ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК-АПТАМЕРОВ, СВЯЗЫВАЮЩАЯСЯ С БАКТЕРИЯМИ Escherichia coli O157:H7 Российский патент 2015 года по МПК C12N15/11 

Изобретение относится к области биоинженерии, биотехнологии, медицинской микробиологии, биохимии, диагностики и терапии особо опасных инфекций.

Основными областями применения ДНК-аптамеров к бактериям штамма Escherichia coli O157:H7 являются микробиологические и клинические исследования, медицинская диагностика кишечных инфекций, в том числе создание высокочувствительных и высокоэффективных систем для детекции данного особо опасного инфекционного возбудителя.

Е. coli O157:H7 является одним из наиболее опасных возбудителей острых кишечных инфекций и вызывает тяжелое острое кишечное заболевание, часто сопряженное с развитием угрожающего жизни гемолитико-уремического синдрома (ГУС). ГУС характеризуется острой почечной недостаточностью, тромбоцитопенией и микроангеопатической гемолитической анемией [Boyer О., Niaudet Р. // Int. J. Nephrol. -2011. - doi: 10.4061/2011/908407]. Вероятность развития ГУС составляет от 3-7% случаев при спорадических инфекциях, вызванных Е. coli O157:Н7, до 20% случаев при эпидемическом распространении заболевания [Mead P.S., Griffin P.M. // Lancet - 1998. - V. 352. - №9135. - P. 1207-1212]. При развитии ГУС острая почечная недостаточность наблюдается в 55-70% случаев, при этом смертность может составлять 3-7% [Parmar M.S. // Medscape and Medicine. http://emedicine.medscape.com/article/201181-overview#a0104]. У 30% переболевших могут развиться остаточные последствия в форме хронической почечной недостаточности, гипертонии и неврологических расстройств [Noris M., Caprioli J. с соавт.// Clin. J. Am. Soc. Nephrol. - 2010. - V.5. - №10. - P. 1844-1859]. Наиболее тяжело болезнь протекает у детей младше 5 лет и пожилых людей [Ruggenenti Ν., Remuzzi P.M. с соавт.// Kidney Int. - V.60. - №3. - P. 831-846]. Качество жизни пациентов после перенесенного заболевания существенно снижается, и в ряде случаев требуется многолетняя поддерживающая терапия для реабилитации функции почек.

В настоящее время острые кишечные инфекции, вызванные штаммами Е. coli O157:Н7, встречаются более чем в 30 странах мира, включая США, Канаду, Японию, страны Европы, страны Африки, Россию. Наиболее высокая частота ассоциированного с E. coli O157:H7 ГУС наблюдается в Аргентине [Rivero М.А., Passucci J.A. с соавт.// Foodborne pathogens and disease. - 2011. - V.8. - №8. - P.901-906]. Гемолитический уремический синдром (ГУС) более чем в 70% случаев является следствием инфекции, вызванной Е. coli серотипа O157:H7. Диагностика инфекции E coli O157:H7 на ранних этапах заболевания, а также своевременная идентификация бактерий в подозрительных продуктах питания и раннее применение адекватной терапии обеспечивают благоприятный прогноз исхода заболевания.

