СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСЕНСОРНОГО ЭЛЕКТРОДА Российский патент 1996 года по МПК G01N27/30 

Настоящее изобретение касается метода иммобилизации биомолекул в проводящем субстрате, в частности, данное изобретение относится к методу электроосаждения биомолекул, таких как энзимы и антитела, в проводящем субстрате после химического взаимодействия биомолекул с образованием нерастворимой в воде массы.

Иммобилизация биомолекул на субстрате необходима для многих широко используемых аналитических или промышленных способов применения биомолекул.

Иммобилизация превращает растворимые, как правило, в воде биомолекулы (такие, как энзимы и антитела) в нерастворимые в воде комплексы путем присоединения части молекул к нерастворимому в воде физическому материалу. Биомолекулы, иммобилизованные таким образом, могут быть использованы для изменения их концентрации или активности с течением времени. Дополнительное преимущество иммобилизации (биомолекулы могут храниться только в специально оборудованных объемах аппаратов или датчиков) в уменьшении стоимости материалов и в максимальной биоактивности.

Очень важное аналитическое применение иммобилизованных молекул, таких как энзимы, антитела, или гликопротеинов, таких как лектины, в биодатчиках, которые обнаруживают присутствие или указывают концентрацию определенных физиологических молекул как результат взаимодействия физиологических лигандов с иммобилизованными биомолекулами. К сожалению, приспособление известных методов иммобилизации может быть затруднено в связи с тем, что в производстве миниатюрных электрохимических биодатчиков используется обычное полупроводниковое оборудование. В настоящее время полупроводниковая техника позволяет изготовить датчик с площадью поверхности 1 кв.м. Такие небольшие размеры приводят к трудностям в конструировании датчика, поскольку производство биодатчиков обычно требует осаждения биомолекул только на рабочей поверхности электрода, который применяется для обнаружения продукта энзиматической реакции. Биомолекулы, осажденные на других поверхностях биодатчика, могут реагировать с образованием продукта, который не может быть обнаружен, что приводит к напрасной трате часто дорогостоящих биомолекул.

Один из методов преодоления проблем осаждения биомолекул основан на электрофорезе для ускорения миграции загрязненных биомолекул, таких как протеины, амфипатические липиды или нуклеоиновые кислоты. В соответствующей среде такие биомолекулы содержат положительно или отрицательно заряженные частицы, которые притягиваются к противоположным полюсам генерированного электрического поля. Миграция биомолекулы, содержащейся в среде, к электроду и осаждение на электроде, имеющем полярность, противоположную заряду молекулы, ускоряется, таким образом, если создан потенциал между двумя электродами в среде.

Например, электрофоретическое осаждение было использовано Икариямой (IKARIAMA) и др. (J.ELECTROCHEM. SOC. 136(6), РР.702-706 (1989). Этот метод способствовал соосаждению частиц платины и энзима глюкозоксидазы. При рН, когда платинизация нормально проходит (рН 3,5), глюкозоксидаза имеет чистый положительный заряд, поскольку рН ниже, чем ее изоэлектрическая точка (4,3). Глюкозоксидаза, таким образом, притягивается к противоположно заряженному электроду вместе с ионами платины. Для увеличения стабильности осажденного энзима датчик погружают в растворы глютаральдегида и альбумина для связывания молекул. Однако такой метод может привести к дезактивации энзима из-за относительно низкого рН, применяемого для улучшения соосаждения энзима.

Айзака (AIZAKA) и др. (J. OF. CHEM. SOC. JAPAN NIPPON KAGAKU KAISHI (11.00.2210-2213 (1987) сообщили об усовершенствовании техники электроосаждения глюкозоксидазы. Глюкозоксидаза адсорбировалась на поверхности платинового электрода при контролируемом потенциале из водного раствора. Оптимальные условия для осаждения были 0 1V VS Ag/AgCl и рН 3. Максимальная толщина, достигнутая этим методом, была равна слою из четырех молекул глюкозоксидазы, эквивалентному приблизительно пленке толщиной 56х10^-9 м. Пpи изменении величины рН от 3 до 9 оптимальный режим осаждения был при рН 3. Чрезвычайно тонкий слой, осажденный по этому методу, не соответствует по многим показателям требованию, чтобы степень взаимодействия лиганда с биомолекулой не являлась бы лимитирующим фактором реакции. Следующий недостаток ограниченное время жизни и невоспроизводимость таких тонких слоев иммобилизованных молекул.

Соответственно, объектом данного изобретения является метод осаждения и иммобилизации относительно тонкого слоя молекул биомолекул на проводящем субстрате так, чтобы взаимодействие лиганда с биомолекулой не лимитировалось по скорости.

