КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ АЛКИЛГЛИКОЗИДЫ, ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ СОДЕРЖАЩИХ БЕЛКИ СОСТАВОВ Российский патент 2016 года по МПК A61K39/395 A61K31/7028 A61K9/08 

Родственная заявка

По данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США 61/358105, поданной 24 июня 2010, которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к применению определенных композиций алкилгликозидов для предотвращения агрегации и окисления антител и других белков в их терапевтически пригодных составах.

Предпосылки создания изобретения

В случае, когда в белковом составе требуется стабилизатор для защиты от денатурации при встряхивании, перемешивании, фрагментации и замерзании-оттаивании или в состоянии покоя на поверхности раздела, часто используется неионный детергент (то есть поверхностно-активное вещество) (патент США 5183746). Примерами этого является применение полисорбатов во многих содержащих белки продуктах. Например, полисорбаты 20 и 80 (Tween® 20 и Tween® 80) используются в составах биотерапевтических продуктов как для предотвращения поверхностной абсорбции, так и в качестве стабилизаторов, направленных против агрегации белков (Kerwin, J. Pharm. Sci. 97(8):2924-2936 (2008)). Полисорбаты представляют собой амфипатические неионные поверхностно-активные вещества, состоящие из эфиров жирных кислот полиоксиэтилен(POE)-сорбитана, таких как полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат для полисорбата 20 и полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат для полисорбата 80.

Однако, к сожалению, полисорбаты могут подвергаться разложению посредством окисления или гидролиза. В случае, когда молекула полисорбата разлагается, она создает различные побочные продукты разложения, например жирные кислоты, POE-сорбитан, PEG, PEG-эфиры и алкиловые кислоты. Определенные из таких побочных продуктов разложения, включая свободные жирные кислоты, могут вызвать увеличение мутности и агрегации белков в содержащих белки составах. Следовательно, хотя полисорбаты обычно применяются в качестве стабилизаторов белков, жирные кислоты и другие побочные продукты разложения, высвобождающиеся при деградации полисорбатов с течением времени, могут неблагоприятно повлиять на защитный эффект, который полисорбаты демонстрируют в содержащих белки составах.

Белки проходят через различные степени деградации в процессе очистки и хранения, где окисление (включая вызванное светом окисление) является одним из основных путей разложения, который оказывает разрушающее влияние на стабильность и активность белков. Окислительные реакции вызывают разрушение аминокислотных остатков, гидролиз пептидных связей и, следовательно, нестабильность белка вследствие изменения третичной структуры белка и агрегации белков (Davies, J. Biol. Chem. 262: 9895-901 (1987)). Обзор окисления белковых фармацевтических препаратов приведен в работах Nguyen (Chapter 4 in Formulation and Delivery of Protein and Peptides (1994)), Hovorka, (J. Pharm Sci. 90:25369 (2001)) и Li (Biotech Bioengineering 48:490-500 (1995)).

С учетом изложенного выше, очевидно, что существует потребность в идентификации композиций, которые могут быть использованы для повышения стабильности и предотвращения агрегации и/или окисления белков в содержащих белки составах.

Сущность изобретения

Изобретение основано на обнаружении того, что определенные композиции алкилгликозидов эффективны для стабилизации и/или снижения агрегации или иммуногенности антител и других белков в терапевтически эффективных составах. Кроме того, изобретение также основано на обнаружении того, что определенные композиции алкилгликозидов эффективны для предотвращения окисления аминокислотных остатков, в частности остатков триптофана, в антителах или других белках в терапевтически эффективных составах. Более конкретно, один из аспектов изобретения направлен на способы применения алкилгликозидов, имеющих значение критической концентрации мицеллообразования (CMC), составляющее по меньшей мере 1,0 мМ, в качестве агентов, стабилизирующих белки или снижающих их агрегацию. В определенных вариантах осуществления изобретения композиция алкилгликозидов используется в составе, содержащем антитела или другие белки, в концентрации, которая ниже соответствующего значения CMC.

Соответственно в одном из аспектов изобретение относится к композиции, содержащей белок и алкилгликозид, имеющий значение CMC около 1,0 мМ или более в воде при 25°C. В определенных вариантах осуществления белок, присутствующий в композиции, представляет собой антитело, которое необязательно может представлять собой моноклональное антитело. В других вариантах осуществления алкилгликозид выбран из группы, состоящей из н-гексил-β-D-глюкопиранозида, н-гептил-β-D-глюкопиранозида, н-октил-β-D-глюкопиранозида, н-нонил-β-D-глюкопиранозида, н-децил-β-D-глюкопиранозида, 3-циклогексил-1-пропил-β-D-глюкозида, 3-циклогексил-1-бутил-β-D-глюкозида, н-гексил-β-D-мальтопиранозида, н-октил-β-D-мальтопиранозида, н-нонил-β-D-мальтопиранозида, н-децил-β-D-мальтопиранозида, циклогексилметил-β-D-мальтозида, 2-циклогексилэтил-β-D-мальтозида, 3-циклогексилпропил-β-D-мальтозида, 4-циклогексилбутил-β-D-мальтозида и 5-циклогексилпентил-β-D-мальтозида. В других вариантах осуществления композиция содержит количество алкилгликозида, ингибирующее агрегацию, вызванную перемешиванием, или препятствующее окислению. В еще одном варианте осуществления алкилгликозид присутствует в композиции в концентрации, которая меньше значения CMC алкилгликозида в воде при 25°C. Композиция может быть водной, может быть стабильной при температуре около 2-8°C в течение по меньшей мере одного года и/или может быть стабильной при температуре около 30°C в течение по меньшей мере одного месяца. Необязательно вещество композиции является нелиофилизированным и не подвергнутым предшествующей лиофилизации, или может представлять собой ресуспендированный лиофилизированный состав.

В еще одном аспекте изобретение направлено на изделие, включающее контейнер, в котором находится описанная выше композиция.

В еще одном аспекте изобретение направлено на способ изготовления фармацевтического состава, включающий приготовление описанной выше композиции и оценку физической стабильности, химической стабильности или биологической активности белка в композиции.

В еще одном аспекте изобретение направлено на способ ингибирования агрегации белка, вызванной перемешиванием, присутствующего в первом водном растворе, включающий стадию добавления к первому водному раствору количества алкилгликозида, ингибирующего агрегацию, вызванную перемешиванием, при этом алкилгликозид имеет значение CMC около 1,0 мМ или более в воде при 25°C, обеспечивая, таким образом, второй водный раствор.

В еще одном аспекте изобретение направлено на способ предотвращения окисления белка, присутствующего в первом водном растворе, включающий стадию добавления к первому водному раствору количества алкилгликозида, ингибирующего окисление, при этом алкилгликозид имеет значение CMC около 1,0 мМ или более в воде при 25°C, обеспечивая, таким образом, второй водный раствор.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показано влияние определенных поверхностно-активных веществ на агрегацию моноклонального антитела анти-MUC16 в водном растворе, вызванную перемешиванием.

На фиг.2 показано влияние определенных поверхностно-активных веществ на агрегацию моноклонального антитела анти-MUC16 в водном растворе, вызванную перемешиванием.

На фиг.3 показано влияние определенных поверхностно-активных веществ на агрегацию моноклонального антитела анти-MUC16 в водном растворе, вызванную перемешиванием.

На фиг.4 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида на мутность водных растворов, содержащих моноклональное антитело анти-MUC16.

На фиг.5 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида на поддержание % мономеров моноклонального антитела анти-MUC16 в водном растворе.

На фиг.6 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на мутность водных растворов, содержащих моноклональное антитело анти-MUC16.

На фиг.7 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на мутность водных растворов, содержащих моноклональное антитело анти-IgE.

На фиг.8 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на мутность водных растворов, содержащих моноклональное антитело анти-CD11a.

На фиг.9 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на мутность водных растворов, содержащих моноклональное антитело анти-CD22.

На фиг.10 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на поддержание % мономеров моноклонального антитела анти-MUC16 в водном растворе.

На фиг.11 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на поддержание % мономеров моноклонального антитела анти-IgE в водном растворе.

На фиг.12 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на поддержание % мономеров моноклонального антитела анти-CD11a в водном растворе.

На фиг.13 показано влияние н-октил-β-D-глюкопиранозида или полисорбата 20 на поддержание % мономеров моноклонального антитела анти-CD22 в водном растворе.

На фиг.14 показано количество пероксида водорода, генерированного различными алкилгликозидами или полисорбатом 20 в растворе с течением времени.

На фиг.15 показано влияние различных алкилгликозидов или полисорбата 20 на предотвращение окисления антитела анти-CD11a в водном растворе.

На фиг.16 показано влияние различных алкилгликозидов или полисорбата 20 на предотвращение окисления антитела анти-CD22 в водном растворе.

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления

Изобретение может быть понятно намного легче со ссылками на приведенное ниже подробное описание конкретных вариантов осуществления и примеры, приведенные в нем.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют то же самое значение, в котором они обычно понимаются специалистом в области техники, к которой относится изобретение. Хотя произвольные способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном описании, могут быть использованы при практическом применении или тестировании изобретения, ниже описаны предпочтительные способы и материалы. Все публикации, приведенные в данном описании, включены в него посредством ссылки во всей своей полноте.

В данном описании диапазоны или количества, перед которыми находится термин "около" явным образом включают точный диапазон или точное численное количество.

Агрегация антител и других белков преимущественно вызывается гидрофобными взаимодействиями, которые в результате приводят к денатурации. Если гидрофобная область частично или полностью развернутого белка подвергается воздействию воды, то это создает термодинамически неблагоприятную ситуацию из-за того факта, что обычно находящаяся внутри гидрофобная область теперь взаимодействует с гидрофильной водной средой. В результате этого снижение энтропии из-за структурирования водных молекул вокруг гидрофобной области вызывает агрегацию денатурированного белка, преимущественно через взаимодействующие гидрофобные области. Таким образом, растворимость белка также может быть нарушена. В некоторых случаях может в определенных условиях произойти самоассоциация белковых субъединиц, естественных или неправильно свернутых, что приведет к осаждению и потере активности.

Факторы, которые влияют на агрегацию белков в растворе, обычно включают концентрацию белка, pH, температуру, другие эксципиенты и механическое напряжение. Некоторые факторы (например, температура) могут легче контролироваться во время очистки, составления смеси, производства, хранения и применения, чем другие (например, механическое напряжение). При исследовании составов будут выбраны соответствующие значения pH и эксципиенты, которые не вызовут агрегацию и/или фактически будут помогать в предотвращении агрегации. Концентрация белка определяется требуемой терапевтической дозой и в зависимости от значения данной концентрации будет определять, существует ли потенциал для более высоких состояний ассоциации (димеры, тетрамеры и т.д.), которые могут затем привести к агрегации в растворе. Тщательный анализ должен быть проведен в процессе разработки состава для определения того, какие факторы влияют на агрегацию белков и затем каким образом данные факторы могут быть исключены или каким образом они могут контролироваться.

Желание идентифицировать стабильные составы растворов антител или другого белка для применения при парентеральном или другом введении может привести к разработке методологии тестирования для оценки влияния различных добавок на физическую стабильность. На основании известных факторов, влияющих на агрегацию белков, и требований таких применений, физическая стабильность может оцениваться с применением механических процедур, включая перемешивание или вращение растворов белков. Методология тестирования механической нагрузки с целью идентификации способности различных добавок предотвращать агрегацию может включать проведение встряхивания или взбалтывания в горизонтальной плоскости или вращение в x см от оси колеса, вращающегося на n об/мин в вертикальной плоскости. Мутность, возникающая вследствие агрегации, обычно определяется как функция от времени посредством визуального наблюдения или анализа рассеивания света. Альтернативно снижение содержания растворимого белка вследствие осаждения может быть количественно измерено с помощью анализа ВЭЖХ как функция от времени.

