ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS КК-ВКМ В-2130D, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПАРОВОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 C12Q1/22 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и касается штамма бактерий спорообразующего микроорганизма для контроля эффективности стерилизации изделий медицинского и ветеринарного назначения термическим методом, а именно стерилизации водяным паром.

Особую угрозу представляют спорообразующие бактерии, споры которых выдерживают кипячение в течение нескольких часов и быстрее погибают только при действии водяного насыщенного пара под избыточным давлением (Вашков В.И. Средства и методы стерилизации, применяемые в медицине. М. Медицина, 1973, с. 20 24). Споры патогенных бактерий могут стать причиной тяжелых заболеваний людей и животных. Из патогенных аэробных бактерий Bacilluc anthracis, из патогенных анаэробных бактерий Clostridium tetani и группа возбудителей газовой гангрены способны к образованию спор, которые могут стать причиной тяжелых осложнений и на многие годы загрязнить окружающую среду. Из токсигенных сапрофитов к таким бактериям принадлежит Clostridium botulinum, представляющий большую опасность для пищевой промышленности из-за ботулинического токсина.

Известны штаммы микроорганизмов спорообразующих бактерий Bacillus subtilus var. niger аналог (Graham G.S. Biological Indicators for Hospital and Industrial Sterilization. In: Sterilization of Medical Products, v. V. Printed in Canada, 1991, p. 56 57) и Bacillus licheniformis G ВКМ В-1711Д (А.С. SU 1712403 С 12 Т 1/20) аналог, которые используют для бактериологического контроля эффективности стерилизации.

Однако эти штаммы применяют только для контроля эффективности стерилизации горячим воздухом из-за низкой устойчивости их спор к водяному пару (Гутерман Р.Л. Средства контроля термической стерилизации изделий медицинского назначения. Дисс. канд. мед. наук. М. 1993, с. 93 100; Методические указания по контролю работы паровых и воздушных стерилизаторов. Утверждены 28.02.91, N 15/6-5. М. 1991, с. 17, 44).

Наиболее близкий по техническому решению и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому штамму является штамм Bacillus stearothermophilus ВКМ В-718 прототип (Санитарные правила СП 1.2.011-94. Госкомсанэпиднадзор России. М. 1994, с. 138).

Однако споры и данного штамма обладают низкой устойчивостью к действию водяного пара, имеют показатель терморезистентности Д₁₃₂° 7с (Гутерман Р.Л. Дисс. канд. мед. наук, с. 101, 103). Поэтому споры штамма Bacillus sterothermophilus ВКМ В-718, быстро погибающие при 132^oC, нельзя считать абсолютно надежными для контроля эффективности стерилизации паровым методом. Для эпидемической, эпизоотической и экологической безопасности необходимо использовать наиболее устойчивые споры непатогенных бактерий.

Целью изобретения является повышение надежности бактериологического контроля эффективности стерилизации паровым методом.

Поставленная цель достигается использованием штамма Bacillus stearothermophilus КК-ВКМ В-2130Д.

Штамм спорообразующего термоустойчивого микроорганизма выделен из флакона с подвергнутой стерилизации паром картофельной агаровой среды, после инкубации флакона при 55^oC для контроля стерильности. Микроорганизмы давали рост единичных колоний на поверхности агара в диаметре до 10 мм с ровным краем.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Вегетативные клетки прямые, палочковидные, расположены единично и короткими цепочками. Грамположительные, подвижные. На картофельном агаре с крахмалом (1,5%) образует эндоспоры эллиптической формы, расположенные преимущественно терминально с концевой раздутостью спорангия.

На мясопептонном бульоне (pH 7,3±0,1) штамм через 24 ч инкубации при (55±1)^oC образует равномерное помутнение питательной среды без пленки на ее поверхности и без осадка.

На мясопептонном агаре и питательном агаре Дифко (pH 7,3±0,1) через 48 ч инкубации при (55±1)^oC образует слабовыпуклые округлые полупрозрачные колонии диаметром 3-5 мм с ровными краями.

Физиолого-биохимические признаки. Аэроб. Максимальная температура роста
(73±1)^oC, минимальная (44±1)^oC, оптимальная - (55±1)^oC. Не растет в анаэробной среде, в бульоне с добавлением 7% поваренной соли; не растет на средах с 0,02% азида натрия и 0,001% лизоцима. Продуцирует каталазу. Реакция Фогес-Проскауера отрицательная. Желатину разжижает. Отношение к источникам углерода расщепляет глюкозу с образованием кислоты без газа; не образует кислоту из арабинозы, ксилозы и маннита. Редуцирует нитраты, не образует газ в анаэробных условиях на среде для денитрификации. Гидролизует крахмал. Не образует индол. Не расщепляет тирозин и фенилаланин.

Устойчивость к антибиотикам. Бактерии штамма Bacillus stearothermophilus КК-ВКМ В-2130Д устойчивы к неомицину и полимиксину, к которым чувствительны клетки Bacillus stearothermophilus ВКМ В-718 при параллельном исследовании.

