БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПЕПТИД И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩАЯ И ПРОТИВОВИРУСНАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ Российский патент 2016 года по МПК C07K7/08 A61K38/10 A61P31/12 A61P35/00 A61P37/00 A61K49/14 

Изобретение относится к белкам и биологически активным пептидам с иммуномодулирующей и противовирусной активностью.

Известна биологическая активность низкомолекулярных пептидов. Описан ряд пептидов, которые обладают прямым противовирусным или противоопухолевым действием [Акияма Н., Хиджиката М., Кобаяси А., Ямори Т., Цуруо Т., Натори С. Противораковое воздействие N-β-аланил-5-S-глютатионил диоксифенилаланина (5-S-GAD), новое антибактериальное вещество, получаемое из насекомых. Противораковое исследование, 2000, Т. 20, стр. 357-362].

Особое место в этом ряду занимают пептиды земноводных и насекомых [Булет П., Хетру К., Диамарк Дж., Хоффман Д. Противомикробные пептиды в насекомых: структура и функция. Разв. Срав. Иммунол., 1999. Т. 23, стр. 329-344, Чинчар В.Г., Ванг Дж., Мурти Г., Кейри К., Роллинг-Смит Л. Инактивация вируса 3 лягушек и вируса проточного сома ескулентином-2Р и ранатуерином-2Р, двумя противомикробными пептидами, выделенными из кожи лягушек. Вирология, 2001. Т. 288, стр. 351-357].

Известна группа противовирусных пептидов, выделенных из насекомых с общим названием Аллофероны, описываемая общей формулой: X₁-His-Gly-X₂-His-Gly-Val-X₃ или их фармацевтически приемлемые соли, где X₁ отсутствует либо содержит не менее 1 аминокислоты, Х₂ содержит не менее 1 аминокислоты либо представляет собой пептидную связь; Х₃ отсутствует либо содержит не менее 1 аминокислоты, причем указанные аминокислоты выбраны из групп: алифатической, ароматической или гетероциклической. (Патент РФ №2172322, МПК С07К 7/06, С07К 7/08, А61К 38/08, А61К 38/10, А61Р 37/02, опубл. 20.08.2001 г.).

На основе пептида Аллоферона-1 разработано и производится лекарственное средство «Аллокин-альфа» - лиофилизат для подкожных инъекций, применяемое при лечении герпеса, острого гепатита В и папилломовирусных инфекций.

Близкой к Аллоферонам по строению и свойствам является группа пептидов под общим названием Аллостатины с общей формулой: X₁-Trp-Gly-Gln-X₂ (Патент РФ №2267496, МПК С07К 7/06, А61К 38/08, А61К 38/10, опубл. 10.01.2006).

Аллостатин-1, отличающийся от Аллоферона-1 наличием двух остатков триптофана (Trp), замещающих гистидин (His) и валин (Val), обладает не только высокой противовирусной активностью, но и противоопухолевым действием.

Данный пример показывает, что замена аминокислотных остатков в молекулах указанных пептидах может существенно изменить их биологические свойства.

Аллофероны являются наиболее близкими аналогами предлагаемого изобретения по химической структуре и механизму действия.

Кроме того, ранее методом компьютерного моделирования пространственной структуры молекулы Аллоферона-1 была показана важнейшая роль остатков гистидина в конформации молекулы пептида. Причем наиболее важный вклад вносят остатки гистидина, находящиеся в положениях 6 и 9. (Патент РФ №2470031, МПК С07К 7/06 А61К 38/08, А61К 38/10, опубл. 20.12.2012).

Наличие других аминокислот в этих положениях существенно изменяет конформацию молекул и, соответственно, их биологическую активность.

Технической задачей, на решение которой направлено заявляемой изобретение, является создание новых пептидов, обладающих повышенной биологической активностью, которые могут быть использованы для создания лекарственных препаратов для лечения и профилактики вирусных и микробных инфекций.

