СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ПЫЛЕВОГО БРОНХИТА Российский патент 2016 года по МПК G01N33/48 G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно к профпатологии и пульмонологии, и может быть использовано в дифференциальной диагностике профессионального пылевого бронхита.

В структуре заболеваний органов дыхания пылевой этиологии, занимающих 1-2 места среди профессиональной патологии, хронический пылевой бронхит и хроническая обструктивная болезнь легких профессионального генеза занимают первое место [О состоянии профессиональной заболеваемости в Российской Федерации в 2011 году. Информационный сборник статистических и аналитических материалов. - Москва, 2012. 48 с. ], что в сочетании с высокой урбанизированностью Кузбасса приводит к значительной первичной и накопленной заболеваемости хроническим пылевым бронхитом. Актуальность этой патологии для практической и научной медицины возрастает еще и по причине размытости критериев диагностики этого заболевания и отсутствия надежных критериев дифференциальной диагностики ее с хроническим бронхитом общесоматического генеза.

На сегодняшний день одним из основных методов диагностики патологических процессов в бронхах является рентгенологическое исследование. Способ предусматривает изготовление рентгеновских обзорных снимков размером 30×40 см при выдержке не более 0,1 с. Информативность обзорных снимков не велика, в связи с чем возникает необходимость дополнительного выполнения боковых, прицельных, увеличенных снимков, а также томо- и бронхографий. Доказательством бронхосклеротического процесса является усиление и деформация рисунка трахеобронхиального дерева, наличием на этом фоне мелкоузелковых фиброзных трансформаций. При прогрессировании процесса в бронхах на рентгенологических снимках выявляется усиление бронхиального рисунка, что косвенно может говорить о формировании бронхиального фиброза, развитии эмфиземы легких с частичной или полной деформацией бронхов (Артамонова В.Г., Шатилов Н.Н. «профессиональные болезни» М., Медицина, 1982, С. 43).

К недостаткам рентгенологического способа диагностики пневмокониозов следует отнести низкую чувствительность и неспецифичность ранних симптомов, вследствие чего приходится выполнять повторные исследования через 6, 12, 18 месяцев, что значительно удлиняет процесс диагностики, способствует прогрессу заболевания, развитию более тяжелых форм патологических процессов, несвоевременному началу лечения. Следует подчеркнуть, что практически все начальные стадии развития пылевых бронхитов протекают бессимптомно не только клинически, но и рентгенологически.

Более информативным, чем клинические и лабораторные признаки болезни, являются данные фибробронхоскопического исследования. Для бронхита инфекционный природы характерен гнойный характер мокроты, образующей порой в просвете бронхов слепки, ее обилие, требующее промывания бронхов; явные признаки воспаления стенки бронхов в виде ее отечности и воспалительной гиперемии; очаговый характер атрофии слизистой оболочки; деформация бронхов в результате продолжительности их хронического воспаления. Для бронхита же пылевой этиологии характерна лишь атрофия слизистой оболочки, чаще всего диффузная, без признаков воспаления со скудным содержимым в бронхах или вообще без такового. Именно облигатность (обязательность) развития диффузной атрофии слизистой бронхов при анамнестических и клинико-лабораторных доказательствах отсутствия вирусно-бактериальной причины ее развития позволили выделить в 70-х годах пылевой бронхит как нозологическую единицу, ввести его в список профессиональных заболеваний и включить фибробронхоскопию в обязательный метод обследования пациентов на предмет пылевого бронхита [Милишникова В.В. Критерии диагностики и решение экспертных вопросов при профессиональном бронхите // Медицина труда и промышленная экология. 2004. - №1. - С. 16-21].

Недостатком фибробронхоскопического исследования являются патогномоничные критерии, не позволяющие провести надежной дифференциальной диагностики, поскольку оценка природы выявленных при фибробронхоскопии атрофических изменений - как пылевых или как инфекционных - все равно нуждается в анамнестических данных и в результатах ранее проводимых исследованиях.

Известен также способ диагностики профессиональных заболеваний легких, связанных с повышенной запыленностью, путем гистологического исследования материала биопсий ткани легких, включая исследование бронхов (Eckert H.Zum stellenwert histologischer Untersuchungen von Biopsielmaterial in der Rereilung professioneller Zungenschaden//Z.Erkr. oftm. 1987, 169, N 1. С. 66-68).

