Способ активации цитотоксических лимфоцитов Российский патент 2021 года по МПК A61K38/10 C07K7/08 A61P35/00 A61P37/02 A61P31/12 

Изобретение относится к области иммунотерапии и может быть использовано для повышения цитотоксической активности NK клеток (естественных киллеров) и Т лимфоцитов в отношении опухолевых и инфицированных вирусами клеток. Приоритетной областью применения изобретения является лечение онкологических и вирусных заболеваний человека и других теплокровных животных.

Известны различные способы активации иммунокомпетентных клеток крови, предназначенные для повышения эффективности иммунотерапии и клеточной терапии онкологических и инфекционных заболеваний [1, 2]. Особое внимание уделяется активации NK клеток - главных эффекторов системы естественного противоопухолевого и противовирусного иммунитета человека и других млекопитающих [3-6]. В частности, известны способы активации цитотоксических NK клеток и Т лимфоцитов с помощью клеточных препаратов, цитокинов и других веществ, стимулирующих переход этих клеток в функционально активное состояние. Так, известны способы активации NK клеток путем их контакта с дендритными клетками [7], препаратом убитых облучением опухолевых клеток [8], генетически модифицированными опухолевыми клетками [9], антителами к CD27 рецептору [10]. Известен способ активации Т лимфоцитов веществами из группы сфинголипидов [11]. Известен также способ одновременной активации NK клеток и цитотоксических Т лимфоцитов, включающий обработку клеток крови комбинацией стимуляторов клеточной пролиферации, противовоспалительных агентов и синтетических пептидов [12].

Известным способом активации Т лимфоцитов и NK клеток является их обработка провоспалительным цитокином интерлейкином-2 (IL-2). Сущность, достоинства и недостатки данного способа детально описаны в литературе [13]. По своей технической сущности он является наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемого изобретения среди известных технических решений, применяемых в настоящее время в клинической практике лечения различных онкологических заболеваний. Общим с заявляемым изобретением признаком является то, что противоопухолевый эффект достигается путем введения в кровь пациента, или место локализации опухоли, или питательную среду для культивирования клеток крови вне организма фармакологически активного вещества, стимулирующего цитотоксическую активность Т лимфоцитов и NK клеток в отношении клеток опухоли. Недостатками известного способа являются высокая токсичность, низкий уровень терапевтической эффективности при применении в режиме монотерапии, высокая стоимость лечения. Высокая токсичность IL2 не позволяет создать и поддерживать терапевтически эффективную концентрацию препарата в организме пациента и создает риск тяжелых побочных эффектов, включая вероятность летального исхода. Применение IL2 в относительно безопасной концентрации обеспечивает лишь временную задержку развития опухоли у части пациентов (порядка 15% при метастазирующем раке или карциноме почки), однако окончательное выздоровление происходит в редких случаях. Разработаны способы применения IL2 в комбинации с другими лекарственными средствами или методами клеточной терапии, которые позволяют повысить долю пациентов, положительно реагирующих на лечение, примерно до 50%, однако и в этих случаях положительный эффект в большинстве случаев носит временный характер. Кроме того, терапевтическая эффективность IL2 ограничена известной особенностью его действия на систему Т лимфоцитов: наряду с желательным эффектом - стимуляцией активности цитотоксических лимфоцитов - IL2 также стимулирует активность регуляторных Т лимфоцитов (T_reg), которые подавляют противоопухолевый иммунный ответ и таким образом ограничивают терапевтическое действие IL2 у онкологических больных. Известным недостатком этого способа является также высокая стоимость лечения, обусловленная большими затратами на производство активного вещества (рекомбинантного IL2), а также необходимость проведения лечения в условиях специализированной клиники. Известное применение IL2 в комбинации с другими препаратами (например, цитокинами или моноклональными антителами) или методами клеточной терапии делает данный способ еще более дорогостоящим и малодоступным. Перечисленные выше и другие известные способы активации цитотоксических лимфоцитов также характеризуются рядом недостатков, включая техническую сложность, высокую стоимость и нежелательные побочные эффекты. Наличие этих недостатков затрудняет применение способов активации NK и Т клеток в клинической практике и делает необходимым продолжение поиска новых технических решений. Заявляемый способ позволяет устранить недостатки, присущие прототипу, путем использования в известном способе усиления противоопухолевой активности цитотоксических лимфоцитов вместо IL2 пептида из группы аллостатинов или его фармацевтически приемлемых солей в концентрации, усиливающей цитотоксическую активность лимфоцитов в отношении трансформированных клеток организма, представляющие собой клетки рака или инфицированные вирусом клетки. Преимущества заявляемого способа состоят в следующем. Аллостатин, в отличие от IL2, практически полностью лишен токсичности для здоровых клеток организма и не препятствует осуществлению функций лимфоцитов даже в концентрации, в 100 000 раз превышающей терапевтически эффективную концентрацию. Кроме того, аллостатин, являясь простым линейным олигопептидом, производится методом химического синтеза, который позволяет резко (на порядки) снизить стоимость получения фармацевтической субстанции по сравнению с рекомбинантными белками, к которым относится IL2. Важным преимуществом заявленного способа является возможность лечения форм рака, при которых IL2 не применяется. В настоящее время терапия IL2 используется главным образом при раке почки и меланоме. Приведенные в заявке результаты исследований показывают, что заявленный способ может найти применение при лечении рака легких, рака шейки матки и ано-генитальной области, миелолейкоза, а также для профилактики онкологических заболеваний вирусной этиологии путем элиминации зараженных вирусом папилломы человека клеток. Кроме того, заявленный способ обеспечивает комплексную перестройку рецепторного аппарата NK клеток и Т лимфоцитов, усиливая экспрессию активационных рецепторов CD25, CD69, NKG2D, CD226 и снижая экспрессию ингибирующих рецепторов KIR2DL3, KIR3DL1, KLRG1. Такая перестройка обеспечивает полноценный переход цитотоксических лимфоцитов в функционально активное состояние и для IL2 не описана. Показано также, что заявленный способ обеспечивает повышение чувствительности цитотоксических лимфоцитов к IL2 и интерлейкину 12 и, следовательно, может применяться в комбинации с этими цитокинами для усиления их противоопухолевого действия. Важным преимуществом заявленного способа является также возможность поддержания популяции NK клеток в функционально активном состоянии в процессе цитотоксической реакции с трансформированными клетками, представляющими собой клетки рака или инфицированные вирусом клетки. В противоположность этому, IL2, наряду с активацией цитотоксических лимфоцитов, вызывает активацию T_reg лимфоцитов, блокирующих реакции противоопухолевого иммунитета и снижающих таким образом эффективность лечения.

В настоящем изобретении предлагается использовать для активации NK клеток и Т лимфоцитов неизвестные ранее свойства пептидов из группы аллостатинов. История создания аллостатинов связана с обнаружением одним из авторов настоящего изобретения аллоферонов - природных пептидов, обладающих противовирусной и противоопухолевой активностью [14, 15]. Аллоферон-1 нашел применение в медицине в качестве противовирусного лекарственного средства. Однако возможности создания на основе аллоферона-1 противоопухолевого лекарственного средства ограничивает то обстоятельство, что аллоферон в зависимости от концентрации может как ингибировать (в области высоких концентраций), так и стимулировать (в области низких концентраций) пролиферацию опухолевых клеток. На следующем этапе были проведены исследования с целью устранения этого недостатка аллоферонов. В результате были разработаны аллостатины - синтетические аналоги аллоферонов с выраженной антипролиферативной активностью, способные подавлять рост опухолевых клеток лимфоидного происхождения [16, 17]. Изучая влияние пептида аллостатин-1, аминокислотная последовательность которого представлена в прилагаемом Перечне последовательностей под номером SEQ ID №1 (далее по тексту аллостатин) на функциональное состояние клеток крови человека, авторы настоящего изобретения обнаружили новое неизвестное ранее свойство аллостатинов - способность усиливать реакции NK клеток и Т лимфоцитов на опухолевые клетки. Основываясь на этом наблюдении, мы предположили, что пептиды, соответствующие структурным формулам аллостатинов [16], могут найти применение в иммунотерапии рака в качестве фармакологических активаторов цитотоксических лимфоцитов. С целью проверки и развития этой гипотезы авторами была проведена серия исследований, результаты которых подтверждают применимость аллостатинов для решения этой важной задачи и обосновывают сущность способов и области их использования в иммунотерапии на примерах 1-14, представленных ниже. Основные результаты этих исследований состоят в следующем:

1) Активация мононуклеаров периферической крови

Установлено, что обработка фракции мононуклеаров периферической крови человека аллостатином приводит к увеличению доли клеток, несущих на своей поверхности маркеры активации CD69 (пример 1) и CD25 (пример 2). Согласно общепринятой в иммунологии интерпретации, это свидетельствует о переходе соответствующей группы лимфоцитов в активное состояние. Важно также отметить, что белок CD25 является составной частью рецептора интерлейкина-2 (ILR2) и его экспрессия составляет необходимое условие чувствительности клетки к этому цитокину. Поскольку IL2 широко используется в иммунотерапии и клеточной терапии рака, повышение чувствительности к нему путем предварительной обработки лимфоцитов аллостатином может быть эффективным способом повышения терапевтической эффективности лекарственных средств на основе IL2.

