ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДСТАВЛЕННОЙ через EFS-WEB
Список последовательностей ASCII с названием "8441-0009-1-ST25", размер которого составляет 17,4 кб, создан 15 июня 2018 года и отправлен в электронном виде через EFS-Web с настоящей заявкой, и включен во всей полноте в настоящий документ посредством ссылки.
ПРАВА ПРАВИТЕЛЬСТВА
Настоящее изобретение поддержано правительством США в рамках гранта FD-U-005110, выданного Управлением по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами. Таким образом, правительство Соединенных Штатов может иметь определенные права на настоящее изобретение, описанное и заявленное в настоящем документе.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной патентной заявкой США 62/539,821, поданной 1 августа 2017 года, и предварительной патентной заявкой США 62/637,609, поданной 2 марта 2018 года, содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к гуманизированным и химерным (например, мыши и человека) антителам и их антигенсвязывающим фрагментам для применения для лечения заболеваний, сопровождающихся отложением амилоида, в частности первичного (AL) амилоидоза, фармацевтическим композициям, содержащим такие антитела, и к способам лечения заболеваний, сопровождающихся отложением амилоида, с применением указанных антител и фармацевтических композиций. Изобретение дополнительно относится к способам лечения заболеваний, сопровождающихся отложением амилоида, с помощью реактивных антител к амилоидным фибриллам. В частности, настоящее изобретение относится к способам улучшения функции миокарда у пациентов с диагнозом амилоидоз легкой цепи (ALA), который включает поражение сердца (то есть отложение амилоида в сердце или вокруг него). У таких пациентов могут быть отложения ALA, содержащие амилоиды, сформированные легкими цепями типа лямбда или амилоиды, сформированные легкими цепями типа каппа. Кроме того, у пациентов может быть заболевание, при котором гематологическая ремиссия достигнута или не достигнута.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Следующее обсуждение предоставлено, чтобы помочь читателю понять настоящее изобретение, и не предназначено для описания или определения предшествующего уровня техники.
Нативные антитела обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой приблизительно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной дисульфидной связью, в то время как число дополнительных дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьируется в зависимости от различных изотипов антител. Простейшим изотипом является IgG (иммуноглобулин G), который содержит всего две легкие цепи и две тяжелые цепи, в которых две тяжелые цепи связаны двумя дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (VH) на одном конце с несколькими смежными константными доменами. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (VL) на одном конце и константный домен на другом конце. Каждый вариабельный домен легкой и тяжелой цепи в антителе содержит три сегмента, называемых областями, определяющими комплементарность ("CDR") или гипервариабельными областями. Каждый CDR в легкой цепи вместе с соответствующим CDR в соседней тяжелой цепи образуют антигенсвязывающий сайт антитела. Легкие цепи бывают двух основных типов, κ и λ, в зависимости от их константной области. Легкие цепи κ и λ могут сочетаться с любыми различными типами тяжелых цепей.
Амилоидоз легкой цепи (AL-амилоидоз, AL или ALA), также называемый первичным амилоидозом, является наиболее распространенной формой системного амилоидоза в Соединенных Штатах. Термин "амилоидоз" относится к группе заболеваний, которые имеют общую черту, то есть внеклеточное отложение патологически нерастворимых фибриллярных белков в органах и тканях (Rodney et al. - NEJM, 25:898). Амилоидоз вызван нарушением функции антителопродуцирующих клеток человека, что приводит к образованию аномальных белковых волокон, которые агрегируют, образуя нерастворимые амилоидные отложения в органах и тканях. Тип амилоидоза определяется природой белков-предшественников, которые образуют отложения фибрилл. При первичном амилоидозе фибриллы содержат фрагменты легких цепей иммуноглобулинов, а при вторичном амилоидозе фибриллы содержат белок амилоида А. Современная классификация амилоидоза основана на природе белков-предшественников плазмы, которые образуют отложения фибрилл.
Белки-предшественники плазмы разнообразны и не связаны. Тем не менее, все отложения предшественников образуют амилоидные отложения, которые имеют общую типичную β-складчатую конфигурацию, которая отвечает за типичные окрашивающие свойства фибриллярных отложений. Завершающей стадией развития амилоидоза является отложение амилоидных фибрилл в органах субъекта, подверженного заболеванию. Смертность при амилоидозе высока, при нынешней пятилетней выживаемости приблизительно 28 %.
До настоящего времени лечение AL было направлено на уменьшение синтеза легких цепей амилоидогенного предшественника посредством атаки на неисправные клетки посредством обычной или высокой дозы цитотоксической химиотерапии. Данное лечение отличается двумя недостатками. Во-первых, фибриллярные отложения часто не имеют симптомов до тех пор, пока не станут значительными. Следовательно, лечение вряд ли будет назначено до выявления значительных отложений. Во-вторых, поскольку данное лечение, в лучшем случае, эффективно только для остановки синтеза аномального белка-предшественника, но не для удаления существующих отложений, прогноз для пациентов с AL остается крайне плохим из-за устойчивости (или прогрессирования) патологических отложений (Solomon, et al. - Int. J. Exp. Clin. Invest. 2:269)
В результате, терапевтическое таргетирование и клиренс амилоидных отложений представляет собой область усиленного медицинского интереса. Тем не менее, FDA не одобрило какие-либо терапевтические продукты на сегодняшний день, и, следовательно, все еще существует значительная неудовлетворенная медицинская потребность в таких продуктах.
Композиции и способы, раскрытые в настоящей заявке, удовлетворяют данную потребность.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем документе описаны композиции и способы лечения заболеваний, сопровождающихся отложением амилоида, в частности, первичного (AL) амилоидоза. В раскрытых композициях и способах применяют гуманизированные или химерные антитела или их фрагменты, которые специфически связываются с амилоидными фибриллами (например, амилоидными фибриллами легкой цепи), для нацеливания фибрилл на клиренс иммунной системой.
В одном аспекте композиции и способы по настоящему изобретению содержат гуманизированные или химерные антитела (например, химерные антитела мыши и человека), применяемые для лечения заболеваний, сопровождающихся отложением амилоида, в частности первичного (ALA) амилоидоза. В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению содержит область VK, содержащую последовательность SEQ ID NO: 47, и область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 48. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит константную область, полученную из человеческого IgG1. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с амилоидными фибриллами с более высокой аффинностью, чем его мышиный эквивалент. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с эпитопом, экспрессируемым β-складчатой конфигурацией амилоидных фибрилл с более высокой аффинностью, чем мышиное антитело, содержащее область VK SEQ ID NO: 36 и область VH SEQ ID NO: 35. И в некоторых вариантах осуществления антитело связывается с амилоидными фибриллами типа каппа и лямбда in vivo.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим гуманизированное или химерное антитело по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Химерное антитело, применяемое в способах и фармацевтических композициях по настоящему изобретению, может быть получено путем котрансфекции векторных конструкций 11-1F4VK.pKN100 и 11-F4VH.pG1D200 в клетках млекопитающих или трансфекции супервекторной конструкции pG1KD200-11-1F4 в клетках млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления котрансфекцию векторных конструкций 11-1F4VK.pKN100 и 11-F4VH.pG1D200 или трансфекцию супервекторной конструкции pG1KD200-11-1F4 осуществляют в клетках COS (яичник китайского хомячка). Полученное антитело обозначено как "химерное антитело 11-1F4".
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения или ослабления заболеваний, сопровождающихся отложением амилоида, таких как первичный (AL) амилоидоз, у человека, нуждающегося в таком лечении, путем введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении или ослаблении, терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного из раскрытых антител или фрагментов в количестве, эффективном для лечения или ослабления заболевания, сопровождающегося отложением амилоида и/или симптомов заболевания. В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению можно вводить вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
В некоторых вариантах осуществления заболевание, сопровождающееся отложением амилоида, представляет собой первичный амилоидоз. В некоторых вариантах осуществления антитело вводят в дозе приблизительно 500 мг/м2 или менее, тогда как в некоторых вариантах осуществления эффективная доза химерного антитела 11-1F4 составляет приблизительно 2200 мг, а в некоторых вариантах осуществления эффективное количество составляет приблизительно от 1 до 50 мг/кг.
В некоторых вариантах осуществления первичный амилоидоз включает поражение по меньшей мере одного органа или ткани, выбранных из группы, состоящей из сердца, почек, печени, легких, желудочно-кишечного тракта, нервной системы, скелетно-мышечной системы, мягких тканей и кожи.
В некоторых вариантах осуществления, когда амилоидоз воздействует на сердце, уровень N-терминального натрийуретического пептида головного мозга (NT-proBNP) пациента может снижаться после введения антитела по меньшей мере приблизительно на 30 % или приблизительно на 40 % по сравнению с базовыми уровнями. В некоторых вариантах осуществления уровень N-терминального натрийуретического пептида головного мозга (NT-proBNP) пациента может снижаться до менее приблизительно 9100, приблизительно 8000, приблизительно 7000, приблизительно 6000 или приблизительно 5000 нг/л после введения антитела. В некоторых вариантах осуществления пациентов причисляли к классу II или III по функциональной классификации Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYKA) до введения антитела, а затем причисляли к классу I после введения антитела.
В некоторых вариантах осуществления, когда амилоидоз влияет на почки, уровень белка в моче пациента может снижаться после введения антитела по меньшей мере приблизительно на 30 % или приблизительно на 40 % по сравнению с базовыми уровнями. В некоторых вариантах осуществления белок в моче пациента может снижаться до менее приблизительно 7000, приблизительно 6000, приблизительно 5000 или приблизительно 4000 мг/24 часа после введения антитела.
В некоторых вариантах осуществления введение антитела не вызывает каких-либо серьезных нежелательных явлений.
Настоящее изобретение относится к способам лечения ALA с поражением сердца. Раскрытые способы уникально способны обеспечить благоприятные клинические результаты в течение приблизительно 3 недель после начала лечения и в популяции пациентов, которые ранее считались не поддающимися лечению из-за чрезвычайно короткой продолжительности жизни.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам улучшения функции миокарда у пациента с диагнозом амилоидоз легкой цепи (ALA) с поражением сердца, включающим: введение пациенту с диагнозом ALA с поражением сердца терапевтически эффективного количества гуманизированного или химерного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат: вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую: область, определяющую комплементарность (CDR) H1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 52, CDRH2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 53, и CDRH3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 54, и вариабельную область легкой цепи (VK), содержащую CDRL1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 49, CDRL2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 50, и CDRL3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 51, тем самым улучшая функцию миокарда пациента в течение приблизительно трех недель после введения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам мониторинга улучшения функции миокарда у пациента с диагнозом амилоидоз легкой цепи (ALA) с поражением сердца, включающим наблюдение за улучшением функции миокарда у пациента с диагнозом ALA, имеющим поражение сердца, в пределах приблизительно три недели после введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 или его антигенсвязывающего фрагмента.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения амилоидоза легкой цепи (ALA) с поражением сердца у пациента, где ALA не достигает гематологической ремиссии, где способ включает введение пациенту с ALA, отличающимся поражением сердца и отсутствием гематологической ремиссии, терапевтически эффективного количества гуманизированного или химерного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего: вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую: область, определяющую комплементарность (CDR) H1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 52, CDRH2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 53, и CDRH3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 54, и вариабельную область легкой цепи (VK), содержащую CDRL1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 49, CDRL2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 50, и CDRL3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 51.
В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутых аспектов, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут представлять собой гуманизированное антитело, тогда как в некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут представлять собой химерное антитело.
В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутых аспектов, область VK антитела или антигенсвязывающего фрагмента может содержать последовательность SEQ ID NO: 47, а область VH может содержать последовательность SEQ ID NO: 48.
В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутых аспектов, антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут содержать константную область, которая происходит из человеческого IgG1.
В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутых аспектов, способы могут обеспечивать улучшение функции миокарда, которое сохраняется в течение по меньшей мере трех месяцев после введения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления улучшение может сохраняться в течение четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати, или более месяцев.
В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутых аспектов, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно вводить не более одного раза, двух, трех или четырех раз в течение трехмесячного периода. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенный фрагмент можно вводить еще реже, например, один раз в два месяца или один раз каждые три месяца.
В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутых аспектов, способы обеспечивают улучшение функции миокарда, которое может включать улучшение глобальной продольной деформации (GLS) по сравнению с уровнем GLS до лечения.
В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутых аспектов, уровень NT-proBNP у пациента до лечения превышает 650 пг/мл.
В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутых аспектов, терапевтически эффективная доза или количество антитела или фрагмента антитела эффективны для снижения уровня NT-proBNP у пациента после лечения приблизительно на 300 пг/мл или более по сравнению с уровнем NT-proBNP до лечения. В некоторых вариантах осуществления снижение уровня NT-proBNP может составлять приблизительно 400, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 900 или приблизительно 1000 или более пг/мл.
В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутых аспектов, способы обеспечивают улучшение функции миокарда, которое может включать снижение уровня NT-proBNP после лечения приблизительно на 30% или более по сравнению с уровнем NT-proBNP до лечения.
В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутых аспектов, пациент может страдать от рецидивного или рефрактерного ALA.
В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутых аспектов, ALA может дополнительно характеризоваться поражением сердца амилоидами, сформированными легкими цепями типа лямбда, тогда как в некоторых вариантах осуществления ALA может быть дополнительно характеризоваться поражением сердца амилоидами, сформированными легкими цепями типа каппа.
В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутых аспектов, ALA не достигает гематологической ремиссии. Например, разница между вовлеченными и не вовлеченными свободными легкими цепями в сыворотке субъекта может составлять более 40 мг/л, или детектируют уровни токсичных амилоидных белков-предшественников у субъекта в его или ее крови, или сыворотке.
В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутых аспектов, способы могут дополнительно включать введение химиотерапевтического соединения пациенту.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам детекции заболевания, сопровождающегося отложением амилоида, у пациента с подозрением на такое заболевание, путем введения меченого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и детектирования присутствия метки у пациента. В некоторых вариантах осуществления метка может представлять собой радиоактивную метку, такую как 124I, но специалистам в данной области техники будет очевидно применение других видов меток.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения пациента с заболеванием, сопровождающимся отложением амилоида, включающим введение терапевтически эффективного количества гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 или его антигенсвязывающего фрагмента указанному пациенту реже одного раза в месяц. Например, в некоторых вариантах осуществления лечение может требовать введения пациенту терапевтически эффективного количества гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 или его антигенсвязывающего фрагмента только один раз в два месяца, один раз в три месяца, один раз в четыре месяца, один раз в пять месяцев, один раз в шесть месяцев, один раз в семь месяцев, один раз в восемь месяцев, один раз в девять месяцев, один раз в десять месяцев, один раз в одиннадцать месяцев или один раз в год.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, гуманизированное или химерное антитело 11-1F4 содержит константную область, полученную из человеческого IgG1.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта заболевание, сопровождающееся отложением амилоида, представляет собой первичный амилоидоз легкой цепи (AL), и заболевание включаеь наличие фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа лямбда. В некоторых вариантах осуществления присутствие фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа лямбда, значительно снижается после введения антитела.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, терапевтически эффективное количество гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 или его антигенсвязывающего фрагмента составляет 500 мг/м2 или менее, тогда как в некоторых вариантах терапевтически эффективное количество гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 или его антигенсвязывающего фрагмента составляет приблизительно 2200 мг, а в некоторых вариантах терапевтически эффективное количество составляет приблизительно от 1 до 50 мг/кг.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, терапевтически эффективное количество гуманизированного или химерного mAb 11-1F4 или антигенсвязывающего фрагмента вводят один раз в два, три, четыре, пять или шесть месяцев. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество химерного mAb 11-1F4 или антигенсвязывающего фрагмента вводят два раза в год или только один раз в год.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения пациента с диагнозом первичный амилоидоз легкой цепи (AL) с поражением сердца, включающим введение дозы гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 указанному пациенту, причем указанная доза эффективна для снижения уровня N-терминального натрийуретического пептида головного мозга (NT-proBNP) по меньшей мере на 30 % у указанного пациента после введения химерного антитела 11-1F4 по сравнению с уровнем до лечения. В некоторых вариантах осуществления AL-амилоидоз является рефрактерным.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, гуманизированное или химерное антитело 11-1F4 содержит константную область, полученную из человеческого IgG1.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, гуманизированное или химерное антитело 11-1F4 вводят один раз в месяц, тогда как в некоторых вариантах осуществления гуманизированное или химерное антитело 11-1F4 вводят один раз в неделю.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, терапевтически эффективное количество гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 составляет 500 мг/м2 или менее, тогда как в некоторых вариантах терапевтически эффективное количество гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 составляет приблизительно 2200 мг, а в некоторых вариантах эффективное количество составляет приблизительно от 1 до 50 мг/кг.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, снижение NT-proBNP сохраняется у пациента в течение по меньшей мере приблизительно шести месяцев после введения химерного антитела 11-1F4.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения пациента с диагнозом первичный амилоидоз легкой цепи (AL) с поражением почек, включающим введение дозы гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 или фрагмента антигенсвязывающего антитела указанному пациенту, причем указанная доза эффективна для снижения протеинурии по меньшей мере на 40 % у указанного пациента после введения гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 по сравнению с уровнем до лечения. В некоторых вариантах осуществления AL-амилоидоз является рефрактерным.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, гуманизированное или химерное антитело 11-1F4 содержит константную область, полученную из человеческого IgG1.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, гуманизированное или химерное антитело 11-1F4 вводят один раз в месяц, тогда как в некоторых вариантах осуществления гуманизированное или химерное антитело 11-1F4 вводят один раз в неделю.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, терапевтически эффективное количество гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 составляет 500 мг/м2 или менее, тогда как в некоторых вариантах терапевтически эффективное количество гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 составляет приблизительно 2200 мг, а в некоторых вариантах терапевтически эффективное количество составляет приблизительно от 1 до 50 мг/кг.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, снижение протеинурии сохраняется у пациента в течение по меньшей мере приблизительно шести месяцев после введения химерного антитела 11-1F4.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам уменьшения количества отложений фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа каппа или лямбда, у пациента, нуждающегося в этом, включающим введение указанному пациенту дозы антитела, содержащего: (a) область VK содержащую последовательность SEQ ID NO: 47, (b) область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 48, и (c) константную область человеческого IgG1, причем указанная доза эффективна для уменьшения количества отложений фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа каппа или лямбда, у пациента.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, первичный амилоидоз характеризуется наличием отложений фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа лямбда, в то время как в некоторых вариантах осуществления первичный амилоидоз характеризуется наличием отложений фибриллярных агрегатов сформированных легкими цепями типа каппа, а в других вариантах осуществления первичный амилоидоз характеризуется наличием отложений фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа каппа и лямбда.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, гуманизированное или химерное антитело 11-1F4 вводят один раз в месяц, тогда как в некоторых вариантах осуществления гуманизированное или химерное антитело 11-1F4 вводят один раз в неделю.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, терапевтически эффективное количество гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 составляет 500 мг/м2 или менее, тогда как в некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 составляет приблизительно 2200 мг, а в некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество составляет приблизительно от 1 до 50 мг/кг.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения AL-амилоидоза, включающим введение пациенту с AL-амилоидозом моноклонального антитела, содержащего области, определяющие комплементарность (CDR) антитела 11-1F4, где антитело не является мышиным 11-14F.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, антитело может представлять собой химерное антитело мыши и человека.
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта, антитело содержит константную область человеческого IgG1.
