N-(ацетилсалицилоил)пиразол, обладающий церебропротекторным действием при недостаточности мозгового кровообращения Российский патент 2017 года по МПК C07D231/12 A61K31/415 A61P9/10 

Как демонстрирует мировая практика, интерес к ацетилсалициловой кислоте (аспирин) и ее производным не уменьшается. На основе ацетилсалициловой кислоты синтезирован огромный ряд веществ обладающих широким спектром фармакологической активности. Так N-ацетилсалицилоил производные аминокислот и пептидов являются перспективными ноотропными агентами, некоторые амиды салициловой (2-гидроксибензойной) кислоты и гетероциклических соединений (N-салицилоилзамещенные) и их солевые формы обладают противоопухолевой активностью, а также являются ненуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы [RU 2495032, US 326557, F. Chen et.al, 2012; T.Laxmi et.al, 2007; F.Liu et.al, 2010].

Изобретение относится к новому производному салициловой кислоты, содержащему гетероциклический фрагмент, и его применению в качестве церебропротекторного агента. Цель изобретения заключается в получении эффективного производного ацетилсалициловой кислоты, сочетающего основные эффекты, присущие церебропротекторным средствам и превосходящие таковые у пирацетама.

Сущность изобретения заключается в синтезе N-(ацетоксисалицилоил)пиразола формулы

и использования его в качестве церебропротекторного средства при недостаточности мозгового кровообращения.

Пример 1. N-(ацетоксисалицилоил)пиразол

К раствору 100 ммоль пиразола в сухом диэтиловом эфире (50 мл) прибавляют медленно по каплям в течение 15 минут раствор хлорангидрида ацетилсалициловой кислоты (50 ммоль) в диэтиловом эфире (30 мл), смесь перемешивают в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем раствор быстро промывают холодной водой (3 раза по 10 мл). Промытый продукт сушат над безводным сульфатом магния. Остаток перегоняют в вакууме при остаточном давлении 3-5 мм рт.ст., собирая фракцию - светло-желтую маслянистую жидкость, кипящую при 103-105°С, R_f 0,350 (этилацетат : гексан 3:1), d²⁰ 1,250, n_D²⁰ 1,594. Выход составил 70%, М+230 (хроматомасс-спектрометр «Saturn-2100», Varian). ЯМР ¹Н, м.д. (ДМСО): 7,77-7,72 м, 7,63-7,60 м, 7,04-7,00 м (3Н, пиразол); 7,68-7,70 м, 7,50-7,56 м, 7,40-7,35 м, 7,31-7,28 м (4Н, ароматическое кольцо); 2,19 с (3Н, -СН₃). Для C₁₂H₁₀N₂O₃ найдено, %: С (62,61), Н (4,38), N (12,16); вычислено, %: С (62,60), Н (4,38), N (12,17).

Пример 2. Церебропротекторное действие веществ при необратимой двусторонней окклюзии сонных артерий

Эксперименты выполнены на половозрелых беспородных крысах-самцах 180-200 г., 3,5-4-месячного возраста (питомник ФГУП ПЛЖ «Рапполово», Ленинградская область). Все животные после доставки из питомника содержались в стандартных условиях вивария и проходили 14-дневный карантин, по окончании которого включались в исследование. В ходе выполнения экспериментов были сформированы следующие группы: 1) ЛО (ложнооперированные) - животные, которые получали физиологический раствор, а при проведении операции на общих сонных артериях, лигатуры подводились под сосуды, но не затягивались; 2) контроль - животные данной группы получали физиологический раствор и у них перевязывались обе общие сонные артерии (ОСА); 3) N-(ацетоксисалицилоил)пиразол - животные, которые до перевязки ОСА получали патентуемое соединение в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно; 4) пирацетам - животные, которые до перевязки ОСА получали пирацетам в дозе 800 мг/кг внутрибрюшинно. Для оценки церебропротекторного действия патентуемого соединения при недостаточности мозгового кровообращения использовалась модель одномоментной необратимой билатеральной окклюзии ОСА [Мирзоян Р.С. Методические рекомендации по доклиническому изучению лекарственных средств для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени // Руководство по доклиническому изучению лекарственных средств / Под. ред. А.Н. Миронова. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.]. О церебропротекторном действии соединения судили по увеличению выживаемости животных после двусторонней ОСА и уменьшению у них выраженности неврологического дефицита по шкале McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной.

Комплексное изучение неврологической картины при заболеваниях ЦНС различной этиологии предполагает оценку поведенческих отклонений, анализ которых позволяет судить о масштабах поражения головного мозга с возможностью в той или иной мере экстраполяции в клиническую практику. Поэтому дополнительно для оценки неврологического состояния животных изучали поведение животных, а также их когнитивные функции для чего использовали стандартные психофармакологические тесты: «Открытое поле» (ОП), «Условная реакция пассивного избегания» (УРПИ) и «Тест экстраполяционного избавления» (ТЭИ).

Тест «Открытое поле» (ОП) [Хаунина Р.А., Лапин И.П. 1976 г., Воронина Т.А. 1982] предназначен для изучения поведения грызунов в новых условиях. Методика проведения была следующей: в центр круглой белой арены хвостом к экспериментатору помещалось животное, после чего проводили визуальный контроль за его поведением в течение 3-х минут, фиксируя следующие показатели: число пересеченных секторов, количество стоек, количество обследованных отверстий-норок. Об ориентировочно-исследовательской активности судили по сумме стоек и заглядываний в отверстия, а по количеству пересеченных секторов - о спонтанной двигательной активности.

