СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ ЕМКОСТИ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2015 года по МПК G01N27/22 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу измерения емкости датчика. Кроме того, изобретение относится к применению этого способа для обнаружения взаимодействия между лигандом и аналитом.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Различные способы анализа биомолекул сегодня являются доступными на рынке. По-прежнему используются традиционные количественные способы, например, масс-спектрометрия, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) или хроматография. Потребность в более чувствительных способах привела к развитию технологий, использующих биодатчики, при этом наиболее часто используемыми являются весовой и оптический методы. Однако наиболее чувствительный способ анализа биомолекул с использованием биодатчика осуществляется с помощью электрохимической технологии, которая базируется на комбинации биологических молекул и электродов.

Аффинные датчики, например иммуносенсоры, базируются на событиях связывания между иммобилизованными биомолекулами (лиганд) и молекулами-мишенями, представляющими интерес для анализа (аналит). Иммобилизация биомолекул имеет большое значение для способности обнаруживать события связывания или взаимодействие между лигандом и аналитом. Получаемая чувствительность зависит от принципа измерения в устройстве датчика и от аффинных свойств и плотности лиганда, направленного на аналит.

Преимущество способов, включающих в себя использование аффинных биодатчиков, заключается в том, что они могут непосредственно обнаруживать взаимодействие между аналитом в растворе и лигандом, расположенным у поверхности датчика, без необходимости в меченом реагенте, что делает анализ менее сложным и менее интенсивным при работе оператора по сравнению с другими способами анализа.

Аффинный датчик может использоваться в различных применениях, например, для обнаружения биологических загрязняющих веществ, таких как бактерии, вирусы или токсичные материалы, содержащие их, в водопроводной воде или в реках, или для обнаружения химического соединения или биологической молекулы, например белка или последовательности нуклеиновых кислот.

В электрохимическом способе концентрация аналита в растворе может быть рассчитана путем измерения изменений в диэлектрических свойствах, когда аналит взаимодействует с лигандом, расположенным на аффинной поверхности электрода биодатчика. Например, для распознавания различных аналитов были исследованы результаты измерений емкости и измерений импеданса.

Емкостной биодатчик может быть выполнен путем размещения захватывающих биомолекул (лиганда) в тонком слое на рабочем электроде, который ранее был покрыт тонким изолирующим слоем. Электрод обычно изготавливают из благородного металла, например золота, но также он может быть изготовлен из других проводящих материалов. Затем рабочий электрод помещают в проточной ячейке и воздействуют на него импульсом потенциала. При введении аналита в проточную ячейку на поверхности электрода образуется комплекс лиганд-аналит благодаря взаимодействию между аналитом и лигандом, который изменит диэлектрические свойства биодатчика, например емкость датчика возрастет. Следовательно, концентрация аналита в растворе может оцениваться с помощью периодических измерений до и после введения аналита посредством измерения изменения емкости.

WO 99/14596 описывает емкостной аффинный датчик, основанный на монослое, собранном на электроде с иммобилизованными элементами распознавания, которые доступны для аналита в окружающем растворе. Электрод является селективным для тех молекул в растворе, которые демонстрируют аффинитет к элементам распознавания на поверхности.

Иммуносенсор без использования меток для прямого обнаружения холерного токсина (cholera toxin) (СТ) описан в статье «Sub-attomolar detection of cholera toxin using a label-free capacitive immunosensor» («Субаттомолярная детекция холерного токсина с помощью емкостного иммуносенсора без использования меток»), Biosensors and Bioelectronics 25 (2010) 1977-1983. В этом исследовании концентрация СТ устанавливалась с помощью потенциостатического измерения емкости, т.е. путем выявления изменения емкости, вызванной образованием комплексов антитело-антиген. Эта способ базируется на теории двойного электрического слоя для измерения изменений в диэлектрических свойствах, когда на поверхности датчика формируется комплекс антитело-антиген. Измерение емкости производилось на основании отклика тока, полученного потенциостатическим методом при подаче на рабочий электрод потенциала с шагом +50 мВ.

Однако известные способы с использованием биодатчиков для измерения изменений в диэлектрических свойствах обладают некоторыми недостатками.

Традиционные приборы для измерения емкости, как описано в предшествующем уровне техники, чувствительны к внешним возмущениям, действующим на электронику, например, фоновому шуму, что оказывает влияние на изменчивость, а значит, и точность измерения.

Недостатком является то, что рабочий электрод должен меняться на новый электрод по окончании одной или более серий измерений из-за обычно используемых резких скачков подаваемого потенциала. Такая подача потенциала также оказывает воздействие на чувствительный слой биомолекул (слой биораспознавания) и на аффинитет датчика таким образом, что лиганд может быть частично денатурирован. Рабочий электрод в конце концов изнашивается и должен быть заменен, что требует проведения длительной операции.

Следовательно, одним из недостатков является то, что несколько из начальных измерений емкости в серии измерений должны быть использованы для калибровки электрода. Такая процедура калибровки ведет к уменьшению количества соответствующих неизвестных образцов, с которыми могут быть произведены измерения на одном электроде датчика до того, как потребуется его замена.