Кроме того, было изучено влияние обработки фракции мононуклеаров аллостатином на количество клеток, экспрессирующих рецепторы семейства KIR (пример 3). В результате было установлено, что обработка аллостатином резко снижает количество мононуклеаров, несущих на своей поверхности рецепторы KIR2DL3 и KIR3DL1. Эти рецепторы характерны для NK клеток и части Т лимфоцитов и оказывают ингибирующее действие на их цитотоксическую активность. В этих же условиях было показано, что обработка фракции мононуклеаров аллостатином приводит к резкому снижению количества клеток, экспрессирующих рецептор KLRG1, который также относится к числу ингибиторов цитотоксической активности NK и Т лимфоцитов. Известно, что лигандом этого рецептора являются белки из группы кадхеринов, представленные на поверхности многих опухолевых клеток. Связываясь с кадхеринами на поверхности опухолевой клетки, например, клетки рака легкого, KLRG1 блокирует активность цитотоксического лимфоцита. Соответственно, снижение экспрессии KLRG1 под влиянием аллостатина может являться способом специфической активации цитотоксических лимфоцитов в отношении опухолей этого типа.

Таким образом, обработка аллостатином вызывает два типа изменений во фракции мононуклеаров периферической крови - увеличение количества клеток, экспрессирующих активационные рецепторы CD25 и CD69, и снижение количества клеток, снабженных ингибирующими рецепторами KIR2DL3, KIR3DL1 и KLRG1. Тот и другой тип изменений и особенно их совокупность свидетельствуют о переходе клеток в активное состояние. Следует также отметить, что все пять рецепторов характерны для NK и Т лимфоцитов и играют важную роль в регуляции их активности.

2) Активация NK клеток

Далее была проведена серия экспериментов с популяцией NK клеток, выделенных из фракции мононуклеаров периферической крови. В этих экспериментах NK клетки инкубировали с клетками-мишенями (клетки миелолейкоза человека линии K562) в присутствии или отсутствии аллостатина и замеряли количество клеток, экспрессирующих активационные рецепторы, которые, как известно, необходимы для осуществления функций NK клеток. В серии экспериментов, описанных в примерах 4-6, показано, что аллостатин усиливает экспрессию белков CD25, CD226, NKG2D, CD244 и NKp80 на поверхности NK клеток. CD25 (ILR2) обеспечивает чувствительность NK клеток к активирующим сигналам IL2. Белок межклеточной адгезии CD226 необходим NK клетке для образования контакта с клеткой-мишенью и продукции цитокинов. NKG2D является ключевым активационным рецептором NK клеток, распознающим белки семейства MICA, MICB и другие сигнальные молекулы трансформированных и поврежденных клеток. NKp80 и CD244 также входят в пул активационных рецепторов NK клеток. Таким образом, обработка NK клеток аллостатином приводит к усиленной экспрессии активационных рецепторов, которая служит необходимым условием распознавания, атаки и уничтожения ими трансформированных клеток-мишеней.

Далее следовало установить, достигается ли при этом конечная цель - усиление цитотоксической активности в отношении опухолевых клеток. Для получения ответа на этот вопрос была проведена еще одна серия экспериментов, в которых активированные аллостатином NK клетки инкубировали с опухолевыми клетками различного происхождения: рака легкого, шейки матки и миелолейкоза (примеры 7-9). В примере 7 проанализировано методом проточной цитометрии влияние аллостатина на цитотоксическую активность NK клеток в отношении трансформированных вирусом папилломы человека (ВПЧ) клеток суспензионной культуры рака шейки матки линии HeLa. В контроле доля летально поврежденных (окрашиваемых пропидиум йодидом) опухолевых клеток составляла около 15%. При инкубации в присутствии аллостатина доля поврежденных опухолевых клеток HeLa возрастала до 60% (Р<0.001, Z-тест). Повторный эксперимент дал аналогичный результат.

В опытах с адгезивной культурой клеток рака легкого А549 (пример 8) цитотоксическую активность NK клеток анализировали спектрофотометрически, поскольку адгезивный характер этой культуры не позволил использовать метод проточной цитометрии. В этих условиях также отмечено статистически значимое снижение выживаемости опухолевых клеток под влиянием аллостатина (Р=0.008). При этом микроскопический анализ состояния монослоя опухолевых клеток показал, что монослой после контакта с активированными аллостатином NK клетками, в отличие от контроля с неактивированными NK клетками, был полностью разрушен и содержал лишь остатки погибших опухолевых клеток.

Наконец, в опыте с суспензионной культурой клеток миелолейкоза К562 (пример 9), опухолевые клетки окрашивали смесью AnnexinV_PE/PI и с помощью проточного цитофлуориметра подсчитывали процент поврежденных клеток (с фенотипами AnnexinV+/PI- AnnexinV+/PI+, AnnexinV-/PI+). Такой способ анализа показал, что активация NK клеток аллостатином увеличивает количество опухолевых клеток-мишеней с повреждениями различного уровня (от индукции апоптоза до гибели) с 13.5 до 73%.

Таким образом, как показали результаты исследований, обработка аллостатином обеспечивает переход NK клеток периферической крови в активное состояние, необходимое и достаточное для элиминации раковых клеток различного происхождения.

3. Влияние аллостатина на продукцию IFNγ

Помимо прямого действия на функциональное состояние цитотоксических лимфоцитов (экспрессию активирующих и ингибирующих рецепторов, цитотоксическую активность), авторами было изучено влияние аллостатина на продукцию интерферона-гамма (IFNγ). Как известно, IFNγ синтезируют NK, NKT и Т-лимфоциты (CD4 Т-хелперы и CD8 цитотоксические лимфоциты). Т-лимфоциты продуцируют IFNγ в ответ на стимуляцию специфическим антигеном, а его продукция NK и NKT лимфоцитами не зависит от антигенной стимуляции. В примере 10 рассмотрено влияние аллостатина на количество Т-лимфоцитов, продуцирующих IFNγ в условиях стимуляции специфическим для Т клеток активатором Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28. В этих условиях обработка аллостатином более чем вдвое увеличивала долю продуцирующих IFNγ Т-лимфоцитов. В примере 11 рассмотрено влияние аллостатина на количество NK клеток, продуцирующих IFNγ в ответ на стимуляцию интерлейкином 12 (IL-12), специфическим активатором продукции IFNγ. При обработке IL-12 продукция наблюдалась в 26% NK клеток, в то время как комбинированное действие IL-12 и аллостатина увеличивало этот показатель до 60% (Р<0.001).

Таким образом, спектр фармакологической активности аллостатина включает усиление продукции IFNy NK и Т-лимфоцитами в ответ на специфические для них активирующие сигналы (IL-12 для NK клеток и антиген для Т-лимфоцитов). Как известно, IFNγ считается одной из перспективных фармакологических мишеней для лечения рака и вирусных инфекций [18]. Соответственно, обнаруженное свойство аллостатина позволяет использовать его в качестве адъюванта IFNγ и лекарственных средств на его основе. IL-12 также относится к числу перспективных средств иммунотерапии онкологических и вирусных заболеваний в качестве активатора продукции IFNγ. Полученные результаты указывают на возможность использования аллостатина в качестве адъюванта (усилителя действия) лекарственных препаратов на основе IL-12.