Основным фактором патогенности штаммов E. coli O157:H7 является продукция шига-подобных токсинов STX-1 и STX-2, которые, проникая в клетку гломерулярного эндотелия, связывают глоботриазилцерамид Gb3, что в силу различных, частично не до конца расшифрованных механизмов, приводит к инициации целого каскада событий сигнальной трансдукции, выражающихся в разнообразных физиологических последствиях - апоптозе, связывании лейкоцитов с клетками эндотелия, выбросе цитокинов, тромбообразовании, микроангиопатическом гемолизе [Psotka М.А., Obata F. с соавт.// Infect. Immun. - 2009. - V.77. - №3. - P.959-969]. Таким образом, шига-подобные токсины (а чаще, кодирующая их в составе бактерии ДНК) как правило, являются основной мишенью при разработке современных экспресс-методов диагностики патогенных штаммов E. coli в клинической практике (включая клиническую детекцию E. coli O157:H7), большинство из которых представляет собой ПЦР с последовательностей, кодирующих токсины [Bélanger S.D., Boissinot M. с соавт.// J. Clin. Microbiol. - 2002. - V.40. - №4. - P. 1436-1440]. Также шига-подобные токсины представляют собой основную мишень для разработки средств экстренной терапии заболевания [Tzipori S., Sheoran А. с соавт. // Clin. Microbiol. Rev. - 2004. -V.17. - №4. - Р.926-941]. Будучи в основном достаточно успешной, подобная стратегия часто ведет к признанию диагностической эквивалентности обнаружения шига-токсина как фактора вирулентности E. coli O157:H7 и наличия штамма-возбудителя заболевания, однако, она не проходила адекватной клинической валидации и в перспективе может оказаться терапевтически весьма рискованной, поскольку в настоящий момент широко известны случаи не только внутривидового (как в случае возникновения патогенного штамма E. coli О104:Н4 [Muniesa M., Hammerl J.А. с соавт. // Appl. Environ. Microbiol. - V.78. - №12. - Р.4065-4073], но и межвидового горизонтального переноса как генов, кодирующих шига-токсины, так и генов антибиотикоустойчивости [Me Manon M.A.S., Blair I.S. с соавт.// J. Appl. Microbiol. - 2007. - V.103. - №5. - P. 1883-1888, Diaz-Sánchez S., Sánchez S. с соавт.// Vet. Microbiol. - 2013. - V.163. - №3-4. - Р.:274-281]. Постоянное нарастание антибиотикоустойчивости патогенных штаммов может потребовать в дальнейшем разработки видо- и даже серогруппоспецифической противоинфекционной терапии. Однако, как ПЦР-анализ, так и рутинная иммунологическая идентификация шига-токсинов крайне затруднены в случае необходимости выявления сверхнизких количеств возбудителя в сложных комплексных образцах - продуктах питания, образцах окружающей среды и др. Таким образом, остро стоит вопрос о разработке высокочувствительных подходов к видо- и серогруппоспецифической идентификации E. coli O157:H7 и поиске молекулярных инструментов для осуществления данных процедур.

В мировой практике было неоднократно показано, что иммунологическая идентификация бактерий E. coli O157:H7 с помощью поли- и моноклональных антител осуществляется весьма успешно в силу существования у них уникальной для 0157 серогруппы структуры поверхностного О-антигена, состоящего из 40-80 повторяющихся субъединиц из 4 сахаров, включая N-ацетилпирозамин, L-фукозу, D-глюкозу и N-ацетил-D-галактозу [Wang L., Reeves P.R. // Infect. Immun. - 1998. - V.66. - №8. - P. 3545-3551], что облегчает получение высокоспецифических вариантов антител к данному патогену [Westerman R. В., Не Y. // J. Clin. Microbiol. - 1997. - V.35. - №3. -P.679-684]. На сегодняшний день диагностические тест-системы на основе ИФА активно используются для прямой идентификации E. coli O157:H7 наряду с ПЦР и стандартными микробиологическими методами [3M™ Tecra™ Е. coli O157 Visual Immunoassays (3M, США), Е. coli 0157 Microwell ELISA (SafePath, США) и др].

Однако антитела являются не единственным типом аффинных молекул, на основе которых возможна разработка средств эффективной детекции данного патогена. В качестве диагностических молекул также могут быть успешно использованы аптамеры - одноцепочечные олигонуклеотиды, которые благодаря образованию сложных трехмерных структур и пространственному расположению зарядов в молекуле имеют высокую аффинность в отношении заданных молекул. Направленный отбор аптамеров против бактериальных мишеней осуществляется по технологии SELEX ("Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment") [US Patent 5567588] с применением различных модификаций технологии, таких как cell-SELEX [Ohuchi S. // Biores. Open Acess. - 2012. - V.l. - №6. - P.265-272], проточная цитометрия [Raddatz M.S., Dolf А. с соавт. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. - 2008. - V.47. - P. 5190-5193], FRET [BrunoJG¹, Carrillo MP. J Fluoresc. 2010 Nov; 20(6):1211-23.] и др.

Известны как РНК, так и ДНК аптамеры, полученные к различным белкам Е. coli - РНК-полимеразе [Kulbachinskiy Α., Feklistov А. с соавт.// Eur. J. Biochem. - 2004. -V.271. - №23-24. - P.4921-4931], фактору высвобождения I (RFI) Ogawa Α., Nishi Т. с соавт. // Nucleic Acids Symp Ser (Oxf).- 2005. - V.49. - P.269-270], внешним мембранным белкам (OMP) [Bruno J.G., Carrillo M.P., Phillips T. // J. Fluoresc. - 2010. - V.20. - №6. -P.1211-1223; Lee H.J., Kim B.C. // Biosens. Bioelectron. - 2009. - V.24. - №12. - P.3550-3555.].