Методика оценки условного рефлекса пассивного избегания» (УРПИ) является базисной моделью для оценки когнитивной функции у животных. Она используется для изучения влияния веществ на формирование, сохранение и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях патологии мозга. Данная методика выполнялась следующим образом:

1) формирование рефлекса пассивного избегания - животное помещалось в центральную зону освещенного отсека (лампа мощность 100 Вт), хвостом к отверстию в темный отсек. Если крыса после обследования светлого отсека крыса переходила в темный, то через электрический пол последнего подавался ток 40 В, 3 импульса по 1 с, с интервалом 0,5 с и животное, в результате чего получало электроболевое раздражение и покидало темный отсек. За животным наблюдали в течение 180 секунд. Крысы, которые не заходили в темный отсек или заходили в темный отсек при электроболевом раздражении более 2-х раз, из эксперимента исключались. Фиксировались следующие показатели: латентный период (ЛП) первого захода в темный отсек (время от момента помещения животного в середину площадки до первого захода в темный отсек) и количество заходов в него;

2) контроль выработки рефлекса - производиться через 24 часа после первого сеанса. Все животные, зашедшие в темный отсек установки, исключались из эксперимента;

3) воспроизведение навыка пассивного избегания - на данном этапе в отличие от этапа обучения, если животное заходило в темный отсек, то электроболевое раздражение не наносили. Регистрировались аналогичные показатели, что и при обучении.

«Тест экстраполяционного избавления» (ТЭИ) предназначен для изучения когнитивных функций грызунов в условиях аверсивной среды и позволяет оценить: индивидуальные различия когнитивного стиля решения задачи (поиска пути активного избавления от аверсивной среды). Фиксировался ЛП подныривания (время от момента погружения животного в воду до подныривания под края цилиндра). Также как и тест УРПИ, методика включает в себя этап обучения навыка (выработка рефлекса избавления) и этапа его воспроизведения через 24 часа. Животные, не решающие задачу за время наблюдения на этапе обучения, исключаются из опыта. Обучение и первое воспроизведение у животных в тестах УРПИ и ТЭИ проводили соответственно за 48 и 24 часа до моделирования двусторонней ОСА, второе воспроизведение - через 72 часа после операции.

Необратимая окклюзия ОСА вызывала выраженное нарушение мозгового кровообращения, которое приводило к гибели части животных. Патентуемое соединение достоверно повышало выживаемость крыс после перевязки сонных артерий по сравнению с группой контроля (контроль-ишемия) (таблица 1). Оказываемое им церебропротекторное действие превосходило таковое у пирацетама.

При оценке неврологического дефицита по шкале McGrawy животных с перевязанными ОСА было отмечено, что введение N-(ацетоксисалицилоил)пиразола препятствовало нарастанию у крыс неврологической симптоматики, о чем свидетельствовал наименьший балл неврологического дефицита у животных, получавших патентуемое соединение (таблица 2).

Двигательная активность животных с перевязанными ОСА в тесте «ОП» была снижена относительно ложнооперированных животных (таблица 2). У животных, получавших патентуемое соединение, показатели двигательной и ориентировочно-исследовательской активности были достоверно выше контрольных животных.

При выполнении и анализе результатов тестов УРПИ и ТЭИ отмечено, что выжившим животным с ОСА, получавших N-(ацетоксисалицилоил)пиразол, в тесте ТЭИ требовалось меньшее время для решения задачи экстраполяционного избавления, а в тесте УРПИ они не заходили в темную камеру, что свидетельствует о сохранении памятного следа, связанного аверсивным воздействием (таблица 2).

Таким образом, учитывая, что N-(ацетоксисалицилоил)пиразол увеличивает выживаемость животных и снижает выраженность неврологических нарушений после перевязки сонных артерий, заявленное соединение может найти применение при создании новых лекарственных средств для лечения нарушений мозгового кровообращения ишемического генеза.

Пример 3. Определение острой токсичности

Острую суточную токсичность при однократном введении изучали на мышах-самцах массой 20-24 г. Соединение в дистиллированной воде вводили животным внутрибрюшинно в различных возрастающих дозах однократно. Наблюдение за животными проводили в течение суток, отмечая количество погибших животных. Расчет LD₅₀ проводили методом Литчфилда и Уилкоксона.

Исследования острой токсичности показали, что по классификации токсичности веществ при их введении в брюшную полость животных (К.К. Сидорова, 1973) заявляемое вещество относится к классу умеренно токсичных по классификации предложенной Саноцким И.В. и Улановой И.П. (1975) (таблица 3).

Изобретение может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности для получения эффективных церебропротективных средств на основе пиразола и 2-ацетоксибензойной кислоты (ацетилсалициловая кислота, аспирин). Предложено производное пиразола, имеющее приведенную ниже формулу. Это производное обладает церебропротективным действием, эффективно и в малых дозах улучшает мозговое кровообращение в модели одномоментной необратимой билатеральной окклюзии общих сонных артерий, превосходит по действию пирацетам. 3 табл., 2 пр.

N-(ацетилсалицилоил)пиразол формулы

обладающий церебропротективным действием при недостаточности мозгового кровообращения.