Изобретение основано на обнаружении того, что определенные композиции алкилгликозидов эффективны для стабилизации или снижения агрегации и иммуногенности антител или других белков в терапевтически эффективных составах. Кроме того, изобретение также основано на обнаружении того, что определенные композиции алкилгликозидов эффективны для предотвращения или снижения окисления антител или других белков в терапевтически эффективных составах.

"Поверхностно-активные вещества" представляют собой поверхностно-активные агенты, которые могут проявлять свое действие на поверхностях типа твердое-твердое, твердое-жидкое, жидкое-жидкое и жидкое-воздух вследствие своего химического состава, имеющего как гидрофильные, так и гидрофобные группы. Данные вещества снижают концентрацию белков в разбавленных растворах на поверхностях раздела воздух-вода и/или вода-твердое, где белки могут адсорбироваться и потенциально агрегироваться. Поверхностно-активные вещества могут связываться с гидрофобными поверхностями раздела в белковых композициях. Белки на поверхности воды будут агрегироваться, особенно при перемешивании, вследствие развертывания и последующей агрегации белкового монослоя.

"Поверхностно-активные вещества" могут денатурировать белки, но также могут стабилизировать их против поверхностной денатурации. Как правило, ионные поверхностно-активные вещества могут денатурировать белки. Однако неионные поверхностно-активные вещества обычно не денатурируют белки даже при относительно высоких концентрациях (1% масса/объем). Большинство парентерально приемлемых поверхностно-активных веществ происходят из групп полисорбатов или полиэфиров. Полисорбаты 20 и 80 представляют собой современные поверхностно-активные стабилизаторы в имеющихся на рынке белковых составах. Однако другие поверхностно-активные вещества, используемые в белковых составах, включают Pluronic F-68 и членов класса "Brij". Ни одно из этих веществ не является алкилгликозидом по изобретению.

Физические события могут проявляться в подверженности химическим событиям. Химическая нестабильность белков может включать расщепление или образование ковалентных связей с первичной структурой белка. Было описано несколько реакций окисления в белках. В щелочной или нейтральной среде остатки аминокислот цистеина, гистидина, метионина, триптофана и тирозина особенно подвержены окислению. Однако в кислотных условиях чувствительным является метионин. Часто реакции окисления вызывают большую потерю биологической активности и даже иммуногенности. В данной области хорошо известно, что окисление аминокислотных остатков в белках, особенно остатков триптофана, может быть вызвано воздействием света.

Пероксиды представляют собой известные загрязняющие вещества для неионных поверхностно-активных веществ. Пероксиды в полисорбатах могут приводить к окислительному разложению белков. Составители композиций обычно изучают источники полисорбатов и других полимерных добавок в белковых составах на предмет загрязнения пероксидами и создают спецификации для использования пероксидов в качестве добавки. Альтернативно внесение антиоксиданта используют для того, чтобы способствовать снижению потенциальной опасности от неионных поверхностно-активных веществ, которые служат в качестве катализаторов окисления для чувствительных к окислению белков.

"Поверхностно-активные вещества" являются молекулами с четко определенными полярными и неполярными областями, что позволяет им агрегировать в растворе с образованием мицелл. В зависимости от природы полярной области поверхностно-активные вещества могут быть неионными, анионными, катионными и цвиттер-ионными. Неионные поверхностно-активные вещества могут быть основаны на сахарах. Основанные на сахарах поверхностно-активные вещества могут представлять собой алкилгликозиды.

Как использовано в данном описании, "алкилгликозид" относится к произвольному сахару, соединенному связью с произвольным гидрофобным алкилом, как известно в данной области. Связь между гидрофобной алкильной цепью и гидрофильным сахаридом может включать, среди прочего, гликозидную, эфирную, тиогликозидную, тиоэфирную, сложноэфирную, амидную или уреидную связь или связывание, примеры которых описаны в данном описании. Термины "алкилгликозид" и "алкилсахарид" могут использоваться в данном описании взаимозаменяемо.

Общей структурой алкилгликозидов по изобретению является R₁-O-(CH₂)_x-R, где R может представлять собой, например, CH₃, циклогексил (C₆H₁₁) или другую алкильную цепь, включая их изомеры, и R₁ представляет собой сахар, обычно глюкозу или мальтозу. Конкретные алкилгликозиды включают алкилы, в которых R₁ представляет собой глюкозу, R представляет собой CH₃, и x равен 5 (н-гексил-β-D-глюкопиранозид), x равен 6 (н-гептил-β-D-глюкопиранозид), x равен 7 (н-октил-β-D-глюкопиранозид), x равен 8 (н-нонил-β-D-глюкопиранозид), x равен 9 (н-децил-β-D-глюкопиранозид) и x равен 11 (н-додецил-β-D-глюкопиранозид). Иногда глюкопиранозиды называют глюкозидами.

Иллюстративные алкилгликозиды дополнительно включают алкилы, в которых R₁ представляет собой мальтозу, R представляет собой CH₃, и x равен 5 (н-гексил-β-D-мальтопиранозид), x равен 7 (н-октил-β-D-мальтопиранозид), x равен 8 (н-нонил-β-D-мальтопиранозид), x равен 9 (н-децил-β-D-мальтопиранозид), x равен 10 (н-ундецил-β-D-мальтопиранозид), x равен 11 (н-додецил-β-D-мальтопиранозид), x равен 12 (н-тридецил-β-D-мальтопиранозид), x равен 13 (н-тетрадецил-β-D-мальтопиранозид) и x равен 15 (н-гексадецил-β-D-мальтопиранозид). Иногда мальтопиранозиды называют мальтозидами.

Иллюстративные алкилгликозиды также включают алкилы, в которых R₁ представляет собой глюкозу, x равен 3, и R представляет собой циклогексил (3-циклогексил-1-пропил-β-D-глюкозид); и в которых R₁ представляет собой мальтозу, x равен 4, и R представляет собой циклогексил (4-циклогексил-1-бутил-β-D-мальтозид).

В одном конкретном аспекте изобретения алкилгликозиды, используемые в изобретении, представляют собой алкилы, демонстрирующие критическую концентрацию мицеллообразования (CMC), составляющую 1,0 мМ или более в воде при температуре в диапазоне 20-25°C, предпочтительно, при 25°C. Иллюстративные алкилгликозиды, имеющие такие значения CMC, показаны в табл. 1, при этом другие алкилы хорошо известны в данной области.

Таблица 1 Алкилгликозид Значение CMC (мМ) Значение CMC (масса/объем) н-гексил-β-D-глюкопиранозид 250 мМ 6,6% масса/объем н-гептил-β-D-глюкопиранозид 70 мМ 1,9% масса/объем н-октил-β-D-глюкопиранозид 18 мМ 0,53% масса/объем н-нонил-β-D-глюкопиранозид 6,5 мМ 0,2% масса/объем н-децил-β-D-глюкопиранозид 2,2 мМ 0,07% масса/объем 3-циклогексил-1-пропил-β-D-глюкозид 28 мМ 0,86% масса/объем 3-циклогексил-1-бутил-β-D-глюкозид 1,8 мМ 0,058% масса/объем н-гексил-β-D-мальтопиранозид 210 мМ 8,9% масса/объем н-октил-β-D-мальтопиранозид 19,5 мМ 0,89% масса/объем н-нонил-β-D-мальтопиранозид 6 мМ 0,28% масса/объем н-децил-β-D-мальтопиранозид 1,8 мМ 0,087% масса/объем циклогексилметил-β-D-мальтозид 340 мМ 15% масса/объем 2-циклогексилэтил-β-D-мальтозид 120 мМ 5,4% масса/объем 3-циклогексилпропил-β-D-мальтозид 34,5 мМ 1,6% масса/объем 4-циклогексилбутил-β-D-мальтозид 7,6 мМ 0,37% масса/объем 5-циклогексилпентил-β-D-мальтозид 2,4 мМ 0,12% масса/объем

н-додецил-β-D-мальтопиранозид 0,17 мМ 0,0087 масса/объем н-додецил-β-D-глюкопиранозид 0,19 мМ 0,0066 масса/объем

В частности, алкилгликозид может быть использован отдельно в качестве агента, стабилизирующего антитело или другой белок (или снижающего агрегацию или окисление), или может быть использован совместно с другими алкилгликозидами. Алкилгликозиды находят применение в качестве агентов, стабилизирующих антитело или другой белок (или снижающих агрегацию или окисление) в широком диапазоне концентраций в водном растворе. В конкретных вариантах осуществления изобретения алкилгликозид (при использовании в качестве отдельного агента) или алкилгликозиды (при совместном использовании) могут присутствовать в водном содержащем антитело или белок составе в концентрации от около 0,001 мМ до около 500 мМ, предпочтительно от около 0,005 мМ до около 400 мМ, более предпочтительно от около 0,01 мМ до около 300 мМ, более предпочтительно от около 0,02 мМ до около 250 мМ, более предпочтительно от около 0,03 мМ до около 200 мМ, более предпочтительно от около 0,05 мМ до около 100 мМ, предпочтительнее от около 0,1 мМ до около 100 мМ, более предпочтительно от около 0,1 мМ до около 50 мМ.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения конкретный алкилгликозид может быть применен в качестве агента, стабилизирующего антитело или другой белок (или снижающего агрегацию или окисление), в концентрации ниже, чем его соответствующее значение CMC.

В отношении описанного выше, в данной области понимается, что химический синтез соединений, таких как алкилгликозиды, описанные в данном описании, приводит к образованию некоторой гетерогенной смеси соединений, отличной от полностью гомогенного состава. Поэтому, если в данном описании указывается, что используется конкретный алкилгликозид, следует понимать, что определение относится к большей части компонентов гетерогенной смеси, которая образуется в результате их химического синтеза.

Под "полипептидом" или "белком" понимают последовательность аминокислот, для которой длина цепи является достаточной для получения более высоких уровней третичной и/или четвертичной структуры. Таким образом, белки отличаются от "пептидов", которые также представляют собой основанные на аминокислотах молекулы, которые не имеют подобной структуры. Обычно белок, используемый для целей изобретения, будет иметь молекулярную массу по меньшей мере около 5-20 кДа, альтернативно по меньшей мере около 15-20 кДа, предпочтительно по меньшей мере около 20 кДа. Под "пептидом" понимается последовательность аминокислот, которая обычно не демонстрирует более высокий уровень третичной и/или четвертичной структуры. Пептиды обычно имеют молекулярную массу менее чем около 5 кДа.

Примеры полипептидов, охватываемых приведенным в настоящем описании определением, включают белки млекопитающих, такие как, например, ренин; гормон роста, включая человеческий гормон роста и гормон роста крупного рогатого скота; фактор, стимулирующий выделение гормона роста; паратиреоидный гормон; тиреостимулирующий гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; A-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевый фактор и фактор фон Виллебранда; факторы противосвертывания, такие как протеин С; предсердный натрийуретический фактор; сурфактант легких; активатор плазминогена, такой как урокиназа или активатор плазминогена человеческой мочи или тканевый активатор плазминогена (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; факторы некроза опухолей альфа и бета; энкефалиназа; RANTES (хемокин, выделяемый T-клетками при активации); человеческий макрофаговый белок воспаления (MIP-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; мюллеров ингибирующий фактор; A-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный ассоциированный с гонадотропином пептид; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; IgE; антиген цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA), такой как CTLA-4; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы для гормонов или факторов роста; белок A или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как выделенный из кости нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6), или фактор роста нервной ткани, такой как NGF-β; фактор роста тромбоцитов (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); des(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), белки связывания инсулиноподобных факторов роста (IGFBP); CD-белки, такие как CD3, CD4, CD8, CD19 и CD20; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например, IL-1-IL-10; супероксид-дисмутаза; рецепторы T-клетки; поверхностные мембранные белки; фактор стимулятора гемолиза; вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки СПИД; транспортные белки; "хоминг"-рецептор; адресины; регуляторные белки; интегрины, такие как CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM; опухолевый специфический антиген, такой как CA125 (антиген рака яичников) или рецептор HER2, HER3 или HER4; иммуноадгезины; и фрагменты и/или варианты любых приведенных выше белков, а также антитела, включая фрагменты антител, связывающиеся с любыми приведенными выше белками.