Известен РНК-аптамер, специфичный к бактериям Е. coli 0157 серогруппы, полученный корейскими исследователями [Патент WO 2012081907 A3; Lee Y.J., Han S.R. с соавт. // Biochem Biophvs Res Commun. 2012 Jan 6;417(1):414-20]. Данный аптамер 1-11 был идентифицирован в виде последовательности, содержащей 99 нуклеотидов из которой позже была выделена функциональная часть длиной 64 нуклеотида, способная связываться с бактериальными клетками (K_D=110 нМ). Однако для данного аптамера не приведены результаты исследования специфичности его взаимодействия с клетками E. coli O157:H7, а эффективность связывания с клетками невысока. Кроме того, РНК малоустойчива во внешней среде и быстро деградирует, таким образом, без оптимизации и стабилизации данного аптамера он не может быть использован для целей диагностики и терапии.

Известен наиболее близкий аналог данного изобретения, ДНК-аптамер, описанный китайскими исследователями и примененный для детекции бактерий Е. coli O157:H7 в разработанных аптасенсорных системах с использованием колориметрической детекции [Wu W., Zhang J. с соавт. // PLOS One. - 2012. - V.7. - №11. - P. 1-9] и детекции на основе золотых наночастиц [Wu W., Li M. с соавт. // Nanoscale Research Letters. - 2012. - V.7. - №:658. - P.1-7]. В работах приводится первичная последовательность использованного аптамера, информация о специфичности детекции бактерий, проанализированная на панели близкородственных микроорганизмов, но не дается информации о способе его получения и параметрах связывания с бактерией. Тем не менее, можно на основе опубликованных данных можно сделать вывод, что чувствительность детекции с помощью данного аптамера составляет до 104 бактериальных клеток Е. coli O157:H7 в зависимости от примененного метода, что значительно ниже чувствительности тест-систем для детекции данных бактерий, основанных, в частности, на ПЦР-детекции, сопряженной с применением высокоспецифических моноклональных антител [Патент WO 1998020148 А1].

Задачей настоящего изобретения является получение ДНК-аптамеров к бактериям Е. coli O157:H7, обладающих аффинностью и специфичностью в отношении данных бактерий, стабильностью при длительном хранении и пригодных для разработки диагностических тест-систем.

Поставленная задача решается с использованием разработанной схемы селекции аптамеров к бактериальным клеткам, основанной на применении тРНК в качестве конкурента за связывание, что позволяет отобрать аптамеры с высокой специфичностью к мишени в результате малого числа раундов селекции.

Также поставленная задача решается применением раундов негативной и позитивной селекции библиотеки ДНК-олигонуклеотидов против бактерий Е. coli O157:H7, непатогенного штамма Е. coli DH12S и близкородственных микроорганизмов, что позволяет удалить из селектируемого пула последовательности ДНК, неспецифичные в отношении бактерий Е. coli серогруппы О157.

Также поставленная задача решается путем клонирования селектированных последовательностей ДНК в плазмидный вектор, определения их первичной структуры и проверки индивидуальных последовательностей ДНК на связывание с бактериями Е. coli O157:H7 при помощи колориметрической детекции в твердофазном анализе и иммуноаптамерной ПЦР.

Техническим результатом изобретения является одноцепочечный ДНК-аптамер O157Flank длиной 81 нуклеотид с молекулярной массой 27кДа и первичной последовательностью

CATACGTTCGACTGCTACTCTGAGTCTGACCTTACAGTCAGTCAATCATGGGACAT ACGAAATGTGAGATGTACAGACTAG,

специфически связывающийся с бактериями Е. coli O157:H7 и способный детектировать их в реакции иммуноаптамерной ПЦР в концентрации до 10³ микробных клеток на 1 мл раствора.

Предлагаемое техническое решение предусматривает сочетание раундов негативной и позитивной селекции, что существенно повышает специфичность отобранных последовательностей.

Также техническое решение предполагает применение тРНК в качестве конкурента за связывание бактериальной клетки, что позволяет выделить при отборе исключительно те ДНК-аптамеры, которые специфически связываются с поверхностью бактерий.

Также техническое решение предполагает тестирование отобранных аптамеров против панели близкородственных к Е. coli O157:H7 микроорганизмов, что позволяет отобрать последовательности ДНК, специфичные исключительно к данным бактериям.