Критическим этапом в конструировании емкостных биодатчиков является иммобилизация слоя элементов биораспознавания на электроде. Если он недостаточно изолирован, ионы могут проникать через указанный слой, вызывая короткое замыкание системы, что ведет к уменьшению сигнала или отсутствию сигнала. Помехи от окислительно-восстановительных пар в электролитическом растворе могут также вызвать сильные фарадические фоновые токи и могут увеличить ток через активное сопротивление и уменьшить емкостной отклик.

Желательно иметь улучшенный способ измерения изменений емкости с использованием биодатчика и более стабильную систему измерения емкости биодатчика для повышения чувствительности и точности способа.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является ослабление или устранение одного или более дефектов или недостатков предшествующего уровня техники, по отдельности или в любой комбинации.

В первом аспекте изобретение относится к способу измерения емкости датчика, имеющего емкость и активное сопротивление. Датчик имеет рабочий электрод, который покрыт изолирующим слоем, содержащим лиганд, помещенный на нем, который образует аффинную поверхность на указанном электроде. Когда аналит приводят в контакт с лигандом и соединяют с ним, диэлектрические свойства датчика изменяются. Емкость вычисляется по кривой потенциалов, полученной из потенциалов, созданных на датчике в ответ на подачу постоянных токов.

Способ содержит следующие шаги:

- приведение упомянутого электрода в контакт с аналитом;

- подача постоянного первого тока на упомянутый датчик в течение первого периода времени с помощью источника тока до тех пор, пока потенциал, накопленный на датчике, не достигнет заранее установленного значения, и

- одновременное взятие замеров потенциала, созданного на датчике;

- подача постоянного второго тока на датчик в течение второго периода времени с помощью источника тока, причем второй ток имеет противоположное направление по сравнению с первым током и имеет то же самое абсолютное значение, что и первый ток, где второй период времени равен упомянутому первому периоду времени или равен упомянутому первому периоду времени, умноженному на два, и

- одновременное взятие замеров потенциала, созданного на датчике;

- подача постоянного третьего тока на датчик в течение третьего периода времени с помощью источника тока, причем третий ток имеет то же самое направление, что и первый ток, и имеет то же самое абсолютное значение, что и первый ток, где, если упомянутый второй период времени равен упомянутому первому периоду времени, третий период времени равен нулю, и, если упомянутый второй период времени равен упомянутому первому периоду времени, умноженному на два, третий период времени равен упомянутому первому периоду времени; и

- вычисление емкости датчика по наклону кривой потенциалов, полученной из потенциала, созданного на датчике, в ответ на подачу постоянных токов, если упомянутый потенциал вернулся к нулю, когда цикл, включающий упомянутые периоды времени, истек.

Взятие замеров производится множество раз в течение каждого периода времени подачи тока, например, приблизительно 100-1000 раз за период.

В одном варианте емкость датчика вычисляют по наклонам кривой потенциалов, полученной в ответ на подачу постоянных токов. В течение одного цикла подач тока вычисляют несколько значений упомянутой емкости. Емкость не учитывается, если потенциал, созданный на датчике, не возвращается к нулю, когда третий период времени истек. Кроме того, если емкость, вычисленная по упомянутым наклонам, изменяется в течение одного цикла, емкость не учитывается. В другом варианте по меньшей мере один наклон упомянутой кривой потенциалов используется для определения состояний ошибок.

Сопротивление датчика может быть использовано в качестве функции управления для контроля стабильности способа и точности измерения получаемых значений. Сопротивление определяется по вертикальным участкам упомянутой кривой потенциалов, и, если упомянутое сопротивление изменяется после последовательных подач постоянных токов в течение цикла, соответствующее значение емкости не учитывается.

Кроме того, сопротивление используется для идентификации электрода.

Во втором аспекте изобретение относится к использованию способа измерения емкости для обнаружения и количественного определения взаимодействия между лигандом и аналитом. Изменение емкости датчика используется для определения взаимодействия между лигандом и аналитом.

В одном варианте лигандом может быть антитело и аналитом может быть антиген или наоборот.

Кроме того, применение способа может относиться к обнаружению взаимодействия между аналитом и лигандом, где лиганд и аналит образуют аффинную пару из любой пары, выбранной из следующего списка:

- антитело - антиген,

- лектин - гликоконъюгат или только углевод,

- протеин с селективным связыванием с другими протеинами, например протеин А и иммуноглобулин G,

- рецептор - объект связывания с рецептором,

- нуклеиновая кислота - нуклеиновая кислота с комплементарной последовательностью оснований,

- фермент - ингибитор фермента: пептид из фаговой библиотеки и его молекула-мишень,

- любая биомолекула и ее либо природный, либо искусственный связывающий лиганд.