В некоторых вариантах осуществления любого из вышеупомянутых способов, дисфункция органов у пациента уменьшается после введения антитела. В некоторых вариантах осуществления любого из указанных выше способов, у пациента проявляются признаки терапевтического ответа менее чем через 5 недель после лечения, иногда менее чем через 4 недели после лечения, иногда менее чем через 3 недели после лечения, иногда менее чем через 2 недели после лечения, тогда как в некоторых других вариантах осуществления у пациента проявляются признаки терапевтического ответа в течение приблизительно недели или менее после лечения.
Вышеизложенное общее описание и последующее подробное описание являются примерными и пояснительными и предназначены для дополнительного объяснения изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фигуре 1 представлена стратегия, применяемая для клонирования мышиных генов VH и VK из линии клеток гибридомы.
Фигура 2 представляет собой перечень последовательностей ДНК и аминокислот гена области VH мышиного антитела 11-1F4, SEQ ID NO: 39 и NO: 35 соответственно.
Фигура 3 представляет собой список последовательностей ДНК и аминокислот гена области VK мышиного антитела 11-1F4, SEQ ID NO: 40 и NO: 36 соответственно.
Фигура 4 представляет собой карту вектора экспрессии pKN100 легкой цепи каппа иммуноглобулина. Он состоит из фрагмента вектора pSV2, который имеет ранний SV40 и поврежденный поздний SV40 промотор, точку начала SV40 и точку начала Co1E1. Он также обладает геном устойчивости к ампициллину и геном устойчивости к неомицину. Поврежденный поздний промотор SV40 управляет генами устойчивости к неомицину. Он также имеет промотор HCMVi, сайт множественного клонирования (содержащий сайты рестрикции HindIII и BamHI) для встраивания гена вариабельной области иммуноглобулина, и кДНК для гена константной области каппа человека, заканчивающийся терминирующим кодоном spaC2 ("Arnie"), который находится в той же ориентации, что и кассета экспрессии легкой цепи типа каппа.
На фигуре 5 представлена карта вектора экспрессии pG1D200 тяжелой цепи иммуноглобулина гамма-1. Он состоит из фрагмента вектора pSV2dhfr, который имеет ранний SV40 и поврежденный поздний промотор SV40, точку начала SV40 и точку начала Co1E1. Он также имеет ген устойчивости к ампициллину и ген устойчивости к dhfr (дигидрофолатредуктаза). Поврежденный поздний промотор SV40 управляет геном устойчивости dhfr. Следовательно, экспрессия является слабовыраженной, что позволяет отбирать клоны с мультигенным/высоким уровнем экспрессии с применением сравнительно низких уровней метотрексата. Он также имеет фрагмент промотора HCMVi, сайт множественного клонирования, кДНК для гена константной области человеческого гамма-1 (интрон минус), за которым следует терминирующий кодон spaC2 ("Arnie").
Фигура 6 представляет собой список последовательностей ДНК и аминокислот модифицированного гена области VK мышиного антитела 11-1F4 (SEQ ID NO: 42 и NO: 47 соответственно) и последовательностей олигонуклеотидных праймеров, применяемых для модификации гена VK (SEQ ID NO: 41 и NO: 43 соответственно).
Фигура 7 представляет собой перечень последовательностей ДНК и аминокислот модифицированного гена области VH мышиного антитела 11-1F4 (SEQ ID NO: 45 и NO: 48 соответственно) и последовательностей олигонуклеотидных праймеров, применяемых для модификации гена VH (SEQ ID NO: 44 и NO: 46 соответственно).
Фигура 8 является графическим представлением результата анализа ELISA (ИФА - Иммуноферментный твердофазный анализ) на связывание амилоидных фибрилл. Супернатанты cos-клеток, содержащие химерное антитело 11-1F4, тестировали отдельно на том же планшете для ELISA вместе с очищенным мышиным антителом 11-1F4. Поглощение считывали при OD405. Новый sv (супервектор) = pG1KD200-11-1F4. Новая котрансфекция = 11-1F4VHpG1D200 плюс 11-1F4VK.pKN100.
На фигуре 9 показан клиренс человеческих ALκ и человеческих ALλ амилоидом у мышей, получавших лечение с применением мышиного 11-1F4. Мышей лечили либо однократной дозой (панель A), либо множественными дозами (панель B) мышиного 11-1F4. Результаты показывают, что мышиный 11-1F4 быстро очищает амилоидомы ALκ, но в большинстве случаев требовались множественные дозы для очистки амилоидом ALλ мышей.
На фигуре 10 показана схема дозирования/оценки фазы 1a/b испытаний химерного 11-1F4. На панели A показана схема для фазы 1a, а на панели B показана схема для фазы 1b. На панели C показаны дозы, которые применяли в данных исследованиях.
Фигура 11 показывает, что введение химерного 11-1F4 обеспечивает улучшение сердечной функции у большинства пациентов. На панели A показаны результаты фазы 1a/b испытания в виде гистограммы, а на панели B показаны результаты в виде ящичковой диаграммы.
Фигура 12 показывает ответ со стороны сердца (NT-proBNP) у типичного пациента во время фазы 1a/b клинического испытания антитела c11-1F4.
Фигура 13 показывает, что введение химерного 11-1F4 обеспечивает улучшение почечной функции у большинства пациентов. На панели A показаны результаты фазы 1a/b испытания в виде гистограммы, а на панели B показаны результаты в виде ящичковой диаграммы.
На фигуре 14 показан ответ со стороны почек (протеинурия) у типичного пациента во время фазы 1a/b клинического испытания химерного антитела 11-1F4.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с настоящим изобретением обеспечены способы и композиции, содержащие гуманизированные антитела, химерные антитела (например, антитела мыши и человека) или их антигенсвязывающие фрагменты, которые полезны для введения людям, страдающим заболеваниями, сопровождающимися отложения амилоида, для лечения или ослабления заболевания и симптомов заболевания. Антитела и фрагменты антител по настоящему изобретению связываются с амилоидными отложениями и активируют иммунную систему пациента для очищения связанных материалов, в то же время вызывая незначительную реакцию с участием человеческого антимышиного антитела (HAMA) или ее отсутствие. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере одно из указанных антител или фрагментов антител и фармацевтически приемлемый носитель, и способам лечения или ослабления амилоидоза и симптомов амилоидоза путем введения пациенту количества указанного антитела или фрагмента антитела, эффективного для удаления при по меньшей мере некоторых амилоидных отложений из органов пациента и, таким образом, для лечения или ослабления заболевания и его симптомов.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением обеспечены способы лечения заболеваний, сопровождающихся отложением амилоида. В частности, настоящее изобретение направлено на улучшение функции миокарда у пациента с диагнозом амилоидоз легких цепей (ALA) с поражением сердца. Способы включают введение пациенту гуманизированного или химерного антитела (например, антитела мыши и человека) или его антигенсвязывающего фрагмента, который связывается с отложениями амилоидных фибрилл, циркулирующими амилоидами и токсичным белком-предшественником амилоида. В частности, в изобретении раскрыто, что введение антител, связывающих амилоидные фибриллы, по настоящему изобретению, пациентам с диагнозом ALA с поражением сердца приводит к улучшению глобальной продольной деформации (GLS) по сравнению с уровнем GLS до лечения и/или снижению уровня NT-proBNP по сравнению с уровнем NT-proBNP до лечения. Кроме того, пациентов можно эффективно лечить, даже если их заболевание не достигло гематологической ремиссии (т.е. у пациента выявлены уровни токсичных белков-предшественников амилоида в крови или, когда разница между вовлеченными и не вовлеченными свободными легкими цепями более 40 мг/л) и независимо от того, характеризуется ли болезнь наличием фибриллярных белков типа каппа или лямбда.
Определения
Следует понимать, что способы не ограничены конкретными описанными вариантами осуществления и, как таковые, могут быть изменены. Также следует понимать, что применяемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения. Объем способов по настоящему изобретению ограничен только прилагаемой формулой изобретения.
В контексте настоящего документа определенные термины могут иметь следующие определенные значения. Как используется в описании и формуле изобретения, формы единственного числа включают в себя единственное и множественное число, если контекст явно не предписывает иное. Например, термин "клетка" включает одну клетку, а также множество клеток, включая их смеси.
Термин "содержащий", в контексте настоящего документа, предназначен для обозначения того, что композиции и способы включают перечисленные элементы, не исключая другие. "По существу состоящий из", для определения композиций и способов, означает исключение других элементов, имеющих существенное значение для композиции или способа. "Состоит из" означает исключение из заявленных композиций других ингредиентов, в количестве большем, чем примеси, и существенных стадий способа. Варианты осуществления, определенные каждым из данных измененных терминов, входят в объем настоящего изобретения. Соответственно, предполагают, что способы и композиции могут включать дополнительные стадии и компоненты (содержащие) или, в качестве альтернативы, включать стадии и композиции, не имеющие значения (состоящие по существу из) или, в качестве альтернативы, предназначенные только для указанных стадий способа или композиций (состоящих из).
Термин "приблизительно", в контексте настоящего документа, означает плюс или минус 10 %.
Термин "необязательный" или "необязательно", в контексте настоящего документа, означает, что впоследствии описанные событие или обстоятельство могут, или не могут возникнуть, и что описание включает случаи, когда упомянутое событие или обстоятельство происходит, и случаи, когда оно не происходит.
Термины "индивидуум", "пациент" или "субъект", в контексте настоящего документа, могут быть отдельным организмом, позвоночным животным, млекопитающим (например, быком, собакой, кошкой или лошадью) или человеком. В предпочтительном варианте осуществления индивидуум, пациент или субъект представляет собой человека.
Термин "выделенное антитело", в контексте настоящего документа, предназначен для обозначения антитела, которое по существу не содержит других антител, обладающих различной антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с амилоидной фибриллой, по существу не содержит антител, которые не связываются с амилоидными фибриллами). Однако выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом амилоидных фибрилл, сформированных легкими цепями (например, фибриллы лямбда и/или каппа), может, иметь перекрестную реактивность с другими белками, такими как амилоидные фибриллы А. Однако антитело предпочтительно всегда связывается с человеческими амилоидными фибриллами, сформированными легкими цепями. Кроме того, выделенное антитело, как правило, по существу не содержит других клеточных материалов и/или химических веществ.
Выражения "терапевтически эффективное количество" и "терапевтический уровень", в контексте настоящего документа, означают дозу антитела или концентрацию в плазме у субъекта, соответственно, которые обеспечивают специфический фармакологический эффект, для которого антитело вводят субъекту, нуждающемуся в таком лечении, то есть для уменьшения, ослабления или устранения последствий, или симптомов заболевания, сопровождающегося отложением амилоида, такого как AL-амилоидоз. Важно, что терапевтически эффективное количество или терапевтический уровень лекарственного средства не всегда будут эффективными при лечении состояний/заболеваний, описанных здесь, даже если такие дозы считаются терапевтически эффективным количеством специалистами в данной области техники. Терапевтически эффективное количество можно варьировать в зависимости от других факторов, в зависимости от пути введения и лекарственной формы, возраста и массы тела субъекта и/или состояния субъекта, включая тип и стадию амилоидоза в момент начала лечения.
Термины "лечение" или "обработка", в контексте настоящего документа, применительно к амилоидным заболеваниям, таким как AL-амилоидоз, относительно уменьшения, ослабления или устранения одного или более симптомов или последствий амилоидоза, включая, но не ограничиваясь ими, клиренс или деградацию амилоидных бляшек или отложений, улучшение функции органов, пораженных данным заболеванием (например, сердца, почек, печени, и т.д.) и увеличение продолжительности жизни пациента или 5-летней выживаемости.
"Терапевтический ответ" означает улучшение по меньшей мере одного показателя амилоидного заболевания, такое как уменьшение размера существующих амилоидных отложений или бляшек, уменьшение скорости отложения амилоида или улучшение функции органов, измеряемое посредством стандартного способа. Например, у пациентов с амилоидными отложениями в сердце, на улучшение функции органов (т.е. терапевтический ответ) может указывать снижение уровня N-терминального натрийуретического пептида головного мозга (NT-proBNP) пациента или снижение уровня функциональной классификации пациента по Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA). У пациентов с амилоидными отложениями в почках на улучшение функции органов (то есть терапевтический ответ) может указывать снижение протеинурии или скорость выхода белка в моче.
Термин "гуманизированное антитело", в контексте настоящего документа, относится к антителу, которое включает CDR антител, полученных от млекопитающих, отличных от человека, и каркасную область (FR) и константную область человеческого антитела. Гуманизированное антитело является полезным в качестве терапевтически эффективного компонента в терапевтическом агенте согласно настоящему изобретению, поскольку антигенность гуманизированного антитела в организме человека снижена.
Термин "поражение сердца", в контексте настоящего документа, означает, что у пациента, страдающего амилоидным заболеванием, имеются амилоидные отложения в сердце. Отложения амилоида в сердце приводят к высвобождению NT-proBNP и повышенным уровням NT-proBNP в крови пациента. В данном случае пациент имеет поражение сердца, если уровень NT-proBNP превышает 650 пг/мл.
Выражение "не достигает гематологической ремиссии", в контексте настоящего документа, в отношении AL-амилоидоза означает, что заболевание не находится ни в полной ремиссии, ни в очень хорошей частичной ремиссии. Например, заболевание не достигает гематологической ремиссии, когда у пациента выявлены уровни токсичных белков-предшественников амилоида в крови (т.е. в крови или сыворотке) или, когда разница между вовлеченными и не вовлеченными свободными легкими цепями составляет более 40 мг/л в крови или сыворотке пациента.
Термин "серьезное неблагоприятное явление", в контексте настоящего документа, означает неблагоприятное медицинское событие, которое приводит к смерти, опасно для жизни, требует стационарной госпитализации или продления существующей госпитализации, или приводит к постоянному или значительному развитию физических недостатков или инвалидности, как определено в разделе 21 статье 312,32 (а) Свода федеральных правил США.
Термин "фармацевтически приемлемый носитель", в контексте настоящего документа, означает материал для смешивания с фармацевтическим соединением (например, химерным антителом) для введения пациенту, как описано, например, в "Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Delivery Systems", Tenth Edition (2014).
Антитела к AL
Мышиные антитела к фибриллам
Недавние исследования на животных показали, что введение мышиного антитела 11-1F4 и других специфических мышиных антител против человеческих легких цепей, направленных против эпитопа, общего для β-складчатой структуры, присутствующего на фибриллах AL, приводит к полной деградации амилоидных отложений ALκ и ALλ у человека. Некоторые из некоторых мышиных антител описаны в патенте США 8,105,594 ("патент № 594"), который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.
Мышиные антитела, как правило, не подходят для введения другим видам животных (например, людям), потому что принимающий вид распознает мышиное антитело как антигенное и продуцирует антитела против него. Антигенность антитела одного вида при инъекции другому виду обычно вызывается частью константного домена. Такой антигенный ответ будет препятствовать или предотвращать желаемый терапевтический эффект мышиного антитела. У людей данный антигенный ответ называется ответом человеческих антимышиных антител (HAMA). Антитела, описанные в патенте № 594, потенциально могут быть высокоиммуногенными для человека благодаря ответу с участием человеческих антимышиных антител (HAMA). Поскольку ответ HAMA обычно приводит к быстрому клиренсу мышиного антитела от человека-реципиента, HAMA серьезно ограничивает любую потенциальную терапевтическую пользу для человека, которую может иметь мышиное антитело. Следовательно, данные мышиные антитела не подходят для введения пациенту, чтобы остановить или способствовать устранению отложений амилоидных фибрилл у пациента. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы лечения заболеваний, сопровождающихся отложением амилоида, которые с меньшей вероятностью вызывают иммуногенный ответ HAMA у пациента после введения.
Гуманизированные и химерные антитела к фибриллам
Настоящее изобретение относится к гуманизированным и химерным антителам или их антигенсвязывающим фрагментам для лечения амилоидоза. Обычно, антитело состоит из четырех полипептидов: двух идентичных копий полипептида с тяжелой (H) цепью и двух копий полипептида с легкой (L) цепью. Как правило, каждая тяжелая цепь содержит одну N-концевую вариабельную (VH) область и три C-концевых константных (CH1, CH2 и CH3) области, и каждая легкая цепь содержит одну N-концевую вариабельную (VL или VK) область и одну C-концевую константную (CL) область. Каждый вариабельный домен легкой и тяжелой цепи в антителе также содержит три сегмента, называемых областями, определяющими комплементарность ("CDR") или гипервариабельными областями. Каждая CDR в легкой цепи вместе с соответствующей CDR в соседней тяжелой цепи образуют антигенсвязывающий сайт антитела. Вариабельные области каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий сайт антитела, тогда как константная область обеспечивает структурную поддержку и модулирует иммунный ответ, инициируемый связыванием антигена.
Химерные антитела содержат вариабельную область нечеловеческого антитела в константной области человеческого антитела. Химерное антитело 11-1F4, например, может быть создано путем экспрессии мышиной вариабельной области с областью Fc человеческого антитела, такого как человеческий IgG1.
Можно получить гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител, которые содержат минимальные последовательности, полученные из нечеловеческого иммуноглобулина. В общем, гуманизированное антитело может содержать один или два, или более вариабельных домена, в которых вариабельные области получены из нечеловеческого иммуноглобулина, а каркасные области (FR) соответствуют последовательности иммуноглобулина человека. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело к AL содержит каркасную область человеческого антитела. Такие антитела могут быть получены известными способами.
Мышиное моноклональное антитело 11-1F4 представляет собой антитело к AL, продуцируемое клеткой гибридомы SP2/0, депонированной Alan Solomon, MD (Медицинский центр Университета Теннесси в Ноксвилле, Теннесси). Клеточная линия гибридомы доступна из Американской коллекции типовых культур (ATCC номер доступа PTA-105). Область VK (SEQ ID NO: 36) и область VH (SEQ ID NO: 35) антитела 11-1F4 показаны в таблице 1 ниже. Последовательности CDR для тяжелой и легкой цепей приведены в Таблице 2.
Таблица 1. Вариабельные последовательности моноклонального антитела 11-1F4
Таблица 2. Последовательности CDR моноклонального антитела 11-1F4
(SEQ ID NO: 49)
(SEQ ID NO: 50)
(SEQ ID NO: 51)
(SEQ ID NO: 52)
(SEQ ID NO: 53)
(SEQ ID NO: 54)
Можно клонировать гены для областей VH и VK, показанных выше, чтобы получить химерное антитело 11-1F4, применяя известные последовательности антител человека. Химерное антитело 11-1F4 связывается с эпитопом, экспрессируемым β-складчатой конфигурацией амилоидов, так же, как его мышиный аналог, но неожиданно, как показано в примере 6 ниже, химерное антитело связывается с амилоидными фибриллами AL с более высокой аффинностью, чем антитело мыши 11-1F4, из которого оно было получено.
Можно также клонировать гены для областей CDR, чтобы получить гуманизированную форму антитела, применяя известные последовательности антител человека. Подобно химерной форме антитела 11-1F4, гуманизированная форма может также иметь сродство к амилоидным фибриллам, которое выше, чем у мышиного аналога.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что в раскрытых гуманизированных и химерных антителах можно применять все разные типы человеческих константных областей и/или каркасных областей. Например, гуманизированные и химерные антитела по настоящему изобретению могут содержать константные области и/или каркасные области человеческого IgG (включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), IgA (иммуноглобулин A), IgE (иммуноглобулин E), IgH (иммуноглобулин H) или IgM (иммуноглобулин M). В предпочтительных вариантах осуществления гуманизированное или химерное антитело 11-1F4 по настоящему изобретению содержит константную область человеческого IgG1.