Способ отличается высокой инвазивностью, трудоемкостью. При силикозе, асбестозе, талькозе и других видах пылевой патологии биопсийный материал позволяет выявить профессиональные заболевания легких по наличию корреляции морфологических и клинических проявлений. Сами авторы метода отрицают абсолютную специфичность гистологических изменений при ряде пневмокониозов.

Наиболее близким к заявленному изобретению по совокупности облигатных признаков поражения бронхов является способ морфологической диагностики хронического пылевого бронхита в гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином и другими специальными окрасками. Способ ориентирован на микроскопических различиях расположения и количества воспалительных клеток в легких и бронхах, а также количестве соединительной ткани в указанных структурах. (Бондарев О.И., кандидатская диссертация «Патолого-анатомические и морфометрические исследования бронхов, респираторной ткани и сосудов малого круга кровообращения при воздействии угольно-породной пыли и при экспериментальном антракосиликозе», Новосибирск 2010, с. 68-108).

Данное исследование заключается в заборе операционно-биопсийного и аутопсийного материала в виде мелких фрагментов ткани (кусочков), которые забираются из различных отделов легких (прикорневой, центральной, периферической и субплевральной зон), из зон уплотнения (пневмофиброза), ателектазов и дисателектатических участков, отложений угольного пигмента, из малопораженных и неизмененных визуально участков легких и бронхов различного калибра (главные, долевые, сегментарные, субсегментарные, терминальные). Полученный операционно биопсийный и аутопсийный материал исследовали по основной, стандартной методике [Г.А.Меркулов. Курс гистологической техники. Медгиз. 1962. Стр. 8-60], которая включала в себя ряд этапов: фиксацию, проводку, заливку, резку гистологического материала и окраску основными и дополнительными красителями.

Гистологические изменения в бронхах выявлялись прокрашиванием по методу Ван Гизон (пикрофуксин). Определение степени развития склероза проводилось спектрофотометрически с предварительным определением минимального порога цветности в контрольной группе. Степень склероза определялась в интерстициальной ткани легких, в слое гладкомышечных клеток бронхов в стенке бронхов. Воспалительная инфильтрация оценивалась морфометрическим методом при помощи счетной программы, в целом, в бронхиальных железах, а также полуколичественным методом на светооптическом уровне.

Характер и количество пылевых отложений идентифицировался микросподографией. В бронхах различных генераций, не только в крупных, но и во многих мелких бронхах и бронхиолах, оценивались атрофические и субатрофические изменения выстилающего бронхиального эпителия со сглаженной, а во многих местах отсутствующей складчатостью слизистого и подслизистого слоев, воспалительные изменения в слизистой и подслизистой основе бронхов, а также в перибронхиальных пространствах. В перибронхиальных пространствах оценивалось наличие мелкоочагового и диффузного резко выраженного склероза ткани с наличием мелких пылевых включений. В собственно мышечной пластинке бронхов выявлялись различной степени интенсивности фибропластические изменения в виде набухания коллагеновых и эластических волокон, с формированием грубопетлистой сети. Наряду с фибропластическими изменениями определялись признаки перестройки соединительнотканного каркаса от упорядоченного и структурированного, до фрагментарно разрозненного с солидизацией и слиянием части волокон в конгломераты на отдельных участках. При специальных окрасках на выявление склеротических изменений по Гейдейгану, Касону и Вейгерту в мышечном слое средних и крупных бронхов четко определялись петлистая, нестабильная соединительнотканная сеть, состоящая из новообразованных коллагеновых и частично эластических волокон. В зоне сформированной соединительнотканной «заплатки» выявлялись немногочисленные фибропластические элементы, а также воспалительная инфильтрация. В перибронхиальных пространствах четко определялась зона выраженного склероза, порой превосходящая толщину стенок исследуемых бронхов. При окраске по ван Гизону склероз окрашивался в ярко-красный цвет. При окраске по Вейгерту отмечались нечеткие контуры некоторых эластических и коллагеновых волокон, фрагментация отдельных участков просветления некоторых сегментов волокна. Кониотические изменения в бронхах шахтеров имели количественные и качественные проявления. Количественные показатели оценивались полуколичественным методом с указанием слабо выраженной, умеренно выраженной и высоко выраженной воспалительной инфильтрации. Воспалительная инфильтрация оценивалась по наличию лимфо-лейкоцитарных элементов в стенке бронхов в 10 полях зрения. Количество клеток до 10 шт. не менее чем в двух полях зрения оценивали как слабо выраженную инфильтрацию, от 20 до 30 шт. в двух полях зрения расценивали как умеренную и наличие воспалительной инфильтрации более 35 шт. в двух полях зрения были расценены как тяжелая степень воспалительной инфильтрации. Качественные его признаки являлись, как бы продолжением кониотического процесса в респираторной части легких и проявлялись отложением угольной пыли и перибронхиальным склерозом.

