ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS H8, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ БОРЬБЫ С ЖЕСТКОКРЫЛЫМИ НАСЕКОМЫМИ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии, биотехнологиии, к производству бактериальных биоинсектицидов, предназначенных для борьбы с жесткокрылыми насекомыми, в том числе с колорадским жуком.

Постоянный прирост населения на земном шаре заставляет интенсифицировать сельское хозяйство, свести к минимуму потери урожая, который уничтожается вредными насекомыми на 30%. Широкое применение химических инсектицидов для защиты экономически значимых агротехнических культур привело к накоплению сведений о негативных факторах химической защиты растений. К основным отрицательным факторам при использовании химических средств защиты растений и сельскохозяйственных культур относятся неспецифичность действия, загрязнение окружающей среды, накопление в окружающей среде (кумулятивный эффект) и возникновение устойчивости у вредных насекомых. Кроме того, имеются многочисленные данные об их отрицательном влиянии на человека, животных, полезных насекомых, птиц, рыб.

В качестве альтернативных средств защиты растений используют бактериальные инсектициды или биоинсектициды. На основе споро- и кристаллообразующих штаммов Bacillus thuringiensis был создан ряд биоинсектицидов, например "Битоксибациллин", однако синтезируемый штаммом экзотоксин обладал неспецифическим действием на нецелевые организмы [1].

На основе штамма Bacillus thuringiensis H8 создан препарат "Новодор", синтезирующий белковый эндотоксин, токсический для жесткокрылых насекомых [2]. В России на основе штамма Bacillus thuringiensis Н8 ВКПМ В-6306, созданного для борьбы с жесткокрылыми насекомыми, в частности с колорадским жуком, разработан биоинсектицид "Колорадо" [3]. Этот штамм является наиболее близким аналогом заявляемого штамма. Уровень токсинообразования штамма-аналога, вычисленный по инсектицидной активности (ЛК₅₀), составлял 0,20 (в % культуральной жидкости); уровень спорообразования - 90%. В настоящее время усилен экологический контроль за применяемыми в России биопестицидами, поэтому избыточное количество спор в этих препаратах, загрязняющее окружающую среду, является существенным негативным фактором.

Задача изобретения - создание высокотоксичного штамма Bacillus thuringiensis Н8, предназначенного для борьбы с жесткокрылыми насекомыми, в частности с колорадским жуком, с пониженным уровнем спорообразования (олигоспорогенный штамм) для предотвращения загрязнения окружающей среды спорами в случае применения биопестицида на основе этого штамма.

Задача решена путем получения штамма Bacillus thuringiensis Н8, синтезирующего квадратные и прямоугольные кристаллы эндотоксина, обладающего токсическим действием на жесткокрылых насекомых.

Полученный штамм Bacillus thuringiensis H8 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ В-8057.

Заявляемый штамм обладает следующими существенными преимуществами перед штаммом-аналогом Bac. thuringiensis Н8 ВКПМ В-6306:
1) - повышенным уровнем токсинообразования (ЛК₅₀ составляет 0,13, т.е. уровень токсинообразования в 1,5 раза выше, чем у штамма-аналога);
2) - пониженным уровнем спорообразования(олигоспорогенный штамм), концентрация спор - 10%(в 9 раз меньше, чем у штамма-аналога).

Эффект повышения синтеза токсина у других штаммов Bac. thuringiensis против вредных жесткокрылых насекомых на фоне пониженного спорообразования описан ранее [4].

Заявляемый штамм с повышенным уровнем токсинообразования получен путем многоступенчатой селекции на основе выделенного из природных источников с применением селективных методов исследования штамма Bacillus thuringiensis Н8, белковые кристаллы которого токсичны для жесткокрылых насекомых, в том числе и для колорадского жука.