В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению могут содержать одну или более замен, вставок или делеций, при условии, что антитело сохраняет способность связываться с амилоидными фибриллами (например, фибриллами, сформированными легкими цепями типа каппа и/или лямбда). Например, в некоторых вариантах осуществления химерное антитело 11-1F4 по настоящему изобретению может содержать тяжелые и легкие цепи с идентичностью приблизительно 85 %, приблизительно 86 %, приблизительно 87 %, приблизительно 88 %, приблизительно 89 %, приблизительно 90 %, приблизительно 91 %, приблизительно 92 %, приблизительно 93 %, приблизительно 94 %, приблизительно 95 %, приблизительно 96 %, приблизительно 97 %, приблизительно 98 %, приблизительно 99 % или приблизительно 100 % по сравнению с соответствующими последовательностями тяжелой и легкой цепи, раскрытыми в настоящем документе, при условии, что антитело сохраняет способность связываться с амилоидными фибриллами. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 11-1F4 по настоящему изобретению может содержать CDR, которые имеют приблизительно 85 %, приблизительно 86 %, приблизительно 87 %, приблизительно 88 %, приблизительно 89 %, приблизительно 90 %, приблизительно 91 %, приблизительно 92 %, приблизительно 93 %, приблизительно 94 %, приблизительно 95 %, приблизительно 96 %, приблизительно 97 %, приблизительно 98 %, приблизительно 99 % или приблизительно 100 % идентичности по сравнению с соответствующими последовательностями CDR, раскрытыми в настоящем документе, при условии, что антитело сохраняет способность связываться с амилоидными фибриллами.
В некоторых вариантах осуществления гуманизированное или химерное антитело по настоящему изобретению связывается с амилоидными фибриллами с более высокой аффинностью, чем его мышиный эквивалент, in vitro и/или in vivo, как определено, например, анализом ELISA на прямое связывание, описанным в примере 6. Не ограничиваясь теорией, полагают, что гуманизированные и химерные антитела 11-1F4 по настоящему изобретению могут связывать и нейтрализовать токсичные циркулирующие амилоидные белки, которые еще не образовали отложения или фибриллы, а гуманизированные и химерные антитела по настоящему изобретению могут растворять амилоидные отложения. Более того, было показано, что химерные антитела 11-1F4 связываются с фибриллами и растворяют амилоидомы человека у мышей. Это заслуживает внимания, поскольку считается, что белок-предшественник легкой цепи является токсичным для кардиомиоцитов, и поэтому подход к лечению, который может быть направлен на циркулирующие токсичные белки-предшественники амилоида, а также на агрегированные амилоидные фибриллы, отложенные в органах, может улучшить сердечно-сосудистые исходы у пациентов с AL-амилоидозом с поражением миокарда, даже если заболевание пациента не достигает гематологической ремиссии (т.е. у пациента выявлены уровни токсичных белков-предшественников амилоида в крови или сыворотке или разница между вовлеченными и не вовлеченными свободными легкими цепями более 40 мг/л).
Сокращения
Модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), фетальная бычья сыворотка (FBS), рибонуклеиновая кислота (РНК), матричная РНК (мРНК), дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), комплементарная ДНК (кДНК), полимеразная цепная реакция (ПЦР), минута (мин), секунда (сек), Трис-боратный буфер (TBE).
Аминокислоты представлены аббревиатурами ИЮПАК, а именно: аланин (Ala), аргинин (Arg), аспарагин (Asn), аспарагиновая кислота (Asp), цистеин (Cys), глутамин (Gln), глутаминовая кислота (Glu), Глицин (Gly), гистидин (His), изолейцин (Ile), лейцин (Leu), лизин (Lys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), пролин (Pro), серин (Ser), треонин (Thr), Триптофан (Trp), тирозин (Tyr), валин (Val). Аналогично для нуклеотидов: аденин (A), цитозин (C), гуанин (G), тимин (T), урацил (U), аденин или гуанин (R), цитозин или тимин (Y), гуанин или цитозин (S), аденин или тимин (W), гуанин или тимин (K), аденин или цитозин (M), цитозин или гуанин или тимин (B), аденин или гуанин или тимин (D), аденин или цитозин или тимин (H), аденин или Цитозин или гуанин (V) и любое основание (N).
Гуманизированные или химерные антитела
Для получения химерных антител по настоящему изобретению гены вариабельной области тяжелой и легкой каппа цепи мышиного моноклонального антитела 11-1F4, описанные в патенте США 8,105,594, модифицировали способом ПЦР для облегчения экспрессии химерного антитела 11-1F4 в клетках млекопитающих. Был проведен подробный анализ последовательности модифицированных генов вариабельных областей. Модифицированные гены вариабельной области клонировали в соответствующие векторы экспрессии млекопитающих, создавая конструкции 11-1F4VHpG1D200 и 11-1F4VK.pKN100. Единственная супервекторная конструкция, pG1KD200-11-1F4, была получена из конструкций 11-1F4VHpG1D200 и 11-IF4VK.pKN100 путем расщепления и лигирования рестриктазой EcoRI. Наконец, химерное антитело 11-1F4 временно экспрессировалось в клетках COS как посредством котрансфекции, так и трансфекции одним супервектором. В то время как клетки COS были выбраны для котрансфекции или трансфекции для удобства, специалистам в данной области техники будет понятно, что можно применять другие клеточные линии млекопитающих. Характеристика связывающей способности химерного антитела 11-1F4 к амилоидным фибриллам определяли анализом ELISA на прямое связывание. Неожиданно и выгодно было то, что химерное антитело 11-1F4 связывалось с амилоидными фибриллами с более высокой аффинностью, чем мышиное антитело 11-1F4.
Как правило, антитело состоит из четырех полипептидов: двух идентичных копий полипептида с тяжелой (H) цепью и двух копий полипептида с легкой (L) цепью. Как правило, каждая тяжелая цепь содержит одну N-концевую вариабельную (VH) область и три C-концевых константных (CH1, CH2 и CH3) области, и каждая легкая цепь содержит одну N-концевую вариабельную (VL или VK) область и одну C-концевую константную (CL) область. Вариабельные области каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий сайт антитела.
Антитело, применяемое в композициях и способах по настоящему изобретению, может представлять собой химерное моноклональное антитело мыши и человека, содержащее область VK последовательности SEQ ID NO: 47 и область VH последовательности SEQ ID NO: 48, или гуманизированное моноклональное антитело, содержащее CDR последовательности SEQ ID NO: 49-54. Данные антитела связываются с эпитопом, экспрессируемым β-складчатой конфигурацией амилоидных фибрилл. Кроме того, неожиданно обнаружено, что антитела связываются с таким эпитопом с более высокой аффинностью, чем мышиное антитело 11-1F4, из которого они были получены, которое содержит область VK последовательности SEQ ID NO: 36 и область VH последовательности SEQ ID NO: 35. Настоящее изобретение включает способы лечения заболевания, сопровождающегося отложением амилоида у человека, нуждающегося в таком лечении, включающим введение пациенту терапевтически эффективной дозы одного из указанных выше антител в фармацевтически приемлемом носителе. Количество вводимого антитела должно быть эффективным, например, для уменьшения количества амилоидных фибрилл, депонированных в тканях пациента. Композицию антитела можно вводить любым обычным путем введения, но предпочтительным является парентеральное введение (такое как внутривенное). Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны в данной области техники, и специалист в области медицины может выбрать подходящий носитель. Заболевание, сопровождающееся отложением амилоида, предпочтительно представляет собой первичный (AL) амилоидоз.
Химерное антитело, подходящее для композиций и способов, описанных и заявленных в настоящем документе (и способ получения химерного антитела), раскрыто в совместной заявке на Договор о международной патентной кооперации _________ (документ 8441-0004WO с приоритетом на патентную заявку США 62/526, 835, поданную 29 июня 2017 г.), поданной на аналогичную дату и включенной в настоящий документ в полном объеме. Материалы, применимые для получения рассматриваемого антитела, включают векторные конструкции, выбранные из группы, состоящей из 11-1F4VK.pKN100 и 11-F4VH.pG1D200, показанные на рисунках 5 и 6 соответственно, и суперконструкцию pG.1KD20011-1F4, полученную из двух вышеуказанных векторных конструкций. Другие применимые материалы включают модифицированный ген VK области мышиного антитела 11-1F4 (SEQ ID NO: 42) и модифицированный ген VH области мышиного антитела 11-1F4 (SEQ ID NO: 45), а также соответствующие праймеры SEQ ID NO: 41, 43, 44 и 46. Антитело по настоящему изобретению может быть получено путем котрансфекции векторных конструкций 11-1F4VK.pKN100 и 11-F4VH.pG1D200 или суперконструкции pG.1KD20011-1F4 в подходящую клетку-хозяина млекопитающего, такую как COS клетки.
Способы получения, испытания и применения гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 более подробно описаны в разделе "Примеры" ниже.
Фармацевтические композиции
Фармацевтические композиции, подходящие для применения в способах, описанных в настоящем документе, могут включать гуманизированные или химерные антитела 11-1F4 по настоящему изобретению, гуманизированные антитела или фрагменты антигенсвязывающих антител и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Композиция может быть изготовлена для внутривенного, подкожного, внутрибрюшинного, внутримышечного, перорального, назального, легочного, глазного, вагинального или ректального введения. В некоторых вариантах осуществления антитела изготовлены для внутривенного, подкожного, внутрибрюшинного или внутримышечного введения, в таком виде как раствор, суспензия, эмульсия, липосомная композиция и т.д. Фармацевтическая композиция может быть изготовлена в виде композиции с немедленным высвобождением, композиции с замедленным высвобождением, композиции с отсроченным высвобождением и т.д., с применением способов, известных в данной области техники.
Фармакологически приемлемые носители для различных лекарственных форм известны в данной области техники. Например, известны эксципиенты, смазывающие вещества, связующие вещества и дезинтегранты для твердых композиций. Известны растворители, солюбилизирующие агенты, суспендирующие агенты, изотонические агенты, буферы и успокаивающие средства для жидких композиций. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции включают один или более дополнительных компонентов, таких как один или более консерванта, антиоксиданта, стабилизирующих агента и тому подобное.
Кроме того, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Наполнитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. В некоторых вариантах осуществления будет предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может быть достигнута включением в композицию агента, который задерживает абсорбцию, например, солей моностеарата и желатина.
Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения активного соединения в необходимом количестве в подходящем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по необходимости, с последующей стерилизацией микрофильтрованием. Как правило, дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и лиофильная сушка (лиофилизация), в результате которых получают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его предварительно стерилизованного фильтрованием раствора.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить в сочетании с другими терапевтическими средствами, которые являются частью современного стандарта лечения амилоидоза и амилоидных заболеваний. В качестве альтернативы, фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить пациенту, который ранее получал традиционное лечение амилоидоза и амилоидных заболеваний, но который не ответил на традиционное лечение (то есть заболевание является рефрактерным или продолжает прогрессировать).
Способы лечения
В настоящем изобретении, по меньшей мере одно химерное антитело, гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент антитела вводят пациенту (например, пациенту, который представляет собой человека), страдающему амилоидозом, для того, чтобы способствовать деградации и удалению по меньшей мере некоторых из амилоидных фибрилл, которые откладываются в органах пациента и/или циркулируют в кровотоке пациента. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество антитела вводят вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Подходящие фармацевтически приемлемые носители хорошо известны в данной области техники, как обсуждается ниже. Типичный путь введения представляет собой парентеральный (например, внутривенный, подкожный или внутримышечный), как хорошо известно специалистам в области медицины. Конечно, возможны и другие способы введения. Введение может быть осуществлено одной или более дозами. Количество вводимого антитела и частота дозирования могут быть оптимизированы врачом для конкретного пациента.
Амилоидоз может поражать различные органы у различных людей, и существуют разные типы амилоидов. Амилоидоз часто поражает сердце, почки, печень, селезенку, нервную систему и пищеварительный тракт. Тяжелый амилоидоз может привести к опасной для жизни органной недостаточности.
Признаки и симптомы амилоидоза могут включать, но не ограничиваются ими: отек лодыжек и ног; сильная усталость и слабость; сбивчивое дыхание; онемение; покалывание или боль в руках или ногах, особенно боль в запястье (синдром запястного канала); диарея, возможно с кровью или запор; непреднамеренная, значительная потеря веса; увеличенный язык; изменения кожи, такие как утолщение или легкие кровоподтеки, и пурпурные пятна вокруг глаз; нерегулярное сердцебиение; или трудности с глотанием.
В общем, амилоидоз возникает из-за накопления аномального белка, называемого амилоидом. Амилоид образуется в костном мозге и может откладываться в любой ткани или органе. Конкретная причина состояния зависит от типа амилоидоза.
Существует несколько типов амилоидоза или амилоидных заболеваний, включая AL-амилоидоз, AA-амилоидоз и наследственный амилоидоз.
AL-амилоидоз (амилоидоз легкой цепи иммуноглобулина) является наиболее распространенным типом и может поражать сердце, почки, кожу, нервы и печень. Ранее известный как первичный амилоидоз, AL-амилоидоз возникает, когда костный мозг вырабатывает аномальные антитела, которые не могут быть разрушены. Антитела откладываются в различных тканях в виде амилоидных бляшек, которые нарушают нормальное функционирование ткани или органа.
АА-амилоидоз обычно поражает почки, но иногда также поражает желудочно-кишечный тракт, печень или сердце. Ранее был известен как вторичный амилоидоз. Часто возникает вместе с хроническими инфекционными или воспалительными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит или воспалительное заболевание кишечника.
Наследственный амилоидоз (семейный амилоидоз) является наследственным заболеванием, которое часто поражает печень, нервы, сердце и/или почки. Многие различные типы генных аномалий, присутствующих при рождении, связаны с повышенным риском возникновения амилоидоза или наследственного амилоидоза. Тип и расположение аномалии амилоидного гена могут влиять на риск возникновения некоторых осложнений, возраст, в котором впервые появляются симптомы, и то, как заболевание прогрессирует с течением времени.
При поражении сердца, амилоидоз может вызывать многочисленные виды осложнений. Амилоидные отложения или бляшки снижают способность сердца наполняться кровью между ударами сердца. С каждым ударом накачивается меньше крови, и это может привести к одышке. Амилоидные отложения или бляшки в сердце или вокруг него могут также вызывать нерегулярное сердцебиение и застойную сердечную недостаточность среди других дисфункций органа.
При поражении почек, амилоидоз часто наносит ущерб фильтрационной способности почек, позволяя белку просачиваться из крови в мочу (то есть протеинурия). Кроме того, способность почек выводить из организма продукты жизнедеятельности снижается, что в конечном итоге может привести к почечной недостаточности.
В настоящей заявке обеспечены способы лечения заболеваний, сопровождающихся отложением амилоида, таких как первичный (AL) амилоидоз, у пациента (например, пациента, представляющего собой человека), нуждающегося в таком лечении, включающие введение пациенту гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 вместе с фармацевтически приемлемым носителем в количестве, эффективном для лечения заболевания, сопровождающегося отложением амилоида.
В некоторых вариантах осуществления заболевание, сопровождающееся отложением амилоида (например, первичный амилоидоз), включает поражение по меньшей мере один орган или ткань, выбранные из группы, состоящей из сердца, почек, печени, легких, желудочно-кишечного тракта, нервной системы, скелетно-мышечной системы, мягких тканей и кожи.
В вариантах осуществления, когда заболевание включает амилоидные отложения или бляшки в сердце пациента, лечение гуманизированным или химерным антителом 11-1F4 по настоящему изобретению может приводить к снижению уровня N-терминального натрийуретического пептида головного мозга (NT-proBNP) пациента по меньшей мере приблизительно на 30 % по сравнению с базовыми уровнями до введения антитела. В некоторых вариантах осуществления снижение NT-proBNP может составлять по меньшей мере приблизительно 40 %, по меньшей мере приблизительно 50 %, по меньшей мере приблизительно 60 % или более по сравнению с базовыми уровнями до введения антитела. В некоторых вариантах осуществления лечение гуманизированным или химерным антителом 11-1F4 по настоящему изобретению может привести к снижению уровня NT-proBNP у пациента до менее приблизительно 9100 нг/л после введения антитела. В некоторых вариантах осуществления уровень NT-proBNP пациента может снижаться до менее приблизительно 8000, 7000, 6000, 5000 или 4000 нг/л после введения антитела. В некоторых вариантах осуществления пациентов первоначально причисляли к классу II или III по функциональной классификации Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA) до введения антитела, а затем причисляли к классу I по шкале классификации NYHA после лечения химерным антителом 11-1F4 по настоящему изобретению.
В настоящем документе обеспечены способы улучшения функции миокарда у пациента, страдающего амилоидозом с поражением сердца, а также способы лечения специфических групп пациентов, таких как пациенты с ALA, имеющих поражение сердца (то есть NT-proBNP больше 650 пг/мл), где заболевание не достигает гематологической ремиссии.
Когда амилоидное заболевание поражает сердце, оно может вызывать многочисленные виды осложнений, и такое поражение сердца имеет плохой прогноз. Амилоидные отложения или бляшки снижают способность сердца наполняться кровью между ударами сердца. С каждым ударом накачивается меньше крови, и это может привести к одышке, среди других серьезных осложнений. Амилоидные отложения или бляшки в сердце или вокруг него могут также вызывать нерегулярное сердцебиение и застойную сердечную недостаточность, среди других нарушений функций органа.
В настоящем документе представлены способы улучшения функции миокарда у пациента, у которого диагностирован амилоидоз легкой цепи (ALA) с поражением сердца, включающие введение пациенту с диагнозом ALA с поражением сердца терапевтически эффективного количества гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 или его антигенсвязывающего фрагмента. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с амилоидными фибриллами с более высокой аффинностью, чем мышиное антитело 11-1F4, как определено анализом ELISA на прямое связывание. Кроме того, улучшение функции миокарда может проявляться в течение приблизительно трех недель после введения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Например, улучшение различных показателей функции миокарда можно наблюдать в пределах приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15 недель после начала лечения.
Функция миокарда у пациентов с поражением сердца может быть определена путем измерения уровней N-терминального натрийуретического пептида головного мозга (NT-proBNP). Повреждение тканей, вызванное амилоидными отложениями в сердце пациентов с ALA, повышает уровни NT-proBNP у пациентов. В некоторых вариантах осуществления у пациентов с диагнозом ALA, имеющим поражение сердца, до лечения обнаруживают уровень NT-proBNP, превышающий 650 пг/мл.
Функцию миокарда и ее улучшение можно измерить с помощью эхокардиографии для измерения глобальной продольной деформации (GLS), как описано в Smiseth et al. - Eur Heart J, 37:1196. При эхокардиографии применяют ультразвук для измерения средней деформации в сегментах миокарда, а GLS является средним из данных сегментов в качестве меры глобальной функции левого желудочка. Амилоидные отложения могут привести к утолщению стенок левого и правого желудочков и к не растягиваемому желудочку, который становится жестким и плохо податливым, что приводит к "деформации" в отношении сердца и сосудистой сети. На языке эхокардиографии термин "деформация" используется для описания деформации в миокарде, которая может включать, но не ограничивается ими, локальное укорочение, утолщение и/или удлинение миокарда. Деформацию можно применять в качестве меры желудочковой функции. Специалисту в данной области техники известно, как применять эхокардиографию для определения GLS, и понятно, что расчеты можно производить различными способами. Например, формула Лагранжа (εL = (L-L0)/L0 = ΔL/L0, где L0 - базовая длина, а L - итоговая длина), определяет деформацию по отношению к базовой длине как относительную меру, в которой укорочение будет отрицательным, а удлинение будет положительным. Обычно выражается в процентах. Альтернативное определение, деформация Эйлера, определяет деформацию по отношению к мгновенной длине: εE = ΔL/L. Для изменения во времени, деформация Лагранжа выражена как: εL = Σ ΔL/L0, а деформация Эйлера как εE = Σ (ΔL/L). Термин был впервые предложен Mirsky и Parmley при описании региональных различий деформации между нормальным и ишемическим миокардом.