Таким образом, данным методом гистологического исследования были выявлены признаки хронического пылевого бронхита с воспалительной инфильтрацией и склеротическими изменениями в стенках бронхов у шахтеров при воздействии угольно-породной пыли, а также развитие соединительной ткани в стенках бронхов и перибронхиальных пространствах.

Недостатком способа является отсутствие четких, ранних достоверных признаков, позволяющих оценить формирование ранних диффузных форм хронического пылевого бронхита на основе изменений доступных для светооптического уровня исследования бронхов, отсутствие прогностических критериев и трудоемкость, а также длительность проводки исследуемого материала более 2 суток.

Задача предлагаемого способа заключается в разработке способа обнаружения на основе иммуногистохимической реакции (ИГХ) ранних признаков хронического пылевого бронхита и его дифференциальная диагностики по отношению к хроническому бронхиту общесоматического генеза.

Поставленная задача достигается способом ранней диагностики хронического пылевого бронхита путем исследования биологического материала. Проводят морфологическое иммуногистохимическое исследование бронхов для определения наличия белков семейства мышечных антител: виментина, десмина, актина в эпителиальной ткани и при их наличии в количестве 10-20% от объема исследуемой эпителиальной ткани бронха диагностируют пылевой бронхит легкой степени тяжести, от 21-30% от объема исследуемой эпителиальной ткани бронха диагностируют пылевой бронхит умеренной степени тяжести, от 31% и выше от объема исследуемой эпителиальной ткани бронха диагностируют пылевой бронхит тяжелой степени тяжести.

Новизна изобретения заключается в том, что наличие белков семейства мышечных антител: виментина, десмина, актина в эпителиальной ткани бронха используют впервые для диагностики пылевого бронхита.

Способ позволяет на основе различий системной детекции белков семейства мышечных антител, т.е. виментинов, десминов, актинов, не являющихся специфической принадлежностью эпителиальных клеток бронхиального дерева, трансформироваться в различные в фенотипическом отношении клеточные генерации, способные вызывать фибропластические изменения в дыхательной системе, создать четкие представления о наличии фиброза в бронхах, его соотношения.

Техническим результатом изобретения является выявление пылевого бронхита на ранних стадиях, дифференцированная диагностика, возможность установления степени тяжести заболевания.

Известно определение наличия белков семейства мышечных антител: виментина, десмина, актина для определения и предупреждения фиброза в поджелудочной железе при алкогольном повреждении (М.Е. Ничитайло, Д.А. Кравченко и др. Морфология, 2012 г., Т 6, №2. С. 34-42, Shimizu К., 2008, Talukdar R. et al., 2008; Li X.C. et al., 2011), однако для диагностики пылевого бронхита использование данного способа неизвестно.

Способ позволяет исключить инфекционно-воспалительную природу атрофии эпителия слизистой оболочки бронхов при пылевом воздействии, доказать ее первичный генез, заключается в выявлении в эпителии бронхов феномена эпителиально-мезенхимальной трансформации (ЭМТ); эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП). Фактически речь идет о процессе тканевой и клеточной дедифференцировки, вызванной депрессией генома.

Проводят микроскопическое и иммуногистохимическое исследование ткани бронхов на выявление признаков ЭМТ, наличие которой свидетельствует о невоспалительном характере изменения бронхиальной стенки, являющегося патогномоничным для хронического бронхита пылевой природы.