Другие цели, особенности и преимущества настоящего изобретения станут понятны из последующего подробного описания, сопроводительных чертежей и зависимых пунктов формулы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

С целью объяснения изобретения варианты осуществления изобретения будут описаны ниже со ссылкой на чертежи, на которых:

Фиг.1 представляет схематический вид системы, которая может быть использована для осуществления способа измерения емкости в соответствии с изобретением,

Фиг.2 представляет схематический вид схемы накачки током Хоуленда (Howland current pump) в системе, показанной на фиг.1,

Фиг.3 показывает схематически составные части потенциала датчика в системе, показанной на фиг.1,

Фиг.4 представляет кривую потенциалов, полученную в ответ на подачу постоянных токов в течение установленных периодов времени на датчик системы, показанной на фиг.1, в соответствии с первым вариантом осуществления способа, и

Фиг.5 представляет кривую потенциалов, полученную в ответ на подачу постоянных токов в течение установленных периодов времени на датчик системы, показанной на фиг.1, в соответствии со вторым вариантом осуществления способа.

Одинаковые ссылочные номера использованы для указания на одни и те же части на чертежах для улучшения читаемости описания и ради ясности.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже будут описаны варианты осуществления изобретения. Эти варианты описываются в иллюстративных целях для того, чтобы дать возможность специалисту осуществить изобретение и раскрыть лучший способ. Однако варианты не ограничивают изобретение. Более того, другие комбинации различных признаков возможны в пределах объема изобретения.

Фиг.1 представляет схематический вид системы 10, которая может использоваться для осуществления способа измерения емкости в соответствии с изобретением. Система 10 содержит источник 11 тока, проточную ячейку 12, дифференциальный усилитель 13 напряжения, процессор 14, аналого/цифровой (A/D) преобразователь 15 и цифро/аналоговый (D/A) преобразователь 16.

Проточная ячейка 12 снабжается первым соединителем 17, вторым соединителем 18 и третьим соединителем 19.

На фиг.2 показан источник 11 тока, который подает постоянный ток I в проточную ячейку 12 через первый соединитель 17. Значение тока составляет, например, около нескольких микроампер (µА). Ток I может быть либо положительным, либо отрицательным. Если V_in имеет более высокое значение, чем потенциал V_ref сравнения, тогда I_out является положительным, и, если V_in имеет более низкое значение, чем V_ref, тогда I_out является отрицательным. I_out равен нулю, когда V_in равен V_ref. На фиг.2 потенциалом V_ref сравнения является земля: когда V_in положителен, тогда I_out положителен, и, если V_in отрицателен, тогда I_out отрицателен. Отрицательные и положительные значения тока I будут использоваться как противоположные направления токов, что будет объяснено ниже. Источником 11 тока является, например, схема накачки током Хоуленда, которая описана более подробно Робертом А. Пизом (Robert A. Pease) в National Semiconductor Application Note 1515 от 29 января 2008 г.

Дифференциальный усилитель 13 напряжения соединен с проточной ячейкой 12 с помощью второго соединителя 18 и третьего соединителя 19, которые установлены для измерения потенциала V на проточной ячейке 12, который создается при подаче тока.

Соединитель 17 для подачи тока отделен от соединителей 18 и 19 во избежание помех от оконечных сопротивлений. Таким образом, система 10 поддерживает постоянное полное сопротивление от проточной ячейки 12 до дифференциального усилителя 13 напряжения, что повышает стабильность системы.

Дифференциальный усилитель 13 соединен с процессором 14 через A/D преобразователь 15 для конвертирования аналогового потенциала V, созданного на проточной ячейке 12, в цифровой сигнал. Процессор 14 может быть встроенным и имеет программное обеспечение для цифровых возможностей компьютера. Дисплей (не показан) предусмотрен для представления измеряемых данных. Процессор 14 выполнен с возможностью подачи управляющего потенциала U в виде аналогового выходного сигнала с помощью D/A преобразователя на управляющий зажим 15 источника 11 тока.

Рабочий электрод выполнен внутри проточной ячейки 12. Объем проточной ячейки 12 является произвольным, например 10 мкл. Рабочий электрод изготовлен из благородного металла, например золота, или изготовлен из других проводящих металлов и покрыт изолирующим слоем, который связывает с ним слой биомолекул (лиганд). Изолирующий слой и ковалентно присоединенные биомолекулы, далее называемые субстратом, образуют аффинную поверхность на рабочем электроде. Изолирующий слой с лигандом, расположенным на нем, образует диэлектрический слой, имеющий некоторую толщину. Изготовление рабочего электрода, как таковое, известно.

Система 10 имеет вспомогательный электрод, например, изготовленный из платиновой проволоки, и по меньшей мере один электрод сравнения, например, изготовленный из платиновой проволоки, серебра/хлорида серебра или комбинации из платиновой проволоки и серебра/хлорида серебра, которые не показаны.

Проточная ячейка 12 содержит раствор, например электролит, и образует емкостной датчик, имеющий активное сопротивление (R) 31 и емкость (С) 32, соединенные последовательно, как показано на фиг.3, в виде RC-цепи.

R 31 является сопротивлением между золотым электродом, покрытым субстратом и комплексом лиганд-аналит, образованным на субстрате, и раствором, несущим аналит. С считается общей емкостью датчика, т.е. емкостью проточной ячейки 12, за исключением идеальных ячеек.

При введении аналита в проточную ячейку 12 комплекс лиганд-аналит образуется на поверхности электрода благодаря взаимодействию между молекулами лиганда и аналита, когда постоянный ток подается к ячейке 12. Комплекс лиганд-аналит сделает аффинную поверхность рабочего электрода более толстой, что увеличивает толщину слоя диэлектрика, в результате чего происходят изменения диэлектрических свойств.