Важным преимуществом предлагаемой системы получения ДНК-аптамеров, специфичных к Е. coli O157:H7, является возможность отбора пула высокоаффинных ДНК-аптамеров с минимальным содержанием низкоаффинных молекул при применении малого количества раундов селекции.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Синтезируют комбинаторную библиотеку ДНК-олигонуклеотидов вида 5′-constl-N45-const2, где N45 - вариабельная область, состоящая из 45 нуклеотидов, а const1 и const2 - константные фланкирующие области длиной по 18 нуклеотидов, которые служат для связывания со специфическими праймерами, позволяющими амплифицировать пул олигонуклеотидов после этапов селекции (Фиг. 1А). Негативную селекцию из комбинаторной библиотеки осуществляют в отношении фиксированных 1% формалина бактерий непатогенного штамма Е. coli DH12S и инактивированных культур штаммов панели близкородственных бактерий. Разделение бактерий со связанными аптамерами от несвязавшихся последовательностей ДНК осуществляют центрифугированием бактериальной суспензии при 6000 g в течение 10 минут. На каждом раунде селекции пул несвязавшихся олигонуклеотидов амплифицируют в ПЦР с применением праймеров: прямого ForFAM, меченого F AM по 5′-концу цепи, и обратного RevP, несущего на 5′-конце остаток фосфорной кислоты (Фиг. 1Б). Двуцепочечный ПЦР-продукт обрабатывают 5′-экзонуклеазой фага лямбда для получения одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов. Деградацию цепи, фосфорилированной по 5′-концу, визуально контролируют электрофорезом в ПААГ по наличию в электрофореграмме единичной меченой FAM полосы одноцепочечной ДНК. Таким образом проводят три раунда негативной селекции.

Проводят пять последовательных раундов позитивной селекции с использованием бактерий штамма Е. coli O157:H7, инактивированных 1% формалина, как описано выше для процесса негативной селекции.

Из отобранного пула получают индивидуальные последовательности ДНК-аптамеров. Для этого пул олигонуклеотидов, прошедший все раунды селекции, амплифицируют с применением прямого ForP и обратного RevP праймеров (Фиг. 1Б), фосфорилированных по 5′-концу. Двуцепочечный ПЦР-продукт лигируют в вектор pBluescriptll SK(-) (Agilent Technologies, США), расщепленный эндонуклеазой рестрикции Smal (Thermo, США) и обработанный щелочной фосфатазой (Invitrogen, США). Полученной плазмидой трансформируют электрокомпетентные клетки Е. coli DH12S. Клетки высевают на агаризованную питательную среду, содержащую ампициллин, X-Gal и IPTG. По принципу бело-голубой селекции выбирают и отсевают колонии, содержащие вставку в составе плазмиды. Проверяют наличие искомой вставки в ПЦР со стандартными праймерами M13/pUC. Колонии, содержащие вставку, соответствующую по размеру единичному аптамеру, подвергают амплификации с собственных праймеров ForFAM и RevP и получают одноцепочечные фрагменты методом, описанным выше.

Проводят скрининг полученных индивидуальных одноцепочечных последовательностей ДНК в отношении чувствительности и специфичности связывания с инактивированными бактериями Е. coli O157:H7 и инактивированными бактериями близкородственных микроорганизмов. Для этого одноцепочечную ДНК индивидуальных аптамеров амплифицируют в ПЦР с использованием праймера, содержащего на 5′-конце биотин (ForBio, Фиг. 1В), получают одноцепочечную биотинилированную ДНК обработкой 5′-экзонуклеазой фага лямбда и очищают одноцепочечный продукт реакции с помощью набора QIAquick PCR Purification kit (Qiagen, США). Полученную ДНК инкубируют в лунках ПЦР-планшета, на поверхности которых иммобилизованы инактивированные бактерии Е. coli O157:H7 либо бактерии близкородственных микроорганизмов. Лунки планшета промывают от свободных молекул ДНК, а затем инкубируют с конъюгатом нейтравидин-пероксидаза (Pierce, США) в течение часа. По окончании инкубации промывают лунки от несвязавшегося конъюгата и проявляют добавлением раствора ТМВ Substrate Kit (Pierce, США). Отбирают ДНК-аптамеры, обнаружившие высокий уровень связывания с бактериями Е. coli O157:H7, но при этом не взаимодействующие с близкородственными бактериями (Таблица 1). Дополнительные проверки отобранных клонов проводят в реакции иммуноптамерной ПЦР.