Данное исследование проводилось в группах аутопсийного материала (AM) и операционно-биопсийного материала (ОБМ) с изучением степени склеротических изменений у шахтеров в AM и экспрессией антител в группе ОБМ. Сущность предлагаемого способа диагностики заключается в появлении инверсии эпителиальных клеток в ткани аутопсийного и операционно-биопсийного материала легких.

Предлагаемый способ диагностики хронического пылевого бронхита апробирован на двух группах клинико-морфологического материала: 10 шахтеров, проходивших обследование в центре профпатологии на предмет связи хронического бронхита с профессией и контингенте из 30 шахтеров судебно-медицинских экспертиз. Контрольная группа составила 15 проведенных судебно-медицинских экспертиз лиц молодого возраста без органной патологии.

В группу шахтеров (ГШ), подвергшихся воздействию угольно-породной пыли, включено 30 случаев судебно-медицинских экспертиз шахтеров, 25 из которых одновременно погибших во время работы в шахте при техногенной катастрофе. Оба контингента проходили периодические медицинские осмотры по регламентам приказа № 90 от 14 марта 1996 года «О порядке проведения предварительных и периодических медицинских осмотров (ПМО) работников и медицинских регламентах допуска к работе» и были признаны годными к работе. Сам факт работы в подземных условиях, с учетом ежегодно проводимым ПМО, служил показателем относительно благополучного состояния здоровья погибших.

Профессии как обследованных в Центре профессиональной патологии (ЦПП), так и погибших относились к основным профессиям угледобывающей отрасли: проходчик, горнорабочий очистного забоя, горнорабочий подземный, подземный электрослесарь, машинист горновыемочных машин, мастер участка.

Анализ санитарно-гигиенических характеристик, выданных Роспотребнадзором, рабочих мест шахтеров, обследованных в профпатологическом центре города Новокузнецка, позволяет говорить о том, что в перечисленных и других основных профессиях угледобывающей отрасли на всех шахтах Кузбасса уровень запыленности рабочих мест шахтеров угольно-породной пылью превышает предельно допустимые концентрации от нескольких раз до нескольких десятков, а порой и сотен раз, то есть относится к третьему классу вредности 1-4 степени (класс 3.1-3.4 согласно «Руководства по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда. Руководства Р.2.2.2006-06. - Москва, 2006. - 205 с).

Дополнительным условием, утяжеляющим действие фактора повышенной запыленности, является тяжесть физического труда в большинстве перечисленных профессий, также относящаяся к третьему классу вредности различной степени, приводящая во время работы к увеличению минутной вентиляции легких и, следовательно, к большему поступлению пыли в систему органов дыхания.

Группа контроля (ГК) была сформирована из 15 случаев судебно-медицинских экспертиз молодых мужчин города Новокузнецка, погибших при автодорожной катастрофе, находившихся в возрасте не старше 25 лет и не имевших по результатам вскрытий видимой органной патологии.

ЭМТ может быть отслежена обычной световой микроскопией не только по изменению внешнего вида эпителиальных клеток (Фиг. 2), теряющих свойственный им вид и мимикрирующих под клетки фибробластической природы, но и по иммуногистохимическому и иммуноферментативному выявлению в них маркеров, свойственных мезенхимальным клеткам: виментина, немышечного актина, десмина, альфа-гладкомышечного актина, N-кадгерина, накоплению в экстрацеллюлярном матриксе гликозаминогликанов, указывающих на менее зрелый характер соединительной ткани, вкупе свидетельствующих о трансформации эпителиальных клеток в типичные фибробласты (Фиг. 3, Фиг. 4, Фиг. 5).

Способ иллюстрируется фотографиями №1, 2, 3, 4, 5.

На Фиг. 1 - фотография легочной ткани с бронхом среднего калибра с четко выраженными кристаллами частиц кварца, что может говорить о пылевом бронхите профессионального генеза.

На Фиг. 2 - фотография стенки бронха крупного долевого диаметра с четко выраженной экспрессией виментина в слизистой оболочке. Увеличение X 100, ИГХ окраска виментином.

На Фиг. 3 - фотография слизистой оболочки крупного бронха с признаками ЭМТ эпителиальных клеток появлению выраженной экспрессии виментина. Увеличение X 400, ИГХ окраска виментином.