Следовательно, в некоторых вариантах осуществления пациенты, получавшие лечение в соответствии со способом по настоящему изобретению, демонстрируют улучшение глобальной продольной деформации (GLS) по сравнению с уровнем GLS до лечения. Например, из 19 пациентов, получавших лечение с применением химерного антитела по настоящему изобретению, 10 имели поражение сердца при скрининге уровней NT-proBNP, и 8 пациентов состояние сердца оценили по базовому уровню NT-proBNP, где поражение сердца подтверждали при уровне NT-proBNP выше 650 пг/мл. В некоторых вариантах осуществления пациент с ALA с поражением сердца может иметь базовый уровень NT-proBNP, по меньшей мере 650 пг/мл, в то время как в некоторых вариантах осуществления пациент с ALA с поражением сердца может иметь базовый уровень NT-proBNP, по меньшей мере 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250 или 2300 или более пг/мл.
Как раскрыто в примере 9 ниже, у 9 из 10 пациентов, имеющих поражение сердца, наблюдалось улучшение функции миокарда при воздействии раскрытого химерного антитела. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления пациент, получавший лечение терапевтически эффективной дозой химерного антитела, демонстрирует улучшение глобальной продольной деформации (GLS) по сравнению с уровнем GLS до лечения. У пациентов, получавших лечение с применением антител по настоящему изобретению, одновременно с уменьшением GLS также могли наблюдать пониженные уровни NT-proBNP.
В некоторых вариантах осуществления улучшение GLS может происходить в пределах приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14 или приблизительно 15 недель от начала лечения. В некоторых вариантах осуществления улучшение GLS может быть представлено 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более процентами снижения GLS по сравнению с базовым уровнем, как рассчитано по формуле Лагранжа. Снижение уровня GLS по сравнению с базовым уровнем приблизительно на 2 % и более считается клинически значимым.
В некоторых вариантах осуществления раскрытые способы лечения гуманизированным или химерным антителом 11-1F4 или его антигенсвязывающим фрагментом могут снижать уровни N-терминального натрийуретического пептида головного мозга (NT-proBNP) пациента по меньшей мере приблизительно на 30 % по сравнению с базовыми уровнями до введения антитела. В некоторых вариантах осуществления снижение NT-proBNP может составлять по меньшей мере приблизительно 40 %, по меньшей мере приблизительно 50 %, по меньшей мере приблизительно 60 % или более по сравнению с базовыми уровнями до введения антитела. В некоторых вариантах осуществления лечение химерным антителом 11-1F4 по настоящему изобретению может привести к снижению уровня NT-proBNP у пациента до менее приблизительно 9100 нг/л после введения антитела. В некоторых вариантах осуществления уровень NT-proBNP пациента может снижаться до менее приблизительно 8000, 7000, 6000, 5000 или 4000 нг/л после введения антитела. В некоторых вариантах осуществления пациентов первоначально причисляли к классу II или III по функциональной классификации Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA) до введения антитела, а затем причисляли к классу I по шкале классификации NYHA после лечения химерным антителом 11-1F4 по настоящему изобретению.
В некоторых вариантах способы по настоящему изобретению включают лечение пациента, страдающего рецидивным или рефрактерным ALA. В некоторых вариантах пациент может иметь ALA типа каппа. В некоторых вариантах пациент может иметь ALA типа лямбда.
Иммуноглобулины состоят из четырех белковых цепей: двух легких цепей, легких цепей каппа (κ) или лямбда (λ), и двух тяжелых цепей, которых существует несколько типов. При AL-амилоидозе легкие цепи типа каппа или легкие цепи типа лямбда могут быть неправильно свернуты и образовывать амилоидные фибриллы или бляшки. Следовательно, у некоторых пациентов фрагменты как каппа, так и лямбда могут быть уложены неправильно. Анализ в подгруппах показал, что у пациентов как с поражением сердца типа лямбда, так и с поражением сердца типа каппа отмечалось улучшение за счет снижения GLS по сравнению с уровнями до лечения, как показано в примере 8. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления пациент дополнительно характеризуется поражением сердца амилоидами, сформированными легкими цепями типа лямбда. В некоторых вариантах осуществления пациент дополнительно характеризуется поражением сердца амилоидами, сформированными легкими цепями типа каппа.
В некоторых вариантах осуществления способы лечения по настоящему изобретению могут дополнительно включать введение химиотерапевтического лекарственного средства, которое может быть предназначено для уничтожения дисфункциональных клеток, которые создают токсичный белок-предшественник. В некоторых случаях такая терапия может быть успешной, что приводит к уменьшению количества дисфункциональных клеток и сопутствующему снижению количества циркулирующих токсичных белков-предшественников амилоида в крови пациента. Однако в некоторых случаях химиотерапия может быть неэффективной в отношении уменьшения количества дисфункциональных клеток и/или способности данных клеток продуцировать токсичные белки-предшественники амилоида. Считается, что те пациенты, у которых в крови выявлены токсичные белки-предшественники амилоидов, имеют ALA, при котором гематологическая ремиссия не достигнута.
Способы лечения по настоящему изобретению могут быть особенно полезными для пациентов с заболеванием, при котором гематологическая ремиссия не достигнута (то есть нет ни полной ремиссии, ни очень хорошей частичной ремиссии), поскольку считается, что гуманизированные и химерные антитела 11-1F4 по настоящему изобретению способны связывать и нейтрализовать токсичные белки-предшественники амилоида в кровообращении, даже до того, как белки агрегируют с образованием амилоидного отложения. Полная ремиссия определяется как отрицательная иммунофиксация в сыворотке и моче и нормальное соотношение в анализе свободных легких цепей (FLC), в то время как очень хорошая частичная ремиссия определяется как наличие разницы между вовлеченными и не вовлеченными свободными легкими цепями менее 40 мг/л.
Улучшение мониторинга
Эхокардиография не инвазивна и может применяться для мониторинга улучшения функции миокарда у пациента с диагнозом амилоидоз легкой цепи (ALA) с поражением сердца, и включает наблюдение за улучшением функции миокарда у пациента с диагнозом ALA с поражением сердца в течение приблизительно трех недель после введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 (c11-1F4 Ab) или его антигенсвязывающего фрагмента, указанного гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 или его антигенсвязывающего фрагмента, имеющего аффинность связывания к амилоидными фибриллам, которая выше, чем аффинность мышиного антитела 11-1F4, как определено анализом ELISA на прямое связывание. Следовательно, улучшение функции миокарда можно наблюдать приблизительно через три недели после введения гуманизированного или химерного антитела 11-1F4, как показано в примере 8. В некоторых вариантах осуществления улучшение функции миокарда сохраняется в течение периода, продолжающегося по меньшей мере три месяца после введения гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 или его антигенсвязывающего фрагмента.
В вариантах осуществления, когда заболевание включает амилоидные отложения или бляшки в почках пациента, лечение гуманизированным или химерным антителом 11-1F4 по настоящему изобретению может снизить уровень белка в моче пациента (т.е. протеинурию) по меньшей мере приблизительно на 30 % по сравнению с базовыми уровнями до введения антитела. В некоторых вариантах осуществления уменьшение содержания белка в моче пациента может составлять по меньшей мере приблизительно 40 %, по меньшей мере приблизительно 50 %, по меньшей мере приблизительно 60 % или более по сравнению с базовыми уровнями до введения антитела. В некоторых вариантах осуществления выход белка в моче пациента может уменьшаться до менее приблизительно 7000, менее чем приблизительно 6000, менее чем приблизительно 5000, менее чем приблизительно 4000 или менее чем приблизительно 3000 мг/24 часа после введения антитела.
Терапевтически эффективные дозы и схемы дозирования
В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективную дозу антитела можно вводить не более одного раза, двух, трех или четырех раз в течение трех месяцев. В некоторых вариантах осуществления снижение NT-proBNP или улучшение GLS сохраняется у пациента в течение по меньшей мере приблизительно трех месяцев после введения гуманизированного или химерного антитела 11-1F4.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что терапевтически эффективные дозы и схемы дозирования вышеуказанными способами могут варьироваться. Схемы дозирования могут быть скорректированы для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтический ответ клиренса амилоидных бляшек или уменьшение количества депонированных амилоидных фибрилл). Например, в некоторых вариантах осуществления можно вводить однократную дозу антитела, тогда как в некоторых вариантах осуществления можно вводить несколько разделенных на курс лечения доз в течение некоторого времени, или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать при последующем дозировании, в соответствии с ситуацией. Например, в некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению можно вводить один или два раза в неделю путем подкожной, внутривенной или внутримышечной инъекции. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить один или два раза в месяц путем подкожной, внутривенной или внутримышечной инъекции. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить один или два раза в год путем подкожной, внутривенной или внутримышечной инъекции. В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению можно вводить один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в месяц, один раз в два месяца, один раз в три месяца, один раз в четыре месяца, один раз в пять месяцев, один раз в шесть месяцев, один раз в семь месяцев, один раз в восемь месяцев, один раз в девять месяцев, один раз в десять месяцев, один раз в одиннадцать месяцев, два раза в год или один раз в год, в зависимости от ситуации или состояния пациента.
Кроме того, данные, раскрытые в настоящем документе, указывают, что ответ пациента на лечение гуманизированным или химерным антителом 11-1F4 является не только устойчивым, но и быстрым. В некоторых вариантах осуществления пациент может проявлять терапевтический ответ (то есть уменьшение размера отложений или бляшек амилоида, уменьшение скорости образования бляшек или улучшение функции органов) в течение одной недели или менее, двух недель или менее, трех недель или менее, четырех недели или менее, пяти недель или менее, шести недель или менее, семи недель или менее, восьми недель или менее, девяти недель или менее, десяти недель или менее, одиннадцати недель или менее, двенадцати недель или менее, или любого промежутка времени между ними. Например, в зависимости от дозы и схемы дозирования пациент может проявлять терапевтический ответ приблизительно через неделю или приблизительно через 4,5 недели.
Терапевтически эффективная доза антитела, вводимого пациенту (независимо от того, вводят ли она однократно или многократно), должна быть достаточной для уменьшения количества депонированных амилоидных фибрилл у пациента. Такое терапевтически эффективное количество может быть определено путем оценки симптоматических изменений у пациента или путем оценки изменения количества депонированных амилоидных фибрилл (например, радиоиммунной детекцией депонированных амилоидных отложений с применением меченого антитела 124I). Таким образом, меченое антитело по настоящему изобретению можно применять для детекции наличия заболевания, сопровождающегося отложением амилоида у пациента с подозрением на наличие заболевания, а также для определения эффективности лечения.
Примерные дозы могут варьироваться в зависимости от размера и состояния здоровья индивидуума, который получает лечение, а также состояния, которое лечат. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 по настоящему изобретению может составлять приблизительно 500 мг/м2 или менее, однако в некоторых ситуациях доза может быть выше. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективная доза может составлять от 10 до 1000 мг/м2, от 25 до 900 мг/м2, от 50 до 800 мг/м2, от 75 до 700 мг/м2, от 100 до 600 мг/м2 или любое промежуточное значение. Например, в некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество может составлять приблизительно 1000, приблизительно 975, приблизительно 950, приблизительно 925, приблизительно 900, приблизительно 875, приблизительно 850, приблизительно 825, приблизительно 800, приблизительно 775, приблизительно 750, приблизительно 725, приблизительно 700, приблизительно 675, приблизительно 650, приблизительно 625, приблизительно 600, приблизительно 575, приблизительно 550, приблизительно 525, приблизительно 500, приблизительно 475, приблизительно 450, приблизительно 425, приблизительно 400, приблизительно 375, приблизительно 350, приблизительно 325, приблизительно 300, приблизительно 275, приблизительно 250, приблизительно 225, приблизительно 200, приблизительно 175, приблизительно 150, приблизительно 125, приблизительно 100 или менее мг/м2.
Аналогично, в некоторых вариантах осуществления эффективное количество гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 составляет приблизительно 2200 мг, однако в некоторых ситуациях доза может быть выше или ниже. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество может составлять от 50 до 5000 мг, от 60 до 4500 мг, от 70 до 4000 мг, от 80 до 3500 мг, от 90 до 3000 мг, от 100 до 2500 мг, от 150 до 2000 мг, от 200 до 1500 мг, от 250 до 1000 мг или любое промежуточное значение. Например, в некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество может составлять приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450, приблизительно 500, приблизительно 550, приблизительно 600, приблизительно 650, приблизительно 700, приблизительно 750, приблизительно 800, приблизительно 850, приблизительно 900, приблизительно 950, приблизительно 1000, приблизительно 1100, приблизительно 1200, приблизительно 1300, приблизительно 1400, приблизительно 1500, приблизительно 1600, приблизительно 1700, приблизительно 1800, приблизительно 1900, приблизительно 2000, приблизительно 2100, приблизительно 2200, приблизительно 2300, приблизительно 2400, приблизительно 2500, приблизительно 2600, приблизительно 2700, приблизительно 2800, приблизительно 2900, приблизительно 3000, приблизительно 3100, приблизительно 3200, приблизительно 3300, приблизительно 3400, приблизительно 3500, приблизительно 3600, приблизительно 3700, приблизительно 3800, приблизительно 3900, приблизительно 4000, приблизительно 4100, приблизительно 4200, приблизительно 4300, приблизительно 4400, приблизительно 4500, приблизительно 4600, приблизительно 4700, приблизительно 4800, приблизительно 4900, приблизительно 5000 или более мг.
Аналогично, в некоторых вариантах осуществления эффективное количество гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 составляет приблизительно 25 мг/кг, однако в некоторых вариантах осуществления концентрация может быть выше или ниже. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество может составлять приблизительно от 1 до 50 мг/кг, приблизительно от 5 до 40 мг/кг, приблизительно от 10 до 30 мг/кг или приблизительно от 15 до 25 мг/кг, или любое промежуточное значение. Например, в некоторых вариантах осуществления эффективное количество может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 или более мг/кг.
Способы лечения по настоящему изобретению также могут быть объединены с другими известными способами лечения, в зависимости от ситуации. Например, современный стандарт лечения AL-амилоидоза обычно включает трансплантацию аутологичных стволовых клеток крови (ASCT) или аутологичную трансплантацию костного мозга. Многие из тех же химиотерапевтических лекарственных средств, которыми лечат множественную миелому, применяют при AL-амилоидозе для остановки роста аномальных или дисфункциональных клеток, которые продуцируют амилоидные/токсичные белки-предшественники амилоида. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления гуманизированные или химерные антитела 11-1F4 по настоящему изобретению можно вводить до, после или одновременно с другими известными способами лечения. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные или химерные антитела 11-1F4 по настоящему изобретению можно вводить только после того, как другие варианты лечения признаны недействующими, или заболевание продолжило прогрессировать. Другими словами, в некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению применяют для лечения рефрактерного амилоидного заболевания, такого как рефрактерный AL-амилоидоз.
В вариантах осуществления, когда заболевание включает амилоидные отложения или бляшки в почках пациента, лечение химерным антителом 11-1F4 по настоящему изобретению может снизить уровень белка в моче пациента (т.е. протеинурию) по меньшей мере приблизительно на 30 % по сравнению с базовыми уровнями до введения антитела. В некоторых вариантах осуществления уменьшение содержания белка в моче пациента может составлять, по меньшей мере, приблизительно 40 %, по меньшей мере, приблизительно 50 %, по меньшей мере, приблизительно 60 % или более по сравнению с базовыми уровнями до введения антитела. В некоторых вариантах осуществления выход белка в моче пациента может уменьшаться до менее приблизительно 7000, менее чем приблизительно 6000, менее чем приблизительно 5000, менее чем приблизительно 4000 или менее чем приблизительно 3000 мг/24 часа после введения антитела.
В настоящем документе также обеспечены способы лечения пациента с заболеванием, сопровождающимся отложением амилоида (например, AL-амилоидоз), включающие введение терапевтически эффективного количества гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 пациенту, нуждающемуся в этом реже одного раза в месяц. В некоторых вариантах осуществления AL-амилоидоз может характеризоваться наличием фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа лямбда, и в этом случае присутствие фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа лямбда, значительно уменьшается после введения антитела.
В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективную дозу антитела можно вводить один раз в два месяца, один раз в три месяца, один раз в четыре месяца, один раз в пять месяцев, один раз в шесть месяцев или два раза в год, и более конкретные схемы дозирования представлены ниже.
Также в настоящем документе обеспечены способы лечения пациента с первичным амилоидозом легкой цепи (AL), который включает поражение сердца, включающие введение указанному пациенту дозы гуманизированного химерного антитела 11-1F4, причем указанная доза эффективна для снижения уровня N-терминального натрийуретического пептида головного мозга (NT-proBNP) по меньшей мере на 30 % после введения гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 по сравнению с уровнем до лечения. Также обеспечены способы лечения пациента с первичным амилоидозом легкой цепи (AL), который включает поражение почек, включающие введение указанному пациенту дозы гуманизированного или химерного антитела 11-1F4, причем указанная доза эффективна для снижения протеинурии по меньшей мере на 40 % после введения гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 по сравнению с уровнями до лечения.
В некоторых вариантах осуществления снижение NT-proBNP и/или протеинурии сохраняется у пациента в течение по меньшей мере приблизительно шести месяцев после введения гуманизированного или химерного 11-1F4 антитела.
Как описано выше, иммуноглобулины состоят из четырех белковых цепей: двух легких цепей, легких цепей каппа (κ) или лямбда (λ), и двух тяжелых цепей, которых существует несколько типов. При AL-амилоидозе легкие цепи типа каппа или легкие цепи типа лямбда могут быть неправильно свернуты и образовывать амилоидные фибриллы или бляшки. У некоторых пациентов фрагменты как каппа, так и лямбда могут быть уложены неправильно. Таким образом, в настоящем документе обеспечены способы уменьшения количества отложений фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа каппа и/или лямбда, у пациента, нуждающегося в этом, включающие введение пациенту с первичным амилоидозом, характеризующимся наличием отложений фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа каппа или лямбда, дозы антитела содержащего: (i) область VK, содержащую последовательность SEQ ID NO: 47, область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 48, или (ii) последовательности CDR, содержащие последовательность SEQ ID NO: 49-54, и константную область человеческого IgG1, где у пациента доза эффективна для уменьшения количества отложений фибрилл, сформированных легкими цепями типа каппа или лямбда.
В некоторых вариантах осуществления первичный амилоидоз характеризуется наличием отложений или бляшек фибрилл, сформированных легкими цепями типа лямбда, в то время как в некоторых вариантах осуществления первичный амилоидоз характеризуется наличием отложений фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа каппа, а в некоторых вариантах осуществления первичный амилоидоз характеризуется наличием отложений фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа каппа и лямбда.
Авторами изобретения было неожиданно обнаружено, что химерное антитело 11-1F4 неожиданно эффективно для выведения фибрилл легких цепей типа лямбда. Более того, доклинические эксперименты, такие как исследования на мышах, представленные в примере 7, показали, что фибриллы типа лямбда были устойчивы к выведению и потребовалось бы несколько повторных курсов лечения для выведения отложений. Однако, как показано в примере 8, когда химерное антитело 11-1F4 вводили людям, лечение приводило к уменьшению отложений амилоида из легких цепей типа лямбда уже после однократного приема. До осуществления способов по настоящему изобретению, получение данного результата совершенно не ожидали. Полагают, что гуманизированное антитело 11-1F4 будет проявлять аналогичную способность по выведению фибрилл легких цепей типа лямбда.