Для постановки иммуноаптамерной ПЦР парамагнитные частицы, несущие антитела к Е. coli O157:H7 (Dynabeads® anti-is. coli O157, Applied Biosystems, США), разносят в лунки планшета, добавляют к частицам различные концентрации инактивированных бактерий Е. coli O157:H7 (от 10⁶ до 10¹ м.к. на 1 мл) и инкубируют в течение 40 минут при комнатной температуре. По окончании инкубации планшет промывают с использованием магнитной платы на вошере Bio-Plex Pro (Bio-Rad, США), блокируют свободные валентности связывания раствором бычьего сывороточного альбумина, добавляют одноцепочечную ДНК индивидуальных аптамеров (0,1 мг/мл) и инкубируют в течение 30 минут со встряхиванием. После завершения инкубации парамагнитные частицы в лунках планшета шестикратно отмывают от несвязавшейся ДНК трис-солевым буфером с использованием магнитной платы вошера Bio-Plex Pro и обрабатывают частицы 10 мМ NaOH в течение 5 минут. Раствор щелочи, содержащий денатурированную ДНК, переносят в лунки ПЦР-планшета для постановки реакции в режиме реального времени, нейтрализуют, добавляют смесь для ПЦР-амплификации с красителем SYBR Green 1 и проводят ПЦР в режиме реального времени с праймеров, соответствующих фланкирующим константным зонам ДНК-аптамеров. На основании результатов ПЦР-амплификации отбирают ДНК-аптамеры, эффективно взаимодействующие с бактериями Ε coli O157:H7, но не взаимодействующие с близкородственными микроорганизмами, в частности, аптамер O157Flank (Фиг. 2, Таблица 2), детектирующий бактерии Е. coli O157:H7 в концентрации 10³ м.к./мл раствора и выше.

Для ДНК-аптамеров, обнаруживших наилучшие характеристики чувствительности и специфичности связывания с бактериями, в частности, аптамера 0157Flank, определяют первичную структуру методом капиллярного секвенирования и проводят моделирование вторичной структуры с использованием программы RNAFold (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi) (Фиг. 3).

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы.

Фиг. 1. Последовательности ДНК, используемые для отбора молекул ДНК, для обогащения селектированного пула, проведения амплификации и анализа полученных аптамерных последовательностей.

A. Последовательность олигонуклеотидной библиотеки, используемой в процессе селекции, где N45 - вариабельная область, const1 и const2 - константные области для отжига специфических праймеров;

Б. Последовательности праймеров, используемых в реакциях обогащения библиотеки, для клонирования и наращивания количества последовательностей ДНК-аптамеров;

B. Последовательность биотинилированного праймера, используемого в реакции амплификации для получения биотинилированных вариантов олигонуклеотидных последовательностей аптамеров.

Фиг. 2. Детекция бактерий Е. coli O157:H7 аптамером O157Flank по методу иммуноаптамерной ПЦР.

1-6 - результаты детекции микробных клеток Е. coli O157:H7 в концентрациях 1×10⁶ (1), 1×10⁵ (2), 1×10⁴ (3), 1×10³ (4), 1×10² (5), 1×10¹ (6) м.к./мл, 7 - отрицательный контроль (реакция РВ-ПЦР без добавления аптамера)

Фиг. 3. Первичная последовательность и результат моделирования вторичной структуры аптамера O157Flank, специфичного к бактериям Е. coli O157:H7.

Таблица 1. Результаты анализа по определению эффективности связывания аптамеров с микробными клетками Е. coli O157:H7.

Таблица 2. Результаты (номера циклов) ПЦР-амплификации при анализе специфичности взаимодействия ДНК-аптамера O157Flank с бактериями O157:H7 и близкородственными бактериями по методу иммуноаптамерной ПЦР

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Проведение раунда негативной селекции последовательностей ДНК-олигонуклеотидов из пула комбинаторной библиотеки олигонуклеотидов против бактерий Е. coli DH12S и микроорганизмов, близкородственных Е. coli O157:H7.

Для проведения раундов негативного отбора используют инактивированные 1% формалина культуры генно-инженерного штаммов Е. coli DH12S и штаммов близкородственных Е. coli O157:H7 микроорганизмов (Е. coli О6 25922 АТСС, Е. coli O55 3912/41, Shigella dysenteriae 1362, Salmonella typhi 13311 АТСС, Yersinia enterocoliticavar. 1 Красноярск-6, Yersinia pseudotuberculosis III 1) в концентрации 1×10⁸ м.к./мл.

Инактивированные 1% формалина культуры E. coli DH12S и микроорганизмов, близкородственных E. coli O157:H7, в концентрации 1×10⁸ м.к./мл отмывают 5 раз путем центрифугирования (12000×g 3 мин) трисовым буфером (ТБ), содержащим 20 мМ трис-HCl, 50 мМ NaCl, pH 7,0. Осадок бактерий ресуспендируют в 100 мкл того же буфера, содержащего 50 нМ тРНК и 0,05% БСА, и добавляют библиотеку олигонуклеотидов в соотношении 1×10⁶ молекул ДНК на 1 микробную клетку. После инкубации в течение 30 минут при температуре 37°C удаляют супернатант с не связавшимися молекулами ДНК путем центрифугирования (12000 × g 3 мин). Несвязавшиеся с микробными клетками последовательности ДНК, содержащиеся в супернатанте, амплифицируют с использованием прямого - For FAM и обратного - RevP праймеров при следующих условиях: предварительная денатурация ДНК - 3 минуты при температуре 95°С; 25 циклов, состоящих из денатурации ДНК в течение 30 с при температуре 95°С, отжига праймеров в течение 20 с при температуре 54°С, элонгации комплементарной цепи ДНК в течение 10 с при температуре 72°C с использованием Taq полимеразы. Фосфорилированную цепь ДНК расщепляют 5′-экзонуклеазой фага лямбда в течение 1 часа при 37°С. Полученный пул одноцепочечных последовательностей экстрагируют смесью фенол-хлороформ (1:1), осаждают этанолом, растворяют в 100 мкл деионизованной автоклавированной воды.