После введения аналита емкость датчика уменьшится, когда толщина аффинной поверхности увеличится в результате упомянутого взаимодействия, пропорционально концентрации введенного аналита. Следовательно, количество введенного аналита может быть вычислено как изменение емкости до и после введения.

Фиг.4 и фиг.5 представляют кривые потенциалов, полученные из потенциалов, созданных в ответ на подачу постоянных токов в течение установленных периодов времени на датчик системы, показанной на фиг.1, в соответствии с первым и вторым вариантом осуществления способа, соответственно. Постоянные токи в виде прямоугольных импульсов подаются от источника 11 тока на проточную ячейку 12, т.е. датчик.

На фиг.4 постоянный первый ток I₁ подается в течение первого периода времени t₁, постоянный второй ток I₂ подается в течение второго периода времени t₂ и постоянный третий ток I₃ подается в течение третьего периода времени t₃ на датчик. Второй ток I₂ имеет противоположное направление и имеет то же самое абсолютное значение, что и первый ток I₁. Второй период времени t₂ равен первому периоду времени t₁, умноженному на два. Третий ток I₃ имеет то же самое направление и ту же самую абсолютную величину, что и первый ток I₁. Третий период времени t₃ равен упомянутому первому периоду времени t₁.

На фиг.5 постоянный первый ток I₁ подается в течение первого периода времени t₁ и постоянный второй ток I₂ подается в течение второго периода времени t₂ на датчик. Второй ток I₂ имеет противоположное направление по сравнению с первым током I₁ и имеет то же самое абсолютное значение, что и первый ток I₁. Второй период времени t₂ равен первому периоду времени t₁. В этом втором варианте третий период времени равен нулю, следовательно, постоянный третий ток I₃ не будет подаваться.

Фиг.4 и фиг.5 представляют кривые потенциалов, когда положительные управляющие потенциалы были использованы для начала подачи тока. Если используется отрицательный управляющий потенциал, подается отрицательный ток и, тем самым, полученная кривая потенциалов станет обратной.

Когда цикл, включающий периоды времени t₁, t₂ и t₃, истечет, потенциал на датчике должен быть нулевым. В противном случае система может испытывать воздействие ошибки, о чем пойдет речь ниже.

Работа системы 10 происходит под управлением программного обеспечения процессора 14. Способ измерения емкости С датчика будет описан ниже со ссылками на фиг.4 и фиг.5.

Изначально рабочий электрод устанавливают в проточную ячейку 12 системы 10. Электрод покрыт изолирующим слоем, имеющим размещенный на нем лиганд, который образует аффинную поверхность электрода, как описано выше.

До введения аналита должна быть определена эталонная емкость упомянутого датчика.

Процессор 14 начинает способ с выдачи управляющего потенциала U через D/A преобразователь 16 на управляющий зажим 20 источника тока 12. Постоянный ток I является положительным, когда управляющий потенциал U является положительным, и постоянный ток является отрицательным, если управляющий потенциал U является отрицательным.

Когда подается постоянный первый ток I₁, потенциал V_R создается на резисторе 31 проточной ячейки 12, что соответствует участку А на фиг.4 и фиг.5. V_R является результатом произведения постоянного первого тока U и сопротивления R. Далее конденсатор С заряжается, и на конденсаторе создается потенциал V_C, что показано участком В.

Одновременно производится взятие замеров потенциала V, накопленного проточной ячейкой 12, несколько сот раз с помощью процессора 14 через дифференциальный усилитель 13 и A/D преобразователь 15.

Когда установленный потенциал V достигнут и/или установленный период времени t₁ истек, управляющий потенциал U меняет направление, так что постоянный второй ток I₂ противоположного направления выдается источником тока 11. Этот второй ток I₂ имеет то же самое абсолютное значение, что и первый ток I₁, который подавался в начале цикла. Второй ток I₂ подается в течение второго периода времени t₂, который равен первому периоду времени t₁, умноженному на множитель 2.

Результатом является то, что потенциал V на конденсаторе мгновенно уменьшается из-за падения потенциала на резисторе 31 проточной ячейки 12, как показано на участке С. Падение потенциала 2V_R в два раза больше по сравнению с ростом потенциала V_R на участке А, поскольку ток падает до нуля и затем изменяет направление на противоположное до отрицательного значения упомянутого тока I₁.

Конденсатор 32 разряжается, как показано на участке D, с той же скоростью, с какой он заряжался на протяжении участка В, так как наклоны кривых В и D потенциалов равны.

Поскольку t₂ равен t₁, умноженному на коэффициент 2, кривая потенциалов упадет до установленного потенциала V, имеющего отрицательное значение, во время заряда конденсатора, показанного на участке F. Подача тока прекращается при прекращении выдачи управляющего потенциала U, когда t₂ истек.