Другой объект этого изобретения метод воспроизводства и точного осаждения и иммобилизации биомолекул на миниатюрных электронных датчиках.2 Следующий объект изобретения метод одновременного осаждения и иммобилизации множества различных биомолекул на проводящем субстрате.

Дополнительный объект изобретения метод осаждения и иммобилизации биомолекул с получением слоя толщиной от 10^-8 до 10^-5 м.

Соответственно, метод приготовления биосенсорного электрода, имеющего проводящий субстрат, покрытый необходимыми биомолекулярными частицами, включает приготовление раствора, по крайней мере, одного вида биомолекул, предназначенных для осаждения забуференного в степени, необходимой для предотвращения денатурализации биомолекул, а также чтобы все виды биомолекул, предназначенные для осаждения, имели одинаковый знак электрического заряда в соответствии с их изоэлектрическими точками. Биосенсорный электрод и противоэлектрод погружены в раствор, и между ними создана разность потенциалов от 100 милливольт до 1 вольта, в результате чего между ними возникает ток. Потенциал со временем меняется согласно расчету с тем, чтобы ток между электродами сохранялся достаточно постоянным, индуцируя миграцию К и осаждение на биосенсорный электрод. После достижения необходимой толщины слоя биомолекул на биосенсорном электроде стабильность осажденной биомолекулярной пленки может быть увеличена путем взаимодействия с подходящим агентом.

В представленном решении биомолекулы находятся в водном растворе и ток между биосенсорным электродом и противоэлектродом выбран около 5 мА/см². Напряжение повышается в процессе осаждения для получения постоянного по величине тока из-за повышения электрического сопротивления биосенсорного электрода, обусловленного осаждением биомолекулярной пленки. Осаждение продолжается до тех пор, пока не будет достигнута средняя толщина пленки больше 5 микрометров.

Одним из преимуществ настоящего изобретения является его широкая применимость с проводящими субстратами, имеющими различную геометрию. Поскольку биомолекулярное осаждение базируется на электрофорезе, биомолекулы могут быть осаждены на практически любом проводнике или полупроводнике, независимо от формы или топографии, Например, очень грубая поверхность проводника может быть равномерно покрыта биомолекулярной пленкой, или внутренняя часть проводящего материала, такого как платиновая трубка, может быть легко покрыта биомолекулами и помещена в текущий поток для аналитических целей. Также, в отличие от многих других способов осаждения, осаждение биомолекул происходит таким способом, что на проводящем субстрате осаждаются только требуемые молекулы.

Другое преимущество основано на относительно тонком слое биомолекул, который может быть осажден на биосенсорном электроде. Очень тонкие мономолекулярные пленки или пленки с толщиной намного меньше 1 микрометра могут быть причиной того, что реакция между физиологическим лигандом и биомолекулой может лимитироваться по скорости из-за малого количества биомолекул, способных к реакции, уменьшается чувствительность датчика, функция взаимодействия (между биомолекулой и лигандом) носит нелинейный характер, что может затруднить определение количества лиганда в растворе.

Другое преимущество настоящего изобретения вытекает из применения постоянного тока в процессе осаждения на биосенсорном электроде, в результате происходит равномерное осаждение биомолекул на биосенсорном электроде, несмотря на то, что осаждение биомолекул блокирует поверхность электрода и повышает электрическое сопротивление. Из-за повышения электрического сопротивления биосенсорного электрода во время осаждения как ток, так и скорость осаждения биомолекул обычно уменьшаются, хотя напряжение уменьшается незначительно. Уменьшение скорости осаждения будет продолжаться до полного прекращения осаждения, хотя осажденная пленка может быть намного тоньше, чем требуется. Напротив, настоящим изобретением предусмотрено поддержание величины тока постоянной и напряжение возрастает с повышением сопротивления до тех пор, пока напряжение достигнет величины, при которой вода будет восстанавливаться или окисляться с образованием пузырьков газа, таким образом способствуя формированию толщиной более 10 микрометров.

Следующее преимущество настоящего изобретения состоит в его применимости при значениях рН, сравнимых с величинами рН, при которых образуются биомолекулы. Очень тонкие пленки протеинокислотных биомолекул, таких как энзимы, могут быть осаждены при физиологическом рН (7,4) в водных растворах, что сводит к минимуму возникновение проблем, связанных с инактивацией или денатурированием энзима, что может встречаться в случае использования других методов осаждения энзимных пленок.

Дополнительные преимущества изобретения станут очевидными после рассмотрения детального описания настоящего воплощения с примерами наилучшего способа проведения процесса.