На Фиг. 4 - фотография слизистой оболочки крупного бронха с признаками ЭМТ эпителиальных клеток, четко выраженная экспрессия актина. Увеличении X 100, ИГХ окраска актином.

На фиг. 5 - фотография слизистой оболочки крупного бронха с признаками ЭМТ эпителиальных клеток появлению выраженной экспрессии виментина. Увеличение X 100, ИГХ окраска виментином.

Результаты исследования групп, сравнение, выводы

В результате реакций на выявления антител на фиброгенные белки мы получили селективную окраску хромогеном исследуемого материала в коричневые цвета части эпителиальных клеток. При хроническом пылевом бронхите и выраженных пневмосклеротических изменениях определяется четкая окраска цитоплазмы отдельных эпителиальных клеток, достигающая коричневого цвета (детекция виментином, десмином и актином). Строма легких и бронхов (соединительнотканный каркас) как в норме, так и при патологических изменениях обнаруживает четкую закономерную детекцию белков: виментана, десмина, актина - коричневую за счет наличия нормальных стромально-мышечных компонентов ткани легких и бронхов и может являться эталоном контроля при ИГХ исследовании.

На основании рассчитанного процентного соотношения реверсивных эпителиальных клеток были разработаны степени тяжести хронического пылевого бронхита. При наличии виментина, десмина, актина в количестве 10-20% от объема исследуемой эпителиальной ткани бронха диагностируют пылевой бронхит легкой степени тяжести, от 21-30% от объема исследуемой эпителиальной ткани бронха диагностируют пылевой бронхит умеренной степени тяжести, от 31% и выше от объема исследуемой эпителиальной ткани бронха диагностируют пылевой бронхит тяжелой степени тяжести.

Способ осуществляется следующим образом.

Предварительный этап гистологической обработки включает в себя упрощенный метод фиксации, обезвоживания и заключения в заливочную среду. Способ основан на применении новых технологических материалов на основе уже известного парафина. Для работы использовался универсальный пластификатор - гистамикс, который не требовал предварительной гомогенизации и, следовательно, укорачивал время исследования. При фиксации вместо нейтрального 10-20% формалина использовался 12% забуференный формалин. С последующей фиксацией при температуре 37°C в течении 6-8 часов.

Для более быстрой и качественной фиксации кусочков бронхов осуществлялась предварительная подрезка материала одноразовым ножом фирмы sacura. Кусочки вырезают толщиной 1-2 мм и площадью около 1,0-1,5 см². Приготовленный материал обезвоживают после 1,5-часового промывания в дистиллированной воде. Обезвоживание проводят в спиртах нарастающей концентрации сначала в 70° спирте - 4 часа, затем 2-й спирт 80° на 3 часа, затем 3-й спирт - 96° на 3 часа, следующий 96° спирт на 3 часа, 5-й спирт 96° на 3 часа, спирт 6-й - абсолютный спирт 100° на 3 часа. В общей сложности процесс обезвоживания занимает 19 часов, что значительно отличается от обычной гистологической проводки в течение 2 суток. В дальнейшем проводят материал в спирт - ксилоле по 1 часу и чистом ксилоле - 1 час. Критерием достаточной обработки было достаточное просветление исследуемых кусочков. Из смеси ксилола кусочки переносят в смесь ксилола гистамикса, далее кусочки перекладывают в чистый гистамикс, который заранее расплавлен до жидкого состояния. Пропитывание в гистомиксе идет в двух порциях, термованных при температуре 37°C и 56°C. Время пребывания объектов в гистамиксе определяется толщиной кусочков.

Следующий этап заключается в помещении исследуемого материала в пластификатор - гистамикс для дальнейшей обработки на микротоме.

После предварительного отбора наиболее качественных препаратов проводилось иммунногистохимическое исследование с использованием антител виментин, десмин, актин по методике, описанной (Сатрат D., Cecchetti D., Bevilacqua G. // J. Path. - 1993. - Vol. 171. - P. 151-152).

Для осуществления данных исследований применялся ИГХ метод, который в гистологических срезах заключался в применении мультимерной безбиотиновой системы детекции - REVEAL Biotin-Free Polyvalent DAB. Производитель Spring Bioscience, США.

