - P. 151-158).

Известен «Модулятор клеточного иммунитета» (патент РФ №2146528, кл. А61К 35/78 от 20.03.2000), включающий приготовление растительного экстракта из свежих листьев Geranium robertanium, сухих листьев Plantago lanceolata и сухих листьев Calendula officinales. Листья настаивают в течение 8 дней при комнатной температуре, при одно- или многократных ежедневных помешиваниях.

Недостатком известного способа является длительность срока приготовления препарата (до 15 дней), необходимость наличия лабораторных животных и ограниченный срок хранения препарата, а также отсутствие данных по влиянию на различные показатели фагоцитарной активности нейтрофилов.

Ближайшим техническим решением к данному изобретению является способ оценки клеточного иммунитета в опсонофагоцитарной реакции (ОФР) нейтрофилов крупного рогатого скота, которую проводили по методике (Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных: Метод. Рекомендации / Россельхозакадемия, Сиб. Отделение, ГНУ ИЭВС и ДВ, ГНУ ВИЕВ, ФГОУ НРИПК АПК МСХ РФ, НГАУ. - Новосибирск, 2003. - 32 с.). Оценку снижения иммуносупрессивного влияние препарата глюкортин клеточного иммунитета учитывали по изменению фагоцитарной активности (ФА) нейтрофилов, фагоцитарного числа (ФЧ) нейтрофилов, фагоцитарного индекса (ФИ) нейтрофилов, фагоцитарной емкости (ФЕ) нейтрофилов и переваривающей способности крови (ПСК).

Задача изобретения - расширение арсенала способов снижения токсического действия энрофлоксацина на клеточный иммунитет с использованием гомеопатических препаратов in vitro.

Указанная задача достигается тем, что в способе снижения токсического действия энрофлоксацина на опсонофагоцитарную активность нейтрофилов с применением гомеопатических препаратов in vitro, включающем использование лейкоцитарной взвеси, антибактериального и гомеопатического препаратов разведенных в физиологическом растворе в выбранном разведении, согласно изобретению к лейкоцитарной взвеси в объеме 0,5 мл добавляют 0,15 мл антибактериального препарата энрофлоксацин 5,0%, затем полученный раствор помещают в термостат на 3 часа при Т=37±0,5°C, после инкубации вносят по 0,5 мл гомеопатического препарата, разведенного в физиологическом растворе в выбранном разведении С6, С12, С30, С200, и вновь помещают в термостат на 4 часа при Т=37±0,5°C, затем вносят взвесь микроорганизмов референтного штамма Staphylococcus albus №182 по 0,5 мл, содержащую 10⁹ КОЕ в 1 мл физиологического раствора, далее помещают в термостат на 30 минут при Т=37±0,5°C, после инкубации мазки крови фиксируют в спирт-формалине 1:9, 40% раствор формалина и 96° спирта, в течение 10 минут и окрашивают по Романовскому - Гимзе в течение 30 минут.

Для определения достоверности полученные результаты сопоставляли с результатами исследований в контрольных группах. В контрольной группе использовали энрофлоксацин 5,0% и 0,85% водный раствор NaCl. Оценку роста показателя активности клеточного иммунитета проводили по отношению к показателям контрольной группы.

Пример 1.

Снижение токсического действия энрофлоксацина на фагоцитарную активность нейтрофилов при применении гомеопатических лекарственных средств выявило наличие роста показателя ФА нейтрофилов при изучении всех исследуемых препаратов относительно показателей контрольной группы, где наблюдали снижение опсонофагоцитарной активности вследствие токсичных явлений, обусловленных энрофлоксацином (табл. 1).

Наиболее выраженную активацию клеточного иммунитета наблюдали при воздействия на нейтрофилы монопрепаратами растительного происхождения в разведениях Нукс Вомика С6, С30, С200, сопровождающийся максимальным ростом показателя ФА от 276,9 до 300,0%, ФЁот 257,1 до 278,6%, ФЧ от 306,6 до 350,0%, ПСК от 253,3 до 280,0% (табл. 2).

При использовании препаратов в различных разведениях отмечали рост показателей ФА нейтрофилов после контакта с препаратами, он составил от 223,0 до 300,0%.

Выраженный рост ФИ, ФЧ после контакта с монопрепаратами был отмечен у Ипекакуана С30 (287,1 и 330,3%), Ипекакуана С200 (300,0 и 343,3%), Нукс Вомика С6 (264,5 и 306,6%), Нукс Вомика С30 (267,7 и 343,3%), Нукс Вомика С200 (274,2 и 350,0%) соответственно.

Снижение токсического действия энрофлоксацина на клеточный иммунитет с применением гомеопатических препаратов растительного происхождения выявило наличие роста показателя ПСК у 100% исследуемых препаратов, представленных в трех и более разведениях, при этом тенденция к росту находится в прямой зависимости от степени их разведения. Так, рост показателя ПСК наблюдали при контакте с Ипекакуаной С30 (413,3%), Аконитом С200 (431,3%), Ипекакуаной С200 (445,5%), относительно контрольных групп.