Краткое описание рисунка.

На рис.1 приведена схематическая иллюстрация аппарата для электроосаждения биомолекул на биосенсорный электрод, погруженный в водную жидкость, содержащую необходимые биомолекулы.

Описание предлагаемого воплощения.

Как показано на рис. 1, аппарат для электроосаждения 10 пригоден для выполнения процесса настоящего изобретения. Аппарат 10 включает контейнер 12 для хранения жидкости 30. Жидкость 30 может быть раствором или суспензией, содержащей необходимый вид биомолекулы. Источник электрической энергии 14 имеет положительный полюс 16, соединенный с биосенсорным электродом 22, и отрицательный полюс 18, соединенный с противоэлектродом 20, и предусмотрен для обеспечения в значительной мере постоянного тока между двумя электродами 20 и 22. Биосенсорный электрод 22 образует часть биосенсорной ячейки 25, которая включает биосенсорный электрод 22 и электрически непроводящий cубстрат 24. Полюса 16 и 18 защищены диэлектрическим материалом, способным выдержать погружение в жидкость 30.

По желанию можно поменять направление тока путем переключения контактов полюсов 16 и 18 на источнике энергии 14 так, чтобы делать полюс 16 отрицательно заряженным, а полюс 16 положительно. Поскольку полюса 16 и 18 защищены и субстрат 24, окружающий биосенсорный электрод, изготовлен из непроводящего материала, осаждение биомолекулярных частиц, содержащихся в жидкости 30, будет происходить только на электродах 20 или 22, имеющих заряд, противоположный по знаку заряду биомолекулы в жидкости 30.

Биомолекулы, предназначенные для осаждения на электродах 20 или 22, включают, но не ограниченно, следующие классы встречающихся в природе или искусственно синтезированных молекул или групп молекул, существующих как компоненты биологических систем: пептиды, олигопептиды, протеины, апpопpотеины, гликопротеины, антигены, антитела, фрагменты антител, гаптены, антитела, рецепторы и другие мембранные протеины, аналоги протеинов, в которых, по крайней мере, непептидная связь заменена на пептидную связь. Энзимы и энзимные предшественники, коэнзимы, ингибиторы энзимов, аминокислоты и их производные, гормоны, липиды, фосфолипиды, гликолипиды, липосомы, нуклеотиды, олигонуклеотиды, полинуклеотиды и их искусственно признанные и биологически функциональные аналоги и производные, включающие, например, метилированные полинуклеотиды и аналоги нуклеотидов, имеющие тиофосфорные связи: плазмиды, коэмиды, искусственные хромосомы, другие носители нуклеиновой кислоты: антисенсорные полинуклеотиды, включая дополнительные, по крайней мере, одной эндогенной нуклеиновой кислотой, или имеющие последовательность с чувствительностью, противопоставленной, по крайней мере, части избранных виральных или ретровиральных геномов, и любая биологически активная молекула, любая из предшествующих биомолекул, имеющая слабую, или несуществующую полярность, или индуцированную полярность в условиях, имеющихся в аппарате 10, может быть ковалентно связана с соответственно заряженным переносчиком, образуя заряженный комплекс, который можно осадить на электродах 20 или 22.

Представители указанных классов биомолекул и любая другая комбинация специфичных представителей может, таким образом, быть помещена в раствор или суспензию в виде коллоидных частиц в жидкость 30 с использованием искусственных методов, что зависит от состава жидкости 30. В общем случае жидкость 30 водный раствор, такой как физиологический раствор, способный проводить значительный электрический ток. Другие добавки, такие как неионогенные поверхностно-активные вещества и антивспениватели, также могут быть добавлены, если требуется.

Направление, скорость миграции и скорость осаждения биомолекул из раствора или просуспендированных в жидкости 30 на электроды 20 и 22 можно довольно точно контролировать установкой рН в жидкости 30. Этот контроль основан на обычной технике электрофореза, применимой для постоянно заряженных частиц, что дает биомолекуле величину заряда в жидкости 30 в зависимости от рН. Величина рН, при которой молекула нулевой отрицательный имеет заряд и, таким образом, не мигрирует под влиянием магнитного поля, определяется как ее изоэлектрическая точка. При значениях рН больше, чем изоэлектрическая точка, молекула имеет отрицательный заряд, при значении рН меньше изоэлектрической точки, молекула имеет положительный заряд. Соответственно в аппарате, показанном на рис.1, величина рН установлена больше или меньше изоэлектрической точки необходимой молекулы, которую осаждают на электроды 20 или 22. Такую установку можно проводить с помощью известных кислотных или щелочных агентов.