Получение одноцепочечных молекул ДНК контролируют в 10% ПААГ электрофорезе с мочевиной. В качестве электродного буфера используют буфер ТБЕ (трис - 108 г/л, борная кислота - 55 г/л, ЭДТА - 7,4 г/л).

Пример 2. Проведение раунда позитивной селекции последовательностей ДНК-олигонуклеотидов против бактерий Е. coli O157:H7.

Инактивированную 1% формалина культуру Е. coli O157:H7 в концентрации 1×10⁸ м.к./мл отмывают 5 раз путем центрифугирования (12000×g 3 мин) трисовым буфером (ТБ), имеющим следующий состав: 20 мМ трис - HCl, 50 мМ NaCl, pH 7,0. Осадок ресуспендируют в 100 мкл того же буфера, содержащего 50 нМ тРНК и 0,05% БСА, и добавляют пул олигонуклеотидов, отобранных в результате трех раундов негативной селекции против бактерий Е. coli DH12S и микроорганизмов, близкородственных Е. coli O157:H7, в соотношении 1×10⁶ молекул ДНК на 1 микробную клетку. После инкубации в течение 30 минут при температуре 37°С удаляют не связавшиеся молекулы ДНК путем центрифугирования (12000×g 3 мин), многократно отмывая осадок клеток буфером ТБ с 0,05% БСА. Связавшиеся с микробными клетками последовательности ДНК амплифицируют с использованием прямого - ForFAM и обратного - RevP праймеров при следующих условиях: предварительная денатурация ДНК - 3 минуты при температуре 95°С; 25 циклов, состоящих из денатурации ДНК в течение 30 с при температуре 95°С, отжига праймеров в течение 20 с при температуре 54°С, элонгации комплементарной цепи ДНК в течение 10 с при температуре 72°C с использованием Taq полимеразы. Фосфорилированную цепь ДНК расщепляют 5′-экзонуклеазой фага лямбда в течение 1 часа при 37°С. Полученный пул одноцепочечных последовательностей экстрагируют смесью фенол-хлороформ (1:1), осаждают этанолом, растворяют в 100 мкл деионизованной автоклавированной воды.

Получение одноцепочечных молекул ДНК контролируют в 10% ПААГ электрофорезе с мочевиной. В качестве электродного буфера используют буфер ТБЕ (трис - 108 г/л, борная кислота - 55 г/л, ЭДТА - 7,4 г/л).

Пример 3. Получение индивидуальных аптамерных кандидатов.

Фрагменты для клонирования в коммерческий вектор pBluescriptll SK(-) (Agilent Technologies, США) нарабатывают на основе пула селектированных олигонуклеотидов при помощи ПЦР с использованием прямого и обратного фосфорилированных праймеров ForP и RevP (отжиг праймеров при 54°С, элонгация 15 секунд) (Фиг. 1). Плазмиду pBluescriptll SK(-) обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Smal в буфере Tango (Thermo, США), после чего обрабатывают щелочной фосфатазой (Invitrogen, США). Фосфорилированные двуцепочечные фрагменты ДНК лигируют в подготовленную плазмиду.

Электрокомпетентные клетки Е. coli DH12S трансформируют подготовленной ранее плазмидой pBluescriptll SK(-), содержащей вставки селектированных последовательностей, применив электротрансформацию (прибор Eppendorf Electroporator 2510 (Eppendorf, Германия), режим 1,7 KB). Трансформированные клетки высевают на плотную среду с 2хУТ-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина, 80 мкг/мл X-Gal и 20 мМ IPTG, и выращивают в течение ночи при 37°С.