Показатели термоустойчивости. При нагревании ультратермостате ампул с суспензией плотностью 1•10⁶ спор в 1 мл дистиллированной воды Д₁₂₁° 3,4 мин, Д₁₃₂° 2,0 мин.

Высушенные в пенициллиновых или инсулиновых стеклянных флаконах споры штамма в количестве от 5•10⁵ до 5•10⁶ при автоклавировании при (120±2)^oC не погибают через 5, 15 и 30 мин, погибают в 70% образцов через 45 мин и в 100% образцов только через 60 мин. Параллельно испытанные споры штамма Bacillus stearothermophilus ВКМ В-718 выживают при 5 мин автоклавирования и погибают через 15 мин.

Штамм назван Bacillus stearothermophilus КК и депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, коллекционный номер ВКМ В-2130Д.

Штамм исследован в сравнении со штаммом-прототипом Bacillus stearothermophilus ВКМ В-718 и использован для планового бактериологического контроля эффективности паровой стерилизации в лечебно-профилактических учреждениях.

Пример 1. Контроль эффективности паровой стерилизации проводят с использованием биотестов. Биотесты представляют собой инсулиновые флаконы, содержащие высушенные споры штамма Bacillus stearothermophilus КК-ВКМ В-2130Д в количестве 5•10⁵ 5•10⁶ спор на носитель в пакетах из упаковочной бумаги.

Для изготовления биотестов в асептических условиях вскрывают ампулу с лиофилизированной культурой Bacillus stearothermophilus КК-ВКМ В-2130Д. Суспензию переносят в две пробирки с мясопептонным бульоном, содержащим 0,5% глюкозы. Посевы инкубируют при (55±1)^oC в течение 24 ч. При росте культуры отмечают помутнение питательной среды.

Суточную бульонную культуру бактериальной петлей пересевают на скошенную питательную среду в пробирках (мясопептонный агар). Посевы инкубируют при (55±1)^oC в течение 24 ч, после чего культуру, выращенную на твердой питательной среде, смывают 5 мл стерильной дистиллированной воды.

Для получения спор производят пересев культуры во флаконы, содержащие скошенный картофельный агар. Взвесь равномерно распределяют по поверхности среды. Флаконы закрывают ватно-марлевыми пробками с бумажными колпачками и инкубируют при (55±1)^oC в течение 10 12 суток в вертикальном или горизонтальном положении (под углом 45^o) агаром вверх. На 5, 7 и 10 сутки культуру проверяют на интенсивность спорообразования (выборочно 2 3 флакона).

После завершения споруляции культуру осторожно при помощи шпателя из проволоки или стерильных стеклянных бус смывают с поверхности агара 5 мл стерильной дистиллированной воды.

Для удаления вегетативных клеток полученную суспензию прогревают при 70
75^oC в течение 30 мин в водяной бане, центрифугируют в стерильных центрифужных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками, с частотой вращения 33,33 с^-1 (2000 об/мин) в течение 15 мин. Далее надосадочную жидкость осторожно удаляют, а осадок трехкратно промывают стерильной дистиллированной водой, чередуя с центрифугированием, после чего суспензируют в небольшом объеме стерильной дистиллированной воды.

Для определения числа жизнеспособных спор в полученной суспензии готовят десятикратные разведения культуры. Из трех последовательных десятикратных разведений исходной суспензии (предел разведения зависит от концентрации полученных спор, ориентировочно от 5•10⁵ до 5•10⁷) производят высев по 0,1 мл суспензии на поверхность трех чашек Петри с мясопептонным агаром. Чашки инкубируют при (55±1)^oC в течение 48 ч, после чего производят подсчет выросших колоний. Приблизительную концентрацию спор в исходной суспензии определяют с учетом посевной дозы и разведений исходной суспензии.

В качестве носителей используют инсулиновые флаконы, которые стерилизуют паровым методом в упаковке из бумаги. Стерильные носители с помощью пипеточного дозатора обсеменяют суспензией спор Bacillus stearothermophilus КК-ВКМ В-2130Д из расчета 5•10⁵ 5•10⁶ спор на носитель, что достигается нанесением спор в дистиллированной воде плотностью 2,5•10⁷ 2,5•10⁸ спор в 1 мл.

Носители высушивают в термостате при (37±1)^oC или в эксикаторе над осушителем (силикагель, хлористый кальций) при комнатной температуре в течение 24 ч, помещают в пакеты из упаковочной бумаги, маркируют и запаивают в полиэтиленовые пакеты. Срок хранения при 4^oC 2 года.

Определение устойчивости спор штамма КК-КВМ-2130Д к действию водяного пара проводят при (120±2)^oC в автоклаве. Показатели устойчивости биотестов должны быть: время выживания спор на носителе не менее 15 мин для каждого образца, время гибели не должно превышать 60 мин для каждого образца.