4. Влияние аллостатина на изменения функционального состояния NK клеток в процессе цитотоксической реакции с опухолевыми клетками

Как показали исследования, результаты которых приведены в примере 6, контакт с опухолевыми клетками приводит к снижению доли NK клеток фенотипа NKG2D+с 72 до 26%, фенотипа CD244+/NKp80+с 93 до 35%. Следовательно, контакт с опухолевыми клетками в условиях данного эксперимента приводил к резкому ограничению доли функционально активных NK клеток. Блокирование активности цитотоксических лимфоцитов в результате контакта с клетками опухоли, как известно, составляет один из важных механизмов прогрессирования рака и снижения эффективности его иммунотерапии. При обработке аллостатином доля NK клеток фенотипа NKG2D+ составляла 40%, фенотипа CD244+/NKp80+ 51%, превышая показатели необработанных клеток примерно в 1.5 раза. Отличия между обработанными и необработанными аллостатином NK клетками были высокодостоверны (Р<0.001). Таким образом, действие аллостатина обеспечило сохранение функциональной активности значительной части NK клеток после контакта с опухолевыми клетками. При лечении опухолей, для которых характерно подавление активности инфильтрующих опухоль NK клеток, интратуморальное введение аллостатина может оказаться особенно эффективным способом иммунотерапии.

5. Влияние аллостатина на клеточный иммунный ответ in vivo.

Для изучения влияния аллостатина на Т-клеточный иммунный ответ использована реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у мышей в соответствии с рекомендациями по изучению новых лекарственных средств [19]. Результаты исследования приведены в примере 12. В качестве антигена использовали клетки эритроидной лейкемии человека К562, инактивированные летальной дозой облучения. Аллостатин вводили одновременно с сенсибилизирующей или разрешающей дозами антигена. Это позволяет проанализировать влияние препарата на различные стадии клеточного иммунного ответа: в первом случае - на процесс образования клона антиген-специфических Т-лимфоцитов, во втором - на способность этих лимфоцитов при встрече с антигеном продуцировать провоспалительные цитокины. Иммунизация опухолевыми клетками индуцировала у мышей выраженную реакцию ГЗТ. Эти данные свидетельствуют о формировании клона Т-лимфоцитов, специфически распознающего антигены клеток К562. Введение аллостатина после разрешающей дозы антигена достоверно усиливало реакцию ГЗТ. Достоверного влияния на показатель ГЗТ при введении аллостатина после сенсибилизирующей дозы отмечено не было. В соответствии с общепринятой в иммунологии интерпретацией, полученные данные указывают на усиление способности Т-лимфоцитов продуцировать провоспалительные цитокины под влиянием аллостатина и отсутствие достоверного влияния на формирование клона К562 позитивных Т-клеток.

Наряду с влиянием аллостатина на реакцию ГЗТ, была изучена неспецифическая реакция на однократное введение опухолевого антигена при одновременном введении животным аллостатина. Как известно, ключевую роль в этой реакции играют NK клетки при участии некоторых субпопуляций Т клеток (NKT лимфоциты и др.), и макрофагов. Результаты этого исследования приведены в примере 13. Методика постановки эксперимента в целом соответствовала описанной в примере 12 с тем отличием, что антиген вводился животным однократно, а реакция воспаления анализировалась в течение суток после введения антигена. Следовательно, речь о формировании специфического иммунитета в данном случае не идет, а наблюдаемые эффекты относятся к области естественного (врожденного) иммунитета. Однократное введение опухолевого антигена в этих условиях не вызвало у животных заметной воспалительной реакции. В том случае, если введение антигена в область левой задней лапы сопровождалось подкожной инъекцией аллостатина в область спины, у всех животных отмечалась воспалительная реакция в этой лапе, в то время как правая лапа, в которую вводился только растворитель, оставалась интактной. Таким образом, аллостатин достоверно усиливал неспецифическое распознавание опухолевого антигена, который никогда ранее данному организму не предъявлялся и без дополнительной стимуляции оставался нераспознанным. Этот факт, в соответствии с общепринятыми в иммунологии представлениями, подтверждает эффективность активации NK клеток (и, возможно, NKT клеток, макрофагов) аллостатином в условиях in vivo.

6. Анализ возможного цитотоксического действия аллостатина на клетки человека

Цитотоксическое действие аллостатина было изучено на примере культуры фибробластов человека (пример 14). Фибробласты культивировали в течение 24 часов в присутствии аллостатина в концентрациях от 1 до 1000 мг/Л питательной среды. Ни в одном из вариантов опытов не было отмечено увеличения количества погибших клеток. Терапевтически эффективная концентрация аллостатина, необходимая и достаточная для активации NK клеток (примеры 7-8) составляет 0.01 мг/Л питательной среды. Таким образом, превышение терапевтически эффективной концентрации аллостатина в 100000 раз не оказывало прямого цитотоксического действия на культуру фибробластов человека. Следует также отметить, что концентрация аллостатина 10 мг/Л, в 1000 раз превышающая указанную терапевтически эффективную, не оказывала прямого токсического действия на мононуклеары периферической крови и не препятствовала их функциональной активности (пример 10). Имеющиеся в настоящее время экспериментальные данные позволяют считать аллостатин продуктом, практически лишенным прямой цитотоксической активности и, соответственно, характеризуемым высоким уровнем безопасности.

Рассмотренные выше результаты исследований обосновывают три варианта использования аллостатина в иммунотерапии и клеточной терапии рака и вирусных инфекций:

1) Путем введения аллостатина в кровь пациента, страдающего онкологическим заболеванием или вирусной инфекцией, с целью повышения активности лимфоцитов периферической крови, направленной на элиминацию патологически измененных клеток организма (клеток опухоли, инфицированных вирусом клеток). При этом желаемый эффект достигается за счет прямой активации цитотоксического действия NK клеток, а также путем увеличения количества NK и Т лимфоцитов, продуцирующих IFNγ и повышения их чувствительности к активирующим сигналам IL-2 и IL-12.

2) Путем интратуморального введения аллостатина с целью поддержания в активном состоянии инфилырующих опухоль (резидентных) NK и Т лимфоцитов, находящихся в непосредственном контакте с раковыми клетками.

3) Путем введения аллостатина в питательную среду, используемую для культивирования клеток крови вне организма, с целью повышения функциональной активности лимфоцитов, применяемых в клеточной терапии рака. Концентрацию аллостатина в культуральной среде подбирают, начиная с концентрации 10 микрограммов/Л и изменяя ее в сторону увеличения или уменьшения в зависимости от условий и целей культивирования.

Согласно приведенным примерам осуществления изобретения, активация NK и Т лимфоцитов аллостатином может быть использована при лечении и профилактике онкологических заболеваний различной этиологии. Одной из распространенных форм такого заболевания является рак шейки матки, вызываемый заражением клеток эпителия шейки матки онкогенным штаммом вируса папилломы человека (ВПЧ). Демонстрацией перспективности применения аллостатина для лечения рака шейки матки служат эксперименты с опухолевыми клетками линии HeLa, трансформированными высокоонкогенным штаммом ВПЧ (пример 7). Понятно также, что иммунотерапия аллостатином может проводиться на ранних, дораковых стадиях развития заболевания с целью элиминации зараженных ВПЧ клеток и предотвращения их трансформации в злокачественные клетки. По литературным данным, инфицирование ВПЧ, помимо рака шейки матки, ассоциировано с другими формами рака аногенитальной области и носоглотки. При таких формах рака активация NK и/или Т лимфоцитов аллостатином также представляется перспективным способом иммунотерапии.

Другой перспективной областью применения аллостатина является иммунотерапия рака легких, наиболее распространенной и трудноизлечимой формы онкологических заболеваний. На примере клеток рака легких линии А549 (пример 8) установлено, что обработка аллостатином увеличивает способность NK клеток уничтожать опухолевые клетки этого типа. Анализ известных биологических и иммунологических особенностей рака легких подтверждает перспективность такого способа использования аллостатина в связи со следующим:

Злокачественные опухоли легких содержат большое количество инфильтрующих опухоль лимфоцитов (TIL, tumor infiltrating lymphocytes), включая NK клетки. TIL рака легких, как правило, обладают низкой литической активностью и это служит ключевым механизмом опухолевого роста [20]. Стимуляция цитотоксической активности TIL, включая NK клетки, поступающие в опухоль из периферической крови, рассматривается как перспективный подход к иммунотерапии рака легких [21].

