Способ исследования проб сыворотки крови или молока на выявление антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 A61B5/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способам диагностики лейкоза крупного рогатого скота

Современная серологическая диагностика лейкоза крупного рогатого скота основана большей частью на использовании реакции иммунодиффузии в геле агара (РИД) и методов иммуноферментного анализа (ИФА). При этом предлагаются разные способы выявления больных лейкозом животных основанные на данные тесты.

Известен способ выявления больных лейкозом крупного рогатого скота животных, при котором проводят дополнительные исследования в РИД после провокации иммунного ответа путем трехкратного введения инактивированной вакцины против лейкоза крупного рогатого (патент RU 2264628 C2).

Известен способ с поэтапной иммобилизацией вируса (патент RU 2377962 C1).

Известен способ послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа смывов с туш или субпродуктов животных (патент RU 2803893 C1) и др.

Недостатком этих способов является, если с одной стороны, недостаточно высокая чувствительность и специфичность РИД, то с другой сложность технологий, особенно по части обработки проб при постановке методов ИФА. Еще одним из недостатков серологических методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота, в том числе и ИФА, является то, что они не позволяют выявлять «связанные антитела», т.е. антитела в составе иммунных комплексов. В результате снижается эффективность оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота.

При хронических инфекциях, вызванных вирусами семейства Retroviridae, в биологических жидкостях организма образуются иммунные комплексы «антиген-антитело», которые имеют определенное значение в патогенезе этих инфекций. Доказано, что циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) в сыворотке крови ВЛКРС-серопозитивных коров содержат антигены вируса и IgG и IgM. Соотношение антител в комплексах («связанные антитела») меняется с возрастом животного и стадией болезни. Сывороточные иммунные комплексы обладают низкой температурной устойчивостью и достаточно легко диссоциируют.

Ближайшим аналогом заявленного изобретения является способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий выявление анти-ВЛКРС антител в молоке или в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа, в котором предварительно перед анализом пробу обезжиренного молока или сыворотки крови инкубируют 2 часа при температуре 50°С, после чего пробы сразу же используют для иммуноферментного анализа (патент RU 2425377 C1).

Целью заявляемого изобретения является сокращение сроков обработки биоматериала сохранив высокую чувствительность и специфичность иммуноферментного метода анализа.

Поставленная задача в способе исследования проб сыворотки крови или молока на выявление антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), включающем выявление анти-ВЛКРС антител в молоке или сыворотке крови животного с помощью иммуноферментного анализа, достигается тем, что предварительно перед анализом пробу обезжиренного молока или сыворотки крови в объеме по 1 мл в пробирках типа Эппендорф инкубируют 45 минут при температуре 60°С, после чего пробы сразу же используют для иммуноферментного анализа («Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота»/ МСХ РФ, Департамент ветеринарии №13-7-2/2130 от 23.08.00.- С.5-8.).

Предлагаемый способ позволяет значительно сократить время постановки ИФА теста и увеличить количество исследуемых животных. Метод обеспечивает полную диссоциацию иммунных комплексов и позволяет обнаружить наряду со свободными и связанные в иммунных комплексах антитела в сыворотке крови и молоке. Следовательно, если учесть, что чувствительность метода по сравнению с аналогом не понижается, то эффективность диагностики лейкоза крупного рогатого скота повышается.

Пример 1. Исследовали по 200 проб сыворотки крови и молока от одних и тех же животных из оздоравливаемого от лейкоза хозяйства Новошишминского района РТ. Перед анализом пробы обезжиренного молока и сывороток крови в объеме по 1 мл в пробирках типа Эппендорф инкубировали 45 минут при температуре 60°С, после чего пробы сразу же использовали для иммуноферментного анализа. ИФА ставили в непрямом твердофазном варианте с использованием «Набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в сыворотке крови и молоке иммуноферментным методом» производства ФКП «Курсая биофабрика - фирма «Биок». Учет результатов реакции проводили согласно наставлению по применению набора. Результаты исследований представлены в таблице 1и 2.

Таблица 1.

Результаты исследования проб сывороток крови методом ИФА на лейкоз крупного рогатого скота.

Всего проб ИФА сывороток крови Без дис-и ЦИК С диссоциацией ЦИК По способу аналога По предлогаемому способу Полож. Отр. Полож. Отр. Полож. Отр. РИД (+)
РИД (-) 100
100 100
11 0
89 100
23 0
77 100
23 0
77

Таблица 2.

Результаты исследования проб сывороток молока методом ИФА на лейкоз крупного рогатого скота.

Всего проб ИФА молока Без дис-и ЦИК С диссоциацией ЦИК По способу аналога По предлогаемому способу Полож. Отр. Полож. Отр. Полож. Отр. РИД (+)
РИД (-) 100
100 76
9 24
91 91
14 9
86 91
16 9
84

100 проб сывороток крови и молока из 200 исследованных были получены от РИД положительных, а остальные 100 от РИД отрицательных животных.

100 проб сывороток крови от РИД положительных животных были положительные в ИФА до и после термической обработки (таблица 1). Пробы молока от этих же коров показали положительные результаты в ИФА в 76 случаях. После диссоциации ЦИК, как по способу аналога, так и по предложенному способу положительными оказались 91 проба (таблица 2).

11 проб сывороток крови из 100 от РИД отрицательных коров показали положительные результаты в классическом ИФА. После инкубирования в вышеуказанных условиях положительно реагирующих проб стало 23 (таблица 1).

В иммуноферментном анализе проб молока от этих же животных получены следующие результаты: 9 - положительные и 91 - отрицательные по обычной методике ИФА, 14 - положительные и 86 - отрицательные по методике аналога, 16-положительные и 84 - отрицательные по предлагаемому способу (таблица 2).

Таким образом, предлагаемый способ исследования проб сыворотки крови или молока на выявление антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) позволяет более полно выявлять в оздоравливаемых стадах ВЛКРС-инфицированных животных, исключить потенциальных источников перезаражения и повысить эффективность противолейкозных мероприятий в хозяйствах. Кроме того, данный способ открывает широкие перспективы мониторинга эпизоотической ситуации по лейкозу в хозяйствах методом иммуноферментного анализа проб молока.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается исследования проб сыворотки крови или молока на выявление антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Выявляют анти-ВЛКРС антитела в молоке или в сыворотке крови животного с помощью иммуноферментного анализа. Предварительно перед анализом пробу обезжиренного молока или сыворотки крови инкубируют 45 минут при температуре 60°С, затем пробы сразу же используют для иммуноферментного анализа. Изобретение обеспечивает повышение достоверности диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа. 2 табл., 1 пр.

Способ исследования проб сыворотки крови или молока на выявление антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), включающий выявление анти-ВЛКРС антител в молоке или в сыворотке крови животного с помощью иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что предварительно перед анализом пробу обезжиренного молока или сыворотки крови, инкубируют 45 минут при температуре 60°С, после чего пробы сразу же используют для иммуноферментного анализа.