Единичные колонии, потенциально содержащие вектор со вставкой (по принципу бело-голубой селекции [Ullmann A, Jacob F, Monod J. // J Mol Biol. - 1967. -V. 24. - N. 2. - P. 339-343.]) верифицируют на наличие единичного встроенного фрагмента ДНК искомой длины в плазмиде с помощью ПЦР со стандартными прямым и обратным праймерами M13/pUC (Fermentas, США). Наращивают количество копий индивидуальных последовательностей клонированных фрагментов ДНК амплификацией с использованием праймеров ForFAM и RevP (Фиг. 1). Получают одноцепочечный продукт для каждого из клонов обработкой 5′-экзонуклеазой фага лямбда с визуальным контролем в электрофорезе. Таким образом, нарабатывают клонированные одноцепочечные индивидуальные последовательности из 500 бактериальных клонов.

Пример 4. Скрининг индивидуальных олигонуклеотидных последовательностей на связывание с бактериями Е. coli O157:H7 в твердофазном анализе с использованием нейтравидин-пероксидазы.

Для проведения скрининга 96-луночные планшеты сенсибилизируют инактивированными микробными клетками штаммов Е. coli O157:H7, штаммов Е. coli других серогрупп и близкородственных микроорганизмов, использованных для негативного отбора, в концентрации 1×10⁶ м.к./лунку. В лунки, служащие отрицательным контролем, вносят буфер ТБ, не содержащий микробной суспензии. Аптамерные последовательности амплифицируют с использованием прямого биотинилированного праймера - ForBio (Фиг. 1) и обрабатывают 5′-экзонуклеазой фага лямбда, получая биотинилированные одноцепочечные молекулы ДНК. Аптамеры вносят в лунки планшетов в 50 мкл буфера ТБ в концентрации 10 нМ/лунку. После инкубации в течение 1 часа при 37°С планшеты 10 раз отмывают тем же буфером.

По окончании инкубации в лунки планшетов вносят по 100 мкл буфера ТБ, содержащего нейтравидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (Pierce, США) в рабочем разведении 1:1000. После 30-ти минутной инкубации шесть раз отмывают планшеты от несвязавшегося конъюгата и добавляют в лунки планшетов по 100 мкл субстрата ТМВ Substrate Kit (Pierce, США). Реакцию останавливают 2 M серной кислотой (50 мкл/лунку) после развития окраски. Результаты считают положительными, если значения оптической плотности в лунках с образцами не менее чем в два раза превышают значение оптической плотности в лунке с отрицательным контролем (K^-). Учет результатов производят спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Результаты оформляют графически в виде таблицы (Таблица 1), на основе которой отбирают варианты аптамеров, наиболее эффективно взаимодействующие с клетками Е. coli O157:H7, в частности ДНК-аптамер O157:Flank (№14).

Пример 5. Анализ взаимодействия аптамера O157Flank с бактериями Е. coli O157:H7 с использованием иммуноаптамерной ПЦР.

Для проведения анализа в микропробирки типа «эппендорф» вносят по 50 мкл суспензии парамагнитных частиц с иммобилизованными моноклональными антителами к Е. coli O157:H7 (Dynabeads® anti-E. coli O157, Applied Biosystems, США) и добавляют по 200 мкл инактивированной культуры штамма Е. coli O157:H7 1282ГИСК в концентрациях от 1×10⁶ м.к./мл до 1×10¹ м.к./мл с десятикратным шагом. В качестве отрицательного контроля используют пробирку с буфером, не содержащим микробных клеток. После 40 минут инкубации удаляют несвязавшиеся бактерии троекратной промывкой буфером ТБ с использованием магнитной платы на вошере Bio-Plex Pro (Bio-Rad, США). Блокируют свободные сайты связывания 3% раствором бычьего сывороточного альбумина в буфере ТБ в течение 60 минут при температуре 37°С при встряхивании, снова троекратно промывают частицы буфером ТБ. Добавляют 200 мкл раствора анализируемого ДНК-аптамера (0157Flank) в концентрации 0,1 мг/мл и инкубируют планшет в течение 30 минут на шейкере, после чего шестикратно отмывают частицы от несвязавшейся ДНК с использованием магнитной платы на вошере Bio-Plex Pro (Bio-Rad, США). Частицы обрабатывают 10 мМ NaOH в течение 5 минут. Раствор щелочи, содержащий денатурированную ДНК, переносят в лунки ПЦР-планшета для постановки реакции в режиме реального времени, нейтрализуют добавлением 100 мМ соляной кислоты, добавляют смесь для ПЦР-амплификации с красителем SYBR Green 1 (Синтол, Россия) и проводят ПЦР в режиме реального времени с праймеров, соответствующих фланкирующим константным зонам ДНК-аптамеров (ForP, RevP, Фиг. 1) по протоколу, рекомендованному производителем прибора для ПЦР в режиме реального времени (iCycler IQ PCR Detection System, Bio-Rad), а именно: предварительная денатурация ДНК в течение 3 минут при температуре 95°С; 45 циклов, состоящих из денатурации ДНК в течение 30 с при температуре 95°С, отжиг праймеров в течение 20 с при температуре 54°С, элонгация комплементарной цепи ДНК в течение 10 с при температуре 72°C с использованием Taq полимеразы.