Белок, включаемый в композицию, предпочтительно является, по существу, чистым и желательно, по существу, гомогенным (то есть свободным от загрязняющих белков). "По существу, чистый" белок означает композицию, содержащую по меньшей мере около 90% белка по массе относительно общей массы композиции, предпочтительно по меньшей мере около 95% по массе. "По существу, гомогенный" белок означает композицию, содержащую по меньшей мере около 99% белка по массе относительно общей массы композиции.

В определенных вариантах осуществления белок представляет собой антитело. В данном описании антитело направлено на представляющий интерес "антиген". Предпочтительно антиген представляет собой биологически важный белок, и введение антитела млекопитающему, страдающему заболеванием или нарушением, может иметь терапевтический эффект для этого млекопитающего. Однако также предполагаются антитела, направленные на небелковые антигены (такие как ассоциированные с опухолью гликолипидные антигены; см. патент США 5091178). Если антиген является белком, он может представлять собой трансмембранную молекулу (например, рецептор) или лиганд, такой как фактор роста. Конкретные антигены включают белки, обсуждаемые выше. Предпочтительные молекулы-мишени для антител, охватываемые изобретением, включают CD-полипептиды, такие как CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 и CD34; члены семейства рецепторов HER, такие как EGF-рецептор (HER1), рецептор HER2, HER3 или HER4; молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, Mac1, pl50,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM и интегрин av/b3, включая его субъединицы a или b (например, антитела анти-CD11a, анти-CD18 или анти-CD 11b); факторы роста, такие как VEGF; IgE; антигены группы крови; рецептор flk2/flt3; рецептор ожирения (OB); рецептор mpl; CTLA-4; полипептид C и т.д. Растворимые антигены или их фрагменты необязательно сопряженные с другими молекулами, могут быть использованы в качестве иммуногенов для получения антител. В случае трансмембранных молекул, таких как рецепторы, их фрагменты (например, внеклеточный домен рецепторы) могут быть использованы в качестве иммуногена. Альтернативно, клетки, экспрессирующие трансмембранную молекулу, могут быть использованы в качестве иммуногена. Такие клетки могут быть получены из природного источника (например, раковых клеточных линий) или могут представлять собой клетки, которые были трансформированы посредством рекомбинантных технологий для экспрессии трансмембранной молекулы.

Примеры антител, предназначенных для очистки в соответствии с изобретением, включают, но не ограничиваются ими, антитела HER2, включая трастузумаб (HERCEPTIN®) (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), патент США 5725856) и пертузумаб (OMNITARG™) (WO01/00245); антитела CD20 (см. ниже); антитела IL-8 (St John et al., Chest, 103:932 (1993) и международная публикация No. WO 95/23865); антитела рецептора VEGF или VEGF, включая гуманизированные антитела VEGF и/или антитела VEGF с созреванием аффинности, такие как гуманизированное антитело VEGF huA4.6.1 бевацизумаб (AVASTIN®) и ранибизумаб (LUCENTIS®) (Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992), международная публикация No. WO96/30046 и WO 98/45331, опубликованная 15 октября 1998); антитела PSCA (WO01/40309); антитела CD11a, включая эфализумаб (RAPTIVA®) (патент США 6037454, патент США 5622700, WO 98/23761, Stoppa et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), и Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)); антитела, которые связывают IgE, включая омализумаб (XOLAIR®) (Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993) и международная публикация No. WO 95/19181; патент США 5714338, выданный 3 февраля 1998, или патент США 5091313, выданный 25 февраля 1992, WO 93/04173, опубликованная 4 марта 1993, или международная заявка No. PCT/US98/13410, поданная 30 июня 1998, патент США 5714338); антитела CD18 (патент США 5622700, выданный 22 апреля 1997, или как в WO 97/26912, опубликованной 31 июля 1997); антитела рецепторного антитела Apo-2 (WO 98/51793, опубликованная 19 ноября 1998); антитела тканевого фактора (TF) (европейский патент 0420937 B1, выданный 9 ноября 1994); антитела интегринов α4-α7 (WO 98/06248, опубликованная 19 февраля 1998); антитела EGFR (например, химерного или гуманизированного антитела 225, цетуксимаб, ERBUTIX®, как в WO 96/40210, опубликованной 19 декабря 1996); антитела CD3, такие как OKT3 (патент США 4515893, выданный 7 мая 1985); антитела CD25 или Tac, такие как CHI-621 (SIMULECT®) и ZENAPAX® (патент США 5693762, выданный 2 декабря 1997); антитела CD4, такие как антитело cM-7412 (Choy et al., Arthritis Rheum 39(l):52-56 (1996)); антитела CD52, такие как CAMPATH-1H (ILEX/Berlex) (Riechmann et al., Nature 332:323-337 (1988)); антитела рецептора Fc, такие как антитело M22 против FcyRI, как в работе Graziano et al., J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)); антитела карциноэмбрионального антигена (CEA), такие как hMN-14 (Sharkey et al., Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995)); антитела, направленные против эпителиальных клеток груди, включая huBrE-3, hu-Mc 3 и CHL6 (Ceriani et al., Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); и Richman et al., Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)); антитела, которые связываются с клетками карциномы толстой кишки, такие как C242 (Litton et al., Eur J. Immunol. 26(1): 1-9 (1996)); антитела CD38, например, AT 13/5 (Ellis et al., J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)); антитела CD33, такие как Hu M195 (Jurcic et al., Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)) и CMA-676 или CDP771; антитела EpCAM, такие как 17-1A (PANOREX®); антитела GpIIb/IIIa, такие как абциксимаб или c7E3 Fab (REOPRO®); антитела RSV, такие как MEDI-493 (SYNAGIS®); антитела CMV, такие как PROTOVIR®; антитела ВИЧ, такие как PR0542; антитела гепатита, такие как антитело Hep B OSTAVIR®; антитело CA125, включая анти-MUC16 (WO2007/001851; Yin, BWT и Lloyd, KO, J. Biol. Chem. 276:27371-27375 (2001)) и OvaRex; антитело идиотипического эпитопа GD3 BEC2; антитело ανβ3 {например, VITAXIN®; Medimmune); антитело почечно-клеточной карциномы, такое как ch-G250; ING-1; антитело против человеческого 17-1An (3622W94); антитело против человеческой колоректальной опухоли (A33); антитело против человеческой меланомы R24, направленное против ганглиозида GD3; против человеческой плоскоклеточной карциномы (SF-25); антитело антигена лейкоцитов человека (HLA), такое как Smart ID 10 и антитело анти-HLA DR Oncolym (Lym-1); антитело CD37, такое как TRU 016 (Trubion); антитело IL-21 (Zymogenetics/Novo Nordisk); антитело анти-B-клетки (Impheron); направленное на B-клетки MAb (Immunogen/Aventis); 1D09C3 (Morphosys/GPC); LymphoRad 131 (HGS); антитело Lym-1, такое как Lym-1Y-90 (USC) или анти-Lym-1 Oncolym (USC/Peregrine); LIF 226 (Enhanced Lifesci.); антитело BAFF (например, WO 03/33658); антитело рецептора BAFF (например, WO 02/24909); антитело BR3; антитело Blys, такое как белимумаб; LYMPHOSTAT-B™; ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen); гомиликсима (Idee 152; Biogen Idee); антитело к рецептору IL-6, такое как атлизумаб (ACTEMRA^TM; Chugai/Roche); антитело к IL-15, такое как HuMax-I1-15 (Genmab/Amgen); антитело к рецептору хемокинов, такое как антитело к CCR2 (например, MLN1202; Millieneum); антитело к комплементу, такое как антитело к C5 (например, экулизумаб, 5G1.1; Alexion); пероральный препарат иммуноглобулина человека (например, IgPO; Protein Therapeutics); антитело к IL-12, такое как ABT-874 (CAT/Abbott); тенеликсимаб (BMS-224818); антитела CD40, включая S2C6 и его гуманизированные варианты (WO00/75348) и TNX 100 (Chiron/Tanox); антитела TNF-α, включая cA2 или инфликсимаб (REMICADE®), CDP571, MAK-195, адалимумаб (HUMIRA™), пегилированный фрагмент антитела к TNF-α, такой как CDP-870 (Celltech), D2E7 (Knoll), поликлональное антитело к анти-TNF-α (например, PassTNF; Verigen); антитела CD22, такие как LL2 или эпратузумаб (LYMPHOCIDE®; Immunomedics), включая эпратузумаб Y-90 и эпратузумаб I-131, антитело Abiogen CD22 (Abiogen, Italy), CMC 544 (Wyeth/Celltech), комботокс (UT Soutwestern), BL22 (NIH) и LympoScan Tc99 (Immunomedics).

Примеры антител CD20 включают "C2B8", которое в настоящее время называется "ритуксимаб" ("RITUXAN®") (патент США 5736137); помеченное иттрием-[90] мышиное антитело 2B8, обозначенное как "Y2B8" или "ибритутомаб тиуксетан" (ZEVALIN®), коммерчески доступное от IDEC Pharmaceuticals, Inc. (патент США 5736137; 2B8, зарегистрированное в ATCC под кодом доступа № HB11388 22 июня 1993); мышиное IgG2a "B1", также называемое "тозитумомаб", необязательно помеченное I с целью создания антитела "131I-B1" или "йод I131 - тозитумомаб" (BEXXAR™), коммерчески доступное от Corixa (патент США 5595721); мышиное моноклональное антитело "1F5" (Press et al., Blood 69(2):584-591 (1987)) и его варианты, включая 1F5 "со склеенным остовом" или гуманизированное 1F5 (WO 2003/002607, Leung, S.; регистрация в ATCC под номером HB-96450); мышиное антитело 2H7 и химерное антитело 2H7 (патент США 5677180); гуманизированное 2H7 (WO 2004/056312, Lowman et al.,); 2F2 (HuMax-CD20), полностью человеческое высокоаффинное антитело, нацеленное на молекулу CD20 в клеточной мембране B-клеток (Genmab, Denmark; например, Glennie and van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) и Cragg et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); WO 2004/035607; US2004/0167319); человеческие моноклональные антитела, описанные в WO 2004/035607 и US2004/0167319 (Teeling et al.); антитела, имеющие сложные соединенные N-гликозидом сахарные цепи, связанные с Fc-областью, описанной в US 2004/0093621 (Shitara et al.,); моноклональные антитела и связывающие антиген фрагменты, связывающиеся с CD20 (WO 2005/000901, Tedder et al.), такие как HB20-3, HB20-4, HB20-25, и MB20-11; связывающие CD20 молекулы, такие как серия антител AME, например, антитела AME 33, описанные в WO 2004/103404 и US2005/0025764 (Watkins et al., Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME); связывающие CD20 молекулы, такие как описано в US 2005/0025764 (Watkins et al.); антитело A20 или его варианты, такие как химерное или гуманизированное антитело A20 (cA20, bA20, соответственно) или IMMU-106 (US 2003/0219433, Immunomedics); связывающие CD20 антитела, включая Leu-16, 1H4, или 2B8 с обедненным эпитопом, необязательно конъюгированные с IL-2, как в US 2005/0069545A1 и WO 2005/16969 (Carr et al.,); биспецифичное антитело, которое связывает CD22 и CD20, например, hLL2xhA20 (WO2005/14618, Chang et al.,); моноклональные антитела L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 или NU-B2, доступные в трудах международного семинара по типированию лейкоцитарных антигенов (Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)); 1H4 (Haisma et al., Blood 92: 184 (1998)); анти-CD20 конъюгат ауристатина E (Seattle Genetics); анти-CD20-IL2 (EMD/Biovation/City of Hope); терапевтическое средство анти-CD20 MAb (EpiCyte); антитело анти-CD20 TRU 015 (Trubion).

