Способ оценки атрофии желез антрального отдела желудка Российский патент 2022 года по МПК G01N1/28 G01N1/30 

Рак желудка - одна из ведущих причин заболеваемости и смертности в структуре онкологической патологии. Диагностика этого заболевания на этапе состоявшейся опухоли часто осуществляется на поздней стадии при наличии метастатического поражения, что существенно ухудшает прогноз [Gastric stem cell and cellular origin of cancer / M. Hata, Y. Hyakawa, K. Koike // Biomedicines. - 2018. - Vol. 6, №4. - Р. 100-9]. Однако формированию рака предшествует целый ряд предраковых изменений, составляющих так называемый каскад P. Correa: хронический гастрит - атрофический гастрит - интраэпителиальная неоплазия/дисплазия - рак желудка [Gastric precancerous process in a high risk population: cohort follow-up / P. Correa, W. Haenszel, C. Cuello [et al.] // Cancer Res. - 1990. - №50. - P. 4737-40]. Своевременное выявление атрофического гастрита позволяет включить пациента в группу риска развития рака желудка, осуществлять мониторинг его состояния и, в случае развития заболевания, диагностировать его на ранних этапах, позволяющих радикальное излечение. Такой подход лег в основу предиктивной парадигмы рака желудка, фактически подразумевающей вторичную профилактику опухолевого роста [Кононов А.В. Роль патологоанатомического заключения «Хронический гастрит» в системе персонифицированной канцерпревенции // Рос. журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2018. - № 28(4). - С. 91-101].

Лежащая в основе атрофического гастрита атрофия желез слизистой оболочки желудка представляет собой снижение числа специализированных желез, свойственных каждому его отделу. Ее диагностика осуществляется на основе эндоскопического исследования с биопсией. При этом для реализации предиктивного потенциала в отношении риска развития рака желудка необходимо взятие биопсийного материала из нескольких точек (два биоптата - из тела, два - из антрального отдела и один - из области угла желудка) [OLGA staging for gastritis: a tutorial. / M. Rugge, P. Correa, F. Di Mario [et al.] // Dig. Liver Dis. - 2008. - №40. - p. 650-8]. Каждый биоптат должен включать все слои слизистой оболочки, в том числе и мышечную пластинку, и содержать как минимум 10 желез. На основании оценки дефицита желез каждого из пяти фрагментов рассчитывается суммарный показатель (стадия хронического гастрита), позволяющий стратифицировать риск развития рака желудка у пациента и отнести его к одной из групп мониторинга.

Существенным затруднением оценки уровня атрофии желез в биоптате желудка при морфологическом (гистологическом) исследовании является субъективный характер оценки имеющего место дефицита желез, сопровождающегося уменьшением протяженности железистого компартмента, замещением соединительной тканью. Это диктует необходимость поиска дополнительных вариантов оценки атрофии желез для возможности осуществления канцерпревенции.

Один из таких вариантов, взятых нами за прототип, является способ оценки, предложенный Аничковым Н. М., который предполагает диагностику атрофии с помощью морфометрического метода [Пат. 2429789 Российская Федерация, МПК A61B 10/02, G01N 1/28. Изобретение: № 2010102397/14: заявл. 25.01.10: опубл. 27.09.11 / Сидоркин А.О., Аничков Н.М., Новикова В.П., Азанчевская С.В.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. - 3 с]. Для определения градации выраженности атрофии слизистой оболочки антрального отдела желудка с помощью линейки микрометра измеряют глубину тела антральной железы и подставляют полученное значение вместо знака Х в формулу:

У=5,03-0,02X1, где X1 - глубина железы антрального отдела желудка.

При значении У≤-1,6 определяют нулевую степень атрофии слизистой оболочки в антральном отделе желудка, то есть отсутствие атрофии. При значении У от -1,5 до 0,61 - I степень атрофии слизистой оболочки в антральном отделе желудка (слабая атрофия); если У от 0,62 до 1,2-II (умеренную) степень атрофии; если У>1,2 - III (выраженную) степень атрофии слизистой оболочки в антральном отделе желудка.

Несмотря на то, что описанный способ предполагает объективную оценку градации атрофии, он также обладает рядом недостатков:

1. Применяемые в процессе диагностики расчеты существенно увеличивают время диагностического процесса, их реализация затруднительна в рутинной практике.

2. Диагностический процесс оценки, согласно описанному методу, требует наличия микрометра и его калибровки каждый раз перед началом работы.

3. Оценка атрофии слизистой оболочки желудка, основанная на расчете измеренных значений, не учитывает индивидуальные колебания толщины слизистой оболочки желудка и может привести как к гипо-, так и к гипердиагностике атрофических изменений.

4. Оценка атрофических изменений на основе одной измененной железы может привести к гипо- и гипердиагностике атрофии, поскольку не учитывает неравномерного характера выраженности процесса.

5. В обозначенном методе отсутствует учет ориентировки биопсийного материала в качестве дополнительного условия для оценки. Наличие тангенциального или поперечно среза существенно изменяет морфометрические показатели слизистой оболочки желудка.