Опухолевые клетки большинства больных раком легких, в отличие от нормальных клеток легкого, инфицированы ВПЧ или другими онкогенными вирусами [22, 23]. Как показано в примере 7, стимуляция аллостатином увеличивает способность NK клеток лизировать трансформированные ВПЧ раковые клетки.

Кроме NK клеток, в элиминации клеток рака легкого важную роль играют Т лимфоциты [24], активация которых под влиянием аллостатина показана в примерах (пример 10 и пример 12).

В иммунотерапии и клеточной терапии рака легкого известно применение IL-2 с целью стимуляции цитотоксической активности NK клеток [24]. Как показано в примере 4, обработка аллостатином стимулирует экспрессию на поверхности NK клеток белка CD25, который является рецептором IL-2 и обеспечивает чувствительность клеток к этому цитокину. Следовательно, применение аллостатина может повысить чувствительность NK клеток к IL-2, применяемому в иммунотерапии и клеточной терапии рака легкого.

Как известно из анализа уровня техники, иммунотерапия признана одним из перспективных методов лечения рака легкого [24]. Однако анализ результатов клинических исследований показывает, что эффективность разработанных методов (за исключением чек-пойнт ингибиторов) остается крайне ограниченной [25]. Таким образом, в настоящее время возможности иммунотерапии рака легкого связаны главным образом с использованием чек-пойнт ингибиторов. Механизм действия этих препаратов ограничивает их применение лечением опухолей, продуцирующих белок PDL. Такие опухоли встречаются примерно у 20% больных раком легкого [26]. Для иммунотерапии оставшихся 80% требуются другие подходы. Предлагаемый авторами вариант способа лечения аллостатином не связан с блокированием белка PDL и может быть особенно полезен для больных с PDL-отрицательными формами рака легкого, которые не поддаются лечению чек-пойнт ингибиторами.

Результаты исследований, приведенные в примерах 1-14, наглядно показывают возможность конкретной реализации заявленного способа и демонстрируют в реальных экспериментальных условиях, что стимуляция NK клеток и Т лимфоцитов аллостатином представляет новый и перспективный вариант иммунотерапии и иммунопрофилактики онкологических заболеваний.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Влияние аллостатина на динамику экспрессии мононуклеарами периферической крови маркера активации CD69 в отсутствие клеток-мишеней.

Химическая структура и метод синтеза аллостатина-1 (SEQ ID №1), использованного в этом и последующих примерах, соответствуют описанным в патенте RU 2267496 [16], одним из авторов которого является автор заявляемого изобретения.

Мононуклеары (РВМС) выделяли из венозной крови с помощью вакутайнера, содержащего фиколл (BD Vacutainer СРТ, 362780) и инкубировали в среде RPMI1640, содержащей 5% инактивированной аутологичной сыворотки и антибиотик (Sigma-Aldrich А5955 Antibiotic Antimycotic Solution 100×). Через 3 часа в культуральную среду добавляли аллостатин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Часть мононуклеаров извлекали и окрашивали антителами к CD69 через 0, 6, 12 и 24 часа. Подсчет числа окрашенных клеток производили с помощью цитометра BD FACS Aria III. Через 3 часа после введения аллостатина (6 часов после выделения из крови) в популяции мононуклеаров значительно (Р<0.001) возрастала доля клеток, эксперссирующих маркер ранней активации CD69. Влияние аллостатина на экспрессию активационного рецептора CD69 мононуклеарами периферической крови приведено в Таблице 1. Эта реакция носила обратимый характер и примерно через 12-24 часа доля активированных клеток возвращалась к исходному уровню. В графической форме результаты данного эксперимента представлены на Фиг. 1.

Таким образом, обработка аллостатином вызывает переход в активное состояние части мононуклеаров периферической крови. Эта реакция носит обратимый характер и в отсутствие дополнительных стимулов количество активированных клеток возвращается к норме в течение суток после обработки аллостатином.

Пример 2. Влияние аллостатина на экспрессию активационного рецептора CD25 мононуклеарами периферической крови человека.

Фракция мононуклеаров была получена из венозной крови донора с помощью способа, описанного в примере 1. В опыте к мононуклеарам добавляли аллостатин в конечной концентрации 0.1 нг/мл. Через 24 часа клетки собирали, окрашивали антителами к антигену CD25 и анализировали на проточном цитофлуориметре. Как видно из Таблицы 2 и Фиг. 2, обработка мононуклеаров аллостатином вызвала более чем 6-кратное увеличение количества CD25-положительных мононуклеаров по сравнению с контролем (Р<0.001). Эти данные свидетельствуют о переходе значительной части мононуклеаров периферической крови в функционально активное состояние под влиянием аллостатина. Поскольку CD25 выполняет функцию рецептора IL-2, эти же данные указывают на приобретение способности мононуклеаров реагировать на сигналы этого ключевого цитокина.

Пример 3. Влияние аллостатина на экспрессию цитотоксическими лимфоцитами периферической крови ингибирующих рецепторов семейства KIR в процессе цитотоксической реакции с клетками К562

Мононуклеары получали из венозной крови способом, описанным в примере 1. Затем мононуклеары смешивали с клетками линии К562 в соотношении Е:Т - 10:1. Полученную смесь разделяли на две равные по объему части и инкубировали в лунках 96-луночного планшета. В одну из них предварительно вносили аллостатин в конечной концентрации 1 мкг/мл. Через 24 часа клетки обрабатывали смесью моноклональных антител к KIR-рецепторам и производили подсчет числа окрашенных клеток с помощью питометра BD FACS Aria III.

В результате было отмечено снижение уровня экспрессии рецепторов KIR2DL3 (таблица 3 и рисунок 3), как это видно из Таблицы 3 и Фиг. 3, на которых представлено влияние аллостатина на экспрессию ингибирующего рецептора KIR2DL3 мононуклеарами периферической крови, и KIR3DL1, как это видно из Таблицы 4 и Фиг. 4, на которых представлено влияние аллостатина на экспрессию ингибирующего рецептора KIR3DL1 мононуклеарами периферической крови. Эти рецепторы характерны для NK клеток и небольшой части Т клеток и выполняют функцию ингибиторов их цитотоксической активности в отношении клеток, несущих на своей поверхности белки MHCI. В контроле около 9% и 11% мононуклеаров экспрессировали KIR2DL3 и KIR3DL1, соответственно. Поскольку эти величины примерно соответствуют суммарной доле во фракции мононуклеаров NK и Т клеток, несущих в состоянии покоя KIR рецепторы, можно предположить, что в контрольном варианте опыта большинство клеток этого типа находилось в неактивном состоянии и не могло осуществлять цитотоксическую реакцию в отношении MHCI-положительных клеток-мишеней. Обработка аллостатином снижала количество таких клеток (Р<0.001), что свидетельствует об их переходе в активное состояние. В частности, такое изменение фенотипа повышает цитотоксическую активность NK и Т клеток в отношении мишеней, защищенных белками главного комплекса гистосовместимости. В этой же серии опытов обнаружено снижение экспрессии ингибирующего рецептора KLRG1. На Фиг. 5 показано влияние аллостатина на экспрессию ингибирующего рецептора KLRG1 мононуклеарами периферической крови. Лигандами этого рецептора служат белки семейства кадхеринов, препятствующие атаке несущих эти маркеры клеток (например, опухолевых клеток эпителиального происхождения).

Таким образом, стимуляция мононуклеаров аллостатином, наряду с усилением экспрессии активационных рецепторов CD25 и CD69, обеспечивает снижение экспрессии ингибирующих рецепторов KIR и KLRG1.

Пример 4. Влияние аллостатина на уровень экспрессии NK клетками маркера активации CD25 в процессе цитотоксической реакции с клетками К562.