Изменив направление управляющего потенциала U, производят подачу постоянного третьего тока I₃ в течение третьего периода времени t₃, который равен t₁. Потенциал V_C на конденсаторе мгновенно уменьшается из-за падения потенциала на резисторе 31 проточной ячейки 12, что показано на участке G. Падение потенциала 2V_R в два раза больше по сравнению с ростом потенциала V_R на участке А, поскольку ток I₂ вначале падает до нуля и затем изменяет направление на противоположное.

Третий ток I₃ имеет то же самое направление и то же самое абсолютное значение, что и первый ток I₁, как представлено участком Н на фиг.5. Подача третьего тока I₃ прекращается при прекращении выдачи управляющего потенциала U, когда истекает t₃, в результате чего потенциал V на проточной ячейке 12 возвращается в ноль, как показано на участке I.

Способ измерения в соответствии со вторым вариантом будет описан со ссылкой на фиг.5. Инициализация способа эквивалентна инициализации, описанной в контексте фиг.4.

Когда установленный потенциал V достигнут и/или истек установленный период времени t₁, управляющий потенциал U изменяется, так что постоянный второй ток I₂ противоположного направления относительно первого тока I₁ выдается источником тока 11. Этот второй ток I₂ имеет то же самое абсолютное значение, что и первый ток I₁, и подается в течение периода времени t₂, который равен периоду времени t₁. В результате этого потенциал V_C на конденсаторе мгновенно падает из-за падения потенциала на резисторе 31 проточной ячейки 12, как показано на участке С. Падение потенциала 2V_R в два раза больше по сравнению с ростом потенциала V_R на участке А, поскольку ток I₂ сначала падает до нуля и затем изменяется на противоположный до отрицательного значения тока I₁. Потенциал V, включающий в себя компоненты V_R и V_C, подвергают замерам несколько сот раз с помощью процессора 14 через дифференциальный усилитель 13 и A/D преобразователь 15.

Конденсатор 32 разряжается, что показано на участке D, с той же самой скоростью, с которой он заряжался на протяжении участка В, поскольку наклоны В и D равны.

Подача тока прекращается при прекращении выдачи управляющего потенциала U, когда истекает t₂, в результате чего потенциал V на проточной ячейке 12 возвращается в ноль, как показано на участке Е.

Прогоняя систему в течение одного или нескольких циклов подачи постоянных токов до введения аналита, определяют эталонную емкость проточной ячейки, содержащей электролит. Такие измерения могут производиться, например, каждую вторую минуту для контроля стабильности системы до запуска способа с аналитом. Емкость С проточной ячейки 12, т.е. датчика, прямо пропорциональна потенциалу, созданному на конденсаторе, и вычисляется с помощью наклона кривой потенциалов на участках В, D, F и Н на фиг.4 или посредством наклона кривой потенциалов на участках В и D на фиг.5.

После этого в проточную ячейку вводят аналит таким образом, что он медленно протекает поверх электрода. Затем производится вычисление полученной емкости, например уменьшения емкости.

Потенциал V, созданный на датчике, который состоит из компонентов V_R и V_C, одновременно подвергается выборкам и замерам несколько сот раз посредством дифференциального усилителя 13 и A/D преобразователя 15, что возможно, поскольку для питания используется источник 20 тока. Взятие замеров производится множество раз в течение каждого периода подачи тока, например, ориентировочно 100-1000 раз за период. Все описанные операции происходят под управлением процессора 14.

Цикл повторяется, например, с интервалом 20 мс (50 Гц) для синхронизации с линейным потенциалом. Установленный период времени может опционально истекать без подачи тока, как показано на фиг.5, пока не будет инициирован новый цикл. Например, установленным значением потенциала V может быть 50 мВ, но может быть установлено любое другое опциональное значение. Период времени между последовательными циклами может быть 10 мс, другие периоды времени могут быть возможны, например, ориентировочно от 10 до 100 мс.

Потенциал V, созданный на проточной ячейке 12, измеряется и подвергается выборке несколько сот раз в течение цикла измерения, поскольку для питания используется источник тока.

Емкость С проточной ячейки 12, т.е. датчика, прямо пропорциональна потенциалу, созданному на конденсаторе, и вычисляется с помощью наклона кривой потенциалов на участках В, D, F и Н на фиг.4 или с помощью наклона кривой потенциалов на участках В и D на фиг.5. Линейность кривой потенциалов дает большое преимущество при вычислении емкости. Может быть произведено надежное измерение, так как наклоны получают с высокой точностью.

$$C=I\times t/U\left(2\right)$$

где U - потенциал, созданный (увеличение) в течение периода t времени, I - постоянный ток, проходящий через датчик, и С - емкость датчика.

Поскольку эталонная величина емкости датчика была установлена до введения аналита, может быть вычислено изменение емкости при добавке аналита. Изменение емкости прямо пропорционально концентрации введенного аналита, следовательно, измерение емкости до и после введения даст концентрацию аналита в растворе.

В соответствии с первым вариантом, показанным на фиг.4, в одном цикле может быть вычислено четыре значения емкости. Если заряд и разряд конденсатора 32 отличаются друг от друга в течение упомянутого одного цикла, например, если по меньшей мере один из наклонов участков В, D, F и Н отличается от других, произошла ошибка и упомянутыми значениями необходимо пренебречь.