Поставленная техническая задача решена тем, что синтезирован биологически активный пептид:

His-Gly-Val-Ser-Gly-Tyr-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly (Пептид I), или

His-Gly-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly (Пептид II), или

His-Gly-Val-Ser-Gly-Arg-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly (Пептид III), или

His-Gly-Val-Ser-Gly-Lys-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly (Пептид IV), или

His-Gly-Val-Ser-Gly-Phe-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly (Пептид V), или

His-Gly-Val-Ser-Gly-Phe(p-OMet)-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly (Пептид VI), или

His-Gly-Val-Ser-Gly-Phe(p-Cl)-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly (Пептид VII),

обладающий повышенной индукцией гамма-интерферона и интерлейкина-18.

Поставленная техническая задача решена также тем, что получена иммуномодулирующая и противовирусная фармацевтическая композиция, содержащая один или несколько пептидов, приведенных выше, или их фармацевтически приемлемых солей в эффективном количестве в сочетании со стандартными вспомогательными веществами.

Синтезированные пептиды отличаются наличием различных аминокислот алифатического и ароматического рядов в положении 6. Для данных пептидов определена биологическая активность синтезированных пептидов.

Технический результат состоит в получении пептидов с повышенной индукцией гамма-интерферона и интерлейкина-18 по сравнению с Аллофероном-1, что обуславливает повышенную иммуномодулирующую и противовирусную активность, что будет подтверждено примерами.

Следует отметить, что сходство химической структуры полученных пептидов I-VII с Аллофероном-1 и Аллостатином-1 является чисто внешним. Они не укладываются в формулы этих групп пептидов.

Синтез пептидов произведен по стандартной Fmoc-процедуре твердофазным способом. Удаление защиты производилось 20%-м раствором пиперидина в диметилформамиде. Реакцию сочетания проводили с помощью HBTU в присутствии HOBt и NMM в течение 2 часов при комнатной температуре. Финишное отделение пептидов проводили с помощью TFA, EDT и воды (95:2,5:2,5) в течение 2 часов при комнатной температуре.

Сырые пептиды промывались холодным диэтиловым эфиром, растворялись в воде и лиофилизовались. Очистка пептидов производилась методом HPLC с использованием колонок TOSOH Bioscience С18 (21,5 мм × 300 мм) (Tosoh, Japan) с UV-детектором 210/240 нм. Процесс проводили в градиенте вода - ацетонитрил, содержащий 0,1% TFA при скорости потока 7 мл/мин. Очищенные лиофилизованные пептиды имели чистоту более 95%.

Финишная стадия получения пептидов - лиофилизация из раствора в 50% уксусной кислоте.

Химическая идентификация пептидов была подтверждена методом масс-спектрометрии с использованием масс-спектрометра типа Microflex LT MALDI-TOF (Bruker Daltonics GmbH).

Возможность достижения цели изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Изучение влияния биологически активных пептидов I-VII на индукцию IL-18

Индукция осуществлялась путем введения подкожно Аллоферона-1 и биологически активных пептидов I-VII однократно в дозе 2 мг на кг веса лабораторных животных. Для эксперимента использовались мыши линии BALB/C, самки, массой 16-22 грамма, возраста 14 недель, полученные из питомника лабораторных животных и прошедшие необходимый карантин. Температура окружающей среды была 22±2°C, относительная влажность 60±5%, содержание аммиака составляло 10 ррм, углекислого газа - не превышало 0,15% к объему воздуха, кратность воздухообмена составляла 10-15 крат/час при скорости движения воздуха - 0,3 м/с. Фильтрование воздуха обеспечивали с помощью фильтров грубой фильтрации. Кормили мышей гранулированным комбикормом, изготовленным в соответствии со стандартами приготовления кормов для лабораторных животных. Корм предварительно стерилизовали в автоклаве с использованием вакуума при 121°C и 1,2 атм в течение 20 мин. Кормление проводили 1 раз в сутки из расчета 8,0 г на одну мышь, после чистки клеток. Питьевую воду заливали в бутылки-поилки вместимостью 200 мл и стерилизовали при 121 С и 1,2 атм в течение 45 мин, пробки автоклавировали отдельно. Поилки ежедневно заменяли на новые. Определялся уровень интерлейкина-18 (IL-18) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, с использованием специфических антител. Количество IL-18 в сыворотке определяли на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 16, 24, 32, 40, 48, 56 час после введения препаратов.