Заявляемый штамм Bacillus thuringiensis H8 ВКПМ В-8057 имеет следующие хактеристики:
1. Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные подвижные палочки размером 1,2-1,5х2,5-3,0 мкм. При росте на богатых агаризованных средах (NBY [5]) через 24 ч при 28-30^oС штамм образует округлые колонии 3-6 мм в диаметре с гладкой полупрозрачной поверхностью белого цвета. Через 72 ч роста на твердых питательных средах штамм образует крупные кристаллические включения квадратной и прямоугольной формы. По данным электронной микроскопии кристаллические включения квадратной формы имеют размеры 0,93х0,93 мкм, прямоугольной формы - 1,43х1,25 мкм. Кристаллы прямоугольной формы преобладают.

При культивировании в жидких питательных средах (ДПС: г/л, дрожжи - 3,0; кукурузная мука - 1,5; стерилизация 30 мин при 0,8 атм; рН после стерилизации 6,8-7,0) при 28-30^oС со встряхиванием 250 об/мин наблюдается равномерный рост по всему объему, кристаллообразование заканчивается к 72 ч роста. По данным светооптического анализа, к 72 ч культивирования наблюдаются преимущественно вегетативные клетки, 10% спор и кристаллы эндотоксина.

При культивировании штамма в жидких и твердых питательных средах выхода фага не наблюдается.

2. Физиолого-биохимические признаки.

Штамм не сбраживает маннозу, сбраживает сахарозу, не разлагает салицин, разлагает эскулин, лецитиназу не образует, гидролизует крахмал, мочевину не расщепляет.

3. Серотипирование.

Серотипирование штамма проводили по методу Баржак [6] с использованием стандартных сывороток к жгутикам (Н-антиген). Штамм Вас. thuringiensis H8 В-8057 растили в L-бульоне [7] в стандартных условиях 24 ч. Подвижные благодаря наличию жгутиков вегетативные клетки штамма дважды отмывали физ. раствором и ставили реакцию агглютинации со стандартной сывороткой серотипа Н8-антигена. Поверхностью для реакции агглютинации служило горизонтально расположенное обезжиренное стекло. По реакции агглютинации с сывороткой Н8-антигена штамм В-8057 отнесен к H8 серотипу.

4. Режим культивирования.

Для культивирования штамма ВТ H8 В-8057 используют стандартные стеклянные конические плоскодонные качалочные колбы объемом 750 см³, которые заполняют по 50 мл стерильной средой ДПС и 2-мя мл посевного материала. Посевной материал готовят следующим образом: в колбу со стерильной питательной средой ДПС помещают бактериальную культуру, собранную петлей с твердой агаризованной среды ДПС, и инкубируют в течение 12-16 ч. После светооптического контроля на отсутствие посторонней микрофлоры содержимое колбы используют как посевной материал.

Штамм выращивают при 28-30^oС со встряхиванием 250 об/мин в течение 72 ч. В процессе ферментации осуществляют контроль на наличие кристаллов (светооптические методы) и отсутствие посторонней микрофлоры (микробиологический метод: высев на чашки с агаризованной питательной средой). Процесс кристаллообразования заканчивается к 72 ч роста штамма.

5. Генетические характеристики.

В клетках штамма содержатся экстрахромосомальные элементы (плазмиды) с молекулярными массами: 60, 40 и 10 килобаз.

Штамм устойчив к полимиксину (100 мкг/ мл).

Штамм устойчив к фагам Tg4, Tg81, Tgl3.

Штамм не патогенен для человека, домашних и диких животных, полезных насекомых, птиц и рыб.

6. Электрофорез белков.

Белковый состав кристаллов штамма анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле с SDS по Laemmli [8], используя 4%-ный концентрирующий и 7,5%-ный разделяющие гели при силе тока в 20 мА и 50 мА соответственно. На гелевые дорожки наносили по 30-70 мкг белка, концентрацию которого определяли методом Бредфорд [9]. Гели окрашивали 0,1%-ным раствором Кумасси R-250. Молекулярные массы белков рассчитывали по сравнению со стандартными белками набора SDS-6H ("Sigma"). Денситометрирование гелей проводили на сканирующем денситометре "Beckman" при 550 нм.