Связывающие агенты, введенные в раствор либо одновременно с введением нужной биомолекулы либо введенные после осаждения на электродах 20 или 22, полезны для ускорения образования нерастворимой в воде массы на электродах. Связывающие агенты обычно включают полифункциональные мостиковые группы, пригодные для образования ковалентной связи с биомолекулой, но могут также включать облучение или другие воздействия, способствующие образованию ковалентной связи между биомолекулами без мостиковых групп. Тип связывающего агента меняется в зависимости от типа осаждаемой биомолекулы и может включать, например, силаны, алкиламиновые агенты сочетания, изотиоцианаты, триазиновые агенты сочетания, агенты азосочетания, фенилгидразиновые агенты сочетания, карбодиимиды и солянокислые агенты сочетания. Использование глютаральдегида имеет особое значение в настоящем изобретении, хотя и другие химические агенты сочетания, такие как 4-азидофенацилбромид, бензофенон-3,3',4,4'-тетракарбоксидиангидрид, эфир биотин-N-тетpагидроксисукцинамида, биотин-4-нитрофениловый эфир, 2,2'-бихинолин-4,4'-дикарбоновая кислота, бис(4-фтор-3-нитрофенил)-сульфон, 1,5-бис(сукцинимидоксикарбонилокси)пентан, 4(вос-аминометил)фенилизоцианат, N-вос-1,6-диаминогексан гидрохлорида, цианурхлорид, 4,4'-диазостильбен-2,2'-дисульфокислоты динатриевая соль, диангидрид диэтилентриаминпентауксусной кислоты, диэтилентриаминпентауксусной кислоты, диэтиленпирокарбонат, 1,5-дифтор2,4-динитробензол, 1,6-диизоцианогексан, 4,4'-диизотиоцианатстильбен-2,2'-дисульфокислоты динатриевая соль, диметиладипимидат дигидрохлорид, N-(диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида гидрохлорид, диметил-3,3'-дитиодипропионимидат гидрохлорид, диметилпимелиндиимидат гидрохлорид, диметилсуберимидат дигидрохлорид, бис(N-гидроксисукцинимид эфир)3,3'-дитиопропионовой кислоты, 4-фтор-3-нитрофенилазид, формальдегид, фумаронитрил, глютаральдегид, глютаронитрил, гликольальдегид, гексаметилендиизоцианат, 6-гидрокси-2-нафтилсульфид, 3(-гидроксиенил)-пропионовой кислоты N-гидроксисукцинимидэфир, 2-иминоотиолангидрохлорид, 4-малеимидобутиламидометил-полистирол, N,N'-(1,4-фенилен)-дималеимид. Полиэтиленгликоль 600 дикислота, N-сукцинимидил-3-малеимидобензоат, N-сукцинимидил-4-малеимидобутират, N-сукцинимидил-6-малеимидокапроат, 6-сукцинимидилмалеимидопропионат. Тиодиэтиленгликоль. Толуол-2,4-дизоцианат и мета-ксилил-диизоцианат также могут использоваться как бивалентные связывающие агенты.

Биосенсорные электроды, изготовленные согласно методу настоящего изобретения, могут использоваться в широком ряде молекулярных детекторных систем, включая аперометрические электрохимические биосенсоры, калориметрические, акустические, потенциометрические, оптические и биосенсоры на базе исфет.

Для лучшей оценки преимуществ изобретения представлены следующие примеры.

ПРИМЕР 1.

5% -ный по весу раствор глюкозоксидазы приготовлен с использованием фосфатного буферного физиологического раствора (рН 7,4) в качестве растворителя. Глюкозоксидаза тщательно растворяется в физиологическом растворе при медленном перемешивании. Причем во время перемешивания следует избегать вспенивания, что может привести к денатурированию глюкозоксидазы. Электроосадительная ячейка наполнена этим раствором, и биосенсорный электрод, на который осаждается энзим, вместе с противоэлектродом погружается в ячейку. Электроконтакты подсоединены к гальваностату. Устанавливается ток с постоянной плотностью 5 мА/см² на поверхности электрода. Направление электрического тока ориентировано таким образом, чтобы положительный заряд на поверхности электрода притягивал отрицательно заряженные молекулы глюкозоксидазы. Ток пропускается 2 минуты. Напряжение во время осаждения не превышает 0,5 вольт. Затем электрод вынимается из раствора энзима и погружается в деионизированную дистиллированную воду на 5 сек без перемешивания для удаления осадка глюкозоксидазы.