В любом из вышеуказанных способов ожидают, что введение гуманизированного или химерного антитела 11-1F4 по настоящему изобретению уменьшит дисфункцию органов. Кроме того, в любом из вышеуказанных способов константная область антитела может представлять собой константную область человеческого IgG. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления константная область антитела может представлять собой константную область человеческого IgG1.
Терапевтически эффективные дозы и схемы дозирования вышеуказанных способов могут варьироваться, как было бы легко понять специалистам в данной области техники. Схемы дозирования могут быть скорректированы для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа в виде клиренса амилоидных бляшек или уменьшение количества отложений амилоидных фибрилл). Например, в некоторых вариантах осуществления можно вводить однократную болюсную дозу антитела, тогда как в некоторых вариантах осуществления можно вводить несколько разделенных доз в течение некоторого времени или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать при последующем введении дозы, в соответствии с ситуацией. Например, в некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению можно вводить один или два раза в неделю путем подкожной, внутривенной или внутримышечной инъекции. В некоторых вариантах осуществления антитела или функциональные фрагменты по настоящему изобретению можно вводить один или два раза в месяц путем подкожной, внутривенной или внутримышечной инъекции. В некоторых вариантах осуществления антитела или функциональные фрагменты по настоящему изобретению можно вводить один или два раза в год путем подкожной, внутривенной или внутримышечной инъекции. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению можно вводить один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в месяц, один раз в два месяца, один раз в три месяца, один раз в четыре месяца, один раз в пять месяцев, один раз в шесть месяцев, один раз в семь месяцев, один раз в восемь месяцев, один раз в девять месяцев, один раз в десять месяцев, один раз в одиннадцать месяцев, два раза в год или один раз в год, в зависимости от ситуации или состояния пациента.
Кроме того, данные, раскрытые в настоящем документе, указывают, что ответ пациента на лечение гуманизированным или химерным антителом 11-1F4 является не только устойчивым, но и быстрым. В некоторых вариантах осуществления пациент может проявлять терапевтический ответ (то есть уменьшение размера отложений или бляшек амилоида, уменьшение скорости образования бляшек или улучшение функции органа) в течение одной недели или менее, двух недель или менее, трех недель или менее, четырех недели или менее, пяти недель или менее, шести недель или менее, семи недель или менее, восьми недель или менее, девяти недель или менее, десяти недель или менее, одиннадцати недель или менее, двенадцати недель или менее, или любого промежутка времени между ними. Например, в зависимости от дозы и схемы дозирования пациент может проявлять терапевтический ответ приблизительно через неделю или приблизительно через 4,5 недели.
Следующие примеры приведены для иллюстрации настоящего изобретения. Должно быть понятно, однако, что изобретение не должно ограничиваться конкретными условиями или деталями, описанными в данных примерах. Все печатные публикации, на которые есть ссылки в настоящем документе, специально включены в качестве ссылки.
Пример 1
Клонирование с помощью ПЦР и секвенирование ДНК мышиного антитела 11-1F4
Гены вариабельной области тяжелой и легкой цепи моноклонального мышиного антитела 11-1F4 клонируют с помощью ПЦР, и проводят подробный анализ последовательности всех выделенных генов вариабельной области (как псевдо, так и функциональных). Были получены подробные ДНК и аминокислотные последовательности генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи мышиного антитела 11-1F4.
Материалы
Компоненты среды и все другие материалы для тканевых культур приобретены у Life Technologies (Великобритания). Набор для растворения РНК приобретен у Stratagene (США), тогда как набор для синтеза первой нити кДНК приобретен у Pharmacia (Великобритания). Все компоненты и оборудование для полимеразной цепной реакции (ПЦР), включая ДНК-полимеразу AmpliTaq®, приобретены у Perkin Elmer (США). Набор TOPO TA Cloning® приобретен у Invitrogen (США). Агароза (UltraPure™) приобретена у Life Technologies (Великобритания). Готовый набор для циклического секвенирования ABI PRISM® Big Dye™ Terminator cycle sequencing ready reaction kit и секвенатор ABI PRISM® 310 приобретены у PE Applied Biosystems (США). Все другие молекулярные биологические продукты приобретены у New England Biolabs (США) и Promega (США).
Способы
Стратегия, применяемая для клонирования с помощью ПЦР мышиных генов VH и VK из линий клеток гибридомы, продуцирующих мышиное моноклональное антитело 11-1F4, представлена на фигуре 1.
Два клона (B2C4 и B2D6) клеточной линии гибридомы SP2/0, продуцирующие человеческое моноклональное антитело α легкой цепи 11-1F4, любезно предоставлены Alan Solomon, MD (Медицинский центр Университета Теннесси в Ноксвилле, Теннесси). Клеточная линия гибридомы получена от Американской коллекции типовых культур (ATCC номер доступа PTA-105). Клеточные линии культивируют с применением среды DMEM с добавлением 20 % (об./об.) FBS, пенициллина/стрептомицина и L-глутамина. Клетки культивируют до тех пор, пока общее количество жизнеспособных клеток не достигало 108.
Клетки собирают отдельно от каждого клона следующим образом. Клеточную линию мышиной гибридомы выращивают в суспензии в соответствующей культуральной среде и в количествах, достаточных для обеспечения общего количества жизнеспособных клеток приблизительно 108. Культуральный супернатант собирают и клетки гибридомы осаждают в настольной центрифуге (250 g, 5 мин). Клетки осторожно ресуспендируют в 20 мл PBS и отбирают аликвоту 100 мкл для подсчета жизнеспособных клеток. Клетки в аликвоте снова осаждают и добавляют 200 мкл PBS и 200 мкл трипанового синего к 100 мкл клеток и осторожно перемешивают. Десять мкл данной смеси пипеткой переносят на одноразовое предметное стекло для подсчета клеток, и количество белых клеток в 9 маленьких квадратах подсчитывают под микроскопом. Синие клетки (то есть мертвые клетки) не учитывают. Процесс подсчета повторяют, результаты усредняют, а средние результаты умножают на 9 × 105, чтобы получить количество жизнеспособных клеток для клеток в 20 мл PBS. После того, как было собрано достаточное количество клеток, их ресуспендируют в 10 мл раствора D для выделения РНК (см. ниже, набор для выделения РНК Stratagene RNA Isolation Kit).
Затем общую РНК выделяют отдельно от клеток каждого клона, с применением набора для выделения РНК Stratagene RNA Isolation Kit, в соответствии с инструкциями производителя. К образцу добавляют 1 мл 2 М ацетата натрия (рН 4,0) и содержимое пробирки тщательно перемешивают путем многократного переворачивания пробирки. В пробирку добавляют 10,0 мл фенола (рН от 5,3 до 5,7) и содержимое снова тщательно перемешивают путем переворачивания. К смеси добавляют 2,0 мл смеси хлороформа и изоамилового спирта, пробирку закрывают крышкой и энергично встряхивают в течение 10 секунд, и пробирку инкубируют на льду в течение 15 минут. Образец переносят в толстостенную круглодонную центрифужную пробирку объемом 50 мл, которая была предварительно охлаждена на льду, и пробирку вращают в центрифуге при 10000 × g в течение 20 минут при 4°С. После центрифугирования в пробирке были видны две фазы. Верхняя водная фаза содержала РНК, а нижняя фенольная фаза и промежуточная фаза содержали ДНК и белки. Верхнюю водную фазу, содержащую РНК, переносяти в новую центрифужную пробирку, а нижнюю фенольную фазу отбрасывают. Равный объем изопропанола добавляют к водной фазе и содержимое перемешивают путем переворачивания, после чего пробирку инкубируют в течение 1 часа при минус 20°С для осаждения РНК. Пробирку центрифугируют при 10000 × g в течение 20 минут при 4°С. После центрифугирования осадок на дне пробирки, который содержит РНК, удаляют и супернатант отбрасывают. Осадок растворяют в 3,0 мл раствора D, в пробирку добавляют 3,0 мл изопропанола и содержимое хорошо перемешивают. После инкубации пробирки в течение 1 часа при минус 20°С ее снова центрифугируют в центрифуге при 10000 × g в течение 10 минут при 4°С и супернатант удаляют из пробирки и отбрасывают. (Примечание: до этого момента, РНК была защищена от рибонуклеаз присутствием изотиоцианата гуанидина, но теперь больше не защищена). Осадок промывают 75 % (об./об.) этанолом (вода, обработанная DEPC (25 %)) и осадок сушат в вакууме в течение 2-3 минут. Осадок РНК повторно суспендируют в количестве воды, обработанной DEPC от 0,5 до 2 мл.
Следуя инструкциям производителя, применяют набор для синтеза первой цепи кДНК Amerham Pharmacia Biotech first strand cDNA synthesis kit для получения одноцепочечной ДНК копии мРНК гибридомы 11-1F4 с применением праймера Not I-d(T)18, поставляемого с набором. Для каждого из двух выделенных образцов РНК проводят одну реакцию следующим образом. Применяемые компоненты: реакционная смесь Bulk first strand cDNA, клонированная мышиная обратная транскриптаза FPLCpure™, RNAguard™, BSA, dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 200 мМ DIT водный раствор, праймер Not Id(T)18: 5'-d[AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAA18]-3' и вода, обработанная DEPC.
Приблизительно 5 мкг общей РНК в 20 мкл воды, обработанной DEPC, нагревают до 65°С в течение 10 мин и затем охлаждают на льду. Объемную реакционную смесь Bulk first strand cDNA осторожно пипетируют для получения однородной суспензии, и реакцию проводят в микроцентрифужной пробирке объемом 0,5 мл, как показано ниже. 20 мкл денатурированного раствора РНК, 11 мкл реакционной смеси Bulk first strand cDNA, 1 мкл праймера Not I-d(T)18 и 1 мкл раствора DTT для общего объема 33 мкл. Реагенты осторожно перемешивают пипеткой и инкубируют при 37°С в течение 1 часа.
Гены вариабельной области тяжелой и легкой цепи каппа мыши (гены VH и гены VK соответственно) затем амплифицируют с помощью ПЦР из матрицы одноцепочечной ДНК, способом, описанным Jones и Bendig (Bio/Technology 9:88).
Отдельные реакции ПЦР проводят для каждого из вырожденных специфических праймеров лидерной последовательности (MHV1 - MHV12 для VH и MKV1 - MKV11 для VK) с подходящим праймером константной области (эквимолярная смесь MHCI - MHC3 для VH и MKC для VK). В таблицах 3 и 4 подробно описаны праймеры, применяемые для амплификации генов областей VH и VK соответственно. Всего было проведено 12 реакций тяжелой цепи и 11 реакций легкой цепи каппа. ДНК-полимеразу AmpliTaq® применяют для амплификации матричной кДНК во всех случаях следующим образом.
Законченную реакцию синтеза первой цепи кДНК нагревают при 90°С в течение 5 минут, чтобы денатурировать дуплекс РНК-кДНК и инактивировать обратную транскриптазу и охлаждают на льду. Одиннадцать реакционных пробирок GeneAmp™ для ПЦР помечают MKV1-11. Для каждой пробирки получают 100 мкл реакционной смеси, каждая реакционная смесь содержала 69,3 мкл стерильной воды, 10 мкл 10 × ПЦР-буфера II, 6 мкл 25 мМ MgCl2, 2 мкл каждого из 10 мМ стоеовых растворов dNTP, 2,5 мкл 10 мМ праймера MKC, 2,5 мкл одного из 10 мМ праймеров MKV и 1 мкл смеси матрицы РНК-кДНК. Затем в каждую из пробирок добавляют 0,7 мкл ДНК-полимеразы AmpliTaq® и завершенную реакционную смесь покрывают 50 мкл минерального масла.
Аналогичную серию реакционных смесей получают, как описано выше, для ПЦР-клона гена вариабельной области тяжелой цепи мыши. Однако в данном случае помечают двенадцать реакционных пробирок, и к каждой из них был добавлен один из двенадцати праймеров MHV и соответствующий праймер MHC. То есть для ПЦР-амплификации гена вариабельного домена тяжелой цепи γ1 мыши, например, применяют праймер MHC G1.
Реакционные пробирки загружают в термоциклер ДНК и проводят амплификацию (после начального плавления при 94°С в течение 1,5 мин) при 94°С в течение 1 минуты, 50°С в течение 1 минуты и 72°С в течение 1 минуты в течение 25 циклов. За последним циклом следовала заключительная стадия удлинения при 72°С в течение 10 минут перед охлаждением до 4°С. Увеличенное время линейного нарастания между каждой стадией цикла составляло 30 секунд, за исключением периодов между отжигом (50°С) и удлинением (72°С), когда оно составляло 2,5 мин. Аликвоту 10 мкл из каждой реакции ПЦР прогоняют на 1 % (мас./об.) агарозном геле/1 × TBE буфер, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия, чтобы определить, какой из праймеров лидерной последовательности продуцировал продукт ПЦР. Положительные ПЦР-клоны имели размер приблизительно от 420 до 500 п.о.
Вышеупомянутый способ ПЦР-амплификации повторяют еще два раза и отбирают те ПЦР-реакции, при которых, по-видимому, амплифицировался полноразмерный ген вариабельного домена. Аликвоту 6 мкл каждого потенциального продукта ПЦР непосредственно клонируют в вектор pCR™II, предоставленный набором TA Cloning®, как описано в инструкциях производителя. Аликвоты 10,0 % (об./об.), 1,0 % (об./об.) и 0,1 % (об./об.) трансформированных клеток E.coli пипеткой наносят на отдельные чашки диаметром 90 мм с LB-агаром, содержащие 50 мкг/мл ампициллина, покрывают 25 мкл стокового раствора X-Gal и 40 мкл стокового раствора IPTG и инкубируют в течение ночи при 37°С. Положительные колонии идентифицируют с помощью ПЦР-скрининга.
Таблица 3. Праймеры ПЦР для клонирования генов вариабельной области легкой цепи каппа мыши
Таблица 4. Праймеры ПЦР для клонирования генов вариабельной области тяжелой цепи мыши
Пять мкл аликвот из каждой реакции ПЦР прогоняют на геле с 1 % агарозой/ТВЕ (рН 8,8), чтобы определить продукт ПЦР правильного размера (приблизительно 450 п.о. (пар оснований)). Данные предполагаемые положительные продукты ПЦР, идентифицированные таким образом, были непосредственно клонированы в вектор pCR2.1, предоставленный набором TA Cloning®, и трансформированы в компетентные клетки TOP10, как описано в протоколе производителя. Колонии, содержащие плазмиду со вставкой правильного размера, идентифицируют с помощью ПЦР-скрининга колоний с применением олигонуклеотидных праймеров 1212 и 1233 (таблица 5) по способу Güssow и Clackson (Nucleic Acids Res. 17: 4000). Эти предполагаемые положительные клоны, идентифицированные таким образом, представляли собой двухцепочечную плазмидную ДНК, секвенированную с применением генетического анализатора ABI PRISM 310 и терминатора ABI PRISM BigDye™. Секвенируют три положительных клона, каждого гена VH и VK из клона клеточной линии гибридомы B2C4, а также четыре положительных клона гена VK и шесть генов VK из клона клеточной линии гибридомы B2D6.
Таблица 5. Праймеры для ПЦР-скрининга и секвенирования трансформированных колоний
Результаты 12 реакций ПЦР, проведенных для каждого клона гибридомы (B2C4 и BCD6) для амплификации гена вариабельной области тяжелой цепи мышиного антитела 11-1F4, представлены в таблице 6(а).
Вырожденный праймер лидерной последовательности MHV7 в сочетании со смесью праймеров константной области MHCG1-3 (таблица 3) приводил к получению продукта ПЦР размером приблизительно 600 п.о. из матричных кДНК, полученных как из клеточных линий гибридомы как B2C4, так и B2D6. Поскольку данный бэнд был больше ожидаемого размера для среднего гена VH (450 п.о.), его дополнительно не исследованы. И наоборот, вырожденный праймер лидерной последовательности MHV6 в сочетании со смесью праймеров константной области MHCG1-3 (таблица 3) приводил к получению продукта ПЦР ожидаемого размера (450 п.о.) для гена VH из матричной кДНК, полученной из обеих клеточных линии гибридомы B2C4 и B2D6.
В таблице 6 показаны результаты ПЦР-амплификации, выполненной для клонирования генов вариабельной области тяжелой (а) и легкой (b) цепи мышиного моноклонального антитела 11-1F4 из клеточных линий гибридомы SP2/0 B2C4 и B2D6. Третий столбец содержит запись фактических результатов ПЦР. В тех случаях, когда для конкретной комбинации праймеров наблюдают бэнд, его размер в парах оснований (п.о.) регистрируют в соответствующей строке.
Таблица 6. Результаты ПЦР-амплификации
(а)
(b)
Анализ последовательности трех клонов продукта ПЦР, полученного из B2C4, и пяти клонов продукта ПЦР, полученного из B2D6, выявил одну последовательность вариабельной области тяжелой цепи (фигура 2).
Применяемая стратегия клонирования (амплификация всего гена вариабельной области с применением праймеров, которые фланкируют данную область, то есть специфических праймеров лидерной последовательности и последовательности константной области) позволила идентифицировать полную последовательность FR1. Все восемь секвенированных клонов имели идентичную последовательность в данной области (фигура 2).
Результаты 11 реакций ПЦР, проведенных для каждого клона гибридомы (B2C4 и BCD6) для амплификации гена вариабельной области легкой цепи каппа мышиного антитела 11-1F4, представлены в таблице 6(b).
Вырожденный праймер лидерной последовательности MKV6 в сочетании с праймером константной области MKC (таблица 4) продуцировал продукт ПЦР длиной приблизительно 200 п.о. из матричной кДНК, полученной только из клеточной линии гибридомы B2C4. Поскольку указанный бэнд был намного меньше ожидаемого размера для гена VK (450 п.о.), его дополнительно не исследовали.
Вырожденный праймер лидерной последовательности MKV2 в сочетании с праймером константной области MKC (таблица 4) приводил к получению продукта ПЦР, который был меньше, чем ожидаемая полоса 450 п.о. (при просмотре на агарозном геле) из матричной кДНК, полученной из клеточных линий гибридомы B2C4 и B2D6. Кроме того, с помощью предыдущего клонирования VK обнаружено, что праймер MKV2 амплифицировал хорошо известный псевдоген легкой цепи каппа. Поэтому проводят анализ последовательности одного клона каждого продукта ПЦР, чтобы подтвердить, что данный продукт представляет собой псевдоген, а не ген VK мышиного антитела 11-1F4. Данный анализ последовательности показал, что указанный клон ПЦР действительно был псевдогеном.
Наконец, вырожденный праймер лидерной последовательности MKV1 в сочетании с праймером константной области MKC (таблица 3) приводил к получению продукта ПЦР приблизительно ожидаемого размера (450 п.о.) для гена VK из матричной кДНК, полученной из обеих клеточных линий гибридомы B2C4 и B2D6.
Анализ последовательности трех клонов продукта ПЦР, полученного из B2C4, и четырех клонов продукта ПЦР, полученного из B2D6, выявил единственную последовательность вариабельной области легкой цепи каппа, которую нельзя было идентифицировать как псевдоген.
Таким образом, ген вариабельной области тяжелой цепи антитела 11-1F4 клонируют (с применением праймеров, специфичных для константной области и специфичных для лидерной последовательности) из мРНК гибридомы и секвенируют.