Кристаллы штамма состоят из белков с молекулярными массами 73, 68 и 65 кД.

7. Инсектицидные свойства штамма.

Штамм высокотоксичен против жесткокрылых насекомых, в частности против колорадского жука. Инсектицидная активность штамма проверялась на личинках колорадского жука I возраста в лабораторных условиях [10].

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Оценка основных технологических характеристик заявляемого штамма.

Заявляемый штамм и штамм-аналог растили в стандартных условиях (среда - жидкая ДПС, 72 ч культивирования, 28-30^oС со встряхиванием 250 об/мин). Методом световой микроскопии оценивали наличие и размер кристаллов, титр бактериальных клеток и спор. Полученные результаты представлены в табл. 1.

Как показали полученные данные (табл. 1), заявляемый штамм имеет большую продуктивность (плотность клеток в 1 мл среды, синтезирует большее количество кристаллов эндотоксина (на каждую бактериальную клетку или спору - 1 кристалл). Штамм обладает пониженным уровнем спорообразования (в 9 раз меньше спор, чем у аналога, что имеет важное экологическое значение). У заявляемого штамма преобладают большие прямоугольные кристаллы размером 1,25х1,45 мкм.

Пример 2.

Проверка токсичности штамма В-8057 для личинок колорадского жука в лабораторных условиях.

Оценку токсичности для жесткокрылых насекомых заявляемого штамма В-8057 и ее сравнительный анализ со штаммом-аналогом В-6306 проводили на личинках колорадского жука I возраста в лабораторных условиях. Выращенные в стандартных условиях в среде ДПС штаммы В-8057 и В-6306 разводили дистиллированной водой в 5 раз, начиная с 10% раствора культуральной жидкости (к/ж) и до 0,016% с тремя повторностями. Стандартные по размеру листья картофеля с черенками по 2-3 см замачивали в стерильных чашках Петри во всех названных концентрациях к/ж обоих штаммов. После подсушивания черенки листьев обматывали влажным ватным тампоном и переносили в сухие стерильные чашки Петри на фильтровальную бумагу, в которые помещали на поверхность листьев по 30 личинок колорадского жука. Чашки оставляли при комнатной температуре на дневном свету на 72 ч. Статистическая обработка результатов, представленных в табл. 2, проведена с помощью компьютерной программы пробит-анализа с учетом гибели жука в контроле (контроль - картофельный лист смачивали дистиллированной водой).

Представленные в табл. 2 данные по сравнительному анализу токсичности для жесткокрылых насекомых заявляемого штамма и штамма-аналога показали, что токсичность штамма В-8057 превышает токсичность штамма В-6306 в 1,5 раза.

Пример 3.

Поддержание и хранение штамма.

Учитывая, что штамм В-8057 является олигоспорогенным, требовались особые условия поддержания и хранения.

Поддержание штамма проводили на косяках с агаризованной средой NBY, которые пересевали каждые две недели.

Хранение штамма осуществляли путем лиофилизации. Вегетативную культуру клеток выращивали на богатой агаризованной среде. Клетки смывали защитной средой со стерилизованным обезжиренным молоком. Ампулы с суспензией клеток помещали при -70^oС на 15 мин, а затем быстро переносили в камеру для сушки, соединенную с вакуумной системой лиофилизации (модель 75150 фирмы "Labkonko"). Давление снижали от 1000 до 5-10 (единицы шкалы сушильной камеры), время сушки 4 ч. Лиофилизированные ампулы хранили в холодильнике при температуре +12^oС 3 и 9 мес. Через 0,3 и 9 мес хранения ампулы вскрывали, выращивали в жидкой питательной среде в стандартных условиях и проверяли сохранность основных характеристик штамма (титр клеток, спор, ЛК₅₀). Полученные результаты представлены в табл. 3.