Термин "антитело", как использовано в данном описании, включает моноклональные антитела (включая полноразмерные антитела, имеющие Fc-область иммуноглобулина), композиции антител со специфичностью ко многим эпитопам, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела, диатела и одноцепочечные молекулы, а также фрагменты антител (например, Fab, F(ab')₂ и Fv). Термин "иммуноглобулин" (Ig) в данном описании используется взаимозаменяемо с термином "антитело".

Базовый элемент 4-цепочечного антитела представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Антитело IgM состоит из 5 базовых гетеротетрамерных единиц и дополнительного полипептида, называемого J-цепью, и содержит 10 сайтов связывания антигена, тогда как антитела IgA содержат от 2 до 5 базовых 4-цепочечных элементов, которые могут полимеризироваться с образованием поливалентных соединений в комбинации с J-цепью. В случае IgG, 4-цепочечный элемент обычно имеет массу около 150000 Да. Каждая L-цепь соединена с H-цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как две H-цепи соединены друг с другом одной или более дисульфидными связями в зависимости от изотипа H-цепи. Каждая H- и L-цепь также имеет расположенные с равными интервалами внутрицепные дисульфидные мостики. Каждая H-цепь имеет на N-конце вариабельный домен (V_H), после которого следуют три константных домена (C_H) для каждой из α- и γ-цепей и четыре C_H-домена для изотипов µ и ε. Каждая L-цепь имеет на N-конце вариабельный домен (V_L), после которого следует константный домен на другом ее конце. V_L выровнен с V_H, и C_L выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи (C_H1). Считается, что конкретные аминокислотные остатки формируют границу раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. В результате объединения V_H и V_L образуется один сайт связывания антигена. Структуры и свойства различных классов антител см., например, в работе Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr и Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 and Chapter 6.

L-цепь из произвольного вида позвоночных может быть отнесена к одному из двух ясно различимых типов, называемых каппа и лямбда, на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей (C_H) иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам или изотипам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, имеющих тяжелые цепи, обозначаемые α, δ, ε, γ и µ соответственно. Классы γ и α дополнительно подразделяются на подклассы на основании сравнительно небольших различий в последовательности и функции их C_H, например, у человека экспрессируются следующие подклассы: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.

Термин "вариабельный" относится к тому факту, что определенные части вариабельных доменов сильно отличаются по последовательности между антителами. V-домен опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела для его конкретного антигена. Однако вариабельность распределена на всем протяжении вариабельных доменов антител неравномерно. Напротив, V-домен состоит из сравнительно неизменных участков, называемых каркасными областями (FR), из 15-30 аминокислотных остатков, разделенных более короткими чрезвычайно вариабельными областями, называемыми "гипервариабельными областями", или иногда "определяющими комплементарность областями" (CDR), каждая из которых имеет длину около 9-12 аминокислотных остатков. Вариабельные домены природных тяжелых и легких цепей содержат по четыре области FR, в основном принимающие конфигурацию бета-слоя, связанные тремя гипервариабельными областями, которые формируют петли, соединяющие и в некоторых случаях формирующие часть структуры бета-слоев. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости областями FR и вместе с гипервариабельными областями из другой цепи участвуют в формировании связывающего антиген участка антител (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены напрямую не участвуют в связывании антитела с антигеном, но обладают различными эффекторными функциями, такими как участие в антителозависимой клеточной токсичности (ADCC).

Термин "гипервариабельная область" (также известный как "определяющие комплементарность области" или CDR), как использовано в данном описании, относится к аминокислотным остаткам антитела (обычно к трем или четырем коротким областям чрезвычайной вариабельности), которые находятся в пределах домена V-области иммуноглобулина, и которые формируют связывающую антиген область и являются основными детерминантами специфичности антигена. Существует по меньшей мере два способа идентификации CDR-остатков: (1) способ, основанный на межвидовой вариабельности последовательности (то есть, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, MS (1991)); и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Однако в той мере, в которой две методики идентификации остатков определяют перекрывающиеся области, но не идентичные области, они могут быть объединены для определения гибридной CDR.

Термин "моноклональное антитело", как использовано в данном описании, относится к антителу, полученному из группы, по существу, гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие группу, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций и/или пострансляционных модификаций (например, изомеризации, амидации), которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направленными на единственный антигенный участок. Кроме того, в отличие от обычных (поликлональных) препаратов антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое из моноклональных антител направлено против единственной детерминанты на антигене. Помимо их специфичности, преимущество моноклональных антител состоит в том, что они синтезируются с помощью гибридомной культуры, не загрязненной другими иммуноглобулинами. Модификатор "моноклональный" указывает на характеристику антитела как полученного, по существу, из гомогенной группы антител, и его не следует рассматривать как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для использования в соответствии с изобретением, могут быть получены гибридомным способом, первоначально описанным Kohler et al., в Nature, 256: 495 (1975), или могут быть получены рекомбинантными способами ДНК (патент США 4816567). "Моноклональные антитела" также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с применением методик, описанных, например, Clackson et al., в Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991).

Моноклональные антитела в данном описании, в частности, включают "химерные" антитела (иммуноглобулины), у которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям антител, полученных у конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, тогда как оставшаяся часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученным у другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (патент США 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерные антитела, представляющие интерес по изобретению, включают "приматированные" антитела, содержащие связывающие антиген последовательности вариабельного домена примата, не являющегося человеком (например, мартышки, гориллы и т.д.) и человеческие последовательности содержательной области.

"Интактное" антитело представляет собой антитело, которое содержит антигенсвязывающий участок, а также C_L и по меньшей мере домены тяжелой цепи С_Н1, С_Н2 и С_Н3. Константные домены могут представлять собой константные домены с природной последовательностью (например, константные домены с человеческой природной последовательностью) или вариант их аминокислотной последовательности. Предпочтительно интактное антитело обладает одной или более эффекторными функциями.

"Фрагмент антитела" содержит часть интактного антитела, предпочтительно содержащий антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антитела включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv; диатела; линейные антитела (патент США 5641870, Example 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифические антитела, полученные из фрагментов антител.

Расщепление антител папаином приводит к образованию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, называемых "Fab"-фрагменты, и остаточного "Fc"-фрагмента, название которого отражает его способность к легкой кристаллизации. Fab-фрагмент состоит из целой L-цепи и домена вариабельной области H-цепи (V_H), а также первого константного домена тяжелой цепи (С_Н1). Каждый Fab-фрагмент является моновалентным в отношении связывания антигена, то есть он имеет единственный сайт связывания антигена. Обработка пепсином приводит к образованию фрагмента (Fab')₂, который грубо соответствует двум дисульфидно соединенным Fab-фрагментам, обладающим различной антигенсвязывающей активностью и все еще способным к перекрестному связыванию антигена. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов тем, что они имеют несколько дополнительных остатков на карбоксильном конце домена С_Н1, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH в данном описании обозначает Fab', в котором остаток(ки) цистеина константных доменов несет(ут) свободную тиольную группу. F(ab')₂-фрагменты антител исходно получали в виде пары фрагментов Fab', которые содержали между собой шарнирные цистеины. Также известны другие химические сочетания фрагментов антител.

Fc-фрагмент содержит области карбоксильных концов обеих H-цепей, соединенные дисульфидами. Эффекторные функции антител определяются последовательностями в Fc-области, которая также распознается Fc-рецепторами (FcR), обнаруженными на клетках определенных типов.

"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий сайт. Данный фрагмент состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой цепи и одной легкой цепи в жесткой нековалентной связи. В результате укладки этих двух доменов возникает шесть гипервариабельных петель (3 петли для каждой из H- и L-цепей), которые дают аминокислотные остатки для связывания антигена и придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с более низкой аффинностью по сравнению с полным сайтом связывания.

"Одноцепочечные Fv", также обозначаемые как "sFv" или "scFv", представляют собой фрагменты антител, которые содержат домены антитела VH и VL, соединенные в одну полипептидную цепь. Предпочтительно полипептид sFv между VH- и VL-доменами дополнительно содержит полипептидный линкер, который позволяет sFv формировать необходимую для связывания антигена структуру. Обзор sFv см. в Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Термин "диатела" относится к небольшим фрагментам антител, полученным путем конструирования sFv-фрагментов (см. предыдущий абзац) с короткими линкерами (около 5-10 остатков) между доменами VH и VL таким образом, чтобы достигалось спаривание V-доменов между цепями, но не внутри цепи, в результате чего формируется бивалентный фрагмент, то есть фрагмент, имеющий два сайта связывания антигена. Биспецифичные антитела являются гетеродимерами двух "пересекающихся" sFv-фрагментов, в которых домены VH и VL двух антител находятся на различных полипептидных цепях. Диатела более подробно описаны, например, в EP 404097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

Антителом, которое "специфично связывается с" или является "специфичным для" конкретного полипептида или эпитопа на конкретном полипептиде, является антитело, которое связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде, при этом, по существу, не связываясь с любым другим полипептидом или эпитопом полипептида.

Термин "твердая фаза" описывает неводный матрикс, к которому может прикрепляться антитело по изобретению. Примеры твердых фаз, охватываемые изобретением, включают твердые фазы, сформированные частично или полностью из стекла (например, стекла с контролируемым размером пор), полисахаридов (например, агарозы), полиакриламидов, полистирола, поливинилового спирта и силиконов. В определенных вариантах осуществления, в зависимости от контекста, твердая фаза может содержать лунку аналитического планшета; в других она представляет собой колонку очистки (например, колонку для аффинной хроматографии). Данный термин также включает прерывистую твердую фазу из дискретных частиц, таких, как описано в патенте США 4275149.

"Гуманизированные" формы не принадлежащих человеку (например, мышиных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие связывающие антиген подпоследовательности антител), по существу, из человеческих последовательностей, которые содержат минимальную последовательность, полученную из не принадлежащего человеку иммуноглобулина. В большинстве случаев гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки гипервариабельной области (также, CDR) реципиента заменены на остатки из гипервариабельной области вида, не являющегося человеком (донорское антитело), такого как мышь, крыса или кролик, обладающие желаемой специфичностью, аффинностью и активностью. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv (FR) человеческого иммуноглобулина заменены на соответствующие не относящиеся к человеку остатки. Кроме того, гуманизированные антитела при использовании в изобретении могут содержать остатки, которые отсутствуют как в реципиентном антителе, так и в донорском антителе. Подобные модификации проводят для дополнительного повышения и оптимизации функциональной способности антитела. В оптимальном случае гуманизированное антитело также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно человеческого иммуноглобулина. Более подробно см. в Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al, Nature, 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596 (1992).

«Зависимое от вида антитело», например антитело млекопитающего против человеческого IgE, представляет собой антитело, которое имеет более высокую аффинность связывания в отношении антигена из млекопитающего первого вида, чем в отношении гомолога этого антигена из млекопитающего второго вида. Обычно зависимое от вида антитела "связывается специфически" с антигеном человека (т.е. имеет величину аффинности связывания (Kd) не более чем приблизительно 1·10^-7М, альтернативно не более чем приблизительно 1·10^-8М, альтернативно не более чем 1·10^-9М), но имеет аффинность связывания в отношении гомолога этого антигена из млекопитающего второго вида, не являющегося человеком, которая по меньшей мере приблизительно в 50 раз, по меньшей мере приблизительно в 500 раз, или по меньшей мере приблизительно в 1000 раз является более слабой, чем его аффинность связывания в отношении антигена, не относящегося к человеку. Зависимое от вида антитело может быть любым относящимся к разнообразным типам антител, определенным выше, но предпочтительно оно является гуманизированным или человеческим антителом.

