СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2015 года по МПК A61K35/66 

Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способам получения антигена вируса лейкоза (ВЛКРС) для серологической и иммунохимической диагностики болезни. Способ состоит в осаждении циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) сыворотки крови больных лейкозом животных с последующей их диссоциацией и экстрагированием белковых компонентов ВЛКРС. Способ позволяет получать более специфичный и стабильный антиген ВЛКРС для серологической и иммунохимической диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Преимуществом предлагаемого антигена является то, что он позволяет определять более полный спектр антител при инфекционном процессе и открывает новые перспективы для разработки новых более эффективных и информативных иммунохимических методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

ВЛКРС обладает выраженной антигенной активностью. В организме крупного рогатого скота антитела вырабатываются преимущественно на структурные белки вириона. У зараженных животных в крови циркулируют антитела к р24, р15, р12, p10, gp30 и gp51. Хотя и считается, что диагностическое значение имеют антитела против gp51 и р24 ВЛКРС, в количественном соотношении они могут коррелировать со стадией инфекционного процесса [1]. Кроме того, доказано, что на разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота меняется и спектр свободно циркулирующих в сыворотке крови антител, обнаруживаются антитела не только основным белкам вириона, но и продуктам их расщепления. Все эти данные свидетельствуют о необходимости комплексного подхода при определении как антигенов вируса, так и антител к ним в серологической диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Необходимо также отметить, что существующие методы диагностики не учитывают генетического многообразия возбудителя болезни [2].

В настоящее время для изучения эпизоотической ситуации по инфекционным болезням в регионах и для их диагностики в мировой практике широко используются и разрабатываются различные экспресс тест-системы.

Наиболее значимыми в разработке экспресс-тестов для диагностики инфекционных болезней являются методы иммунохимического анализа. При этом применяются различные технологии, среди которых немало важную роль играют модифицированные методы ИФА, а также иммуноблот анализ. Определяющим фактором эффективности иммунохимических методов является качество используемого антигена. В настоящее время большинство серологических реакций, применяемых в диагностике лейкоза крупного рогатого скота, направлено только на выявление анти-gp51 антител.

Известные способы получения антигена ВЛКРС предусматривают культивирование вируссодержащих клеток с последующей их обработкой специальными методами. Патент на изобретение №2020960 от 15 октября 1994, патент на изобретение №2185854 от 27 июля 2002, патент на изобретение US 8529909 В2 от 27 сентября 2009. Известны способы получения антигена вируса лейкоза с использованием фазовых систем декстран - полиэтиленгликоль (ПЭГ), сульфат декстрана - ПЭГ, сульфат декстрана - поливиниловый спирт, сульфат декстрана - метилцеллюлоза [3].

Основным недостатком всех известных способов является то, что они трудоемки и позволяют получать антигены или р24, или gp51.

Ближайшим аналогом предлагаемого способа является патент на изобретение №2282854 МПК: G01N «Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота» от 27 августа 2006 г., основной этап которого заключается в том, что из крови получают концентрированный образец белков ВЛКРС путем центрифугирования при 20000-100000 g, суспендируют его в буфере средней ионной силы с pH 7,0-7,8.

В предлагаемом изобретении при выделении антигена ВЛКРС из сывороток крови больных лейкозом коров исходили из того, что вирусные частицы, главным образом, содержатся в составе ЦИК. Технологию разрабатывали с учетом необходимости диссоциации ЦИК и избавления от сывороточных антител и всех остальных белков.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

1. Осаждение ЦИК в сыворотке крови методом преципитации полиэтиленгликолем (ПЭГ-6000). Для этого сыворотку крови от больных лейкозом коров в объеме не менее 500 мл смешивают раствором ПЭГ-6000 в 0,1 М боратном буфере (pH-8,8) до 3% конечной концентрации. Перемешивают и оставляют на 24 часа при +4°С.

2. Выделение ЦИК методом центрифугирования. По истечении указанного времени пробу сыворотки крови центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, надосадок сливают, а осадок растворяют в 5-кратном объеме 3% раствора ПЭГ-6000 в боратном буфере и вновь центрифугируют в тех же условиях (промывка).