При проведении контроля биотесты размещают в контрольные точки стерилизационной камеры между изделиями, подвергающимися стерилизации. Количество контрольных точек зависит от размера стерилизационной камеры (от 5 до 15 биотестов).

По окончании времени стерилизационной выдержки биотесты вынимают из стерилизатора и доставляют в бактериологическую лабораторию, где производят посев с соблюдением асептических условий.

Для культивирования биотестов после стерилизации используют бульон Хоттингера или мясопептонный бульон с добавлением в них 0,5% глюкозы. Биотесты инкубируют в течение 7 суток. Учет результатов контроля проводят путем ежедневного визуального осмотра биотестов. Биотесты считают стерильными, если помутнение питательной среды отсутствует, что указывает на гибель спор Bacillus stearothermophilus КК-ВКМ В-2130Д, т.е. на эффективность проведенной стерилизации. Помутнение питательной среды указывает на неэффективность проведенной стерилизации.

Пример 2. Термоустойчивость спор штаммов Bacillus stearothermophilus КК-ВКМ В-2130Д и Bacillus stearothermophilus ВКМ В-718 определили в модельном опыте в ультратермостате. Использовали суспензию, содержащую 5•10⁵ 5•10⁶ спор в 1 мл дистиллированной воды. В ампулы вносили по 1 мл суспензии, концы запаивали и погружали в вазелиновое масло температурой (120±1)^oC и (132±1)^oC. Перемешивание масла осуществляли механическим способом. Каждой температуре и каждому времени термической обработки соответствовали прогревы двух ампул. По окончании экспозиции ампулы вынимали и охлаждали в емкости со льдом. В асептических условиях разбивали запаянный конец и высевали по 0,1 мл суспензии из последовательных десятикратных разведений исходной суспензии на поверхность чашек Петри с мясопептонным агаром. На основании данных о числе спор, оставшихся жизнеспособными после нагревания, для каждой из исследуемых температур строили кривые выживания, откладывая на оси абсцисс время прогревы и по оси ординат - соответствующее значение средней логарифмической величины числа выживших спор. Обработку результатов опытов и построение кривых выживания проводили с использованием метода наименьших квадратов. Из графика выживания спор (см. чертеж) находили величину Д, которая количественно характеризует время, необходимое для десятикратного уменьшения числа жизнеспособных спор.

На чертеже приведен график выживаемости спор штаммов Bacillus stearothermophilus в модельных опытах в ультратермостате.

Для спор штамма Bacillus stearothermophilus КК-ВКМ В-2130Д Д₁₂₁° 3,4 мин, Д₁₃₂° 2,0 мин. Для спор штамма Bacillus stearothermophilus ВКМ В-718 Д₁₂₁° 2,2 мин, Д₁₃₂° 0,1 мин.

Анализ этих данных показывает, что споры штамма Bacillus stearothermophilus КК-ВКМ В-2130Д обладают большей термоустойчивостью; особенно велика разница для температуры 132^oC в 20 раз.

Пример 3. Биотесты со спорами штаммов Bscillus stearothermophilus КК-ВКМ В-2130Д и Bacillus stearothermophilus ВКМ В-718, приготовленные как описано в примере 1, в количестве от 5•10⁵ до 5•10⁶, подвергали автоклавированию в аппарате марки ВК-75. Установили, что споры Bacillus stearothermophilus ВКМ В-718 выживают при 5 мин и погибают во всех образцах через 15 мин. Споры Bacillus stearothermophilus КК ВКМ В-2130Д выживают при тех же условиях стерилизации через 5, 15 и 30 мин, погибают в 70% образцов через 45 мин и в 100% образцов через 60 мин (см. таблицу).

Так как споры штамма Basillus stearothermophilus КК-ВКМ В-2130Д более термоустойчивы, чем используемые в настоящее время споры штамма Bacillus stearothermophilus ВКМ В-718, то штамм Bacillus stearothermophilus КК-ВКМ В-2130Д обеспечит лучший контроль за эффективностью паровой стерилизации. Это приведет к большей надежности обеззараживания стерилизуемого материала.

Использование: медицинская и ветеринарная микробиология, для контроля эффективности стерилизации изделий термическим методом. Сущность изобретения: штамм Bacillus stearothermophilus КК ВКМ В-2130Д выделен из агаровой питательной среды, подвергнутой стерилизации водяным паром, споры штамма обладают большой термоустойчивостью, величина Д (десятикратное уменьшение числа жизнеспособных спор) при 121^oC равна 3,4 мин, при 132^oC - 2,0 мин. Споры Bacillus stearothermophilus КК - ВКМ-2130Д выживают при 121^oC через 5, 15, 30 мин, погибают в 70% образцов через 45 мин и в 100% образцов - через 60 мин. 1 ил., 1 табл.

Штамм бактерий Bacillus strearothermophilus КК ВКМ В-2130D, используемый для бактериологического контроля эффективности паровой стерилизации.