Снижение токсического действия энрофлоксацина на клеточный иммунитет с применением гомеопатических лекарственных препаратов животного происхождения выявило наличие роста всех исследуемых показателей фагоцитарной активности нейтрофилов. Так, рост показателя ПСК наблюдали при контакте с Лахезис С6 на 438,1%, Лахезис С30 на 523,5%, Лахезис С200 на 554,1%, Апис С6 на 374,1%, Апис С30 на 387,7%, Апис С200 на 404,7% (табл. 3).

Снижение токсического действия энрофлоксацина на клеточный иммунитет с применением гомеопатических лекарственных средств минерального происхождения, выявило рост показателя ПСК при использований 27 (100%), а ФЧ при культивировании с 14 (51,8%) испытуемый препаратами, при этом тенденция к росту сохраняется в зависимости от степени разведения (табл. 4).

Снижение токсического действия энрофлоксацина на клеточный иммунитет с применением гомеопатических препаратов минерального происхождения выявило наибольший эффект при одновременном использовании 2-3 разведений. Так, рост показателей опсонофагоцитарной реакции нейтрофилов при использовании Кали бихромикум составил ФЁ - 342,8%, ФА - 369,4%, ФЧ - 583,3%, ФИ - 629,0%, ПСК - 837,4%.

Промышленная применимость иллюстрируется следующим примером. Группе телят возрастом от 1 до 3 мес. при бронхопневмонии назначали лечение энрофлоксацином 5,0% внутримышечно, 1 мл / 10 кг живой массы, 1 раз в день в течение 5-7 дней. После окончания курса лечения брали кровь с цитратом натрия и выделяли нейтрофилы.

К образцам проб телят опытной группы добавляли водный раствор гомеопатических препаратов, к пробам контрольной группы добавляли 0,85% раствор хлорида натрия по вышеописанной методике. Результаты исследования показали, что водный раствор гомеопатических лекарственных средств вызывал увеличение показателей опсонофагоцитарной активности относительно контрольной группы ФА на 45-86%, ФЁ на 54-112%, ФИ на 65-90%, ФЧ на 40-122%, ПСК на 76 - 115%.

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для снижения токсического эффекта энрофлоксацина на опсонофагоцитарную активность нейтрофилов с применением гомеопатических препаратов in vitro. Для этого к лейкоцитарной взвеси в объеме 0,5 мл добавляют 0,15 мл антибактериального препарата энрофлоксацин 5%. Затем полученный раствор помещают в термостат на 3 часа при Т=37±0,5°C, после инкубации вносят по 0,5 мл гомеопатического препарата, разведенного в физиологическом растворе в выбранном разведении С6, С12, С30, С200. После этого пробирки вновь помещают в термостат на 4 часа при Т=37±0,5°C и затем вносят взвесь микроорганизмов референтного штамма Staphylococcus albus №182 по 0,5 мл, содержащего 109 КОЕ в 1 мл физиологического раствора. Далее помещают в термостат на 30 минут при Т=37±0,5°C, после инкубации мазки крови фиксируют в спирт-формалине 1:9, 40% раствор формалина и 96° спирта, в течение 10 минут и окрашивают по Романовскому - Гимзе в течение 30 минут. Использование данного способа позволяет in vitro оценить влияние гомеопатических препаратов на снижение токсического эффекта энрофлоксацина на опсонофагоцитарную активность нейтрофилов. 4 табл.

Способ снижения токсического действия энрофлоксацина на опсонофагоцитарную активность нейтрофилов с применением гомеопатических препаратов in vitro, отличается тем, что включает использование лейкоцитарной взвеси, антибактериального и гомеопатического препаратов, разведенных в физиологическом растворе в выбранном разведении, согласно изобретению к лейкоцитарной взвеси в объеме 0,5 мл добавляют 0,15 мл антибактериального препарата энрофлоксацин 5%, затем полученный раствор помещают в термостат на 3 часа при Т=37±0,5°C, после инкубации вносят по 0,5 мл гомеопатического препарата, разведенного в физиологическом растворе в выбранном разведении С6, С12, С30, С200, после этого пробирки вновь помещают в термостат на 4 часа при Т=37±0,5°C, затем вносят взвесь микроорганизмов референтного штамма Staphylococcus albus №182 по 0,5 мл, содержащего 10⁹ КОЕ в 1 мл физиологического раствора, далее помещают в термостат на 30 минут при Т=37±0,5°C, после инкубации мазки крови фиксируют в спирт-формалине 1:9, 40% раствор формалина и 96° спирта, в течение 10 минут и окрашивают по Романовскому - Гимзе в течение 30 минут.