В соответствии со вторым вариантом, как показано на фиг.5, в одном цикле получают два значения емкости. Если наклоны участков В и D отличаются друг от друга, произошла ошибка и этими значениями необходимо пренебречь.

При намеренном разряде конденсатора потенциал на датчике применяется в течение ограниченного периода времени, в результате чего химические связи на поверхности электрода датчика затрагиваются меньше. Кроме того, чувствительные биомолекулы подвергаются более мягкому обращению в процессе измерения, что благоприятно для аффинитета. Управление процессом производится посредством заряда и последующего разряда датчика в течение установленного периода времени. Датчик остается под тем же потенциалом после разряда до подачи тока.

Способ предлагает функцию управления для того, чтобы гарантировать, что никакой компонент системы не подвергается воздействию искажений от окружающей обстановки. Потенциал V_C на конденсаторе 32 проточной ячейки 12 пропорционален наклону участка В, полученному при подаче постоянного первого тока I₁ к проточной ячейке 12, и наклону участка D при подаче второго тока I₂ противоположного направления. Если эти наклоны отличаются каким бы то ни было образом в течение одного цикла, это является индикатором того, что на систему оказала воздействие ошибка. Обращаясь к фиг.5, наклоны В, D, F и Н должный быть равными; иначе на систему оказала воздействие ошибка.

Потенциал V_R на резисторе 31 проточной ячейки 12 пропорционален высоте участков А, С, Е, G и I. В соответствии с первым вариантом участки А и I должны иметь равную высоту, а участки С и G должны быть вдвое выше. Если это не так, имеет место некоторая ошибка системы или неисправность оказывает воздействие на систему. Обращаясь к фиг.5, участки А и Е должны быть равной высоты, а участки С и G должны быть вдвое их выше.

На измерение изменения емкости не оказывает влияние качество проточной ячейки 12. Она рассматривается только в виде активного сопротивления R, когда способ инициируется при подаче управляющего потенциала U, т.к. в этот момент конденсатор С не заряжен. Это означает, что начальная точка на горизонтальной оси может быть выбрана независимо от того, где измерения начинаются, и не окажет влияния на измерения.

Сопротивление R, которое не вовлечено в вычисление емкости С в соответствии с предложенным способом, может быть использовано для идентификации электрода датчика. Каждый электрод биодатчика является уникальным, и различия в качестве между разными электродами датчиков относятся к сопротивлению R, что дает уникальный признак, который может использоваться для защиты от копирования. У каждого электрода датчика может быть предусмотрен чип с однократной перезаписью. Этот чип взаимодействует с компонентами системы и может подтвердить свою подлинность для выполнения измерений определенным электродом биодатчика. Если указанный чип копируется и предназначается для другого электрода датчика, невозможно разблокировать измерительный процесс, поскольку электрод датчика не является определенным электродом. Например, эталонная кривая емкости С может быть сохранена в чип и затем использована для калибровки с расчетными значениями С. Данная эталонная кривая может быть закодирована с помощью ключа управления на основе конкретных различий в емкости С; впоследствии невозможно запрограммировать данный чип еще раз.

В основе существующих приборов для измерения емкости биодатчиков лежит подача потенциала на проточную камеру, и ответная реакция тока на него является основой для вычислений. Подведение потенциала является чувствительным к внешним электронным возмущениям, которые воздействуют на фоновый шум. Измерения емкости, основанные на подаче потенциала, продемонстрировали фоновую изменчивость порядка 1 нанофарады.

Способ в соответствии с изобретением базируется на питании от источника постоянного тока, что обеспечивает уменьшение электронного шума по сравнению с подачей потенциала. Кроме того, фоновая изменчивость уменьшилась, экспериментальные данные показали около 100 пикофарад, т.е. уменьшение составило 90% по сравнению со способом известного уровня техники, см. таблицы ниже.

Пример: анализ чувствительности

1. Система известного уровня техники

Холерная концентрация 1 С (нФ) Дельта (нФ) стандартное отклонение 236,35     235,96 0,39   236,11 -0,15   236,55 -0,44   235,75 0,8   235,85 -0,1 0,306447

2. Система известного уровня техники

Холерная концентрация 2 С (нФ) Дельта (нФ) стандартное отклонение 255,37     256,41 1,04   255,67 -0,74   255,74 0,07   256,76 1,02   255,49 -1,27 0,552618

3. Система согласно изобретению

Холерная концентрация 3 С (нФ) Дельта (нФ) стандартное отклонение 147,078     147,067 0,011   147,054 0,013   147,052 0,002   147,031 0,021   147,06 -0,029 0,015875

Некоторые преимущества измерения емкости с использованием электрохимических принципов достигаются предлагаемым способом в сравнении с известными способами измерения в области биохимии.

Изобретение содействует получению надежных и точных значений емкости, которые могут использоваться в различных применениях. Примерами таких применений являются определение концентраций специфических агентов, присутствующих в любом типе жидкости, конкретно путем использования подходящего лиганда для определения взаимодействия с соответствующим аналитом. Определение событий связывания с использованием изобретения позволит применять системы на основе антител и антигенов, лектинов и сахаридных частей или других молекул-партнеров по связыванию.