3. Диссоциация ЦИК и удаление глобулинов. Полученный осадок, содержащий ЦИК с компонентами вируса, растворяют в 3-кратном объеме дистиллированной воды и выдерживают, периодически перемешивая, 1 час при 60°C. По истечении этого времени пробу смешивают равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония, осторожно перемешивают в течение 2-3 минуты и центрифугируют.

4. Выделение и очищение антигенного препарата. Надосадочную жидкость осторожно отделяют и диализируют при комнатной температуре в течение 48 часов против дистиллированной воды. Фильтруют через бумажный фильтр и концентрируют (не менее в 10 раз) против силикагеля L 100/250 для хроматографии.

Пример 1.

Антигенные свойства выделенных белковых фракций вирусных частиц изучали в ИФА с использованием сывороток крови инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров. Контрольным тестом служилИФА с использованием набора выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота, производства НПО «Нарвак». Всего исследовали более 152 проб сывороток крови. Результаты исследований по одному хозяйству представлены в таблице 1.

По результатам исследований установлено, что вирусные частицы, выделенные из сывороток крови больных лейкозом коров, обладают антигенными свойствами и не уступают по специфичности антигену gp51, применяемых в коммерческих наборах для ИФА.

Из приведенных в таблице данных особый интерес представляют результаты исследований проб №№3, 7 и 8. Показатели оптической плотности (ОП) в ИФА у этих проб с исследуемым антигеном гораздо выше. Причем результаты ОП положительной контрольной сыворотки у данного антигена ниже, чем у коммерческого набора.

Как известно, в тест-системах для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в основном используются белки оболочки вируса - gp51. Положительные контрольные сыворотки, соответственно получены против этого антигена.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемый антиген является комплексным, содержащим различные белковые фракции вируса лейкоза, и позволяет определять более полный спектр антител при инфекционном процессе, открывает новые перспективы для разработки новых более эффективных и информативных иммунохимических методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Источники информации

1. Сюрин В.Н. Вирус лейкоза крупного рогатого скота / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. - М.: МВА, 1998. - С. 76-85.

2. Хазипов Н.З. Генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота по env-гену / Н.З. Хазипов, Р.Н. Вафин, А.М. Алимов и др. // Вестник Российской академии с/х наук. - 2011. С.62-63.

3. Hammar L., Merza М., Malm К., Eriksson S., Morein В. The use of aqueous two-phase systems to concentrate and purify bovine leukemia virus outer envelope protein gp51. / Biotechnology and biochemistry. - 1989. - 11. - 296-306.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способам получения антигена вируса лейкоза (ВЛКРС) для серологической и иммунохимической диагностики болезни. Способ состоит в осаждении циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) сыворотки крови больных лейкозом животных с последующей их диссоциацией и экстрагированием белковых компонентов ВЛКРС. При этом сыворотку крови от больных лейкозом коров смешивают раствором ПЭГ-6000 в 0,1 М боратном буфере до 3% конечной концентрации; перемешивают, центрифугируют, отделяют осадок и растворяют в 5-кратном объеме 3% раствора ПЭГ-6000 в боратном буфере, центрифугируют; полученный осадок, содержащий ЦИК с компонентами вируса, растворяют в 3-кратном объеме дистиллированной воды и выдерживают, перемешивая, после чего пробу смешивают равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивают и центрифугируют; надосадочную жидкость отделяют и диализируют, фильтруют и концентрируют. Способ позволяет получать более специфичный и стабильный антиген ВЛКРС для серологической диагностики инфекции, который позволяет определять более полный спектр антител при инфекционном процессе. 1 табл., 1 пр.

Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), включающий выделение белковых компонентов ВЛКРС из сыворотки крови, отличающийся тем, что предварительно осаждают циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) методом преципитации с ПЭГ-6000 с последующей диссоциацией путем инкубирования при 60°C 1 час, иммуноглобулины осаждают полунасыщенным раствором сульфата аммония, супернатант диализируют против дистиллированной воды, концентрируют против силикагеля L100/250 и используют в качестве антигена в иммунохимических реакциях в диагностике лейкоза крупного рогатого скота.