Для преодоления недостатков существующего метода был разработан собственный способ оценки атрофии слизистой оболочки желудка, основанный на иммуногистохимическом определении экспрессии белковых молекул. Первым этапом предлагаемого способа является оценка состоятельности полученного биоптата путем визуализации гладкомышечных волокон, входящих в состав мышечной пластинки. С этой целью применяется гладкомышечный актин (SMA), чувствительный маркер мышечной дифференцировки [Alpha smooth muscle actin positive stromal cells in gastric carcinoma / H. Nakayama, H. Enzan, E. Miyazaki [et al.] // J. Clin. Pathol. - 2002. - №55(10). - Р. 741-4]. Положительное цитоплазматическое окрашивание клеток, формирующих сплошную линию, параллельную поверхности среза, является критерием правильной ориентировки биопсийного материала согласно Фиг. 1. В цитоплазме клеток мышечной пластинки слизистой оболочки отмечается экспрессия SMA. Мышечная пластинка расположена перпендикулярно длиннику желез и параллельно поверхности слизистой оболочки, что соответствует, верно, ориентированному гистологическому срезу. ×100. Следующим шагом предлагаемого способа является оценка соотношения протяженности поверхностных и глубоких отделов желез. Дефицит желез при атрофии в первую очередь формируется за счет уменьшения длины глубоких отделов (тела и дна железы), что отражает снижение числа стволовых клеток и истощение регенераторного потенциала слизистой оболочки желудка. На светооптическом уровне при рутинной окраске (гематоксилин и эозин) деление железы на отделы неточно и носит условный характер. Точно визуализировать глубокие отделы желез способна идентификация их специфических продуктов - муцинов.

Муцины - это гликопротеины, содержащие кислые полисахариды; обнаруженные на сегодняшний день муцины пронумерованы в хронологическом порядке - от муцина-1 (MUC1) до муцина-17 (MUC17). В норме муцины слизистой оболочки желудка представлены MUC1, муцином-5АС (MUC5AC) и муцином-6 (MUC6); при этом MUC1 связан с мембранами клеток, а MUC5AC и MUC6 являются секретируемыми и выявляются в цитоплазме клеток желез [Ho S. B. The adherent gastric mucous layer is composed of alternating layers of MUC5AC and MUC6 mucin proteins / S. B. Ho, K. Takamura, R. Anway [et al.] // Dig Dis Sci. - 2004. - Vol. 49. - P. 1598-1606]. Характер распределения секретируемых муцинов в железах специфичен и сопряжен с функцией: MUC5AC обнаруживается в поверхностном фовеолярном эпителии, тогда как MUC6 локализуется в области тела дна желез. Учитывая особенности гистологического строения в разных отделах желудка для антрального отдела нормальным является соотношение MUC5AC к MUC6 как 2:1, что отражает протяженность компартментов, их секретирующих [Mills, S. Histology for pathologists / S. Mills. - 5^thed. - UK: Lippincott Williams and Wilkins, 2020. - 1344 р.].

Описанное распределение и соотношение меняется в условиях атрофии желез при хроническом воспалении, в частности, вызванном Helicobacter pylori - наиболее частым этиологическим фактором хронического гастрита. Донные отделы желез и соответствующая им зона продукции MUC6 укорачивается. Достоверно оценить продукцию секретируемых муцинов позволяет иммуногистохимическое (ИГХ) исследование со специфическими антителами, при котором цитоплазма клеток, экспрессирующих муцины, диффузно окрашивается в коричневый цвет. Предпочтительно использование антитела MUC6, окрашивающего нижние компартменты железы и демонстрирующего более стабильный уровень экспрессии независимо от длительности персистенции гастрита [Pak J.S. Immunohistochemical expressions of MUC2, MUC5AC, and MUC6 in normal, Helicobacter pylori infected and metaplastic gastric mucosa of children and adolescents / J. S. Park, J. S. Yeom, J. H. Seo [et al.] // Helicobacter. - Vol.20 (4). - 2015. - P.260-8].

На основании соотношения протяженности поверхностных неокрашенных отделов слизистой оболочки и глубоких отделов желез слизистой оболочки антрального отдела желудка авторами разработан собственный способ диагностики атрофии. Расчет соотношения отделов желез проводится на 10 желез в пределах одного биоптата по формуле:

а = (протяженность зоны поверхностных неокрашенных отделов слизистой оболочки без экспрессии MUC6)/(протяженность зоны экспрессии MUC6)=

(протяженность неокрашенной после иммуногистохимической реакции части слизистой оболочки (покровно-ямочный слой))/(протяженность окрашенной части железы),

где a - атрофические изменения, соответствующие одной железе антрального отдела желудка.

Соотношение протяженности неокрашенных поверхностных отделов слизистой оболочки (покровно-ямочного слоя) к глубоким отделам железы, экспрессирующим MUC6, меньшее или равное 2 соответствует норме, отсутствию атрофии слизистой оболочки антрального отдела желудка; более 2 - наличию атрофии слизистой оболочки антрального отдела желудка согласно Фиг. 2. Цитоплазматическая экспрессия MUC6 отмечается в донных отделах желез пилорического отдела желудка и имеет протяженность менее железы. Изменения соответствуют отсутствию атрофии желез. ×100.