Чувствительность любого емкостного биодатчика очень высока; поэтому желательно измерять емкость с высоким разрешением и точностью, что достигается предлагаемым способом. Этот способ является стабильным, поскольку постоянный ток, подаваемый к датчику, не испытывает воздействия линейных потенциалов.

Питание постоянным током в два микроампера является более предпочтительным для электродов и поверхности биораспознавания. Электрод не изнашивается, и лиганд не поглощается так быстро, как в случае применения импульса потенциала в соответствии с существующими способами.

Аффинная поверхность подвержена меньшему воздействию, т.к. заряд и разряд датчика выполняются управляемым способом благодаря постоянному току, который подается в установленные периоды времени и направления которого выбираются друг относительно друга.

Линейность кривой потенциалов, полученная в ответ на подачу постоянного тока, обеспечивает простой и точный путь для вычисления емкости, поскольку она пропорциональна наклону упомянутой кривой.

Сопротивление датчика, а значит, и качество электрода не имеет значения для вычисления емкости. Преимущества предлагаемого способа очевидны в сравнении с существующими способами и устройствами, в которых сопротивление сначала должно быть рассчитано, а затем емкость определена с помощью логарифмического уравнения; при этом упомянутые различные шаги приводят к большей неточности измерений емкости.

Посредством предлагаемого способа два или более значения емкости получают за каждый отдельный измерительный цикл, что во многих аспектах способствует более высокой точности. Все вычисленные значения могут быть использованы для вычисления изменения емкости, при этом одновременно выполняется контроль достоверности, т.к. все значения внутри одного цикла должны корреспондироваться. Когда для надежного результата требуется заранее установленное количество значений, это может быть достигнуто за более короткий промежуток времени по сравнению с существующими способами.

Кроме того, с точки зрения аспекта эффективности затрат, предлагаемый способ предоставляет менее дорогостоящий путь выполнения измерений, т.к. лиганд и электрод могут использоваться в течение более длительного периода времени в комбинации с большим количеством значений для расчета емкости, тем самым увеличивая интервалы времени до замены или ручного восстановления рабочего электрода.

Потенциал V_R на резисторе датчика, полученный по кривой потенциалов, может быть также использован для контроля надежности и точности способа. Если V_R не возвращается к нулю, когда цикл истек, на систему влияет ошибка и соответствующие значения потенциалов V_C, созданных на конденсаторе, не должны учитываться.

Растущие требования в отношении характеристики низких уровней загрязнений указывают на необходимость развития высокочувствительных аналитических способов, которые являются относительно быстрыми, удобными в использовании и позволяющими интегрировать их в производственный процесс для измерений в процессе производства. Загрязнения обычно присутствуют в ничтожном количестве. Необходимо, чтобы аналитические процедуры были адаптированы к обнаружению и количественному определению чрезвычайно низких концентраций молекул-мишеней. Кроме того, важно анализировать образцы с максимально возможной скоростью и предпочтительно в реальном времени так, чтобы можно было быстро изменить условия для того, чтобы отреагировать на наблюдаемые увеличения концентрации ключевых загрязнений.

Предлагаемый способ отвечает этим требованиям. Способ хорошо подходит для выявления чрезвычайно низких уровней бактериальных токсинов и вирусных загрязнений, присутствующих в пробе, а также для отслеживания допинговых веществ в крови или для обнаружения биологических маркеров вирусных заболеваний, например ВИЧ. Способ может быть использован для обнаружения неизвестных молекул в растворе и для обнаружения остатков веществ, которые остаются в фармацевтических препаратах.

Следовательно, во втором аспекте, изобретение относится к применению предложенного способа для обнаружения и количественного определения взаимодействия между лигандом и аналитом, например, способ может быть применен, когда лигандом является антитело, а аналитом является антиген.

Кроме того, способ может быть применен к любому аналиту, будь то биомолекула и ее либо природный, либо синтетический связывающий лиганд.

Кроме того, способ может быть применен для обнаружения взаимодействия между аналитом и лигандом, где лиганд и аналит образуют аффинную пару из любой из пар, выбранных из списка ниже:

- лектин - гликоконъюгат,

- лектин - углевод,

- протеин с селективным связыванием с другими протеинами, например протеин А и иммуноглобулин А,

- рецептор - объект рецепторного связывания,

- нуклеиновая кислота - нуклеиновая кислота с комплементарной последовательностью оснований,

- фермент - ингибитор фермента: пептид из фаговой библиотеки и его целевая молекула

- любая биомолекула и ее либо природный, либо искусственный связывающий лиганд.

Любая из двух частей аффинной пары может быть лигандом, а другая часть может быть аналитом.

Еще одним примером использования способа для обнаружения взаимодействия является такой, когда лигандом является сахар-связывающий белок (лектин) и аналитом является структура клеточной поверхности.

Еще одним применением способа является такой, когда лигандом является мембранно-связанный рецептор и аналитом является соответствующий партнер по связыванию.

В формуле изобретения термин «содержит/содержащий» не исключает присутствие других элементов или шагов. Кроме того, хотя имеется конкретное перечисление, может быть осуществлено множество других средств, элементов или шагов способа. Ссылочные обозначения в формуле изобретения приводятся в качестве поясняющего примера и не должны трактоваться как ограничивающие объем изобретения.