"Эффекторные функции" антитела означают биологические функции, относимые к Fc-области (Fc-области природной последовательности или Fc-области аминокислотной последовательности варианта) антитела и варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность; связывание рецептора Fc; антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, рецепторов В-клеток) и активацию В-клеток.

"Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность", или ADCC, является формой цитотоксичности, в которой секретируемые Ig, связанные на рецепторах Fc (FcR), представленные на некоторых цитотоксических клетках (например, естественные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), позволяют данным цитотоксическим клеткам связываться с несущей антиген клеткой-мишенью и затем убивать клетку-мишень цитотоксинами. Эти антитела "вооружают" цитотоксические клетки и являются необходимыми для уничтожения клетки-мишени по этому механизму. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия Fc на гемопоэтических клетках суммирована в табл. 3 на странице 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Для оценки ADCC-активности представляющей интерес молекулы может быть выполнен анализ ADCC in vitro, как описано в патентах США 5500362 или 5821337. Целесообразные эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и природные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно активность ADCC представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например, на модели животного, как описано в Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998).

"Рецептор Fc", или "FcR", обозначает рецептор, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является природная последовательность FcR человека. Кроме того, предпочтительным FcR является FcR, который связывается с IgG-антителом (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, в том числе аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. FcγRII-рецепторы включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, различающиеся в основном в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит иммунорецепторный мотив активации (ITAM) на основе тирозина в своем цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит иммунорецепторный мотив ингибирования (ITIM) на основе тирозина в своем цитоплазматическом домене (M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997). FcR рассмотрены в обзоре Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Другие FcR, в том числе FcR, которые будут идентифицированы в будущем, также включены в термин "FcR" в данном описании. Этот термин включает также неонатальный рецептор, FcRn, который является ответственным за перенос материнских IgG в плод (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).

"Эффекторные клетки человека" представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно эти клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и выполняют эффекторную функцию ADCC. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы, причем предпочтительными являются PBMC и MNK-клетки. Эти эффекторные клетки могут быть выделены из природного источника, например крови.

"Комплементзависимая цитотоксичность" (CDC) означает лизис клетки-мишени в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (подходящего подкласса), которые связываются с соответствующим им антигеном. Для оценки активации комплемента может быть выполнен CDC-анализ, например, описанный Gazzano-Santoro et al., в J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).

Термин "фармацевтический состав" относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы биологическая активность активного ингредиента была эффективной, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому состав будет вводиться.

Антитело обладает "биологической активностью" в фармацевтической составе, если биологическая активность антитела в заданный момент времени находится в пределах около 10% (в пределах ошибок анализа) от биологической активности, демонстрируемой в момент времени, когда фармацевтический состав был приготовлен, в соответствии с определенным по способности антитела связывать антиген in vitro или in vivo, и приводит к измеряемой биологической реакции.

"Стабильный" состав представляет собой композицию, в которой белок, по существу, сохраняет свою физическую и/или химическую стабильность при хранении. Стабильность может быть измерена при выбранной температуре в течение выбранного периода времени. Предпочтительно состав стабилен при комнатной температуре (~30°C) или при 40°C в течение по меньшей мере 1 месяца и/или стабилен при 2-8°C в течение по меньшей мере 1 года и предпочтительно в течение по меньшей мере 2 лет. Например, степень агрегации во время хранения может быть использована в качестве индикатора стабильности белка. Таким образом, "стабильным составом" может быть композиция, в которой менее чем около 10% и предпочтительно менее чем около 5% белка присутствуют в виде агрегата в композиции. Различные аналитические методики для измерения стабильности белка известны в данной области и приведены, например, в обзоре Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993).

Повышение "стабильности" содержащего белок состава относится к сокращению (по сравнению с необработанным содержащим белок составом) или предотвращению образования агрегатов в этом составе.

Термин "водный раствор" относится к раствору, в котором вода является растворяющей средой или растворителем. В случае, когда вещество растворяется в жидкости, смесь называется раствором. Растворенным веществом является вещество, которое было растворено, и жидкость, в которой выполняется растворение (в данном случае, вода), представляет собой растворитель.

Термин "стабилизирующий агент" или "стабилизатор" при использовании в данном описании означает химическое соединение или компонент, который добавляется в раствор, или смесь, или суспензию, или композицию, или терапевтическую композицию для ее поддержания в стабильном или неизменном состоянии; или который используется, поскольку он приводит к реакции, влекущей к изменениям в атомах или молекулах, приводящим к более стабильному или неизменяемому состоянию.

Термин "агрегат" или "агрегация" при использовании в данном описании означает соединение или сбор в вещество или целое, например, как при агрегации пептидов, полипептидов, антител или их вариантов. Агрегаты могут быть самоагрегирующимися или могут агрегировать благодаря другим факторам, например, вызывающим агрегацию агентам, осадителям, вследствие перемешивания или посредством других средств и способов, посредством которых пептиды, полипептиды, антитела и их варианты могут быть объединены.

Вызываемая перемешиванием агрегация представляет собой образование агрегатов в содержащем белок растворе, вызываемое перемешиванием, при этом перемешивание запускается посредством встряхивания или взбалтывания.

Антитело, "подверженное агрегации" представляет собой антитело, для которого наблюдалась агрегация с другими молекулами антител, особенно после перемешивания.

Под "ингибированием" агрегации, вызываемой перемешиванием, подразумевается предотвращение, сокращение или снижение количества агрегации, вызываемой перемешиванием, измеренного путем сравнения количества агрегата, присутствующего в содержащем белок растворе, который содержит по меньшей мере один ингибитор агрегации, вызываемой перемешиванием, с количеством агрегата, присутствующего в содержащем белок растворе, который не содержит по меньшей мере одного ингибитора агрегации, вызываемой перемешиванием.

"Ингибирующим агрегацию, вызываемую перемешиванием", количеством алкилгликозида является количество, которое ингибирует выявляемым образом агрегацию белка, вызываемую перемешиванием, по сравнению с идентично обработанным белком в отсутствие алкилгликозида.

"Окисленным" белком в данном описании является белок, в котором один или более его аминокислотных остатков были окислены. В определенных вариантах осуществления окисленной аминокислотой является триптофан. Окисление аминокислот в белках может быть вызвано воздействием света и в этом случае в данном описании оно называется "вызванным светом окислением".

Белок, "чувствительный окислению" представляет собой белок, содержащий один или более остатков, для которых была обнаружена склонность к окислению.

Под "ингибированием" или "предотвращением" окисления предполагается сокращение или снижение количества окисления, измеренное посредством сравнения количества окисления, имеющегося в содержащем белок растворе, который содержит по меньшей мере один ингибитор окисления, с количеством окисления, имеющегося в содержащем белок растворе, который не содержит по меньшей мере одного ингибитора окисления.

"Предотвращающим окисление" количеством алкилгликозида является такое количество алкилгликозида, которое ингибирует или сокращает окисление выявляемым образом по сравнению с идентично обработанным белком в отсутствие алкилгликозида.

Способы, которые могут быть применены в изобретении для измерения агрегации, вызываемой перемешиванием, и/или окисления белка включают гель-электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, капиллярный электрофорез, хроматографию, такую как эксклюзионная хроматография размеров, ионообменная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенными фазами, пептидное картирование, олигосахаридное картирование, масс-спектрометрию, спектроскопию ультрафиолетового поглощения, флуоресцентную спектроскопию, спектроскопию кругового дихроизма, изотермическую титрационную калориметрию, дифференциальную сканирующую калориметрию, аналитическое ультрацентрифугирование, динамическое рассеяние света, протеолиз и перекрестное сшивание, измерение мутности, исследования задержки в фильтрах, иммунологические анализы, анализы связывания флуоресцентного красителя, анализа окрашивания белков, микроскопию и обнаружение агрегатов с помощью ELISA или других анализов связывания.

"Критическая концентрация мицеллообразования" (CMC) представляет собой пороговую концентрацию, при которой поверхностно-активное вещество агрегирует в растворе с образованием скоплений, называемых мицеллами. При использовании в данном описании значения CMC для любого конкретного поверхностно-активного вещества измеряются при 20-25°C в воде, предпочтительно при 25°C в воде, и могут быть выражены в единицах мМ или масса/объем. Поскольку образование мицелл из мономерных компонентов требует равновесия, было установлено наличие узкого диапазона концентраций для мицелл, ниже которого раствор содержит пренебрежимо малое количество мицелл и выше которого практически все дополнительное поверхностно-активное вещество обнаруживается в форме дополнительных мицелл. Набор значений CMC для сотен веществ в водном растворе был подготовлен Mukerjee, P. and Mysels, K.J. (1971) в Critical Micelle Concentrations of Aqueous Surfactant Systems, NSRDS-NBS 36. Superintendent of Documents, U.S. Government Printing Office, Washington, DC. Также см. http://www.anatrace.com/docs/detergent_data.pdf.

Одной из общепринятых методик, используемых для определения CMC, является непосредственное измерение равновесного поверхностного натяжения как функции концентрации поверхностно-активного вещества с использованием поверхностного тензиометра. Другие способы включают измерение интенсивности рассеянного света, растворимости флуоресцентных красителей и т.д. как функции концентрации поверхностно-активного вещества. Эти и другие подобные методики хорошо известны и регулярно применяются в данной области.

"Выделенный" при использовании для описания различных полипептидов и антител, изложенных в данном описании, означает полипептид или антитело, которое было идентифицировано отделено и/или восстановлено из компонента среды его получения. Предпочтительно выделенный полипептид не имеет связей с другими компонентами из среды его получения. Загрязняющие компоненты из среды его получения, такие как возникающие из рекомбинантных трансфецированных клеток, являются компонентами, которые обычно будут создавать помехи диагностическому и терапевтическому применению полипептидов, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые и небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления полипептид будет очищен (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности путем использования секвенатора с вращающейся чашкой, или (2) до гомогенности по SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием красителя синего кумасси или предпочтительно содержащего серебро красителя. Однако обычно выделенный полипептид или антитело получают с использованием по меньшей мере одной стадии очистки.

"Выделенной" молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды и антитела, описанные в данном описании, является молекула нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в среде, в которой она была получена. Предпочтительно эта выделенная нуклеиновая кислота свободна от связи со всеми компонентами, связанными со средой получения. Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды и антитела, описанные в данном описании, находится в форме, отличной от формы или окружения, в которой они находятся в природе. Таким образом, выделенные молекулы нуклеиновых кислот отличаются от нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды и антитела, описанные в данном описании, и существующей в природных условиях в клетке.

Термин "регуляторные последовательности" относится к ДНК-последовательностям, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Регуляторные последовательности, которые пригодны, например, для прокариот, включают промотор, необязательно операторную последовательность и сайт связывания рибосом. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", когда она помещена в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для препоследовательности или секреторного лидера функционально связана с ДНК для полипептида, если она экспрессируется в виде пребелка, который участвует в секреции этого полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию этой последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, что он облегчает трансляцию. Обычно термин "функционально связанные" означает, что связываемые ДНК-последовательности являются смежными и в случае секреторного лидера смежными и находящимися в одной рамке считывания. Однако энхансеры необязательно должны быть смежными. Связывание выполняется лигированием в удобных сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.