При этом маркерный фермент коньюгируется с вторичным антителом при помощи небольших линейных молекул, так называемых мультимерных линкеров. Чувствительность данной системы очень высока, что достигается за счет связывания каждого антитела с несколькими молекулами фермента, малым размером мультимерных молекул, который минимизирует пространственное взаимодействие и облегчает процесс проникновения вторичных антител в ткани образца, а также высокочувствительными хромогенами, входящими в состав набора. Небольшой размер линкеров также увеличивает специфичность данного метода, позволяя добиваться более контрастного изображения за счет локального связывания мультимерного комплекса с выявляемыми антигенами. Таким образом, данный метод обеспечивает высокое качество визуализации, отсутствие неспецифического связывания и контрастность изображения на самом современном уровне.

Проводимая иммуногистохимическая реакция включает ряд этапов (концентрация состав и количество компонентов приведены в табл. №1). Проводят депарафинизацию и регидратацию фиксированных в формалине и залитых в гистамикс тканей. Для этого срезы проводят через четыре порции толуола, абсолютный этанол, спирт 70% и 56%, а также забуференный физиологический раствор - по 10 минут в каждой порции жидкости.

Блокирование эндогенной пероксидазы осуществляют путем внесения на срез нескольких капель перекиси водорода. При этом добавляют достаточное кол-во Hydrogen Peroxide Block фирма Spring Bioscience, США (перекиси водорода), чтобы покрыть образец. Инкубируют в течение 10 мин, затем промывают в буфере 10 мин.

Проводят температурную демаскировку антигена в аппарате Ретривер 200100, если она требуется, промывают в буфере 10 мин.

Вносят Protein Block и инкубируют 10 мин при комнатной температуре, чтобы убрать неспецифическое фоновое окрашивание, промывают в буфере.

Добавляют первичное антитело и инкубируют.

Промывают в Фосфатном буфере pH 6,0.

Вносят вторичное антитело Complement Spring Bioscience, США, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, промывают в буфере. Данный этап нужен только для мышиных антител. Если используются кроличьи антитела, этот этап пропускают.

Добавляют IIRP Conjugate и инкубируют 15 мин при температуре 25°C. Промывают в буфере. Промывают 4 раза в буфере. Вносят предварительно приготовленный краситель смесь 20 мкл DAB Plus Chromogen и 1 мл DAB Plus Substrate. Инкубируют 5 мин. Промывают в буфере.

Для повышения контрастности ядер проводят окраску гематоксилином (2 мин). Промывают водой.

Помещают в спирт в концентрации 96,6% на 2 мин (2 порции спирта, т.е. 4 мин).

Просветляют в 3 порциях ортоксилола по 2 мин в каждой порции.

Заключают в заливочную среду «биомаунт».

Гистологическое исследование проводилось на микроскопе Olympus СХ 31 (Япония) с цифровой видеокамерой Nikon digital sight - Fi 1 (Japan) с использованием компьютерной программы фирмы West Medica HandelsgmbH - Bio Vision 4.0, позволяющей более детально фиксировать морфологические изменения тканевых структур. Используемая компьютерная программа выдает % содержания в исследуемой ткани виментина, десмина, актина в отношении всего объема исследуемой эпителиальной ткани бронха.

При изучении объектов использовались объективы микроскопа с увеличением EPlan 4×/0.10., LWD 20×/0.40., EPlan 40×/0.65., EPlan 100/1.25 Oil Pol, и окуляра CF1 10×20.

Для коррекции скрытых гистологических дефектов использовалось наложение гамма фильтров со смягчением компьютерного изображения и сглаживанием артефициальных факторов. При детализации тонких и ультратонких, а также мелких нечетко визуализирующихся структур ткани легких производилось масштабирование измеряемых объектов с изменением исходного размера в сторону увеличения параметров на 100, 200 и 300% от номинального с последующим расчетом в базе программы и фиксацией микрофотографий.