При трансляции последовательность дала пептидную последовательность TVSS. Анализ 122 перегруппированных человеческих генов VH, зарегистрированных в базе данных по Кабату (Kabat et al. - Sequences of Proteins of Immunological Interest), показал, что 84 % данных последовательностей имели пептидную последовательность TVSS. Поэтому был сделан вывод, что выделенный ген VH был правильной последовательностью гена антитела 11-1F4.
Ген вариабельной области легкой цепи каппа мышиного антитела 11-1F4 также был успешно клонирован и секвенирован, как и нефункциональный ген псевдогена VK. Данный псевдоген был впервые идентифицирован Carroll et al. (Molecular Immunology (1988) 25:991). Последовательность возникает из аберрентного транскрипта мРНК, который присутствует во всех стандартных партнерах по слиянию, полученных из исходной опухоли MOPC-21 (включая SP2/0). В результате аберрантной мРНК инвариантный цистеин в положении 23 заменяется остатком тирозина, и соединение VJ выходит за рамки, что приводит к появлению стоп-кодона в положении 105.
Обычно лимфоидные или гибридомные клетки синтезируют более одной перегруппированной легкой мРНК иммуноглобулина. Данные мРНК обычно непродуктивны из-за присутствия терминирующих кодонов или сдвигов рамки, которые обычно не наблюдаются в функциональных генах VK. Данные псевдо-мессенджеры часто представляют серьезные проблемы при клонировании генов иммуноглобулина из гибридом, поскольку они являются очень хорошими субстратами для ПЦР V-области, несмотря на то, что они не кодируют функциональные полипептиды.
Последовательность гена VK антитела 11-1F4 идентифицируют после детального анализа последовательности семи отдельных клонов ПЦР, выделенных из двух разных продуктов ПЦР, с получением SEQ. ID NO: 36. Поскольку все последовательности были идентичными, она была принята в качестве правильной последовательности вариабельной области легкой цепи каппа антитела 11-1F4.
Клонированные гены областей VH и VK применяют для получения химерного моноклонального антитела мыши-человека 11-1F4, которое затем анализируют для подтверждения специфического связывания с фибриллами AL.
Пример 2
Конструирование химерного антитела мыши-человека 11-1F4 (c11-1F4)
Чтобы обеспечить временную экспрессию генов вариабельной области 11-1F4 VH и VK, описанных выше, в клетках млекопитающих как части химерного антитела мыши-человека, необходимо было модифицировать 5'- и 3'-концы, применяя специально разработанные ПЦР-праймеры (Таблица 7). Олигонуклеотидные праймеры F39836 и F39837 применяют для ПЦР-модификации гена VK 11-1F4, в то время как праймеры F39835 и F58933 применяют для ПЦР-модификации гена VH 11-1F4. Обратные (BAK) праймеры F39836 и F39835 вводят сайт рестрикции HindIII, сайт инициации трансляции Козак и лидерную последовательность иммуноглобулина к 5' концам генов VK и VH соответственно. Прямой (FOR) олигонуклеотидный праймер F39837 вводил донорный сайт сплайсинга и сайт рестрикции BamHI к 3' концу гена VK, тогда как прямой (FOR) олигонуклеотидный праймер F58933 добавлял первые 22 пары оснований гена гамма-1CH1, включая ген сайта рестрикции ApaI до 3'-конца гена VH.
Таблица 7. Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР модификации генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи каппа 11-1F4
Консенсусная последовательность Козак имеет решающее значение для эффективной трансляции последовательности вариабельной области (Kozak - J Mol Bio 196:947). Он определяет правильный кодон AUG, с которого начинается трансляция рибосомы, и единственным наиболее важным основанием является аденин (или менее предпочтительно гуанин) в положении -3, выше от стартового кодона AUG.
Лидерная последовательность иммуноглобулина гарантирует, что экспрессированное антитело секретируется в среду и, следовательно, легко собирается и очищается. Лидерными последовательностями в данном случае были лидерные последовательности VK и VH мыши 11-1F4, клонированные из кДНК гибридомы во время процесса клонирования VH и VK.
Последовательность донора сплайсинга важна для правильного прикрепления в рамке вариабельной области легкой цепи к ее соответствующей константной области, таким образом, проходит сплайсинг интрона VK:CK длиной 130 п.о. Вариабельная область тяжелой цепи была присоединена непосредственно к соответствующему гену константной области через сайт Apal, таким образом устраняя необходимость в сайте донора сплайсинга.
Сайты рестрикции субклонирования HindIII и BamHI, а также HindIll и Apal, соответственно, заключают в себе модифицированные гены вариабельной области VK и VH, тогда как применение различных уникальных сайтов рестрикции обеспечивало направленное субклонирование в соответствующий вектор экспрессии млекопитающих.
Ген вариабельной области легкой цепи 11-1F4 сначала тщательно анализируют для выявления любых нежелательных сайтов донора сплайсинга, сайтов акцептора сплайсинга и последовательностей Козак (см. Таблицу 8). Гены вариабельной области как тяжелой, так и легкой цепи анализируют на наличие каких-либо дополнительных сайтов рестрикции субклонирования, которые позднее будут влиять на субклонирование и/или экспрессию функционального полного антитела. Ни один не был найден.
Таблица 8. Последовательности, важные для эффективной экспрессии генов иммуноглобулина в клетках млекопитающих
Отдельные реакции ПЦР получают следующим образом, по одной для каждого гена вариабельной области. Описанные выше плазмиды 11-1F4 VH.pCR2.1 и 11-1F4 VK.pCR2.1 применяют в качестве матриц. 100 мкл реакционной смеси готовят в каждой пробирке для ПЦР, каждая смесь содержала до 41 мкл стерильной воды, 10 мкл 10 × ПЦР-буфера 1, 8 мкл 10 мМ стокового раствора dNTP, 1 мкл 10 мМ 5' прямого праймера, 1 мкл 10 мМ 3' обратного праймера и 1 мкл матричной ДНК разведением 1/10. Наконец, 0,5 мкл ДНК-полимеразы AmpliTaq® (2,5 единицы) добавляют перед нанесением на законченную реакционную смесь 50 мкл минерального масла. Реакционные пробирки загружают в термоциклер ДНК и проводят амплификацию (после начального плавления при 94°С в течение 1 мин) при 94°С в течение 30 сек, 68°С в течение 30 сек и 72°С в течение 50 сек в течение 25 циклов. За последним циклом следовала заключительная стадия удлинения при 72°С в течение 7 минут перед охлаждением до 4°С. Аликвоту 10 мкл из каждой реакционной пробирки для ПЦР прогоняют на 1,2 % (мас./об.) агарозном геле/1 × TBE буфер, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия, для определения размера и наличия продукта ПЦР. Положительные ПЦР-клоны имели размер приблизительно 420 п.о. Данные предполагаемые положительные продукты ПЦР, идентифицированные таким образом, непосредственно клонируют в вектор pCR2.1, предоставленный в наборе Topo TA Cloning®, и трансформированы в компетентные клетки TOP10, как описано в протоколе производителя. Колонии, содержащие плазмиду со вставкой правильного размера, идентифицируют с помощью ПЦР-скрининга колоний с применением олигонуклеотидных праймеров 1212 и 1233 (таблица 5) по способу Güssow и Clackson. Данные предполагаемые положительные клоны, идентифицированные таким образом, представляют собой двухцепочечную плазмидную ДНК, секвенированную с применением генетического анализатора ABI PRISM 310 и терминатора ABI PRISM BigDye™. Секвенируют два положительных клона, каждый из клонированных генов Topo TA VH и VK.
Клоны, содержащие правильно модифицированные гены VH 11-1F4 и VK 11-1F4, идентифицируют, и модифицированные гены V из данных клонов субклонируют в соответствующие векторы экспрессии для облегчения экспрессии химерных тяжелых цепей и легких цепей каппа в клетках млекопитающих. Модифицированный ген VK 11-1F4 субклонируют в вектор экспрессии pKN100 (фигура 4) в виде фрагмента HindIII-BamHI, данный вектор содержит ген константной области каппа человека (аллотип: Km (3 Ala153, Ser191)). Модифицированный ген VH 11-1F4 также субклонируют в виде фрагмента HindIII-ApaI в вектор экспрессии pG1D200 (фигура 5), данный вектор содержал ген константной области γ1 человека (аллотип: G1m (-1 Glu377, Met38I, -2Ala462, 3 Arg222, Ser229)). Применяемые аллотипы константной области каппа и γ1 обычно встречаются в кавказской популяции. Лигированные конструкции экспрессии, 11-1F4VK.pKN100 и 11-1F4VH.pG1D200, затем применяют для трансформации компетентных клеток DH5α, и положительные клоны идентифицируют с применением способа скрининга ПЦР, который описан выше, с исходными праймерами модификации ПЦР (таблица 6). Векторы экспрессии коммерчески легко доступны.
Пример 3
Конструирование одного супервектора для временной экспрессии химерного 11-1F4 в COS-клетках.
Один супервектор, экспрессирующий обе цепи иммуноглобулина химерного антитела 11-1F4, конструируют следующим образом. Кассета экспрессии легкой цепи каппа 11-1F4 (которая содержит промотор HCMVi, ген вариабельной области легкой цепи каппа 11-1F4 и ген константной области легкой цепи каппа) расщепляют рестриктазой (EcoRI в положениях 1 и 2490) из конструкции 11-1F4VK.pKN100 (фигура 4) и затем лигируют в 11-1F4VHpG1D200 через уникальный EcoRI (позиция 4297, фигура 5). Такое лигирование приводило к созданию супервекторной конструкции pG1KD200-11-1F4, содержащей как тяжелые, так и легкие цепи каппа химерного антитела 11-1F4.
Пример 4
Временная экспрессия химерного полного антитела γ1/κ.11-IF4 в клетках COS
Химерное антитело 11-IF4 временно экспрессировалось в клетках COS из Европейской коллекции клеточных культур (ECACC) двумя способами:
(i) котрансфекцией 10 мкг каждой из векторных конструкций 11-1F4VK.pKN100 и 11-1F4VH.pG1D200. Котрансфекции осуществляют в двух повторах;
(ii) трансфекцией 13 мкг одной супервекторной конструкции pG1KD200-11-1F4. Трансфекции супервекторов осуществляли пять раз.
Применяют следующий способ трансфекции. Клеточную линию COS выращивают в среде DMEM с добавлением 10 % (об./об.) FCS, 580 мкг/мл L-глутамина и 50 ед./мл пенициллина/50 мкг/мл стрептомицина ("среда") в колбе объемом 150 см2 до объединения. Клетки трипсинизируют, центрифугируют в центрифуге (250 g в течение 5 минут), затем ресуспендируют в 6 мл среды перед тем, как делить их поровну между тремя колбами по 150 см2, каждая из которых содержала 25 мл свежей предварительно нагретой среды. Клетки инкубируют в течение ночи при 37°С в 5 % СО2, а затем собирают на следующий день, пока они еще находились в стадии экспоненциального роста. Каждая колба содержала приблизительно 1 × 107 клеток. Клетки снова трипсинизируют, осаждают, как и ранее, и промывают в 20 мл PBS, после чего ресуспендируют в достаточном количестве PBS, чтобы создать концентрацию клеток 1 × 107 клеток/мл. 700 мкл данных отмытых клеток COS переносят с помощью пипетки в кювету Gene Pulser®, в которую затем добавляют 1 мкл ДНК вектора экспрессии как тяжелой цепи, так и легкой цепи каппа (каждая по 10 мкг) или 13 мкг супервекторной конструкции. Импульс емкостью 1900 В, 25 мкФ был подан на смесь с применением аппарата Bio-Rad Gene Pulser®. Пульсацию повторяют для каждой экспериментальной трансфекции и контроля "без ДНК" (при котором клетки COS подвергают электропорации в отсутствие какой-либо ДНК). Для проверки эффективности клеток COS также проводят положительный контроль ранее экспрессированного антитела.
Клеткам COS дают возможность восстановиться при комнатной температуре в течение 10 минут, затем осторожно переносят пипеткой в чашку для тканевых культур диаметром 10 см, содержащую 8 мл предварительно нагретого DMEM, дополненного 10 % (об./об.) свободным от γ-глобулина FBS, 580 мкг/мл L-глютамина и 50 ед./мл пенициллина/50 мкг/мл стрептомицина и инкубируют в условиях 5 % CO2 при 37°С в течение 72 часов перед сбором супернатанта клеток COS для анализа. После инкубации в течение 72 часов среду собирают, откручивают для удаления клеточного дебриса и анализируют с помощью ELISA на продуцирование химерного антитела и связывание антигена антителом c11-1F4.
Пример 5
Количественное определение химерного антитела γ1/κ 11-1F4 с помощью ELISA с захватом
После экспрессии полные молекулы IgG, присутствующие в супернатанте клеток COS, количественно определяют с применением анализа ELISA с захватом. Молекулы IgG захватывают на планшете Nunc-Immuno MaxiSorb™ с помощью иммобилизованного козьего антитела к человеческому IgG, специфичного к Fcγ-фрагменту, и детектируют с помощью антитела, конъюгированного с пероксидазой к легкой цепи каппа человека. Стандартную кривую получают путем захвата и детектирования известных концентраций стандартного антитела IgG на том же планшете таким же образом, как указано ниже. Каждую лунку 96-луночного иммунопланшета покрывают 100 мкл аликвот по 0,4 мкг/мл козьего антитела к человеческому IgG, разведенного в PBS, и инкубируют в течение ночи при 4°С. Избыток покрывающего раствора удаляют и планшет трижды промывают 200 мкл/лунку промывочного буфера (1 × PBS, 0,1 % TWEEN). Во все лунки, кроме лунок в колонке 2, ряды с B по G, вносят 100 мкл буфера SEC. В качестве стандарта готовили раствор 1 мкг/мл человеческого IgG1/каппа антитела в буфере SEC, и 200 мкл/лунку переносят пипеткой в лунки в колонке 2, ряды B и C. Среду из трансфицированных COS клеток центрифугируют (250 g, 5 мин), сохраняя супернатант. Аликвоту 200 мкл супернатанта из контроля "без ДНК" (в котором клетки COS трансфицируют в отсутствие ДНК) пипеткой вносят в лунку в колонке 2, ряд D, и аликвоты 200 мкл/лунку экспериментальных супернатантов пипеткой вносят в лунки в колонке 2, ряды E, F и G. Аликвоты по 200 мкл в лунках колонки 2, ряды с B по G смешивают и затем 100 мкл переносят из каждой лунки в соседнюю лунку в колонке 3. Данную процедуру продолжают до колонки 11 с серией 2-кратных разведений стандартных, контрольных и экспериментальных образцов, после чего инкубируют при 37°С в течение 1 часа, и все лунки промывают шесть раз 200 мкл аликвоты промывочного буфера. Конъюгат козьего антитела с пероксидазой к легкой цепи каппа человека разводят в 5000 раз в SEC буфере и 100 мкл разведенного конъюгата добавляют в каждую лунку с последующим повторением стадий инкубации и отмывания. В каждую лунку добавляют 150 мкл субстрата K-BLUE с последующей инкубацией в темноте при 25°С в течение 10 минут. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл раствора RED STOP в каждую лунку и считывают оптическую плотность при 655 нм.
Пример 6
Анализ связывания химерного антитела 11-1F4
Химерное антитело 11-1F4 тестируют на связывание с амилоидными фибриллами с применением анализа ELISA на прямое связывание. Синтетические фибриллы формируют из белка легкой цепи иммуноглобулина и применяют для контроля реактивности антитела в твердофазном анализе на основе ELISA с применением полистирольных пластин с "низким связыванием" (Costar, 3474). Непосредственно перед нанесением покрытия на чашку, 250 мкг фибрилл разбавляют до 1 мл буфером для нанесения покрытия (0,1 % бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере, рН 7,5). Затем образец обрабатывают ультразвуком в течение 20 сек с помощью ультразвукового зонда Tekmar Sonic Disruptor, с мощностью, установленной на 40 % от максимальной, в результате чего получают раствор с короткими фибриллами, состоящими из 2-5 протофибрилл каждая. Данный раствор затем разбавляют до 5 мл, хорошо перемешивают на вортексе и разделяют на аликвоты в лунки планшета. Такая процедура позволяет получить 50 мкл раствора фибрилл с концентрацией 50 мкг/мл в каждой лунке. Планшет затем сушат в течение ночи в инкубаторе при 37°С.
Затем проводят анализ ELISA следующим образом в течение 48 часов после подготовки планшета. Лунки блокируют добавлением 100 мкл 1 % BSA в PBS и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере. Планшет промывают 3 раза в PBS, 0,05 % Tween 20 (об./об.). В каждую лунку планшета добавляют 50 мкл раствора c11-1F4 (3 мкг/мл антитела в 0,1 % BSA/PBS) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа на шейкере. Планшет снова промывают 3 раза (как и ранее), и детекцию связанного антитела осуществляют с применением биотинилированного козьего антитела к IgG мыши (Sigma # B-8774, к тяжелой и легкой цепи).
Результаты
Анализ последовательности успешно модифицированных генов VH и VK показал, что присутствовала правильная последовательность. Подробные ДНК- и аминокислотные последовательности модифицированных генов VH и VK 11-1F4 представлены на фигурах 3 и 4. Модифицированные гены VH и VK были успешно клонированы в векторы экспрессии млекопитающих pG1D200 и pKN100 соответственно, и полученные конструкции 11-1F4VK.pKN100 и 11-1F4VHpG1D200 применяют для котрансфекции клеток млекопитающих.
Конструкции 11-1F4VK.pKN100 и 11-1F4VHpG1D200 также впоследствии применяют для создания одного супервектора (pG1KD200-11-1F4), который экспрессировал химерное антитело 11-1F4 в клетках млекопитающих. Были проанализированы уровни экспрессии химерного антитела 11-1F4 как от котрансфекций, так и от супервекторных трансфекций клеток COS ECACC. Уровни экспрессии, наблюдаемые при трансфекциях супервектора pG1KD200-11-1F4 (10326 нг/мл), были в 3,7 раза выше, чем уровни, наблюдаемые при соответствующих котрансфекциях конструкций 11-1F4VK.pKN100 и 11-1F4VHpG1D200 (2820 нг/мл).
После экспрессии и количественного определения химерное антитело 11-1F4 тестируют на связывание с антигеном-мишенью (амилоидные фибриллы, любезно предоставленные NCI) анализом ELISA на прямое связывание. Результаты связывания ELISA представлены на фигуре 8. Супернатанты от двух лучших индивидуальных трансфекций супервектора pG1KD200-11-1F4 анализируют параллельно с одним супернатантом от соответствующей котрансфекции.
Результаты показали, что химерное антитело 11-1F4 связывалось с амилоидными фибриллами с более высоким аффинностью, чем его мышиный эквивалент. Данный результат является неожиданным и поразительным, поскольку обычно ожидается, что химерное антитело будет иметь аффинность связывания, сравнимую с исходным мышиным антителом. Не ограничиваясь конкретным механизмом или теорией, авторы изобретения полагают, что возможно, суммарный эффект от объединения мышиных V областей 11-1F4 с человеческими γ1/κ C областями, применяемыми для создания химерного антитела 11-1F4, продуцирует антитело с более высокой аффинностью.