В этом и последующих примерах 5-9 и 11 для изучения влияния аллостатина использовали очищенную популяцию NK клеток, выделенную из фракции мононуклеаров периферической крови. NK клетки фенотипа CD3-/CD16+/CD56+ выделяли из фракции мононуклеаров периферической крови методом магнитной сепарации (ThermoFisher 11349D Dynabeads™ Untouched™ Human NK Cells Kit) согласно протоколу, рекомендуемому производителем. Путем истощения нецелевых фракций концентрацию NK клеток доводили до >90%. Цитофлуориметрический анализ показал, что чистота выделенной популяции NK клеток составляла в этом опыте 99%. Выделенные NK клетки инкубировали с клетками линии К562 в присутствии аллостатина (1 мкг/мл) и без него (контроль) при соотношении эффектор : мишень 10:1. Через 24 часа клетки окрашивали моноклональными антителами к CD25 и производили подсчет CD25-положительных клеток в лимфоцитарном гейте. Исходно 29,2% NK клеток экспрессировали маркер CD25 После инкубации с клетками-мишенями К562 доля CD25+NK в контроле возросла до 42,2%, как это видно из Таблицы 5 и иллюстрируется на Фиг. 6. Обработка NK клеток аллостатином увеличивала процент активированных клеток до 48,9% (Р<0.001). При этом значение десятичного логарифма Log10 геометрических средних значений флюоресценции для активированных клеток (показатель Mean) в контрольном варианте было равно 342, а в варианте с аллостатином - 523 (Фиг. 6). То есть обработанные аллостатином NK клетки после активации на 53% интенсивней экспрессировали маркер CD25 по сравнению с аналогичными контрольными клетками. Таким образом, контакт NK клеток с опухолевыми клетками-мишенями К562 приводит к увеличению количества CD25-положительных NK клеток и плотности расположения белка CD25 на их поверхности. На этом фоне обработка аллостатином вызывает дополнительное увеличение количества CD25-положительных NK клеток и среднего уровня экспрессии CD25.

Пример 5. Усиление экспрессии маркеров CD244 и CD226 NK клетками под влиянием аллостатина в процессе цитотоксической реакции с клетками К562

Способ получения очищенной популяции NK клеток и постановки эксперимента соответствовали описанным в примере 4 способам. Клетки окрашивали смесью моноклональных антител к маркерам CD226 и CD244. В Таблице 6 и на Фиг. 7 представлено влияние аллостатина на экспрессию NK клетками маркеров активации CD244 и CD226 в процессе цитотоксической реакции с клетками К562 в виде конкретных данных по количеству NK клеток фенотипа CD226+/CD244+ в контроле и при обработке аллостатином. Обработка аллостатином более чем в три раза увеличила количество NK клеток, одновременно экспрессирующих оба маркера активации.

Пример 6. Изменение экспрессии маркеров CD25, NKG2D, CD244 и NKp80 под влиянием аллостатина в процессе цитотоксической реакции NK клеток с клетками К562 Для получения обогащенной фракции интактных NK клеток использовался способ негативной магнитной сепарации, описанный в примере 4. Полученные клетки переводили в среду RPMI-1640 (с добавлением 5% инактивированной аутологичной сыворотки и антибиотиков) и разделяли на три группы. Первая группа инкубировалась без клеток-мишеней и служила контролем функционального состояния NK клеток. Две другие группы культивировались с клетками линии К562 при соотношении Е:Т - 1:10. В одну из них также добавляли аллостатин в конечной концентрации - 1 мкг/мл. Через 18 часов все варианты окрашивались смесью моноклональных антител к маркерам NKG2D, CD244, NKp80, CD25. В Таблице 7 представлены результаты эксперимента по изменению экспрессии NK клетками рецепторов CD25, NKG2D, CD244 и NKp80 под влиянием аллостатина в процессе цитотоксической реакции с клетками опухоли К562. Графически изменение экспрессии рецепторов под влиянием аллостатина и контакта с опухолевыми клетками представлено на Фиг. 8 (CD25 и NKG2D) и Фиг. 9 (CD244 и NKp80).

Судя по частоте встречаемости маркера активации в контроле, подавляющее большинство NK клеток находилось в неактивном состоянии. Инкубация с клетками опухоли не вызывала увеличения числа CD25-положительных NK клеток. Однако комбинация аллостатина и опухолевых клеток обеспечивала резкое статистически значимое (Р<0.001) увеличение числа активированных NK клеток по сравнению с контролем и контактом с опухолевыми клетками в отсутствие аллостатина. Ранее в примере 2 было показано, что усиление экспрессии CD25 мононуклеарами под влиянием аллостатина не требует контакта с опухолевыми клетками. Суммируя данные этих двух примеров, можно заключить, что механизм действия аллостатина на экспрессию CD25 NK и, возможно, Т лимфоцитами не связан с реакцией на опухолевые антигены и может осуществляться в отсутствии контакта с опухолевыми клетками.

В отличие от CD25, NKG2D конститутивно экспрессируется большинством неактивированных NK клеток. Контакт с опухолевыми клетками приводит к резкому снижению экспрессии этих рецепторов. Этот эффект хорошо известен в литературе по онкоиммунологии и служит одним из важных механизмов подавления противоопухолевого иммунитета клетками опухоли. Обработка аллостатином снижает ингибирующее действие опухолевых клеток на экспрессию NKG2D и сохраняет таким образом противоопухолевую активность NK клеток. Аналогичным образом, комплекс NKp80/CD244 экспрессируется большинством интактных NK клеток, но его экспрессия резко подавляется при контакте с опухолевыми клетками. Поскольку данный комплекс также необходим для осуществления NK клетками цитотоксической реакции, это, в сочетании с подавлением экспрессии NKG2D, неизбежно приводит к блокированию противоопухолевого иммунитета. Обработка аллостатином контактирующих с опухолевыми клетками NK лимфоцитов обеспечивает повышение (или сохранение) ими экспрессии NKp80/CD244 и таким образом препятствует подавлению их цитотоксической активности опухолевыми клетками.

Пример 7. Влияние аллостатина на цитотоксическую активность NK клеток в отношении трансформированных ВПЧ клеток рака шейки матки линии HeLa.

В качестве клеток-мишеней в этих опытах использовали клетки рака шейки матки линии HeLa, содержащие геномы ВПЧ онкогенных штаммов 16 и 18 из коллекции клеточных культур ЦИН РАН [Российская коллекция клеточных культур позвоночных (РККК П) ИНЦ РАН]. Интактные NK клетки фенотипа CD3-/CD16+/CD56+ получали из мононуклеаров периферической крови человека путем истощения нецелевых фракций лейкоцитов способом негативной магнитной сепарации, как указано в примере 4.

Полученную фракцию NK клеток инкубировали с клетками HeLa в течение 18 часов при температуре 37°С и соотношении эффектор : мишень 1:10 в отсутствии (контроль) и присутствии (10 нг/мл) аллостатина. Затем клетки окрашивались красителем пропидий иодидом (PI). Количество поврежденных (PI положительных) клеток HeLa подсчитывали способом проточной цитофлуориметрии на цитофлюориметре BD FACS Aria III. Результаты эксперимента демонстрируют резкое увеличение количества поврежденных NK клетками клеток HeLa в присутствии аллостатина (Таблица 8 и Фиг. 10). Эти результаты служат прямым доказательством того, что аллостатин эффективно стимулирует цитотоксическую активность NK клеток в отношении трансформированных ВПЧ клеток рака шейки матки.

Пример 8. Влияние аллостатина на цитотоксическую активность NK клеток в отношении клеток рака легкого линии А549.

Интактные NK-клетки, получали способом, описанным в примере 4. Клетки линии А549 выращивали в питательной среде DMEM/F12 (1:1), с L-глутамином, с добавлением антибиотиков и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (SV30160.03, HyClone). Затем клетки линии А549 переводили в суспензию, смешивали с NK-клетками в соотношении Е:Т - 1:10 и инкубировали при 36°С в присутствии аллостатина (10 нг/мл) и без него. В контроле клетки опухоли инкубировали в тех же условиях без добавления NK клеток и аллостатина. Через 18 часов надосадок с лейкоцитами удаляли, а монослой клеток А549 промывали и окрашивали Cell Counting Kit (96992 Sigma, USA) способом, рекомендуемым производителем. Через 2 часа производили спектрофотометрическое измерение результатов. Каждый вариант опыта был повторен трижды.