Результаты иммуногистохимической реакции оценивали в 10 полях зрения микроскопа, по 100 клеток в каждом, при различном увеличении от *100 до *400. В готовых срезах высчитывали количество антиген-положительных клеток к общему объему всех клеток слизистой при иммуногистохимической реакции. При наличии виментина, десмина, актина в количестве 10-20% от объема исследуемой эпителиальной ткани бронха диагностируют пылевой бронхит легкой степени тяжести, от 21-30% от объема исследуемой эпителиальной ткани бронха диагностируют пылевой бронхит умеренной степени тяжести, от 31% и выше от объема исследуемой эпителиальной ткани бронха диагностируют пылевой бронхит тяжелой степени тяжести.

Следует отметить, что при проведении иммуногистохимической реакции мы использовали "слепой" контроль, то есть те срезы тканей без патологического процесса со стороны дыхательной системы, т.е. "положительный" контроль который являлся эталоном качества окраски срезов.

В каждом случае применялся и "отрицательный" контроль, то есть срезы аналогичной исследуемой ткани, в которых при проведении реакции опущены некоторые этапы ее с целью обнаружения возможного фонового окрашивания. Другими словами, применяют тест на качество набивки эндогенной пероксидазы, которая при недостаточном устранении на втором этапе реакции может быть проявлена иммунопероксидазным методом и вызовет ложные представления о степени детекции искомого белка.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить количество антител в гистологическом срезе бронхов. По высокой детекции последних можно судить о степени фиброзной трансформации, стадии развития хронического пылевого бронхита и прогнозе заболевания.

Пример 1.

Пациент Б-ов В.В., 1955 г. р. (57 лет), обследован в Центре профпатологии. ПП 02.02-20.02.2014 г. По копии трудовой книжки пациент с 1983 по конец 2013 г. проработал в профессиях горнорабочего и проходчика. По медицинской карте амбулаторного больного - спорадические единичные обращения с ОРВИ - до 2003 г. Анамнестически: появление кашля и одышки при ранее свободной переносимой работе относится примерно к 2010-2011 гг. С этими жалобами в поликлинику не обращался.

При ПМО в 2013 г. в связи с указанными жалобами впервые заподозрен пылевой бронхит, запрошена и получена из Роспотребнадзора СГХ рабочего места пациента, в которой указано, что по всему 30-летнему профмаршруту в профессиях ГРП и проходчика запыленность превышала ПДК и соответствовала классу 3.1-4 ст. Пациент направлен в центр профпатологии на экспертизу связи заболевания с профессией.

При поступлении: жалобы преимущественно на кашель со скудно отделяемой мокротой серого цвета; одышка при умеренной ходьбе с 3 этажа. Объективно: грудная клетка правильной формы, равномерно участвует в акте дыхания; частота дыхания 16 мин; перкуторно - легочной звук, аускультативно - дыхание жесткое, хрипов нет.

Rg-грамма органов грудной клетки: легочные поля обычной прозрачности, без очаговых и инфильтративных затемнений. Легочной рисунок умеренно деформирован по ячеисто-тяжистому типу, преимущественно в прикорневых и базальных отделах. Корни тяжистые. Срединная тень - без особенностей. Синусы свободны.

Спирографическое исследование (с проведением пробы с бронхолитиками): дыхательный маневр выполнен правильно; ЖЕЛ - 89 (87)%, ФЖЕЛ - 60 (51)%, ОФВ1 - 74 (63)%, индекс Тифно - 130 (130)%, МОС25 - 110 (116)%, МОС50 - 110 (115)%, МОС75 - 181 (182)%.

Лабораторно: мокрота слизистая, лейкоцитов - 11-50 в поле зрения; эпителиальные клетки в небольшом количестве.

По фибробронхоскопии (ФБС) - голосовая щель симметричная, трахея не изменена, карина острая, хрящевой рельеф бронхов выражен очень ярко; слизистая оболочка бледно-розовая, истонченная, с хорошо видимым сосудистым рисунком; устья бронхов расширены, шпоры истончены; секрет слизистый, вязкий, в малом количестве; все бронхи осмотрены до субсегментарных, дополнительных образований не выявлено. Заключение - диффузный 2-сторонний атрофический бронхит.

При ФБС выполнена бранш-биопсия из правого верхнедолевого бронха. При гистологическом исследование обнаружены признаки субатрофического бронхита и ИГХ четкие признаки ЭМТ с положительной «инверсией» и 33% детекцией эпителиальной ткани виментином, десмином и актином, что может говорить о тяжелой степени поражения бронхов.