Термин "эпитоп-меченый" при использовании в данном описании относится к химерному полипептиду, содержащему описанные в данном описании полипептид или антитело, слитые с "полипептидом-меткой". Полипептид-метка имеет достаточно остатков для создания эпитопа, против которого может быть получено антитело, но все еще является достаточно коротким, чтобы не мешать активности полипептида, с которым он слит. Полипептид-метка предпочтительно является достаточно уникальным, так что антитело, по существу, не реагирует перекрестно с другими эпитопами. Подходящие полипептиды-метки обычно имеют по меньшей мере шесть аминокислотных остатков и обычно имеют приблизительно 8-50 аминокислотных остатков (предпочтительно около 10-20 аминокислотных остатков).

Как использовано в данном описании, термин «иммуноадгезин» означает подобные антителу молекулы, которые объединяют в себе специфичность связывания гетерологичного белка ("адгезина") с эффекторными функциями константных доменов иммуноглобулина. Структурно иммуноадгезины представляют собой слияние аминокислотной последовательности с желаемой специфичностью связывания, отличной от участка распознавания антигена и связывания антитела (т.е. "гетерологичной"), и последовательности константного домена иммуноглобулина. Адгезиновая часть молекулы иммуноадгезина обычно представляет собой последовательность смежных аминокислот, содержащую по меньшей мере сайт связывания рецептора или лиганда. Последовательность константного домена иммуноглобулина в иммуноадгезине может быть получена из любого иммуноглобулина, такого как подтипы IgG-1, IgG2, IgG-3 или IgG-4, IgA (в том числе IgA-1 и IgA-2), IgE, IgD или IgM. Такие Ig-слияния предпочтительно включают замену по меньшей мере одного вариабельного района в молекуле Ig на домен описанного в данном описании полипептида или антитела. В особенно предпочтительном варианте осуществления слияние иммуноглобулина включает шарнирную область, области СН2 и СН3 или шарнирную область, области СН1, СН2 и СН3 молекулы IgG1. В отношении получения слияний иммуноглобулинов см. также патент США 5428130, выданный 27 июня 1995 года.

"Изотонической" является композиция, которая имеет, по существу, такое же осмотическое давление, что и кровь человека. Изотонические композиции обычно будут иметь осмотическое давление от около 250 до 300 мОсм. Термин "гипотоническая" описывает композицию с осмотическим давлением ниже осмотического давления крови человека. Соответственно термин "гипертоническая" используется для описания композиции с осмотическим давлением выше осмотического давления крови человека. Изотоничность может быть измерена, например, с использованием парофазного осмометра или криоскопического осмометра. Композиции по изобретению являются гипертоническими в результате добавления соли и/или буфера.

"Восстановленной" композицией является композиция, которая была получена растворением лиофилизированной композиции белка или антитела в разбавителе таким образом, чтобы этот белок был диспергирован в восстановленной композиции. Такая восстановленная композиция может быть использована для введения (например, парентерального введения) пациенту, для которого проводят лечение представляющим интерес белком, и в некоторых вариантах осуществления она может представлять собой композицию, подходящую для подкожного введения.

"Фармацевтически приемлемая кислота" включает неорганические и органические кислоты, которые не являются токсичными в концентрации и при использовании способов, с помощью которых их получают. Например, подходящие неорганические кислоты включают хлористоводородную, перхлорную, бромистоводородную, иодистоводородную, азотную, серную, сульфоновую, сульфиновую, сульфаниловую, фосфорную, угольную кислоту и т.д. Подходящие органические кислоты включают содержащие алкил с прямой или разветвленной цепью, ароматические, циклические, циклоалифатические, арилалифатические, гетероциклические, насыщенные, ненасыщенные, моно-, ди- и трикарбоновые кислоты, в том числе, например, муравьиную, уксусную, 2-гидроксиуксусную, трифторуксусную, фенилуксусную, триметилуксусную, трет-бутилуксусную, антраниловую, пропановую, 2-гидроксипропановую, 2-оксопропановую, пропандиовую, циклопентанпропионовую, циклопентанпропионовую, 3-фенилпропионовую, бутановую, бутандиовую, бензойную, 3-(4-гидроксибензоил)бензойную, 2-ацетоксибензойную, аскорбиновую, коричную, лаурилсерную, стеариновую, муконовую, миндальную, янтарную, эмбоновую, фумаровую, яблочную, малеиновую, гидроксималеиновую, малоновую, молочную, лимонную, винную, гликолевую, гликоновую, глюконовую, пировиноградную, глиоксалевую, щавелевую, метилсульфониловую, янтарную, салициловую, фталевую, пальмовую, пальмеиновую, тиоциановую, метансульфоновую, этансульфоновую, 1,2-этандисульфоновую, 2-гидроксиэтансульфоновую, бензолсульфоновую, 4-хлорбензолсульфоновую, нафталин-2-сульфоновую, п-толуолсульфоновую, камфорсульфоновую, 4-метилбицикло[2.2.2]окт-2-ен-1-карбоновую, глюкогептоновую, 4,4'-метиленбис-3-(гидрокси-2-ен-1-карбоновую кислоту), гидроксинафтойную кислоты.

"Фармацевтически приемлемые основания" включают неорганические и органические основания, которые не являются токсичными в концентрации и при использовании способов, с помощью которых их получают. Например, подходящие основания включают основания, образованные из образующих неорганическое основание металлов, таких как литий, натрий, калий, магний, кальций, аммоний, железо, цинк, медь, марганец, алюминий, N-метилглюкамин, морфолин, пиперидин и органические нетоксичные основания, включающие первичный, вторичный и третичный амин, замещенные амины, циклические амины и основные ионообменные смолы [например, N(R^')₄ ⁺ (где R' означает независимо Н или С_1-4алкил, например, аммоний, Трис)], например изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипропиламин, этаноламин, 2-диэтиламиноэтанол, триметамин, дициклогексиламин, лизин, аргинин, гистидин, кофеин, прокаин, гидрабамин, холин, бетаин, этилендиамин, глюкозамин, метилглюкамин, теобромин, пурины, пиперазин, пиперидин, N-этилпиперидин, полиаминные смолы и т.п. Особенно предпочтительными органическими нетоксичными основаниями являются изопропиламин, диэтиламин, этаноламин, триметамин, дициклогексиламин, холин и кофеин.

Дополнительные фармацевтически приемлемые кислоты и основания, используемые в изобретении, включают кислоты и основания, полученные из аминокислот, например гистидина, глицина, фенилаланина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, лизина и аспарагина.

"Фармацевтически приемлемые" буферы и соли включают буферы и соли, полученные как из кислотно-аддитивных, так и основно-аддитивных солей вышеуказанных кислот и оснований. Конкретные буферы и/или соли включают гистидин, сукцинат и ацетат.

"Лиопротектор" представляет собой молекулу, которая при объединении с представляющим интерес белком значимо предотвращает или уменьшает физико-химическую нестабильность белка при лиофилизации и последующем хранении. Примеры лиопротекторов включают сахара и соответствующие им сахароспирты; аминокислоту, такую как мононатрийглутамат или гистидин; метиламин, такой как бетаин; лиотропную соль, такую как сульфат магния; полиол, такой как трехатомные или более высокомолекулярные сахароспирты, например глицерин, декстран, эритрит, глицерол, арабит, ксилит, сорбит и маннит; пропиленгликоль; полиэтиленгликоль; Pluronics®; и их комбинации. Дополнительные примеры лиопротекторов включают глицерин и желатин, и сахара меллибиозу, мелецитозу, рафинозу, маннотриозу и стахиозу. Примеры редуцирующих сахаров включают глюкозу, мальтозу, лактозу, мальтулозу, изомальтулозу и лактулозу. Примеры нередуцирующих сахаров включают нередуцирующие гликозиды полигидроксисоединений, выбранные из сахароспиртов и других полиспиртов с прямой цепью. Предпочтительными сахароспиртами являются моногликозиды, в частности соединения, полученные восстановлением дисахаридов, таких как лактоза, мальтоза, лактулоза и мальтулоза. Гликозидная боковая группа может быть либо глюкозидной, либо галактозидной. Дополнительными примерами сахароспиртов являются глюцит, мальтит, лактит и изомальтоза. Предпочтительными лиопротекторами являются нередуцирующие сахара трегалоза или сахароза.

Лиопротектор добавляют к предварительно лиофилизированной композиции в "лиопротективном количестве", что означает, что после лиофилизации белка в присутствии лиопротективного количества лиопротектора белок, по существу, сохраняет свою физико-химическую стабильность при лиофилизации и хранении.

"Фармацевтически приемлемым сахаром" является молекула, которая при объединении с представляющим интерес белком предотвращает или уменьшает физико-химическую нестабильность этого белка при хранении. В случае, когда композиция должна быть лиофилизирована и затем восстановлена, "фармацевтически приемлемые сахара" могут также называться "лиопротектором". Примеры сахаров и соответствующих им сахароспиртов включают аминокислоту, такую как мононатрийглутамат или гистидин; метиламин, такой как бетаин; лиотропную соль, такую как сульфат магния; полиол, такой как трехатомные или более высокомолекулярные сахароспирты, например глицерин, декстран, эритрит, глицерол, арабит, ксилит, сорбит и маннит; пропиленгликоль; полиэтиленгликоль; Pluronics®; и их комбинации. Дополнительные примеры лиопротекторов включают глицерин и желатин, и сахара меллибиозу, мелецитозу, рафинозу, маннотриозу и стахиозу. Пример редуцирующих сахаров включают глюкозу, мальтозу, лактозу, мальтулозу, изомальтулозу и лактулозу. Примеры нередуцирующих сахаров включают нередуцирующие гликозиды полигидроксисоединений, выбранных из сахароспиртов и других полиспиртов с прямой цепью. Предпочтительными сахароспиртами являются моногликозиды, в частности соединения, полученные восстановлением дисахаридов, таких как лактоза, мальтоза, лактулоза и мальтулоза. Гликозидная боковая группа может быть либо глюкозидной, либо галактозидной. Дополнительными примерами сахароспиртов являются глюцит, мальтит, лактит и изомальтоза. Предпочтительными фармацевтически приемлемыми сахарами являются нередуцирующие сахара трегалоза или сахароза.

Фармацевтически приемлемые сахара добавляют к композиции в "защитном количестве" (например, перед лиофилизацией), что означает, что белок, по существу, сохраняет свою физико-химическую стабильность во время хранения (например, после восстановления и хранения).

Представляющим интерес "разбавителем" в данном описании является разбавитель, который является фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксичным при введении человеку) и который может использоваться для получения жидкой композиции, такой как композиция, восстановленная после лиофилизации. Примеры разбавителей включают стерильную воду, бактериостатическую воду для инъекции (BWFI), раствор с забуференным рН (например, забуференный фосфатом солевой раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы. В альтернативном варианте осуществления разбавители могут включать водные растворы солей и/или буферов.

«Консервант» представляет собой соединение, которое может быть добавлено к композициям по изобретению для снижения бактериальной активности. Например, добавление консерванта может облегчать получение композиции для многоразового применения (многодозовой композиции). Примеры возможных консервантов включают октадецилдиметилбензиламмонийхлорид, гексаметонийхлорид, бензалконийхлорид (смесь алкилбензилдиметиламмонийхлоридов, в которых алкильные группы являются длинноцепочечными), и бензетонийхлорид. Другие типы консервантов включают ароматические спирты, такие как фенол, бутиловый и бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол. Наиболее предпочтительным консервантом в данном описании является бензиловый спирт.

Термин "лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и профилактическим или превентивным мерам. Индивиды, нуждающиеся в лечении, включают как индивидов, уже имеющих нарушение, так и индивидов, у которых должно быть предотвращено нарушение.

"Млекопитающим" для целей лечения является любое животное, классифицируемое как млекопитающее, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных и животных зоопарков, используемых в спорте животных или домашних животных, таких как собаки, лошади, кролики, крупный рогатый скот, свиньи, хомяки, песчанки, мыши, хорьки, крысы, кошки и т.д. Предпочтительно млекопитающим является человек.