Электрод затем погружается в раствор, содержащий 2,5% объемных глютаральдегида в фосфатном физиологическом растворе (рН 7,4), на 30 минут для ковалентного соединения молекул глюкозы и образования нерастворимой в воде массы. Электрод снова погружается в деионизированную дистиллированную воду на 5 сек и сушится на воздухе 30 минут.

Проверка электрода обнаруживает слой глюкозоксидазы примерно 1,5 толщиной. Последующим испытанием найдено, что энзимный компонент биосенсора функционирует в этой точке.

ПРИМЕР 2.

Соосаждение двух или более биомолекул на поверхности электрода также возможно при условии, что их изоэлектрические точки выше или ниже рН осаждаемого раствора. В этом примере готовится фосфатный буферный физиологический раствор (рН 7,4), содержащий 5% весовых глюкозоксидазы и 5% весовых альбумина. Изоэлектрические точки глюкозоксидазы альбумина 4,3 и 4,7 соответственно. В результате у обеих молекул имеется отрицательный заряд при рН раствора 7,4. Электрод погружается в раствор глюкозоксидазы и альбумина, и в течение 2 минут на него подается ток плотностью 5 мА/см². Молекулы связываются в глютаральдегидном растворе. Как описано в примере 1, электрод прополаскивается и сушится. Найдено в результате, что слой глюкозоксидазы (альбумина примерно 5 m толщиной. При длительном испытании активности глюкозоксидазы найдено, что слой глюкозоксидазы) альбумина значительно более стабилен, чем только глюкозоксидазный слой, полученный согласно примеру 1.

ПРИМЕР 3.

Готовился раствор 2,4 мг/л кроликового антифлуоресцентного антитела (очищенного) с использованием борного буферного раствора (рН 9,0) в качестве растворителя. Значение рН было выбрано для поддержания максимальной связывающей активности антитела. Электроосадительная ячейка наполнялась этим раствором, и в него погружались биосенсорный электрод, на который осаждались антитела, и противоэлектрод. Электроконтакты подсоединены к гальваностату. Устанавливался ток с постоянной плотностью 5 мА/см • кВ на поверхности электрода. Направление тока ориентировано так, чтобы в результате на поверхности биосенсорного электрода создавался отрицательный заряд для притягивания положительно заряженных молекул антитела. Ток пропускался 50 минут. Электрод удалялся из раствора антитела и погружался в деионизированную дистиллированую воду без перемешивания на 5 сек для удаления осадка антитела.

Электрод затем погружался в раствор, содержащий 2,5% объемных глиютаральдегида в фосфатном буферном физиологическом растворе (рН 7,4), на 30 минут для ковалентного связывания молекул глюкозы и образования нерастворимой в воде массы. Электрод снова погружался в деионизированную дистиллированную воду на 5 сек и высушивался на воздухе 30 минут. Проверка электрода показала, что слой электроосажденного антитела имеет толщину примерно 5,5m.

Хотя изобретение описано в деталях со ссылкой на определенные устройства и специфичные примеры, возможны варианты и модификации, как описано и определено в последующей заявке.

Использование: изобретение относится к области медицины и может быть использовано для иммобилизации биомолекул в проводящем субстрате. Сущность изобретения: способ получения биосенсорного электрода включает приготовление забуференного раствора биомолекул в степени, достаточной для предотвращения денатурирования биомолекул и такой, чтобы все виды биомолекул имели бы одинаковый знак электрического заряда, определяемый их изоэлектрическими точками. Затем в раствор погружают два электрода и создают между ними разность потенциалов менее 1 вольта. При этом разность потенциалов варьируют в режиме, обеспечивающем постоянный электрический ток, достаточный для осаждения биомолекул на одном из электродов и накопления их на нем. 3 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения биосенсорного электрода, включающий приготовление раствора, содержащего по крайней мере один вид биомолекул, погружение в раствор двух электродов, создание между электродами разности потенциалов менее 1 В, отличающийся тем, что раствор приготавливают забуференным в степени, достаточной для предотвращения денатурирования биомолекул и такой, чтобы все виды биомолекул имели бы одинаковый знак электрического заряда, определяемый их изоэлектрическими точками, при этом разность потенциалов варьируют в режиме, обеспечивающем постоянный электрический ток, достаточный для осаждения биомолекул на одном из электродов и накопления их на нем. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют стадию ввода в раствор связывающего агента для формирования на электроде не растворимой в воде осажденной массы биомолекул. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве биомолекул используют протеин. 4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве биомолекул используют глюкозооксидазу, причем связывающий агент вводят в раствор в количестве и в течение времени, достаточных для формирования слоя осажденной массы более 10 мкм.