Образцы клеток СНО (идентифицированных как CAEL-101), которые секретируют химерное моноклональное антитело 11-1F4, применяемое в настоящем изобретении, депонированы в Американской коллекции типовых культур (ATCC номер доступа PTA-125146) 27 июня 2018 года в соблюдение Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Пример 7
Исследование амилоидомы у мышей с помощью мышиного 11-1F4
Амилоиды получают от людей и характеризуют. Вкратце, от 30 до 40 г свежезамороженной (минус 80°С) или 10 г лиофилизированной селезенки или печени, полученных посмертно у пациентов с AL-амилоидозом, гомогенизируют в приблизительно 300 мл холодного фосфатно-солевого буфера с помощью прибора Virtis-Tempest (Virtis, Gardiner, Нью-Йорк). Гомогенаты центрифугируют при 6°С в течение 30 минут при 17000 об/мин, а остаточный солерастворимый материал удаляют повторной гомогенизацией и отмывают до тех пор, пока OD полученного супернатанта не составляло менее 0,10 при А280. Затем осадок многократно гомогенизируют, промывают холодной деионизированной водой, центрифугируют, а амилоидсодержащие супернатанты лиофилизируют. Количество извлеченного белка составляло приблизительно от одной трети до одной пятой массы исходного материала. Состав легкой цепи и подгруппу VL амилоида определяют аминокислотным секвенированием (Procise Protein Sequencing System, Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния) и ионизирующей масс-спектроскопией (PE SCIEX API 150 EX, Perkin Elmer, Норуолк, Коннектикут) разделением пептидов высокоэффективной жидкостной хроматографией, полученные путем расщепления трипсином восстановленного и пиридилэтилированного белка, экстрагированного из водорастворимого материала 6 моль/л гуанидина HCl. Присутствие протеогликана гепарансульфата определяют окрашиванием синим.
Состав амилоидных экстрактов определяют химическим, иммуноблоттингом, аминокислотным секвенированием и ионизирующим масс-спектроскопическим анализом, где было обнаружено, что преобладающими белковыми видами являются молекулы, связанные с κ или λ легкими цепями, которые в большинстве случаев состояли преимущественно из вариабельной области (VL) плюс первые приблизительно 50 остатков константной области (CL) и, в других случаях, фрагментов VL или интактных молекул. Кроме того, данные экстракты содержали ожидаемый связанный с амилоидом P-компонент, а также протеогликангепаринсульфат.
Лиофилизированные водорастворимые амилоидные экстракты суспендируют в 25 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и гомогенизируют с помощью прибора PCU-2 Polytron (Brinkman, Люцерн, Швейцария). Фибриллы осаждают центрифугированием при 6°С в течение 30 минут при 17000 об/мин, Полученный осадок ресуспендируют в 1 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и повторно гомогенизируют. Данный раствор вводят подкожно между лопатками мышей BALB/c, CD-18 нулевые и C.B-17 SCID с применением иглы 18-го калибра, прикрепленной к шприцу объемом 6 мл. Размер полученной амилоидомы измеряют путем ежедневной пальпации и затем животное подвергают аутопсии. Изображения рентгеновской компьютерной томографии высокого разрешения получают с применением прибора microCat (Национальная лаборатория Ок-Риджа, Ок-Ридж, Теннесси).
Инъецированный материал образовывал хорошо видимую, ощутимую массу на спине животных, размер которой зависел от количества вводимого материала (например, от 0,2 до 2,5 см в максимальном диаметре). Амилоидома оставалась локализованной и неизменной в течение приблизительно от 10 до 24 дней, о чем свидетельствует рентгеновская компьютерная томография высокого разрешения, после данного момента амилоидомы начали регрессировать и в конечном итоге исчезали в течение приблизительно 4 дней. Данный ответ происходил независимо от природы κ или λ или подгруппы VL амилоидного экстракта, однако в исследованиях, включающих пять различных κ и семь λ амилоидом, экстракты ALλ обычно рассасывались медленнее, чем ALk (ALλ, 18 +/- 6 дней по сравнению с ALκ, 13 +/- 3 дня). Было доступно достаточно материала для повторения экспериментов по меньшей мере четыре раза в восьми из 12 случаев, когда было обнаружено, что данный эффект воспроизводим у здоровых молодых животных независимо от тканевого источника амилоида. Однако растворение индуцированных амилоидом последовательно откладывалось более чем на 3 месяца у мышей в возрасте (более 18 месяцев) и мышей с иммунодефицитом.
Гистологические исследования для определения судьбы регрессирующих амилоидом продемонстрировали, что амилоид не перераспределялся в другие ткани мыши, о чем свидетельствует окрашивание конго красным. Кроме того, амилоидомы инфильтруют нафтол-AS-D-хлорацетат-позитивными, α-нафтилацетат-негативными полиморфно-ядерными клетками, то есть нейтрофилами. Напротив, такой клеточный ответ не наблюдают у нулевых мышей CD-18, где выведение амилоидом AL человека требовало значительно более длительного периода времени (т.е. 3 месяца). Кроме того, расщепление амилоидов задерживалось у животных, подвергшихся глубокой нейтропении, путем одновременного введения 250 мг моноклонального антитела Gr-1 к нейтрофилам, введенного во время индукции амилоидомы, и еще раз на 3 день.
Удаление амилоида также зависело от гуморального ответа мыши на материал, содержащий легкие цепи человека. Приблизительно через 10-20 дней после индукции амилоидомы в экспериментах по иммуноблоттингу авторами было показано, что сыворотка мыши содержит антитела, которые распознают не только компонент легкой цепи инъецируемого амилоидного белка, но также и гетерологичные экстракты ALκ или ALλ. Напротив, не было никакой реактивности с гомологичным белком-предшественником амилоида, то есть с белком Бенс-Джонса или любым другим протестированной моноклональной легкой цепью. Когда один и тот же амилоидный препарат повторно вводят данным иммунизированным животным, скорость его исчезновения увеличивалась приблизительно в два раза.
Чтобы проверить терапевтическую эффективность мышиного антитела 11-1F4, проводят серию экспериментов, в которых 100 мкг дозы антитела вводят парам мышей, несущих амилоидомы AL человека. В случае ALk, эксперименты с участием двух разных экстрактов показали, что даже одна инъекция антитела приводила к быстрому и полному исчезновению амилоидной опухоли по сравнению с животными без лечения (таблица 9, фигура 9). Масса амилоидомы ALkλ уменьшалась более чем на 90 % в течение 4 дней после введения антитела по сравнению с контрольными животными. Однако для достижения аналогичного ответа при некоторых амилоидомах типа ALλ требовались многократные дозы вещества. Их вводят в виде серии инъекций по 100 мкг, начиная с индуцирования амилоидомы (день 0), а затем снова на 2, 4 и 6 дни (фигура 9B). Как показано в таблице 9, в экспериментах, в которых протестировали пять разных амилоидом ALλ человека на мышиной модели, было обнаружено, что лечение антителом 11-1F4 уменьшилось в четыре раза по сравнению с временем устранения амилоидных опухолей. Примечательно, что, хотя однократные или повторные дозы двух других моноклональных антител к легкой цепи, которые распознавали фибриллы AL (например, 31-8C7), ускоряли расщепление амилоидов, реагент 11-1F4 был уникален тем, что ускорял удаление как амилоида ALκ, так и ALλ, хотя и в разных отношениях. Напротив, у трех других протестированных моноклональных антител к легкой цепи такой активности не наблюдают.
Таблица 9. Лечение мышей с амилоидомами человека мышиным 11-1F4
Также установлено, что 11-1F4 распознает другие формы амилоида, что подтверждается иммуногистохимическим анализом тканей, содержащих AA-, ATTR-, ALyS-, AApoA1- и Ab-. В каждом случае аналогичные схемы активности были получены с 11-1F4 и антителами, специфичными для данных пяти различных типов амилоидных белков.
Пример 8
Фаза 1a/b исследования химерного антитела 11-1F4
Химерное моноклональное реактивное антитело 11-1F4 IgG1 к амилоидным фибриллам GMP-класса, было получено Отделом биологических ресурсов Национального института онкологии для фазы 1а/b исследования, в которой проводят лечение пациентов с рефрактерным AL-амилоидозом. Клеточная линия CHO, продуцирующая химерное моноклональное антитело 11-1F4 IgG1, идентифицируется как CAEL-101.
В исследование были включены пациенты с рецидивным или рефрактерным AL-амилоидозом, которые ранее получали лечение антиплазматическими клетками. Пациенты получали химерное моноклональное антитело 11-1F4 IgG1 в виде однократной внутривенной инфузии (фаза 1a) или серии еженедельных инфузий в течение 4 недель (фаза 1b). Схема повышения дозы "вверх и вниз" применяли для фазы 1a и 1b, при которых вводят последовательные дозы 0,5, 5, 10, 50, 100, 250 и 500 мг/м2.
Основная цель исследования состояла в том, чтобы установить максимально переносимую дозу химерного антитела 11-1F4, и вторичные задачи включали: (1) демонстрацию снижения амилоидной нагрузки, о чем свидетельствует уменьшение патологического увеличения внутренних органов и/или улучшение функции органа, (2) определение фармакокинетики 11-1F4 при введении в виде однократной внутривенной инфузии (фаза 1а) или в виде серии еженедельных внутривенных инфузий (фаза 1b), и (3) определение разницы между дозами 250 мг/м2 и 500 мг/м2.
Ключевыми критериями включения были возраст 21 год или более, пациент ранее получал системную терапию, пациент не нуждался в таргетной терапии плазматическими клетками, и общее состояние пациента по Восточной кооперативной онкологической группе (ECOG) менее или равно 3.
Ключевые критерии исключения включали межжелудочковую перегородку более 2,5 мм, клиренс креатинина менее 30 см3/мин, щелочную фосфатазу более чем в 3 раза превышающую установленный верхний предел нормы и билирубин выше 3,0 мг/дл.
Для фазы 1а исследования повышение дозы выполняют по схеме "вверх и вниз". После того как пациенты получают переносимую дозу, они получают прогрессивно более высокие дозы химерного моноклонального антитела 11-1F4, причем два пациента получают дозу 500 мг/м2. Даже пациенты, получавшие дозу 500 мг/м2, не сообщали о каком-либо дозолимитирующем токсическом действии. Пациентов оценивают на 0 неделе, вводят химерное 11-1F4 на 1 неделе, а затем повторно оценивают на 2, 3, 4 и 8 неделе, как показано на фигуре 9А.
Для исследования фазы 1b инфузии проводят один раз в неделю в течение четырех недель, начиная с 0,5 мг/м2. После того как пациенты получают переносимую дозу, они получают прогрессивно более высокие дозы химерного моноклонального антитела 11-1F4, причем шесть пациентов получают дозу 500 мг/м2. Схема дозирования показана на фигуре 9В.
Результаты
Двадцать семь пациентов получили лечение с применением химерного антитела 11-1F4A. Оценивают ответ двадцати шести пациентов. Восемь пациентов завершили фазу 1a и девятнадцать пациентов завершили лечение в фазе 1b. Средний возраст пациентов в фазах 1a и 1b составлял 68 лет. Все пациенты переносили получение дозы химерного моноклонального антитела 11-1F4 и вплоть до высшего уровня дозы 500 мг/м2 в фазах 1a и 1b. Не было никаких связанных с получением лекарственного средства неблагоприятных явлений (НЯ) 4 или 5 степени тяжести или дозолимитирующего токсического действия. У двух пациентов появилась сыпь 2 степени через 3-4 дня после инфузии. У одного пациента появилась кожная сыпь в фазе 1а (уровень дозы 4) и когда он снова начал получать лечение в фазе 1b. Биопсия кожи с иммуногистохимическим окрашиванием показала, что химерное антитело 11-1F4 связывается с амилоидными фибриллами с сопутствующим нейтрофильным инфильтратом. У того же пациента и другого пациента развилась похожая сыпь в фазе 1b, что дополнительно обеспечивает клинические и корреляционные данные, показывающие, что химерное антитело 11-1F4 непосредственно связывает амилоидные фибриллы, сформированные легкими цепями. В целом, 63 % (5 из 8) подлежащих оценке пациентов продемонстрировали ответ со стороны органов после одной инфузии моноклонального антитела c11-1F4 в фазе 1a. Среднее время ответа в фазе 1а составляло 4,5 недели после завершения терапии. В фазе 1b у 61 % (11 из 18) подлежащих оценке пациентов наблюдались значительные ответы со стороны органов со средним временем ответа 1 неделя после начала терапии с тенденцией более быстрого ответа при более высоких дозировках.
Характеристики пациентов подгруппы подлежащих оценке пациентов показаны в таблице 10 ниже.
Таблица 10. Характеристики пациентов в фазе 1a/b
(Диапазон: от 34 до 77)
Женщины N=6 (32 %)
κ N=8 (48 %)
Почка N=11(52 %)
Кожа/Мягкие ткани N=10 (48 %)
Желудочно-кишечный тракт N=8 (38 %)
Нервная система N=4 (19 %)
Печень N=3 (14 %)
Легкое N=2 (10 %)
Костно-мышечная система N=1(5 %)
Очень хорошая частичная ремиссия N=15(71 %)
Частичная ремиссия N=2 (10 %)
Отсутствие ремиссии N=1 (5 %)
(Диапазон: от 894 до 13,131)
(Диапазон: от 1078 до 10,170)
b Базовый уровень белка в моче за 24 часа у пациентов с поражением почек, подлежащих оценке по ответу (базовый уровень белка в моче за 24 часа более 500 мг/сутки)
В конце фазы 1a/b исследования 18 пациентов имели подлежащие оценке ответы (N = 1 не имел подлежащих оценке заболеваний, N = 2 не завершил лечение). Двенадцать из 18 (67%) показали улучшенный ответ со стороны органа. В частности, в фазе 1а, 63% пациента (5 из 8) с измеряемой тяжестью проявления болезни продемонстрировали ответ со стороны органов после одной инфузии моноклонального антитела 11-1F4 (2 почки, 2 сердца и 1 желудочно-кишечный тракт). В фазе 1b исследования 70 % пациентов (7 из 10) с измеряемой тяжестью проявления болезни продемонстрировали ответ со стороны органов: у 3 из 4 пациентов, которые подлежали оценке, с поражением сердца, показали ответ со стороны сердца, 4 из 4 пациентов, которые подлежали оценке, с поражением почек, показали ответ со стороны почек, оценен 1 пациент с ответом со стороны желудочно-кишечного тракта, и 1 пациент с ответом со стороны мягких тканей показал улучшение состояния артрита от 3 до 1.
Ответ со стороны сердца
Восемь пациентов подлежали оценке ответа со стороны сердца. Среди показателей, подлежащих оценке, были NT-proBNP и критерии класса NYHA. Базовый уровень для всех данных пациентов составлял более или равно 650 пг/мл. У пяти пациентов (63 %) показан значительно улучшенный ответ (т.е. снижение NT-proBNP более или равно 30 % и/или переход от класса III к классу I по NYHA), 2 пациента оставались стабильными, и только у одного из них были какие-либо признаки прогрессирование заболевания. Результаты, полученные для сердца для групп пациентов показаны на фигуре 11. В качестве иллюстрации, уменьшение уровня NT-proBNP для одного пациента показано на фигуре 12.
Ответ со стороны почек
Восемь пациентов подлежали оценке ответа со стороны почек, причем протеинурия была основным показателем для определения ответа. У шести пациентов (75 %) показан значительно улучшенный ответ (то есть снижение протеинурии более или равно 30 % или снижение до менее 0,5 г/24 часа в отсутствие прогрессирования почек), и два пациента оставались стабильными. Ни у одного пациента не было признаков прогрессирования заболевания почек (ухудшение в расчётной скорости клубочковой фильтрации (рСКФ) более 25 %). Результаты, полученные для почек для групп пациентов показаны на фигуре 13. В качестве иллюстрации, уменьшение протеинурии для одного пациента показано на фигуре 14.
Обзор результатов исследования
Лечение химерным антителом 11-1F4 было хорошо переносимым и безопасным. Не было связанных с препаратом неблагоприятных явлений (НЯ) 4 или 5 степени тяжести или дозолимитирующего токсического действия, вплоть до максимально переносимой дозы 500 мг/м2. Более того, химерное антитело 11-1F4 клинически эффективно. Большинство пациентов показали ранний и устойчивый ответ со стороны органов даже после однократной инфузии или еженедельных инфузий в течение 4 недель. Улучшенные ответы наблюдают в тканях/органах, включая ответ со стороны сердца, почек, желудочно-кишечного тракта, кожи и мягких тканей. Более того, химерное антитело 11-1F4 безопасно способствует выведению амилоида у 67 % пациентов и приводит к улучшению функции органов после однократного приема даже у пациентов с отложениями ALλ. Ответ пациента на получение химерного антитела 11-1F4 был быстрым и устойчивым. Более того, при среднем времени ответа 4,5 недели в фазе 1а исследования и всего лишь одной неделе в фазе 1b исследования химерное антитело 11-1F4 обеспечивает положительный ответ быстрее, чем любое другое известное терапевтическое воздействие на амилоидные фибриллы. Быстрое разрушение амилоидных фибрилл химерным антителом 11-1F4 может улучшить функцию органов и, соответственно, значительно улучшить показатели смертности у пациентов с данной однотипной смертельной болезнью.
Пример 9
Ответ со стороны сердца на химерное реактивное моноклональное антитело к амилоидным фибриллам 11-1F4 у пациентов с AL-амилоидозом с глобальной продольной деформацией: результаты фазы 1b исследования
Фаза 1b открытого клинического исследования химерного моноклонального антитела 11-1F4 было завершено с многообещающими результатами, как показано ниже. Данное исследование было проведено для оценки ответа функции миокарда на введение моноклонального антитела с применением глобальной продольной деформации (GLS).
Девятнадцать пациентов с рецидивным или рефрактерным AL-амилоидозом были включены в исследование (возраст ± стандартное отклонение, 63 ± 12, 68 % мужчины). Пятьдесят три процента имели амилоиды легкой цепи типа каппа, и 52 % имели поражение сердца, что определили по уровню NTpro-BNP более 650 пг/мл. Скрининг NTpro-BNP и базовые уровни у девятнадцати пациентов показаны в таблице 11 ниже. Данные пациенты с поражением сердца включали 2 пациентов, которые не участвовали в первичном клиническом анализе по оценке поражения сердца, из-за различий в скрининге и базовых значениях NT-proBNP.
Таблица 11. Скрининг и базовые значения NTpro-BNP эхокардиографического анализа
Моноклональное антитело вводят еженедельно в течение 4 недель с последовательными дозами 0,5, 5, 10, 50, 100, 250 и 500 мг/м2 по схеме с повышением дозы. Было проведено сравнение клинических эхокардиографических (ЭхоКГ) исследований в начале исследования и через 12 недель после терапии. Было получено несколько эхокардиографических переменных, включая фракцию выброса левого желудочка (ФВЛЖ) (рассчитанную с применением способа Симпсона в двух проекциях) и глобальную продольную деформацию (GLS). GLS измеряют с применением спекл-трекинга (TomTec-Arena 1.2, Германия) и рассчитывают, как среднее из 4-, 2- и 3-камерных измерений. Парный t-критерий Стьюдента применяют для сравнения эхокардиографических переменных в начале исследования и через 12 недель после терапии моноклональным антителом. Анализ параметров эхокардиограммы показан в таблице 12 ниже.