Результаты эксперимента представлены в Таблице 9 в виде абсолютной величины оптической плотности OD и нормированного показателя OD (абсолютный показатель OD в опытном варианте поделенный на показатель OD в параллельном контрольном варианте, в %). Как видно из данных Таблицы, NK клетки проявляли цитотоксическую активность, вызывая снижение жизнеспособности опухолевых клеток по сравнению с контролем. При этом обработанные аллостатином NK клетки демонстрировали более высокий уровень цитотоксической активности по сравнению с необработанными клетками (Р=0.008, ANOVA).

Таким образом, NK клетки периферической крови в условиях данного эксперимента проявили цитотоксическую активность в отношении клеток рака легкого. Стимуляция аллостатином вызвала достоверное усиление цитотоксической активности NK клеток.

В другой серии экспериментов цитотоксическое действие активированных и неактивированных аллостатином мононуклеаров на клетки рака легких А549 было исследовано способом прямого микроскопического наблюдения. Как видно из Фиг. 11, интактные клетки А549 образуют монослой клеток полигональной формы нормальной для клеток эпителиального происхождения. Добавление к монослою А549 иммуноцитов (мононуклеаров крови) и инкубация в течение 18 часов не приводили к видимому повреждению опухолевых клеток. Добавление к монослою тех же иммуноцитов в присутствии аллостатина приводило к практически полному разрушению опухолевых клеток. На препарате можно наблюдать только мертвые остатки опухолевых клеток и живые иммуноциты. Таким образом, стимуляция аллостатином вызвала массовый переход мононуклеаров периферической крови в активное состояние. В состав мононуклеаров входят, главным образом, цитотоксические клетки двух типов: NK клетки и Т-лимфоциты. Поскольку Т-лимфоциты для проявления цитотоксической активности требуют предварительного контакта с соответствующим антигеном, исключенного в условиях данного эксперимента, наиболее вероятным механизмом активации является действие аллостатина на распознавание и элиминацию опухолевых клеток NK клетками. Таким образом, эти и приведенные выше результаты исследований служат достоверным подтверждением возможности использования аллостатина в иммунотерапии рака легкого путем активации NK-клеточного звена противоопухолевого иммунитета.

Пример 9. Влияние аллостатина на цитотоксическую активность NK клеток в отношении клеток миелолейкоза линии К562

Интактные NK-клетки, полученные способом, описанным в примере 4, инкубировали с клетками линии К562 в присутствии аллостатина (1 мкг/мл) и без него при соотношении эффектор : мишень 10:1. Через 18 часов клетки окрашивали смесью AnnexinV_PE/PI (88-8102-72 eBioscience) и с помощью цитометра подсчитывали процент апоптотических клеток (с фенотипами AnnexinV+/PI- AnnexinV+/PI+, AnnexinV-/PI+). Результаты представлены на Фиг. 12. В контрольном варианте (NK+К562) доля поврежденных клеток составила 13.5%. В варианте с аллостатином (NK+К562+AS) доля поврежденных клеток превысила 75%. Таким образом, аллостатин является высокоэффективным стимулятором цитотоксической активности NK клеток в отношении опухолевых клеток этого типа. Клетки К562 известны высокой чувствительностью к цитотоксическому действию NK клеток, обусловленной низкой плотностью белков главного комплекса гистосовместимости на их поверхности. В этих условиях стимуляция NK клеток аллостатином оказывается особенно эффективной. На этом основании можно заключить, что свойства аллостатина могут быть особенно полезными при лечении опухолей данного типа.

Пример 10. Влияние аллостатина на продукцию цитокинов активированными Т-лимфоцитами

Мононуклеары (РВМС) выделяли из венозной крови с помощью способа, описанного в примере 1. В опытных группах поликлональную активацию Т-лимфоцитов производили при помощи магнитных частиц (Thermofisher 11132D, Dynabeads™ Human Т-Activator CD3/CD28) методом, рекомендованным производителем. Для оценки влияния аллостатина в соответствующем варианте опыта перед активацией в среду вносили пептид в конечной концентрации - 10 мкг/мл. Через 4 часа активирующие частицы удаляли и добавляли в среду брефендин (BD 555029, Golgi Plug™). Еще через 12 часов клетки отмывали и производили иммуноцитохимическое окрашивание на присутствие в клетках цитокинов согласно протоколу BD Immunofluorescent Staining of Intracellular Cytokines for Flow Cytometric Analysis (https://www.bdbiosciences.com/us/resources/s/cytokinesfca). Дополнительно клетки окрашивали антителами к CD69. Подсчет клеток, продуцирующих IL-2 и IFNγ, проводили на цитометре BD FACS Aria III.

Уровень активации Т-клеток магнитными частицами оценивали по доле клеток, экспрессирующих маркер ранней активации CD69 (Таблица 10). Данные по частоте встречаемости CD69-положительных Т-клеток показывают, что обработка Т-активатором привела к резкому усилению экспрессии маркера ранней активации CD69 по сравнению с контролем и, следовательно, к переходу Т-клеток в активное состояние. При этом в варианте Т-активатор+аллостатин наблюдалось небольшое, но статистически значимое (Р<0.001) увеличение количества CD69+ по сравнению с обработкой только Т-активатором. Обработка Т-активатором также привела к статистически значимому (Р<0.001) увеличению доли клеток, продуцирующих IL-2 и IFNy. При этом в варианте Т-активатор+аллостатин количество продуцирующих IFNγ клеток почти в три раза превышало уровень в варианте с Т-активатором (Р<0.001) и в 12 раз уровень контроля. На уровень продукции IL-2 в условиях данного эксперимента аллостатин существенного влияния не оказал.

Таким образом, стимуляция аллостатином избирательно усиливает продукцию IFNγ активированными Т-лимфоцитами.

Пример 11. Влияние аллостатина на продукцию IFNγ NK клетками, активированными IL-12.

Обогащенную популяцию интактных NK-клеток получали способом, описанным в примере 4. Далее клетки инкубировали в среде RPMI, с добавлением антибиотика и инактивированной аутологичной сыворотки (5%). В среду также добавляли рекомбинантный IL-12 (р70) человека (Biolegend, 573002) в конечной концентрации 1 нг/мл. Часть клеток инкубировали в тех же условиях в присутствии аллостатина (10 нг/мл). Через 6 часов к клеткам добавляли блокатор везикулярного транспорта - монензин (GolgiPlug™, 555029, BD, USA), а спустя еще 12 часов их фиксировали 20 минут на льду раствором BD Fixation/Permeabilization (554714 BD, USA). Затем обрабатывали содержащим сапонин раствором (PermWash, 554723 BD, USA) и окрашивали антителами к IFNγ. Подсчет числа клеток, продуцирующих IFNγ, проводили с помощью цитометра BD FACS Aria III. Результаты эксперимента представлены в Таблице 11. Среди обработанных IL12 NK клеток IFNγ обнаружен в цитоплазме 25.6% клеток. Дополнительная обработка аллостатином увеличила долю IFNγ-позитивных клеток более чем в два раза. Таким образом, совместное действие аллостатина и IL12 позволяет значительно повысить продукцию IFNγ NK клетками. Исходя из этого факта, можно прогнозировать, что стимуляция NK клеток периферической крови аллостатином позволит значительно повысить эффективность применения IL12 в иммунотерапии рака, поскольку усиление продукции IFNγ является основным механизмом противоопухолевого действия этого цитокина.

Пример 12. Влияние аллостатина на клеточный иммунный ответ in vivo. Стандартным методом оценки влияния иммунотропных препаратов на клеточный иммунный ответ служит анализ реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) [19]. В данном примере рассмотрено влияние аллостатина на реакцию ГЗТ у мышей при двукратном подкожном введении антигена - ксеногенных опухолевых клеток, инактивированных летальной дозой облучения. С этой целью использовали 2-2,5-мес. самок мышей линии ДВА/2. В качестве антигена использовали клетки эритроидной лейкемии человека К562, которые культивировали в среде RPMI 1640 с 10% фетальной сывороткой теленка.