Заключение врачебной комиссии по профпатологии: формирование клиники хронического бронхита к 2011 г., то есть после 38 лет работы в условиях запыленности класса 3.1-3.4 ст.; атрофическая бронхопатия, подтвержденная эндоскопически; слизистый, а не гнойный, характер мокроты; выявление признаков эпителиально-мезенхимальной трансформации, а также отсутствие значимых перенесенных заболеваний бронхолегочной системы, прослеженных по амбулаторной карте, говорят о его профессиональном генезе.

Заключительный диагноз: хронический пылевой необструктивный бронхит в стадии ремиссии. Диффузный пневмосклероз. ДН 0-I (нулевой-первой) степени. Заболевание профессиональное, установлено впервые.

Пример 2.

Исследование аутопсийного материала больного А.В. 1989 г. р. (5 лет стажа подземного рабочего). По копии трудовой книжки пациент с 2008 по конец 2013 г. проработал в профессиях горнорабочего. По медицинской карте амбулаторного больного - ранее за медицинской помощью с жалобами на заболевания органов дыхания в поликлинику и стационары общесамотического профиля не обращался. Материал был получен в результате техногенной катастрофы на угольном предприятии.

Материал был представлен кусочками ткани из различных отделов легких (прикорневой, центральной, периферической и субплевральной зон), а также из бронхов различного калибра (главные, долевые, сегментарные, субсегментарные, терминальные). Исследуемая ткань забиралась ступенчато в количестве 20-30 кус с доли легкого. Всего для исследования одного легкого бралось от 50 до 80 кусочков. Фрагменты аутопсийного материала исследовались как при рутинных окрасках для контроля изучаемого метода, так и при проведении ИГХ для оценки степени изменений бронхиального дерева.

В результате проведенного иммуногистохимического исследования с детализацией тонких структурных элементов с использованием большого увеличение до *1000 под масляной иммерсией. Получили положительные результаты с четкой устойчивой экспрессией виментина, десмина, актина в слизистой трахеобронхитального дерева в количестве 12% от всего объема исследуемой эпителиальной ткани бронха, на основании проведенного исследования был диагностирован пылевой бронхит легкой степени тяжести.

Пример 3.

Проведено исследование аутопсийного материала погибших горнорабочих Г. и М. 1957 и 1964 г. р. (30 и 27 лет стажа подземного рабочего). При проведении иммуногистохимического исследования (ИГХ), также были получены четко выраженные положительные результаты с прогрессирующей экспрессией виментина, десмина и актина в слизистой бронхов различного калибра в количестве 31% и 34% от объема исследуемой эпителиальной ткани бронха соответственно. На основании полученных данных у горнорабочих был диагностирован хронический пылевой бронхит тяжелой степени тяжести.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу ранней диагностики хронического пылевого бронхита путем исследования биологического материала. Сущность способа состоит в том, что при морфологическом, иммуногистохимическом исследовании легких и бронхов определяют наличие белков семейства мышечных антител: виментина, десмина, актина в эпителиальном компоненте. При их наличии в количестве 10-20% диагностируют пылевой бронхит легкой степени тяжести, от 21-30% диагностируют пылевой бронхит умеренной степени тяжести, от 31% и выше диагностируют пылевой бронхит тяжелой степени тяжести. Использование заявленного способа позволяет эффективно выявить пылевой бронхит на ранних стадиях, осуществив дифференцированную диагностику, с возможностью установления степени тяжести заболевания. 1 табл., 5 ил., 3 пр.

Способ ранней диагностики хронического пылевого бронхита путем исследования биологического материала, отличающийся тем, что при морфологическом иммуногистохимическом исследовании бронхов определяют наличие белков семейства мышечных антител: виментина, десмина, актина в эпителиальной ткани бронха и при их наличии в количестве 10-20% от объема исследуемой эпителиальной ткани бронха диагностируют пылевой бронхит легкой степени тяжести, от 21-30% от объема исследуемой эпителиальной ткани бронха диагностируют пылевой бронхит умеренной степени тяжести, от 31% и выше от объема исследуемой эпителиальной ткани бронха диагностируют пылевой бронхит тяжелой степени тяжести.