Таблица 12. Анализ эхокардиографических параметров
Хотя не наблюдают ни значимого изменения между ФВЛЖ (фракция выброса левого желудочка) (56,2 ± 8,6 % против 56,2 ± 9,5 %, р = 0,985), ни GLS (минус 19,04 ± -5,11 % против минус 19,73 ± минус 4,1 %, р = 0,119) от начала до 12 недель исследования для всей когорты, у пациентов с поражением сердца наблюдают улучшение в GLS (минус 15,58 ± минус 4,14 % до и минус 17,37 ± минус 3,53 % после, р = 0,004). Анализ подгрупп показал улучшение GLS у пациентов с поражением сердца амилоидами типа лямбда в (минус 14,3 ± минус 4,38 % до и минус 16,17 ± минус 3,74 % после, р = 0,02) и тенденция к улучшению с поражением сердца амилоидами типа каппа (минус 16,60 ± минус 4,10 % до и минус 18,16 ± минус 3,48 % после, р = 0,07). Кроме того, подлежащая оценке популяция по кардиологическим параметрам, что определяют в клиническом анализе исследования (с применением базовых значений NT-proBNP, а не значений скрининга), также привела к статистически значимому снижению GLS % (значение p 0,0163) с численно сходным снижением (минус 1,71) в соответствии с данными анализа группы ЭхоКГ (минус 1,69). В приведенной ниже таблице 13 представлен анализ уменьшения GLS у пациентов с поражением сердца по сравнению с пациентами с поражением сердца, подлежащими оценке, и пациентами, не страдающими поражением сердца.
Таблица 13. Сравнение значений скрининга пациентов с поражением сердца с базовыми значениями и пациентами, не страдающими поражением сердца.
В заключение, это исследование показывает значительное улучшение в GLS после воздействия специфического моноклонального антитела к амилоидным фибриллам у субъектов с поражением сердца амилоидами AL. 9 из 10 пациентов с поражением сердца показали улучшение показателя GLS %. Вероятность того, что 9 или более пациентов покажут улучшение, при нулевой гипотезе об отсутствии лекарственного эффекта, составляет приблизительно 0,0107, что говорит о том, что получение 9 из 10 пациентов с улучшением является крайне маловероятным результатом, за исключением, когда препарат действительно эффективен. Данные предварительные данные помогут в разработке более крупного клинического испытания. Кроме того, необходимы более масштабные исследования с применением GLS для оценки функции миокарда.
Пример 10
Ответ со стороны органов на химерное реактивное моноклональное антитело к амилоидным фибриллам 11-1F4 у пациентов с отсутствием гематологической ремиссии.
Пациенту, который получил 6 курсов химиотерапии и достиг частичной гематологической ремиссии без ответа со стороны органов, вводят химерное реактивное моноклональное антитело (mAb) к амилоидным фибриллам 11-1F4. В течение трех последовательных периодов после введения дозы, наблюдают постоянное снижение уровня NT-proBNP после введения 11-1F4, и у пациента выявляют ответ со стороны органа. Но при отмене введения антитела, количество свободных легких цепей увеличивалось, и состояние пациента ухудшалось. Прогрессирование органов наблюдают после завершения исследования. Схема ответа данного пациента привела авторов изобретения к выводу, что ответ со стороны органа был обусловлен получением химерного антитела 11-1F4 и не зависел от гематологической ремиссии, вызванной химиотерапией.
В описании и формуле изобретения настоящего документа, слово "содержать" и варианты данного слова, такие как "содержит" и "содержащий", не предназначены для исключения других признаков, добавок, компонентов, целых чисел или стадий, а скорее, если явно не указано иное, объем данных слов должен толковаться широко так, чтобы они имели скорее включающее, чем исключающее значение.
Хотя композиции и способы настоящего изобретения раскрыты в настоящем документе посредством иллюстративных примеров, следует понимать, что изобретение не ограничено ими и что могут быть внесены изменения, известные специалистам в данной области техники, без отступления от идей изобретения, определенных прилагаемой формулой изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ЗЕ ТРАСТИС ОФ КОЛАМБИЯ ЮНИВЕРСИТИ ИН ЗЕ СИТИ ОФ НЬЮ-ЙОРК
<120> СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АМИЛОИДОЗОВ
<130> 8441-0004WO
<150> US 62/526835
<151> 2017-06-29
<160> 48
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 1
atgaagattg cctgttaggc tgttggtgct g 31
<210> 2
<211> 31
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 2
atggagwcag acacactccc tgytatgggt g 31
<210> 3
<211> 30
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 3
atgagtgtgc tcactcaggt cctggsgttg 30
<210> 4
<211> 33
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 4
atgaggrccc ctgctcagwt tyttggmwtc ttg 33
<210> 5
<211> 30
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 5
atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc 30
<210> 6
<211> 29
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 6
atgaggtkcy ytgytsayct yctctgrgg 29
<210> 7
<211> 32
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 7
atgggcwtca aagatggagt cacakwyycw gg 32
<210> 8
<211> 31
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 8
atgtggggay ctkttttycm mtttttcaat g 31
<210> 9
<211> 25
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 9
atggtrtccw casctcagtt ccttg 25
<210> 10
<211> 27
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 10
atgtatatat gtttgttgtc tatttct 27
<210> 11
<211> 28
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 11
atggaagccc cagctcagct tctcttcc 28
<210> 12
<211> 20
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 12
actggatggt gggaagatgg 20
<210> 13
<211> 27
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 13
atgaaatgca gctggggcat sttcttc 27
<210> 14
<211> 26
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 14
atgggatgga gctrtatcat sytctt 26
<210> 15
<211> 27
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 15
atgaagwtgt ggttaaactg ggttttt 27
<210> 16
<211> 25
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 16
atgractttg ggytcagctt grttt 25
<210> 17
<211> 32
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 17
atgggactcc aggcttcaat ttagttttcc tt 32
<210> 18
<211> 29
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 18
atggcttgtc yttrgsgctr ctcttctgc 29
<210> 19
<211> 27
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 19
atggratgga gckggrgtct ttmtctt 27
<210> 20
<211> 23
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 20
atgagagtgc tgattctttt gtc 23
<210> 21
<211> 31
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 21
atggmttggg tgtggamctt gcttattcct g 31
<210> 22
<211> 28
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 22
atgggcagac ttaccattct cattcctg 28
<210> 23
<211> 28
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 23
atggattttg ggctgatttt ttttattg 28
<210> 24
<211> 27
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 24
atgatggtgt taagtcttct gtacctg 27
<210> 25
<211> 21
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 25
cagtggatag acagatgggg g 21
<210> 26
<211> 21
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 26
cagtggatag accgatgggg g 21
<210> 27
<211> 21
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 27
cagtggatga gctgatgggg g 21
<210> 28
<211> 21
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 28
caagggatag acagatgggg c 21
<210> 29
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность, содержащая последовательности
человека разумного и мыши домовой
<400> 29
gttttcccag tcacgac 17
<210> 30
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность, содержащая последовательности
человека разумного и мыши домовой
<400> 30
agcggataat ttcacacagg a 21
<210> 31
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность, содержащая последовательности
человека разумного и мыши домовой
<400> 31
aagcttgccg ccaccatggc tgtcctgggg ctgctcttct gc 42
<210> 32
<211> 46
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность, содержащая последовательности
человека разумного и мыши домовой
<400> 32
ccgatgggcc cttggtggag gctgaggaga cggtgactga ggttcc 46
<210> 33
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность, содержащая последовательности
человека разумного и мыши домовой
<400> 33
aagcttgccg ccaccatgaa gttgcctgtt aggctgttgg tgc 43
<210> 34
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность, содержащая последовательности
человека разумного и мыши домовой
<400> 34
ggatccactc acgtttgatt tccagcttgg tcccccctcc ga 42
<210> 35
<211> 111
<212> PRT
<213> Мышь домовая
<400> 35
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Lys Pro Asn Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ile Ser Lys Ser Gln Val Leu Phe
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 36
<211> 112
<212> PRT
<213> Мышь домовая
<400> 36
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys Phe Gln Thr
85 90 95
Thr Tyr Val Pro Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 131
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность, содержащая последовательности
человека разумного и мыши домовой
<400> 37
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Arg Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Arg Asp Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys
100 105 110
Phe Gln Thr Thr Tyr Val Pro Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 38
<211> 130
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность, содержащая последовательности
человека разумного и мыши домовой
<400> 38
Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
20 25 30
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro
65 70 75 80
Asn Leu Met Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ile Ser Lys Ser Gln
85 90 95
Val Leu Phe Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Val Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 39
<211> 333
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 39
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acatgcactg tctcagggtt ctcattaagc agctatggtg taagctgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggtg acgggagcac aaattatcat 180
ccaaatctca tgtccagact gagtatcagc aaggatattt ccaagagcca agttctcttc 240
aaactgaata gtctgcaaac tgatgacaca gccacgtact actgtgtcac cttcgactac 300
tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tca 333
<210> 40
<211> 336
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 40
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta catagaaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggactt tatttctgtt ttcaaactac atatgttccg 300
aacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 41
<211> 43
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 41
aagcttgccg ccaccatgaa gttgcctgtt aggctgttgg tgc 43
<210> 42
<211> 422
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность, содержащая последовательности
человека разумного и мыши домовой
<400> 42
aagcttgccg ccaccatgaa gttgcctgtt aggctgttgg tgctgatgtt ctggattcct 60
gcttccagca gtgatgttgt gatgacccaa actccactct ccctgcctgt cagtcttgga 120
gatcaagcct ccatctcttg cagatctagt cagagccttg tacatagaaa tggaaacacc 180
tatttacatt ggtacctgca gaagccaggc cagtctccaa agctcctgat ctacaaagtt 240
tccaaccgat tttctggggt cccagacagg ttcagtggca gtggatcagg gacagatttc 300
acactcaaga tcagcagagt ggaggctgag gatttgggac tttatttctg ttttcaagac 360
tacatatgtt ccgaacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaatcaaac gtgagtggat 420
cc 422
<210> 43
<211> 42
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 43
ggatccactc acgtttgatt tccagcttgg tcccccctcc ga 42
<210> 44
<211> 42
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 44
aagctttccg ccaccatggc tgtcctgggg ctgctcttct gc 42
<210> 45
<211> 426
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность, содержащая последовательности
человека разумного и мыши домовой
<400> 45
aagctttccg ccaccatggc tgtccctggg gctgctcttc tgcctggtga cattaccaag 60
ctgtgtcctg tcccaggtgc agctgaagga gtcaggacct ggcctggtgg agcctcacag 120
agcctgtcca tcacatgcac tgtctcaggg ttctcattaa gcagctatgg tgtaagctgg 180
gttcgccagc ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggtg acgggagcac 240
aaattatcat ccaaatctca tgtccagact gagtatcagc aaggatattt ccaagagcaa 300
gttctcttca aactgaatag tctgcaaact gatgacacag ccacgtacta ctgtgtcacc 360
ttggactact ggggtcaaag gaacctccag tcaccgtctc ctcagcctcc accacgggcc 420
catcgg 426
<210> 46
<211> 46
<212> ДНК
<213> Мышь домовая
<400> 46
ccgatgggcc cttggtggag gctgaggaga cggtgactga ggttcc 46
<210> 47
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность, содержащая последовательности
человека разумного и мыши домовой
<400> 47
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Arg Asp Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys Phe Gln Thr
85 90 95
Thr Tyr Val Pro Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 48
<211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность, содержащая последовательности
человека разумного и мыши домовой
<400> 48
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Asn Leu Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ile Ser Lys Ser Gln Val Leu Phe
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ХИМЕРНЫЕ АНТИТЕЛА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХСЯ ОТЛОЖЕНИЕМ АМИЛОИДА | 2018 |
|
RU2746325C1 |
| ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ И ЛЕЧЕНИЕ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ АМИЛОИДНОЙ АНГИОПАТИИ | 2008 |
|
RU2523894C2 |
| ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО | 2008 |
|
RU2538709C2 |
| ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ АМИЛОИДА-БЕТА ПРИ ГЛАЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ | 2008 |
|
RU2571859C2 |
| СЛИТАЯ МОЛЕКУЛА, СПОСОБНАЯ ИНДУЦИРОВАТЬ НЕВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ ФАГОЦИТОЗ | 2022 |
|
RU2823919C1 |
| ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К АМИЛОИДУ БЕТА | 2007 |
|
RU2498999C2 |
| ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА К АМИЛОИДУ БЕТА | 2008 |
|
RU2567151C2 |
| ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К АМИЛОИДУ БЕТА | 2013 |
|
RU2668161C2 |
| ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ АМИЛОИДА БЕТА ПРИ ГЛАЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ | 2008 |
|
RU2542967C2 |
| АНТИ-C5 АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2018 |
|
RU2774716C2 |
Изобретение относится к медицине, в частности к способам лечения заболеваний, сопровождающихся отложением амилоида, в частности первичного амилоидоза, к способу детекции наличия амилоидных отложений первичного амилоидоза, к способу уменьшения количества отложений фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа каппа и/или лямбда у пациента с диагнозом первичный амилоидоз, а также к способу лечения амилоидоза легких цепей (ALA) с поражением сердца у пациента, где ALA не достигает гематологической ремиссии путем применения химерного (мыши и человека) антитела к амилоидным фибриллам. Изобретение обеспечивает эффективное лечение заболеваний, связанных с отложением амилоида, в частности первичного амилоидоза. 4 н. и 26 з.п. ф-лы, 14 ил., 13 табл., 10 пр.
1. Способ лечения первичного амилоидоза у пациента, представляющего собой человека, нуждающегося в таком лечении, включающий введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей химерное антитело мыши и человека, содержащее область VK (вариабельная область легкой цепи), содержащую последовательность SEQ ID NO: 47, и область VH (вариабельная область тяжелой цепи), содержащую последовательность SEQ ID NO: 48, в дозе, эффективной для лечения указанного первичного амилоидоза, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
2. Способ по п. 1, где химерное антитело вводят в дозе приблизительно 500 мг/м2 или менее.
3. Способ по п. 1, где эффективная доза химерного антитела составляет приблизительно от 1 до 50 мг/кг.
4. Способ по п. 1, где первичный амилоидоз включает поражение по меньшей мере одного органа или ткани, выбранных из группы, состоящей из сердца, почек, печени, легкого, желудочно-кишечного тракта, нервной системы, скелетно-мышечной системы, мягких тканей и кожи.
5. Способ по п. 1, где доза эффективна для того, чтобы вызвать признаки терапевтического ответа менее чем за 5 недель.
6. Способ по п. 1, где пациент проявляет признаки терапевтического ответа в течение приблизительно недели или менее.
7. Способ по п. 4, где первичный амилоидоз включает поражение сердца.
8. Способ по п. 5, где доза эффективна для снижения уровня N-терминального натрийуретического пептида головного мозга (NT-proBNP) у пациента по меньшей мере приблизительно на 30 % по сравнению с базовыми уровнями после введения химерного антитела.
9. Способ по п. 1, где эффективная доза химерного антитела составляет приблизительно 2200 мг.
10. Способ по п. 5, где доза эффективна для снижения уровня N-терминального натрийуретического пептида головного мозга (NT-proBNP) у пациента до менее приблизительно 9100 нг/л после введения антитела.
11. Способ по п. 4, где пациент был причислен к классу II или III по функциональной классификации Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA) до введения химерного антитела и его причисляют к классу I после введения химерного антитела.
12. Способ по п. 4, где первичный амилоидоз включает поражение почек.
13. Способ по п. 12, где доза эффективна для снижения уровня белка в моче пациента по меньшей мере приблизительно на 30 % по сравнению с базовыми уровнями после введения антитела.
14. Способ по п. 12, где доза эффективна для снижения уровня белка в моче пациента до менее приблизительно 7000 мг/24 часа после введения антитела.
15. Способ детекции наличия амилоидных отложений первичного амилоидоза у пациента с подозрением на наличие таких отложений, включающий введение пациенту количества химерного антитела мыши и человека, содержащего область VK, содержащую последовательность SEQ ID NO: 47, и область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 48, и имеющего прикрепленную к нему детектируемую метку, при этом количество вводимого антитела является достаточным для выявления амилоидных отложений первичного амилоидоза, если таковые имеются.
16. Способ по п. 15, где детектируемая метка представляет собой 124I.
17. Способ по п. 1, где химерное антитело содержит константную область, полученную из человеческого IgG1 (иммуноглобулин G).
18. Способ по п. 1, где первичный амилоидоз представляет собой первичный амилоидоз легкой цепи (AL).
19. Способ по п. 18, где AL-амилоидоз характеризуется наличием фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа лямбда.
20. Способ по п. 1, где терапевтически эффективное количество химерного антитела вводят один раз в два, три, четыре, пять или шесть месяцев.
21. Способ по п. 1, где терапевтически эффективное количество химерного антитела вводят два раза в год.
22. Способ по п. 18, где AL-амилоидоз является рефрактерным.
23. Способ уменьшения количества отложений фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа каппа и/или лямбда, у пациента, представляющего собой человека, с диагнозом первичный амилоидоз, характеризующимся наличием отложений фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа каппа или лямбда, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективной дозы, уменьшающей отложения фибриллярных агрегатов, антитела, содержащего:
а) область VK, содержащую последовательность SEQ ID NO: 47,
b) область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 48, и
с) константную область человеческого IgG1,
где введение антитела уменьшает количество отложений фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа каппа и/или лямбда, у пациента.
24. Способ по п. 23, где первичный амилоидоз характеризуется наличием отложений фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа лямбда.
25. Способ по п. 23, где первичный амилоидоз характеризуется наличием отложений фибриллярных агрегатов, сформированных легкими цепями типа каппа.
26. Способ по п. 23, где антитело содержит:
VH, содержащую: область, определяющую комплементарность (CDR) H1, имеющую последовательность SEQ ID NO: 52, CDRH2, имеющую последовательность SEQ ID NO: 53, и CDRH3, имеющую последовательность SEQ ID NO: 54, и
VK, содержащую CDRL1, имеющую последовательность SEQ ID NO: 49, CDRL2, имеющую последовательность SEQ ID NO: 50, и CDRL3, имеющую последовательность SEQ ID NO: 51.
27. Способ по п. 18, необязательно дополнительно включающий мониторинг улучшения функции миокарда у пациента с диагнозом амилоидоз легких цепей (ALA) с поражением сердца, включающий наблюдение улучшения функции миокарда у пациента с диагнозом ALA с поражением сердца в течение приблизительно трех недель после введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества химерного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
28. Способ лечения амилоидоза легких цепей (ALA) с поражением сердца у пациента, где ALA не достигает гематологической ремиссии, включающий введение указанному пациенту с диагнозом ALA, характеризующимся поражением сердца и отсутствием гематологической ремиссии, терапевтически эффективного количества гуманизированного или химерного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего:
VH, содержащую: CDRH1, имеющую последовательность SEQ ID NO: 52, CDRH2, имеющую последовательность SEQ ID NO: 53, и CDRH3, имеющую последовательность SEQ ID NO: 54, и
VK, содержащую CDRL1, имеющую последовательность SEQ ID NO: 49, CDRL2, имеющую последовательность SEQ ID NO: 50, и CDRL3, имеющую последовательность SEQ ID NO: 51.
29. Способ по п. 28, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное, человеческое или химерное антитело.
30. Способ по п. 28, где область VK имеет последовательность SEQ ID NO: 47 и область VH имеет последовательность SEQ ID NO: 48.
| ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА К β-АМИЛОИДНОМУ ПЕПТИДУ | 2008 |
|
RU2475500C2 |
| WO 2016187546 A1, 24.11.2016 | |||
| US 2016243230 A1, 25.08.2016 | |||
| MERLINI G | |||
| et al | |||
| Molecular mechanisms of amyloidosis, N | |||
| Engl | |||
| J | |||
| Med., 2003, Volume 349, Issue 6, pp | |||
| Автоматический аппарат для тушения пожаров | 1912 |
|
SU583A1 |
| TUZOVIC M | |||
| et al | |||
| Cardiac Amyloidosis: Diagnosis and Treatment Strategies, Curr Oncol Rep., 2017, Volume 19, Issue 7, p | |||
| Способ изготовления звездочек для французской бороны-катка | 1922 |
|
SU46A1 |
| ДИСПОР Э | |||
| и др | |||