Клетки К562 перед введением животным инактивировали высокой дозой радиации (15000 рад). При первой (сенсибилизирующей) иммунизации, которая проводилась посредством подкожной инъекции убитых клеток в область спины, доза клеток К562 составляла 0,5×10⁶/мышь в 200 мкл буфера Хенкса. Повторная (разрешающая) иммунизация проводилась через 10 суток. Для этого по 5×10⁶ убитых радиацией клеток К562 в 50 мкл буфера Хенкса вводили под апоневротическую пластинку задней левой конечности. В качестве контроля в правую заднюю лапу каждой мыши вводили 50 мкл буфера Хенкса. Интенсивность воспалительной реакции, которая является показателем уровня ГЗТ, определяли через 24 часа после введения разрешающей дозы антигена, сравнивая массу отрезанных на уровне голеностопного сустава задних конечностей каждой мыши. Индекс воспаления (ИВ) рассчитывали по разнице массы опытной (О) и контрольной (К) конечностей:

Влияние аллостатина на ГЗТ оценивали как на стадии сенсибилизации, так и на стадии разрешения. С этой целью препарат в дозе 2,5 или 25 мкг инъецировали мышам подкожно в область спины сразу после сенсибилизирующей и/или разрешающей иммунизации. Полученные результаты приведены в таблице 12.

В использованных экспериментальных условиях клетки эритроидной лейкемии человека линии К562 индуцировали у мышей выраженную реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Эти данные свидетельствуют о формировании клона Т-лимфоцитов, специфически распознающего антигены клеток К562. Введение аллостатина усиливало реакцию ГЗТ в результате повышения реактивности соответствующего клона Т-лимфоцитов. Таким образом, полученные результаты демонстрируют эффективность стимуляции Т-лимфоцитов аллостатином в условиях in vivo и возможность использования этого эффекта для усиления распознавания опухолевых антигенов и, соответственно, иммунотерапии рака.

Пример 13. Влияние аллостатина на распознавание опухолевых клеток системой естественного иммунитета

Методика постановки экспериментов в целом соответствовала описанной в примере 12, посвященном анализу реакции ГЗТ. Основное отличие состояло в том, что антиген вводился животным однократно, а реакция воспаления анализировалась вскоре после введения антигена. Следовательно, речь о формировании специфического иммунитета в данном случае не идет, а наблюдаемые эффекты относятся к области естественного (врожденного) иммунитета, основными эффекторами которого являются NK клетки и некоторые субпопуляции Т-лимфоцитов, в частности, NKT.

В опытах использовали 3-месячных самцов белых беспородных мышей. Убитые летальной дозой радиации (15 тыс. рад) клетки К562 применяли в качестве чужеродных для мышей корпускулярных антигенов. Иммунизацию проводили посредством инокуляции 1,2×10⁶ клеток под апоневротическую пластинку левой задней лапы животных в 50 мкл буфера Хенкса. Для контроля в правую заднюю лапу вводили 50 мкл буферного раствора. Аллостатин в дозе 2,5 мкг на животное в 200 мкл буфера Хенкса вводили подкожно в область спины сразу после введения антигена. Интенсивность воспалительной реакции оценивали через 24 часа после инъекции антигена, сравнивая массу отрезанных по голеностопному суставу задних конечностей у каждого животного. Индекс воспаления рассчитывали по формуле, приведенной в примере 12.

Результаты исследования представлены в Таблице 13. Однократное введение антигена в этих условиях не вызвало у животных заметной воспалительной реакции. В том случае, если введение антигена в область левой задней лапы сопровождалось подкожной инъекцией аллостатина в область спины, у всех животных отмечалась воспалительная реакция в этой лапе, в то время как правая лапа, в которую вводился только раствор Хенкса, оставалась интактной. Таким образом, аллостатин достоверно усиливал неспецифическое распознавание корпускулярного антигена, который никогда ранее данному организму не предъявлялся и без дополнительной стимуляции оставался нераспознанным. В контексте общепринятых представлений о механизмах естественного иммунитета наиболее вероятным объяснением наблюдаемого эффекта является стимулирующее действие аллостатина на цитотоксическую активность NK клеток. Независимым экспериментальным подтверждением этой гипотезы служат результаты исследований in vitro, которые приведены выше в примерах 7-9. Таким образом, полученные результаты демонстрируют эффективность стимуляции аллостатином NK клеток в условиях in vivo и возможность использования этого эффекта в иммунотерапии рака. Механизм активации может быть связан как с прямой стимуляцией цитотоксической активности NK клеток (примеры 7-9), так и с усилением продукции IFNy Т-лимфоцитами (пример 10) и самими NK клетками (пример 11).

Пример 14. Анализ токсичности аллостатина

Для определения токсичности аллостатина использовали культуру клеток фибробластов кожи взрослого человека, пассаж 3 и 4. Клетки выращивали на среде DMEM/F12 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (HyClone, USA) и антибиотиков пенициллина и стрептомицина (Pen/Strep 100×, Gibco), пересевали с помощью 0,25% раствора трипсина и ЭДТА (Gibco). Для опыта высевали клетки в 96-луночные панели (Costar) в количестве 5 тысяч на лунку, объем среды 200 мкл/лунку. На следующий день плотность посева составляла 75% площади лунки. Среду полностью меняли на свежую ростовую среду в контрольном варианте и с добавками аллостатина в опытных вариантах. Растворы аллостатина готовили следующим образом: навеску препарата растворяли в ростовой среде в концентрации 1000 мг/Л, затем делали серию последовательных 10-кратных разведений. Для каждого варианта опыта использовали 3 лунки с клетками. 96-луночную панель инкубировали в стандартных условиях: 5% СО₂, 37°С, 85% влажности в течение 24 ч. Через 24 ч лунки каждого варианта последовательно промывали раствором PBS (Sigma), добавляли 200 мкл раствора трипсина, инкубировали 5 мин, затем пипетировали и приготавливали суспензию единичных клеток. Аликвоту суспензии разбавляли 0,4% раствором трипанового синего (Gibco) 1:1 и подсчитывали количество живых и мертвых клеток в камере Горяева.

Результаты эксперимента представлены в Таблице 14. Количество живых и мертвых (окрашиваемых трипановым синим) клеток во всех вариантах существенно не различалось, закономерных изменений этих показателей в зависимости от концентрации аллостатина не наблюдалось.

Таким образом, аллостатин не оказывает цитотоксического действия на фибробласты человека во всем диапазоне изученных концентраций, включая максимальную концентрацию 1000 мг/Л. По данным, приведенным в примерах 7 и 8, терапевтически эффективная концентрация аллостатина при воздействии на NK клетки не превышает 0.01 мг/Л. Сравнение этих величин показывает, что превышение терапевтически эффективной концентрации аллостатина в 100000 раз не оказывает цитотоксического действия на клетки человека.

Таблицы к примерам 1-14

Использованные источники информации

1. Hongming Zhang, Jibei Chen Current status and future directions of cancer immunotherapy Journal of Cancer 2018, 9(10): 1773-1781.

2. Gao X, Mi Y, Guo N, Xu H, Xu L, Gou X and Jin W Cytokine Induced Killer Cells As Pharmacological Tools for Cancer Immunotherapy. Front. Immunol. 2017 8:774. doi: 10.3389/fimmu.2017.00774.

3. Richard W. Childs and Manias Carlsten Therapeutic approaches to enhance natural killer cell cytotoxicity against cancer: the force awakens Nature reviews Drug discovery 2015, 14: 487-498.

4. Maelig G. Morvan and Lewis L. Lanier NK cells and cancer: you can teach innate cells new tricks, Nature reviews/Cancer, 2016,16: 7-19.

5. Hofer E and Koehl U Natural Killer Cell-Based Cancer Immunotherapies: From Immune Evasion to Promising Targeted Cellular Therapies. Front. Immunol. 2017, 8:745. doi: 10.3389/fimmu.2017.00745.

6. Seila Lorenzo-Herrero, Alejandro Lopez-Soto, Christian Sordo-Bahamonde, Ana P Gonzalez-Rodriguez, Massimo Vitale and Segundo Gonzalez NK Cell-Based Immunotherapy in Cancer Metastasis. Cancers 2019, 11, 29; doi: 10.3390/cancers 11010029.