Аналогичным образом проводят тестирование взаимодействия аптамера и инактивированных культур бактерий, близкородственных Е. coli O157:H7 (Таблица 2).

Результаты проведенного анализа демонстрируют, что ДНК-аптамер O157Flank специфически выявляет микробные клетки Е. coli O157:H7 в тест-системе на основе иммуноаптамерной ПЦР в концентрациях 1×10³ м.к./мл и выше и не взаимодействует с близкородственными бактериями (Фиг. 2, Таблица 2).

Пример 6. Определение первичной и моделирование вторичной структуры полученных ДНК-аптамеров к бактериям Е. coli O157:H7.

Определение первичной структуры аптамеров проводят методом капиллярного секвенирования. Моделирование вторичной структуры осуществляют с использованием программы RNAFold (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi). Аптамер О157Flank имеет нуклеотидную последовательность и предположительную первичную структуру, представленные на рисунке (Фиг. 3).

Таблица 2 Штаммы микроорганизмов Концентрация исследуемых микроорганизмов, м.к./мл 1×10⁶ 1×10⁵ 1×10⁴ 1×10³ 1×10² 1×10¹ Циклы ПЦР E. coli O157:H7 1282 ГИСК (положительный контроль) 13 17 22 24 27 27 E. coli O6 25922 АТСС 27 27 27,9 28,1 28,8 28,9 E. coli O55 3912/41 27,2 27,7 28,2 28,1 28,2 28,3 Salmonella enteritidis var. Issat 2 27,2 27,9 28,6 28,4 28,0 28,1 Shigella dysenteriae 1362 27,7 27,5 28,3 28,3 28,5 28,7 Shigella flexneri 4888 28,2 28,1 28,0 28,3 28,6 29,1 Shigella sonnei 4385 27,3 28,0 27,3 27,5 28,2 28,3 Vibrio cholerae non O1 9741-P 28,2 28,2 28,1 28,2 28,1 29,3

Перечень последовательностей к заявке на получение патента «Последовательность ДНК-аптамеров, связывающаяся с бактериями Escherichia coli O157:H7»

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к последовательности ДНК-аптамера. Указанный ДНК-аптамер связывается с бактериями Escherichia coli O157:Н7 и представлен одноцепочечной ДНК O157Flank длиной 81 нуклеотид и молекулярной массой 27 кДа. ДНК-аптамер обладает высокой специфичностью связывания в отношении бактерий Escherichia coli O157:Н7 и имеет первичную последовательность CATACGTTCGACTGCTACTCTGAGTCTGACCTTACAGTCAGTCAATCATGGGACAT ACGAAATGTGAGATGTACAGACTAG. Последовательность ДНК-аптамера отобрана в результате раундов позитивной селекции против бактерий Escherichia coli O157:Н7 и негативной селекции против бактерий других серогрупп Escherichia coli и близкородственных микроорганизмов с использованием тРНК в качестве молекулы-компетитора за связывание. ДНК-аптамер способен специфически детектировать бактерии Escherichia coli O157:H7 в реакции иммуноаптамерной ПЦР в концентрации до 10³ микробных клеток на 1 мл раствора. Предложенное изобретение позволяет с высокой эффективностью детектировать бактерии Е. coli O157:Н7. 3 ил., 2 табл., 6 пр.

Последовательность ДНК-аптамеров, связывающаяся с бактериями Escherichia coli O157:Н7 представлена одноцепочечной ДНК O157Flank длиной 81 нуклеотид и молекулярной массой 27 кДа, обладает высокой специфичностью связывания в отношении бактерий Escherichia coli O157:Н7 и имеет первичную последовательность CATACGTTCGACTGCTACTCTGAGTCTGACCTTACAGTCAGTCAATCATGGGACAT ACGAAATGTGAGATGTACAGACTAG, отобрана в результате раундов позитивной селекции против бактерий Escherichia coli O157:Н7 и негативной селекции против бактерий других серогрупп Escherichia coli и близкородственных микроорганизмов с использованием тРНК в качестве молекулы-компетитора за связывание, способна специфически детектировать бактерии Escherichia coli O157:H7 в реакции иммуноаптамерной ПЦР в концентрации до 10³ микробных клеток на 1 мл раствора.