"Нарушение" представляет собой любое состояние, лечение которого белком может быть целесообразным. Оно включает хронические и острые нарушения или заболевания, включая патологические состояния, которые предрасполагают к возникновению у млекопитающего рассматриваемого нарушения. Неограничивающие примеры нарушений, на которые может быть направлено лечение, включают карциномы и воспаления.

"Терапевтически эффективное количество" представляет собой по меньшей мере минимальную концентрацию, требуемую для осуществления измеримого улучшения или предупреждения конкретного нарушения. Терапевтически эффективное количество известных белков хорошо известно в данной области, в то время как эффективные количества белков, которые будут обнаружены ниже, могут быть определены стандартными методиками, которые находятся в компетенции специалиста в данной области техники, например врача общей практики.

Способы получения антител (включая антител, конъюгированных с токсином) и других белков, которые могут быть включены в описанные в данном описании композиции, хорошо известны в данной области и подробно описаны, например, в WO2007/001851.

Антитела и другие белки могут быть включены в композиции по изобретению в водной или лиофилизированной форме, при этом в последнем случае они могут быть восстановлены до водной формы.

Описанные в данном описании композиции могут быть также получены в виде восстановленных лиофилизированных композиций. Описанные в данном описании белки или антитела лиофилизируют и затем восстанавливают для получения стабильных жидких композиций по изобретению. В этом конкретном варианте осуществления после получения представляющего интерес белка, как описано выше, получают «предварительно лиофилизированную композицию». Количество белка, присутствующего в «предварительно лиофилизированной композиции», определяют с учетом желаемого количества дозы, способа(ов) введения и т.д. Например, исходная концентрация интактного антитела может составлять от около 2 мг/мл до около 50 мг/мл, предпочтительно от около 5 мг/мл до около 40 мг/мл и наиболее предпочтительно около 20-30 мг/мл.

Белок, который может использоваться в виде композиции, обычно присутствует в растворе. Например, в композициях по изобретения белок может присутствовать в растворе с забуференным рН при рН около 4-8 и предпочтительно около 5-7. Концентрация буфера может составлять от около 1 мМ до около 20 мМ, альтернативно от около 3 мМ до около 15 мМ, в зависимости, например, от буфера и желаемой тоничности данной композиции (например, восстановленной композиции). Примерами буферов и/или солей являются буферы и соли, которые являются фармацевтически приемлемыми и могут быть образованы из подходящих кислот, оснований и их солей, таких как кислоты, основания и соли, которые определяются термином "фармацевтически приемлемые" кислоты, основания и соли.

В одном из вариантов осуществления к предварительно лиофилизированной композиции добавляют лиопротектор. Количество лиопротектора в предварительно лиофилизированной композиции обычно является таким, чтобы при восстановлении полученная предварительно лиофилизированная композиция была изотонической. Однако также могут использоваться гипертонические восстановленные композиции. Кроме того, количество лиопротектора не должно быть слишком низким, таким, чтобы при лиофилизации имело место неприемлемое количество разложения/агрегации данного белка. Однако иллюстративными концентрациями лиопротектора в предварительно лиофилизированной композиции являются концентрации от около 10 мМ до около 400 мМ, альтернативно от около 30 мМ до около 300 мМ, альтернативно от около 50 мМ до около 100 мМ. Примеры лиопротекторов включают сахара и сахароспирты, такие как сахароза, манноза, трегалоза, глюкоза, сорбит, маннит. Однако при конкретных обстоятельствах некоторые лиопротекторы могут также способствовать увеличению вязкости композиции. Поэтому следует обращать внимание на то, чтобы были выбраны конкретные лиопротекторы, которые минимизируют или нейтрализуют этот эффект. Дополнительными лиопротекторами являются лиопротекторы, описанные выше под определением "лиопротекторы", также называемые в данном описании "фармацевтически приемлемыми сахарами".

Отношение белка к лиопротектору может изменяться для каждого конкретного белка или антитела и комбинации лиопротекторов. В случае, когда в качестве выбранного белка выступает антитело, и в качестве лиопротектора выступает сахар (например, сахароза или трегалоза), для создания изотонической восстановленной композиции с высокой концентрацией белка молярное отношение лиопротектора к антителу может составлять от около 100 до около 1500 моль лиопротектора на 1 моль антитела и предпочтительно от около 200 до около 1000 моль лиопротектора на 1 моль антитела, например от около 200 до около 600 моль лиопротектора на 1 моль антитела.

Смесь лиопротектора (такого как сахароза или трегалоза) и наполнителя (например, маннита или глицина) может быть использована при получении предварительно лиофилизированной композиции. Наполнитель может дать возможность получения однородного лиофилизированного остатка без избыточных полостей в нем и т.д. В предварительно лиофилизированную композицию (и/или лиофилизированную композицию, и/или восстановленную композицию) могут быть включены другие фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы, такие как описано в Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980), при условии, что они не действуют неблагоприятным образом на желаемые характеристики композиции. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными в отношении реципиентов при используемых дозах и концентрациях и включают дополнительные буферные агенты; консерванты; сорастворители; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; хелатообразующие агенты, такие как EDTA; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); биоразлагаемые полимеры, такие как полиэфиры; и/или солеобразующие противоионы, такие как натрий.

Композиция изобретения может также содержать более чем один белок, если это необходимо для конкретного подлежащего лечению показания, предпочтительно, белки с дополняющими активностями, которые не влияют неблагоприятным образом на другой белок. Например, может быть желательным предоставление двух или более антител, которые связываются с желаемой мишенью (например, рецептором или антигеном), в единой композиции. Такие белки предпочтительно присутствуют в этой комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемой цели.

Композиции, которые предназначены для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко достигается фильтрованием через стерильные фильтрующие мембраны до или после лиофилизации и восстановления. Альтернативно стерильность полной смеси может достигаться автоклавированием ингредиентов, за исключением белка, при около 120°С, например, в течение около 30 мин.

После смешивания вместе белка, необязательного лиопротектора и других необязательных компонентов полученную композицию лиофилизируют. Для этой цели могут быть использованы многочисленные сушилки с вымораживанием, такие как сушилки с вымораживанием Hull50^TM (Hull, США) или GT20^TM (Leybold-Heraeus, Германия). Лиофилизацию выполняют посредством вымораживания композиции и последующей сублимации льда из замороженного содержимого при температуре, подходящей для первичной сушки. В этих условиях температура продукта находится ниже точки эвтектики или температуры разрушения этой композиции. Обычно температура выдерживания для первичной сушки будет находиться в диапазоне от около -30 до 25°С (при условии, что этот продукт остается замороженным во время первичной сушки) при подходящем давлении, обычно в диапазоне приблизительно 50-250 мТорр. Состав, размер и тип контейнера для образца (например, стеклянного флакона) и объем жидкости будут в основном определять время, необходимое для сушки, которое может находиться в диапазоне от нескольких часов до нескольких дней (например, 40-60 ч). Необязательно может также выполняться стадия вторичной сушки в зависимости от желаемого остаточного уровня влажности в данном продукте. Температура, при которой проводят вторичную сушку, находится в диапазоне около 0-40°С в зависимости прежде всего от типа и размера контейнера и типа используемого белка. Например, температура выдерживания на протяжении фазы лиофилизации полного удаления воды может составлять около 15-30°С (например, около 20°С). Время и давление, требуемые для вторичной сушки, будут такими, которые дают подходящий лиофилизированный остаток в зависимости, например, от температуры и других параметров. Время вторичной сушки определяется желаемым остаточным уровнем влажности в данном продукте и обычно составляет около 5 ч (например, 10-15 ч). Давление может быть таким же, какое использовали во время стадии первичной сушки. Условия лиофилизации могут варьироваться в зависимости от конкретной композиции и размера флакона.

Перед введением пациенту лиофилизированную композицию восстанавливают фармацевтически приемлемым разбавителем таким образом, чтобы концентрация белка в этой восстановленной композиции составляла по меньшей мере около 50 мг/мл, например, от около 50 мг/мл до около 400 мг/мл, альтернативно от около 80 мг/мл до около 300 мг/мл, альтернативно от около 90 мг/мл до около 150 мг/мл. Такие высокие концентрации белка в восстановленной композиции считаются особенно выгодными, когда предполагается подкожная доставка восстановленной композиции. Однако для других способов введения, таких как внутривенное введение, могут быть желательными более низкие концентрации белка в восстановленной композиции (например, около 5-50 мг/мл или около 10-40 мг/мл белка в восстановленной композиции). В некоторых вариантах осуществления концентрация белка в восстановленной композиции является значительно более высокой, чем концентрация белка в предварительно лиофилизированной композиции. Например, концентрация белка в восстановленной композиции может превышать концентрацию предварительно лиофилизированной композиции приблизительно в 2-40 раз, альтернативно в 3-10 раз, альтернативно в 3-6 раз (например по меньшей мере в три раза или по меньшей мере в четыре раза).

Восстановление обычно выполняют при температуре около 25°С для обеспечения полной гидратации, хотя, если это необходимо, могут быть использованы другие температуры. Время, необходимое для восстановления, будет зависеть, например, от типа разбавителя, количества вспомогательного(ых) вещества(в) и белка. Примеры разбавителей включают стерильную воду, бактериостатическую воду для инъекции (BWF), раствор с забуференным рН (например, забуференный фосфатом солевой раствор), стерильный солевой раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы. Разбавитель необязательно содержит консервант. Примеры консервантов описаны выше, причем предпочтительными консервантами являются ароматические спирты, такие как бензиловый спирт или фенолоспирт. Количество используемого консерванта определяют посредством оценочного тестирования различных концентраций консерванта на совместимость с белком и испытанием эффективности консерванта. Например, если консервант является ароматическим спиртом (таким как бензиловый спирт), он может присутствовать в количестве около 0,1-2,0% и предпочтительно около 0,5-1,5%, но наиболее предпочтительно около 1,0-1,2%.

Предпочтительно восстановленная композиция имеет менее 6000 частиц на флакон, которые имеют размер ≥10 мкм.

Терапевтические композиции подготавливают для хранения посредством смешивания активного ингредиента, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 18^th edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 [1990]). Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными в отношении реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают буферы, антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту, метионин, витамин Е, метабисульфит натрия, консерванты, агенты изотоничности, стабилизаторы, комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок) и/или хелатообразующие агенты, такие как EDTA.

В случае, когда терапевтическим агентом является фрагмент антитела, предпочтительным является наименьший фрагмент, который специфически связывается со связывающим доменом белка-мишени. Например, на основе последовательностей вариабельных областей антител могут быть сконструированы фрагменты антител или даже пептидные молекулы, которые сохраняют способность связывания с последовательностью белка-мишени. Такие пептиды могут быть синтезированы химически и/или получены технологией рекомбинантных ДНК (Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 [1993]).

Для контроля рН в диапазоне, который оптимизирует терапевтическую эффективность, используют буферы, особенно в том случае, когда стабильность зависит от рН. Буферы присутствуют предпочтительно в концентрациях в диапазоне от около 50 мМ до около 250 мМ. Подходящие буферные агенты для использования в изобретении включают как органические, так и неорганические кислоты и их соли. Например, цитрат, фосфат, сукцинат, тартрат, фумарат, глюконат, оксалат, лактат, ацетат. Кроме того, буферы могут состоять из солей гистидина и триметиламина, таких как Трис.

Для замедления роста микробов добавляют консерванты, и они обычно присутствуют в диапазоне 0,2-1,0% (масса/объем). Подходящие консерванты для использования по изобретению включают октадецилдиметилбензиламмонийхлорид; гексаметонийхлорид; бензалконийгалогениды (например, хлорид, бромид, иодид), бензетонийхлорид; тимерозал, фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехин; резорцин; циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол.