Изобретение касается способа измерения емкости датчика с емкостью (С). Датчик имеет рабочий электрод, который покрыт изолирующим слоем и лигандом, образующим аффинную поверхность. Способ содержит шаги приведения электрода в контакт с аналитом, подачи постоянного первого тока (I₁), постоянного второго тока (I₂) противоположного направления относительно первого тока (I₁) и постоянного третьего тока (I₃) того же направления, что и первый ток (I₁), на датчик в течение заданных периодов времени. Далее способ содержит взятие замеров потенциала (V), созданного на датчике, и вычисление емкости датчика по наклону (В, D, F, Н) кривой потенциалов, полученной в ответ на подачу тока. Кроме того, изобретение относится к применению предложенного способа для обнаружения взаимодействия между лигандом и аналитом. Изобретение обеспечивает улучшенный способ измерения изменений емкости с использованием биодатчика и более стабильную систему измерения емкости биодатчика для повышения чувствительности и точности. 13 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл.

1. Способ измерения емкости (С) датчика, имеющего емкость (32) и активное сопротивление (31), причем датчик содержит рабочий электрод, который покрыт изолирующим слоем с лигандом, расположенным на нем с образованием аффинной поверхности на упомянутом электроде, при этом способ содержит следующие шаги:
- приведение упомянутого электрода в контакт с аналитом;
- подача постоянного первого тока (I₁) на датчик в течение первого периода времени (t₁) с помощью источника (20) тока до тех пор, пока потенциал, созданный на датчике, не достигнет заданного значения (V), и
- одновременное взятие замеров потенциала (V), созданного на датчике;
- подача постоянного второго тока (I₂) на датчик в течение второго периода времени (t₂) с помощью источника (20) тока, причем второй ток (I₂) имеет противоположное направление по сравнению с первым током (I₁) и имеет то же самое абсолютное значение, что и первый ток (I₁), где второй период времени (t₂) равен упомянутому первому периоду времени (t₁) или равен удвоенному первому периоду времени (t₁), и
- одновременное взятие замеров потенциала (V), созданного на датчике;
- подача постоянного третьего тока (I₃) на датчик в течение третьего периода времени (t₃) с помощью источника (20) тока, причем третий ток (I₃) имеет то же направление, что и первый ток (I₁), и имеет то же самое абсолютное значение, что и первый ток (I₁), причем, если упомянутый второй период времени (t₂) равен упомянутому первому периоду времени (t₁), то третий период времени (t₃) равен нулю, а если упомянутый второй период времени (t₂) равен удвоенному первому периоду времени (t₁), то третий период времени (t₃) равен упомянутому первому периоду времени (t₁); и
- одновременное взятие замеров потенциала (V), созданного на датчике; и
- вычисление емкости (С) датчика по наклону (В, D, F, H) кривой потенциалов, полученной из потенциала (V), созданного на датчике в ответ на подачу постоянных токов (I₁, I₂, I₃), если упомянутый потенциал (V) вернулся к нулю, когда цикл, включающий упомянутые периоды времени (t₁, t₂, t₃), истек.

2. Способ по п. 1, в котором упомянутую емкость (С) не учитывают, если потенциал (V), созданный на датчике, не возвращается к нулю, когда третий период времени (t₃) истек.

3. Способ по п. 1, в котором упомянутое взятие замеров выполняют множество раз в течение каждого периода времени (t₁, t₂, t₃) подачи тока.

4. Способ по п. 1, в котором если по меньшей мере один наклон (В, Н, F, Н) упомянутой кривой потенциала отличается от других наклонов, то произошла ошибка, и вычисленную емкость не учитывают.

5. Способ по п. 1, в котором активное сопротивление (31) электрода определяют по вертикальному участку (А, С, G, Е, I) упомянутой кривой потенциалов, и, если это сопротивление (31) изменяется после последовательных подач постоянных токов (I₁, I₂, I₃), то соответствующую вычисленную емкость (С) не учитывают.

6. Способ по п. 5, в котором упомянутое активное сопротивление (31) используют для идентификации электрода.

7. Применение способа по любому из пп. 1-6 для обнаружения и количественного определения взаимодействия между лигандом и аналитом.

8. Применение по п. 7, в котором лигандом является антитело, а аналитом является антиген.

9. Применение по п. 7, в котором лиганд и аналит образуют аффинную пару из любой пары, выбранной из:
- лектин - гликоконъюгат,
- лектин - углевод,
- протеин с селективным связыванием с другими протеинами, например протеин А и иммуноглобулин G,
- рецептор - объект рецепторного связывания,
- нуклеиновая кислота - нуклеиновая кислота с комплементарной последовательностью оснований,
- фермент - ингибитор фермента;
- пептид из фаговой библиотеки - его целевая молекула;
при этом любая из двух частей аффинной пары может быть лигандом, а другая часть может быть аналитом.

10. Применение по п. 7, в котором аналитом является биомолекула, а лигандом является природный или синтетический соответствующий партнер по связыванию с упомянутой биомолекулой.