7. WO 1999045102 Method for activating natural killer (NK) cells.

8. Patent US 2017/0071982 A1 In vivo priming of natural killer cells

9. WO/2018/182511 Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells

10. WO 2009100942 Ligands of the natural killer (NK) cell surface marker CD27 and therapeutic uses thereof

11. WO 2013119857 Glycosphingolipids for use in modulating immune responses

12. Patent US 2015/0299252 Al

13. John M. Wrangle, Alicia Patterson, C. Bryce Johnson, Daniel J. Neitzke, Shikhar Mehrotra IL-2 and Beyond in Cancer Immunotherapy Journal of interferon and cytokine research, 2018, 38: 45-68 (ПРОТОТИП)

14. Chernysh S.I., S.I. Kim, G. Bekker, V.A. Pleskach, N.A. Filatova, V.B. Anikin, V.G. Platonov and Philippe Bulet. Antiviral and antitumor peptides from insects. PNAS, 2002, 99 (20): 12628-12632

15. Chernysh S, Kozuharova I, Artsibasheva I. Anti-tumor activity of immunomodulatory peptide alloferon-1 in mouse tumor transplantation model, Intern. Immunopharmacol., 2012; 12:312-314

16. Патент RU 2267496 Противоопухолевые и антивирусные пептиды

17. Chernysh S., Kozuharova I. Anti-tumor activity of a peptide combining patterns of insect alloferons and mammalian immunoglobulins in naive and tumor antigen vaccinated mice, Intern. Immunopharmacol., 2013,17: 1090-1093

18. Alspach E, Lussier DM, Schreiber RD Interferon γ and Its Important Roles in Promoting and Inhibiting Spontaneous and Therapeutic Cancer Immunity, Cold Spring Harb Perspect Biol., 2019 Mar 1;11(3). pii: a028480. doi: 10.1101/cshperspect.a028480.

19. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012, с. 629-630

20. Dahlberg CIM, Sarhan D, Chrobok M, Duru AD and Alici E Natural Killer Cell-Based Therapies Targeting Cancer: Possible Strategies to Gain and Sustain Anti-Tumor Activity. Front. Immunol., 2015, 6:605. doi: 10.3389/fimmu.2015.00605

21. Carrega P and Ferlazzo G Natural Killers Are Made Not Born: How to Exploit NK Cells in Lung Malignancies Front. Immunol., 2017, 8:277. doi: 10.3389/fimmu.2017.00277

22. Robinson LA, Jaing CJ, Campbell CP, Magliocco A, Xiong Y, Magliocco G, Thissen JB and Antonia S Molecular evidence of viral DNA in non-small cell lung cancer and nonneoplastic lung. British Journal of Cancer 2016,115,497-504 doi: 10.1038/bjc.2016.213

23. Hasegawaa Y, Ando M, Kubo A, Isa S, Yamamoto S, Tsujino K, Kurata T, Ou SH, Takada M, Kawaguchi T, Human papillomavirus in non-small cell lung cancer in never smokers: A systematic review of the literature Lung Cancer 2014, 83 8-13

24. Stiven A, Fischer SA, Robinson BW Immunotherapy for lung cancer Respirology 2016, 21, 821-833 doi: 10.1111/resp.l2789

25. Zhu J, Li R, Tiselius E, Roudi R, Teghararian O, Suo C, Song H. Immunotherapy (excluding checkpoint inhibitors) for stage I to III non-small cell lung cancer treated with surgery or radiotherapy with curative intent. Cochrane Database of Systematic Reviews 2017,12. Art. No.: CD011300. DOI: 10.1002/14651858.CD011300.pub2

26. Chang Y-C, Hsu P-C, Li S-H, Weng S-H, Kuo C-H, Yang T-Y, et al. The Prevalence of PD-L1 Expression in Lung Cancer. Clin Oncol. 2019, 4:1591.

--->

Перечень последовательностей

<110> Черныш Сергей Иванович; Chernysh Sergey Ivanovich

<120> Способ активации цитотоксических лимфоцитов

<160> 1

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аллостатин 1

<310> RU 2267496 C2

<311> 2004-01-15

<312> 2006-01-10

<400> 1

His Gly Val Ser Gly Trp Gly Gln His Gly Thr His Gly

1 5 10

<---

Группа изобретений относится к области иммунотерапии и может быть использована для повышения противоопухолевой активности NK-клеток и Т-лимфоцитов при лечении и профилактике рака легкого, лейкозов, рака вирусной этиологии и других онкологических заболеваний. Предложен способ активации цитотоксических лимфоцитов путем обработки клеток крови пептидом, содержащим аминокислотную последовательность His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No.1), или его фармацевтически приемлемыми солями в концентрации, усиливающей способность цитотоксических лимфоцитов лизировать трансформированные клетки организма, такие как клетки рака или инфицированные вирусом клетки. Способ обеспечивает усиление экспрессии активационных рецепторов CD25, CD69, NKG2D, CD226 CD244 и NKp80 на поверхности лимфоцитов и снижает экспрессию ингибирующих рецепторов KIR2DL3, KIR3DL1, KLRG1, также обеспечивает повышение чувствительности лимфоцитов к IL-2 и IL-12, стимулирует продукцию IFNγ, поддерживает популяции NK-клеток в функционально активном состоянии в процессе цитотоксической реакции с трансформированными клетками. Способ может применяться в комбинации с IL-2 или IL-12 для усиления их противоопухолевого действия. Активация лимфоцитов предложенным способом увеличивает количество опухолевых клеток-мишеней с повреждениями с 13,5 до 73%. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 14 табл., 14 пр., 12 ил.

1. Способ активации цитотоксических лимфоцитов, включающий обработку клеток крови пептидом, содержащим аминокислотный сиквенс His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No.1), или его фармацевтически приемлемыми солями в концентрации, усиливающей способность цитотоксических лимфоцитов лизировать трансформированные клетки организма, представляющие собой клетки рака или инфицированные вирусом клетки.

2. Способ по п. 1, в котором клетки рака являются клетками рака легких.

3. Способ по п. 1, в котором клетки рака являются клетками рака шейки матки.

4. Способ по п. 1, в котором клетки рака являются клетками лейкоза.

5. Способ по п.1, в котором вирус является вирусом папилломы человека.

6. Способ по п. 1, результатом которого является активация NK-лимфоцитов.

7. Способ по п. 1, результатом которого является активация Т-лимфоцитов.

8. Способ по п. 1, результатом которого является увеличение доли лимфоцитов, продуцирующих интерферон-гамма.

9. Способ по п. 1, результатом которого является увеличение доли лимфоцитов, экспрессирующих активационный рецептор CD25.

10. Способ по п. 1, результатом которого является увеличение доли лимфоцитов, экспрессирующих активационный рецептор CD69.

11. Способ по п. 1, результатом которого является увеличение доли лимфоцитов, экспрессирующих активационный рецептор NKG2D.

12. Способ по п. 1, результатом которого является увеличение доли лимфоцитов, экспрессирующих активационный рецептор CD226.

13. Способ по п. 1, результатом которого является снижение доли лимфоцитов, экспрессирующих ингибирующие рецепторы семейства KIR.

14. Способ по п.13, в котором ингибирующий рецептор семейства KIR является KIR2DL3, KIR3DL1, KLRG1.

15. Способ по п. 1, в котором лимфоциты обрабатывают путем введения пептида His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No.1) в кровь пациента.

16. Способ по п. 1, в котором лимфоциты обрабатывают путем интратуморального введения пептида His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No.1).

17. Способ по п. 1, в котором лимфоциты выделяют из периферической крови и инкубируют в питательной среде, содержащей пептид His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No.1).

18. Применение способа по п. 1 для повышения чувствительности цитотоксических лимфоцитов к интерлейкину-12.

19. Применение способа по п. 1 для повышения чувствительности цитотоксических лимфоцитов к интерлейкину-2.

20. Применение способа по п. 1 для поддержания популяции NK-клеток в функционально активном состоянии в процессе цитотоксической реакции с трансформированными клетками организма, представляющими собой клетки рака или инфицированные вирусом клетки.