Параллельно изучалось «фоновое» количество IL-18, присутствующее в сыворотке крови исследуемых животных. Для этой цели использовалось 14 мышей в качестве контрольной группы, которые получали подкожную инъекцию физиологического раствора. В опытной группе использовалось 336 животных. В случае контрольной группы доверительный интервал рассчитывался по измерениям разведения одного и того же образца. В опытной группе доверительный интервал вычислялся относительно трех образцов от трех животных на каждую измеряемую точку.

Через 3-4 часа после введения у всех пептидов наблюдается небольшой достоверный пик увеличения концентрации IL-18. Через 24 часа наблюдается второй пик значительного увеличения содержания IL-18 в сыворотке крови опытной группы животных, который длится около 20 часов. Наличие первого пика на 3-4 часу возможно обусловлено не специфической индукцией. Значительное повышение IL-18 на 2-3-й день эксперимента свидетельствует о специфической способности препаратов индуцировать изучаемый цитокин.

Результаты испытания препарата приведены в таблице 1.

Введение как Аллоферона-1, так и пептидов I-VII, вызвало индукцию ИЛ-18, которая длилась до 3 суток. Максимальная концентрация ИЛ-18 достигается спустя 30 часов после однократного введения пептидов. Характер индукции - интенсивность и временной диапазон - для пептидов одинаков.

Для всех изученных пептидов зафиксирована индукция интерлейкина-18, уровень которой превышает величину, достигаемую Аллофероном-1. Максимальный уровень интерлейкина-18 через 32 часа (410 пг/мл) был зафиксирован для пептида I. Фоновый уровень в среднем в группе контрольных животных составил 200 пг на мл.

Пример 2. Изучение интерфероногенной активности изучаемых пептидов I-VII

Активность определялась путем введения подкожно изучаемых пептидов однократно в дозе 1 мг на кг веса лабораторных животных. Для эксперимента использовались мыши линии BALB/C, самки, массой 16-22 грамма, возраста 18 недель, содержавшиеся в соответствии с протоколом, изложенным выше в примере 1. Определялся уровень интерферона гамма в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, с использованием специфических антител. Количество интерферона в сыворотке определяли на 3, 6, 12, 16, 24, 32, 40 и 48 час после введения препарата.

Параллельно изучалось «фоновое» количество интерферона гамма, присутствующее в сыворотке исследуемых животных. Для этой цели использовалось 8 мышей в качестве контрольной группы, которые получали подкожную инъекцию физиологического раствора. Среднее значение по контрольной группе на 5% уровне значимости составило 29±8 пг/мл исследуемой сыворотки. В каждой опытной группе также использовались по 8 мышей, которые получали подкожную инъекцию препаратов в дозе 25 мкг с изучаемыми пептидами I-VII, а также Аллофероном-1. Результаты испытания препаратов представлены в таблице 2.

Полученные данные свидетельствуют о том, что изучаемые пептиды I-VII вызывают индукцию интерферона гамма, превышающую уровень индукции Аллоферона-1.

Пример 3. Изучение влияния биологически активных пептидов I-VII на резистентность мышей к вирусу гриппа А

Антивирусное действие биологически активных пептидов I-VII изучали на модели летальной вирусной инфекции мышей вирусом гриппа А. Суспензию вируса вводили интраназально в дозе, соответствующей 10 LD₅₀. Аллоферон-1 и пептиды I-VII в 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида вводили внутрибрюшинно за одни сутки до инокуляции вируса, затем через 1, 2, 4, 6 и 8 дней после инокуляции. Препараты испытывали в дозе 25 мкг. В контроле мышам вводили равный объем растворителя. Критерием эффективности служила выживаемость животных через 10 суток после инфицирования вирусом. Для проведения эксперимента были отобраны половозрелые белые мыши, самцы, весом 20,0-22,0 г, полученные из питомника лабораторных животных и прошедшие необходимый карантин. Содержание мышей осуществлялось по протоколу, изложенному выше в примере 1. В эксперименте были использованы 180 мышей.