Оценка общей выраженности атрофии слизистой оболочки желудка в исследуемом фрагменте осуществляется путем расчета среднего арифметического показателя по формуле:

,

где А - выраженность атрофии слизистой оболочки антрального отдела желудка.

При значении А менее или равное 2 диагностируют отсутствие атрофии слизистой оболочки антрального отдела желудка. При А более 2, но менее 3 определяют слабую степень атрофии слизистой оболочки в антральном отделе согласно Фиг. 3. Цитоплазматическая экспрессия MUC6 отмечается в донных отделах желез пилорического отдела желудка. Соотношение протяженности поверхностных отделов железы к глубоким отделам железы, экспрессирующим MUC6, более 2, но менее 3, что соответствует атрофии желез слабой степени. ×100), что соответствует градации 1; при А более 3, но менее 4 - умеренную степень атрофии (градация 2); при значении А более 4 - выраженную степень атрофии слизистой оболочки в антральном отделе желудка (градация 3).

Преимуществами такого подхода являются:

1. Предварительное исключение тангенциального характера среза путем оценки экспрессии гладкомышечного актина (SMA).

2. Простота интерпретации результата оценки (соотношение компартмента с отсутствием иммуногистохимической реакции с MUC6 к MUC6-позитивному компартменту), обеспечивающая высокую воспроизводимость диагностического заключения.

3. Возможность применения способа в рутинной практике исследования биопсийного материала с быстрой оценкой результата.

4. Объективность определения градации атрофии, связанная с оценкой изменений в 10 железах с формированием усредненного конечного показателя.

Таким образом, при различном сочетании характеристик оцениваемых признаков примеры осуществления изобретения могут быть описаны следующим образом. При проведении иммуногистохимической реакции с гладкомышечным актином (SMA) в гистологических срезах получено положительное цитоплазматическое окрашивание клеток, формирующих сплошную линию, параллельную поверхности среза, что свидетельствует о пригодности образца к оценке атрофии. Цитоплазматическая экспрессия MUC6, выявленная иммуногистохимическим методом, оценивается в донных отделах желудочного эпителия. В 10 железах соотношение протяженности поверхностных неокрашенных отделов слизистой оболочки (покровно-ямочного слоя) к глубоким отделам железы, экспрессирующим MUC6, менее или равное 2 свидетельствует об отсутствии атрофии. При получении в 10 железах соотношения протяженности неокрашенных поверхностных отделов слизистой оболочки (покровно-ямочного слоя) к глубоким отделам железы, экспрессирующим MUC6, более 2, но менее 3 можно сделать вывод о наличии атрофии слабой степени (градация 1).

Изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии. Для диагностики атрофии желез антрального отдела желудка проводят иммуногистохимическое окрашивание с использованием гладкомышечного актина (SMA); положительное цитоплазматическое окрашивание клеток мышечной пластинки слизистой оболочки, формирующих сплошную линию, параллельную поверхности среза, что является критерием правильной ориентировки среза. Проводят иммуногистохимическое окрашивание правильно ориентированных срезов с использованием антител MUC6. Далее рассчитывают в 10 железах слизистой оболочки антрального отдела желудка отношения протяженности зоны без экспрессии MUC6 к протяженности зоны с экспрессией MUC6; определяют среднее арифметическое отношение. При значении среднего арифметического отношения, равного или менее 2, определяют отсутствие атрофии слизистой оболочки антрального отдела желудка. При значении отношения более 2, но менее 3 определяют слабую степень атрофии. При значении более 3, но менее 4 определяют умеренную степень атрофии. При значении отношения более 4 определяют выраженную степень атрофии. Способ позволяет исключить тангенциальный характер среза за счет оценки экспрессии гладкомышечного актина, упрощает интерпретацию результата оценки, обеспечивает высокую воспроизводимость диагностики в практике исследования биопсийного материала. 3 ил.

Способ оценки атрофии желез антрального отдела желудка, отличающийся тем, что для исключения тангенциального характера гистологического среза проводят иммуногистохимическое окрашивание с использованием гладкомышечного актина (SMA); положительное цитоплазматическое окрашивание клеток мышечной пластинки слизистой оболочки, формирующих сплошную линию, параллельную поверхности среза, является критерием правильной ориентировки среза; проводят иммуногистохимическое окрашивание правильно ориентированных срезов с использованием антител MUC6; далее рассчитывают в 10 железах слизистой оболочки антрального отдела желудка отношения протяженности зоны без экспрессии MUC6 к протяженности зоны с экспрессией MUC6; определяют среднее арифметическое отношение; при значении среднего арифметического отношения, равного и менее 2, определяют отсутствие атрофии слизистой оболочки антрального отдела желудка; при значении отношения более 2, но менее 3 определяют слабую степень атрофии; при значении более 3, но менее 4 определяют умеренную степень атрофии; при значении отношения более 4 определяют выраженную степень атрофии.