Как видно из представленных в табл. 3 данных, штамм В-8057 при лиофилизации сохраняет основные регламентные показатели (титр клеток и спор, токсичность для жесткокрылых насекомых) длительное время (до 9 мес).

Заявляемый штамм Bac. thuringiensis H-8 ВКПМ В-8057 обладает:
- повышенным уровнем токсинообразования (в 1,5 раза больше, чем у штамма-аналога),
- пониженным уровнем спорообразования (в 9 раз меньше спор, чем у штамма-аналога),
- в стандартных условиях культивирования накапливает большее количество биомассы,
- кристаллы эндотоксина крупнее.

Источники информации
1. Кандыбин Н. В. с соавт. Новые экзотоксигенные штаммы Bac. thuringiensis. В сборнике "Бактериальные средства и методы борьбы с вредными насекомыми и грызунами" Л.: Колос. 1972. С.20-23.

2 Ruch S. Use of coleopteran active Bacillus thuringiensis for controlling the cereal leaf beetle Oulema melanopa. WO 91/14369.

3. Азизбекян P.P., Миненкова И.Б., Смирнова Т.А., Шагов Е.М., Константинова Г. Е. , Дебабов В.Г., Параскевов В.Г., Калужский В.Е., Турков М.И. Инсектицидный преперат "Колорадо" против жесткокрылых насекомых и штамм бактерий Bac. thuringiensis, используемый для получения инсектицидного препарата. 1995. Патент РФ 2081583. RU БИ 36. С.4.

4. Agaisse H. , D. Lereclus. Expression in Bacillus subtilis of Bac. thuringiensis cry III toxin gene is not dependent on a sporulation-specific sigma factor and is increased in a spo OA mutant. 1994. J. Bacteriol. 176p. 4734-4741.

5. Thorne C.B. 1968. J. Virology. 2. p.657-662.

6. H.de Barjac. Identification of H-serotypes of Bac. thuringiensis. In: . Microbial control of pests and plant diseases (1970-1980). Ed.H,D.Burges. Acad.Press.London.N.Y. 1981. p.34-43.

7. Miller J. H. Experiments in Molecular genetics. 1972. Cold Spring Harbor. p.395.

8. Laemli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. 1970. Nature. V.227. 5293. p.680-685.

9. Bradford M.M. 1976. Analytic Biochemistry. 72. 1-2. p.248-252.

10. Шагов Е.М., Миненкова И.Б., Константинова Г.Е. Метод биологической оценки активности бактериального инсектицида против жесткокрылых, 1992.1. С. 75-78.8

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству бактериальных инсектицидов, предназначенных для борьбы с жесткокрылыми насекомыми, в том числе с колорадским жуком. На основе токсичного для жесткокрылых насекомых штамма Bacillus thuringiensis Н8, выделенного из природных источников путем многоступенчатой селекции с применением других методов исследования, получен высокотоксичный олигоспорогенный штамм Bacillus thuringiensis Н8 ВКПМ В-8057. Штамм образует квадратные и прямоугольные кристаллы эндотоксина. Штамм предназначен для получения инсектицидного препарата против жесткокрылых насекомых. По сравнению со штаммом-аналогом Bacillus thuringiensis Н8 ВКПМ В-6306 штамм Bac. thuringiensis Н8 ВКПМ В-8057 обладает экономическими и экологическими преимуществами: повышенным уровнем токсинообразования (в 1,5 раз больше, чем у штамма-аналога) и малым количеством спор (в 9 раз меньше, чем у штамма-аналога). Использование данного штамма предотвращает загрязнение окружающей среды при массовом применении инсектицидного препарата на основе предлагаемого штамма. 3 табл.

Штамм Bacillus thuringiensis Н8 ВКПМ В-8057, предназначенный для борьбы с жесткокрылыми насекомыми.