Введение Аллоферона-1 и биологически активных пептидов I-VII инфицированным животным вызывало дозозависимый протекторный эффект (Таблица 3). Препараты в дозе 25 мкг вызывали значительное увеличение числа выживших в течение срока наблюдения животных. Эффект данной дозы высокодостоверен.

Таким образом, результаты примера 3 свидетельствуют о том, что биологически активные пептиды I-VII в дозе 25 мкг оказывают выраженное антивирусное действие на мышей, инфицированных вирусом гриппа А, превышающее антивирусное действие Аллоферона-1.

Пример 4. Изучение влияния биологически активных пептидов I-VII на резистентность мышей к вирусу гриппа В

Исследование влияния биологически активных пептидов I-VII на устойчивость мышей к вирусу гриппа В проводилось на 200 мышах. Для проведения эксперимента были отобраны половозрелые белые мыши, самцы, весом 20,0-22,0 г, полученные из питомника лабораторных животных и прошедшие необходимый карантин. Содержание мышей осуществлялось по протоколу, изложенному выше в примере 1. Мышей инфицировали штаммом LEE 1/40 вируса гриппа В, взятым в инфекционной дозе, соответствующих 30 ЛД₅₀. В качестве позитивного контроля использовали специфический антивирусный препарат Рибавирин.

Аллоферон-1 и биологически активные пептиды I-VII вводили внутрибрюшинно в дозе 25 мкг за 1 сутки до инфицирования вирусом, затем через 1, 2, 4, 6 и 8 суток.

Результаты изложены в Таблице 4.

В контроле интраназальное введение вируса вызвало тяжелую пневмонию с высокой летальностью (80%). На этом фоне Рибавирин при высокой инфекционной нагрузке (30 ЛД₅₀) в условиях данного эксперимента оказался малоэффективным. В то же время биологически активные пептиды I-VII оказали выраженное протекторное действие, превышающее антивирусное действие Аллоферона-1.

Таким образом, результаты примера 4 свидетельствуют о том, что биологически активные пептиды I-VII в дозе 25 мкг оказывают выраженное антивирусное действие на мышей, инфицированных вирусом гриппа В, существенно превышающие защитный эффект как Рибавирина, хорошо зарекомендовавшего себя антивирусного средства, а также Аллоферона-1, и могут служить основой для создания новых антивирусных препаратов.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к синтетическим пептидам с иммуностимулирующими свойствами, и может быть использовано в медицине. Синтезирован ряд пептидов, отличающихся по химической структуре от известных биологически активных пептидов Аллоферонов и Аллостатинов. Отличие состоит в том, что в положении 6 структуры His-Gly-Val-Ser-Gly-Х-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly вместо гистидина или триптофана, характерных для этих пептидов, находятся другие аминокислоты алифатического и ароматического рядов, а также их химические модификации. Полученные пептиды используются в составе иммуномодулирующей и противовирусной фармацевтической композиции. Изобретение позволяет получить пептиды, эффективно индуцирующие выработку интерлейкина-18 и интерферона гамма. 2 н.п. ф-лы, 4 табл., 4 пр.

1. Биологически активный пептид
His-Gly-Val-Ser-Gly-Tyr-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly, или
His-Gly-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly, или
His-Gly-Val-Ser-Gly-Arg-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly, или
His-Gly-Val-Ser-Gly-Lys-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly, или
His-Gly-Val-Ser-Gly-Phe-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly, или
His-Gly-Val-Ser-Gly-Phe(p-OMet)-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly, или
His-Gly-Val-Ser-Gly-Phe(p-Cl)-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly,
обладающий повышенной индукцией гамма-интерферона и интерлейкина-18.

2. Иммуномодулирующая и противовирусная фармацевтическая композиция, содержащая один или несколько пептидов по п. 1 или их фармацевтически приемлемых солей в эффективном количестве в сочетании со стандартными вспомогательными веществами.