Агенты тоничности, иногда называемые "стабилизаторами", присутствуют для коррекции или поддержания тоничности жидкой композиции. При применении с большими заряженными биомолекулами, такими как белки и антитела, их часто называют "стабилизаторами", так как они могут взаимодействовать с заряженными группами боковых цепей аминокислот, ослабляя, тем самым, потенциал в отношении меж- и внутриклеточных взаимодействий. Агенты тоничности могут присутствовать в произвольном количестве от 0,1 до 25% по массе, предпочтительно 1-5% по массе с учетом относительных количеств других ингредиентов. Агенты тоничности включают многоатомные сахароспирты, предпочтительно трехатомные или более высокоатомные сахароспирты, такие как глицерин, эритрит, арабит, ксилит, сорбит и маннит.

Дополнительные эксципиенты включают агенты, которые могут служить в качестве одного или нескольких из следующих компонентов: (1) наполнителей, (2) усилителей растворимости, (3) стабилизаторов и (4) агентов, предотвращающих денатурацию или прикрепление к стенке контейнера. Такие эксципиенты включают многоатомные сахароспирты (перечисленные выше); аминокислоты, такие как аланин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин, лизин, орнитин, лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин и т.д.; органические сахара или сахароспирты, такие как сахароза, лактоза, лактит, трегалоза, стахиоза, манноза, сорбоза, ксилоза, рибоза, рибит, миоинозитоза, миоинозит, галактоза, галактит, глицерин, циклит (например, инозит), полиэтиленгликоль; содержащие серу восстанавливающие агенты, такие как мочевина, глутатион, тиоктовая кислота, тиогликолат натрия, тиоглицерин, α-монотиоглицерин и тиосульфат натрия; низкомолекулярные белки, такие как сывороточный альбумин человека, бычий сывороточный альбумин, желатин или другие иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; моносахариды (например, ксилозу, маннозу, фруктозу, глюкозу); дисахариды (например, лактозу, мальтозу, сахарозу); трисахариды, такие как рафиноза; и полисахариды, такие как декстрин или декстран.

Для того чтобы композиции могли быть использованы для введения in vivo, они должны быть стерильными. Композиция может быть стерилизована посредством фильтрования через стерильные фильтрующие мембраны. Терапевтические композиции, описанные в данном описании, обычно помещают в контейнер, имеющий стерильный входной канал, например мешочек для внутривенного раствора, или сосуд, имеющий пробку, протыкаемую иглой для гиподермальной инъекции.

Путь введения соответствует известным и общепризнанным способам, таким как единственное или множественное болюсное введение или инфузия в течение продолжительного периода времени подходящим способом, например инъекция или инфузия подкожным, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутриартериальным путем, введение в повреждение или внутрь сустава, местное введение, ингаляция или способ поддерживаемого или пролонгированного высвобождения.

Описанная в данном описании композиция может также содержать более одного активного соединения, если это необходимо для конкретного подлежащего лечению показания, предпочтительно она может содержать соединения с дополняющими активностями, которые не действуют неблагоприятным образом друг на друга. Альтернативно или дополнительно композиция может содержать цитотоксический агент, цитокин или ингибирующий рост агент. Такие молекулы предпочтительно присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемых целей.

Активные ингредиенты могут быть также заключены в микрокапсулы, полученные, например, посредством методик коацервации или посредством межфазной полимеризации, например микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы или желатиновые микрокапсулы, и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы или нанокапсулы) или в макроэмульсиях. Такие методики изложены в Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, см. выше.

Могут быть получены препараты пролонгированного высвобождения. Подходящие примеры препаратов пролонгированного высвобождения включают полупроницаемые матриксы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, причем эти матриксы находятся в виде формованных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриксов пролонгированного высвобождения включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразлагаемый этилен-винилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота. Микроинкапсулирование рекомбинантных белков для пролонгированного высвобождения было успешно выполнено с гормоном роста человека (rhGH), интерфероном человека (rhIFN-), интерлейкином-2 и MN rpg 120. Johnson et al., Nat. Med. 2: 795-799 (1996); Yasuda et al., Biomed. Ther. 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8: 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds., (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692; WO 96/40072; WO 96/07399 и патент США 5654010.

Композиции пролонгированного высвобождения из таких белков могут быть разработаны с использованием сополимера полимолочной и гликолевой кислот (PLGA) вследствие его биосовместимости и широкого диапазона биодеградируемых свойств. Продукты разложения PLGA, молочная и гликолевая кислоты, могут быстро выводиться из организма человека. Кроме того, расщепляемость этого полимера может быть доведена с месяцев до лет в зависимости от его молекулярной массы и состава. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", in Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker; New York, 1990), M. Chasin and R. Langer (Eds.) pp. 1-41.

В то время как такие полимеры, как этилен - винилацетат и молочная кислота - гликолевая кислота, позволяют высвобождать молекулы в течение более 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. Когда инкапсулированные антитела остаются в организме в течение продолжительного времени, они могут денатурироваться или агрегировать в результате воздействия влаги при 37°С, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. Могут быть разработаны рациональные стратегии для стабилизации в зависимости от участвующего в этом механизма. Например, если обнаружено, что механизмом агрегации является образование межмолекулярной S-S-связи посредством взаимообмена тиол-дисульфид, стабилизация может быть достигнута модификацией сульфгидрильных остатков, лиофилизацией из кислотного раствора, регуляцией содержания влаги, использованием подходящих добавок и разработкой специфических композиций с использованием полимерного матрикса.

Для получения композиций белков или антител, описанных в данном описании, также могут быть использованы липосомные или протеиноидные композиции (патенты США 4925673 и 5013556).

Стабильность описанных в данном описании белков и антител может быть повышена посредством использования нетоксичных "водорастворимых солей поливалентных металлов". Примеры включают Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, Sn²⁺, Sn³⁺, Al²⁺ и Al³⁺. Примеры анионов, которые могут образовывать водорастворимые соли с вышеуказанными катионами поливалентных металлов, включают анионы, образованные из неорганических кислот и/или органических кислот. Такие водорастворимые соли имеют растворимость в воде (при 20°C), составляющую по меньшей мере около 20 мг/мл, альтернативно по меньшей мере около 100 мг/мл, альтернативно по меньшей мере около 200 мг/мл.

Подходящие неорганические кислоты, которые могут быть использованы для образования "водорастворимых солей поливалентных металлов", включают хлористоводородную, уксусную, серную, азотную, тиоциановую и фосфорную кислоту. Подходящие органические кислоты, которые могут быть использованы, включают алифатические карбоновые кислоты и ароматические кислоты. Алифатические кислоты в пределах данного определения могут быть определены как насыщенные или ненасыщенные С_2-9-карбоновые кислоты (например, алифатические моно-, ди- и трикарбоновые кислоты). Например, примеры монокарбоновых кислот в данном определении включают насыщенные С_2-9-монокарбоновые кислоты: уксусную, пропионовую, масляную, валериановую, капроновую, энантовую, каприловую, пеларгоновую и каприоновую кислоты, и ненасыщенные С_2-9-монокарбоновые кислоты: акриловую, пропиоловую, метакриловую, кротоновую и изокротоновую кислоты. Примеры дикарбоновых кислот включают насыщенные С_2-9-дикарбоновые кислоты: малоновую, янтарную, глутаровую, адипиновую и пимелиновую кислоты, тогда как ненасыщенные С_2-9-дикарбоновые кислоты включают малеиновую, фумаровую, цитраконовую и мезаконовую кислоты. Примеры трикарбоновых кислот включают насыщенные С_2-9-трикарбоновые кислоты: трикарбаллиловую и 1,2,3-бутантрикарбоновую кислоту. Кроме того, карбоновые кислоты этого определения могут также содержать одну или две гидроксильные группы для образования гидроксикарбоновых кислот. Примеры гидроксикарбоновых кислот включают гликолевую, молочную, глицериновую, тартроновую, яблочную, винную и лимонную кислоты. Ароматические кислоты в данном определении включают бензойную и салициловую кислоту.

Обычно используемые водорастворимые соли поливалентных металлов, которые могут быть использованы для улучшения стабилизации инкапсулированных полипептидов по изобретению, включают, например: (1) соли металлов и неорганических кислот, выбранные из галогенидов (например, хлорид цинка, хлорид кальция), сульфатов, нитратов, фосфатов и тиоцианатов; (2) соли металлов и алифатических карбоновых кислот (например, ацетат кальция, ацетат цинка, пропионат кальция, гликолат цинка, лактат кальция, лактат цинка и тартрат цинка); и (3) соли металлов и ароматических карбоновых кислот, выбранные из бензоатов (например, бензоат цинка) и салицилатов.

Для профилактики или лечения заболевания подходящая доза активного агента будет зависеть от типа заболевания, на которое направлено лечение, как определенно выше, тяжести и протекания этого заболевания, от того, вводится ли этот агент для профилактических или терапевтических целей, от предыдущей терапии, клинической истории пациента и реакции на данный агент, а также от мнения лечащего врача. Этот агент вводят пациенту подходящим способом единовременно или на протяжении ряда введений.

Способ по изобретению может комбинироваться с известными способами лечения нарушения в виде комбинированных или дополнительных стадий лечения, либо в виде дополнительных компонентов терапевтической композиции.

Дозы и желаемая концентрация лекарственного средства в фармацевтической композиции по изобретению могут изменяться в зависимости от конкретного предполагаемого применения. Определение подходящей дозы или способа введения находится в компетенции специалиста в данной области техники. Эксперименты на животных обеспечивают надежную рекомендацию для определения эффективных доз для терапии человека. Межвидовое масштабирование эффективных доз может выполняться в соответствии с принципами, установленными Mordenti, J. and Chappell, W. в "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics", In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46.

При введении in vivo описанных в данном описании полипептидов или антител нормальные количества доз могут варьироваться от около 10 нг/кг до около 100 мг/кг массы тела млекопитающего или большего количества на день, предпочтительно, от около 1 мг/кг/день до 10 мг/кг/день в зависимости от способа введения. Руководство в отношении конкретных доз и способов доставки приведено в литературе (патенты США 4657760; 5206344 или 5225212). В объем изобретения входят различные композиции, которые будут эффективными для различных способов лечения и различных нарушений, и введение, предназначенное для лечения конкретного органа или ткани, может потребовать доставки способом, отличающимся от способа доставки для другого органа или ткани. Кроме того, дозы могут вводиться посредством одного введения или нескольких отдельных введений или посредством непрерывной инфузии. Для повторяемых введений на протяжении нескольких дней или более длительного периода времени в зависимости от состояния, лечение поддерживают до тех пор, пока не происходит желаемое подавление симптомов заболевания. Однако могут быть целесообразными и другие схемы введения доз. Ход такой терапии можно легко подвергнуть мониторингу с использованием общепринятых способов и анализов.

Композиции по изобретениию, включая, но, не ограничиваясь ими, восстановленные композиции, вводят животному, нуждающемуся в лечении данным белком, предпочтительно человеку, согласно известным способам, таким как внутривенное введение в виде болюса или непрерывной инфузии в течение некоторого периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацереброспинальным, подкожным, внутрисуставным, интрасиновиальным, подоболочечным, пероральным, местным или ингаляционным способом.

В предпочтительных вариантах осуществления композиции вводят млекопитающему подкожным (то есть под кожу) введением. Для таких целей композиция может бить инъецирована с использованием шприца. Однако имеются другие устройства для введения композиции, такие как инъекционные устройства (например, устройства Inject-ease™ и Genject™); ручки для инъекции (такие как GenPen™); автоинъекторные устройства, безыгольные устройства (например, MediJector™ и BioJector™) и подкожные системы доставки в виде пластырей.

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к наборам для элемента введения отдельных доз. Такие наборы содержат контейнер водной композиции терапевтического белка или антитела, включающий либо однокамерные, либо многокамерные предварительно наполненные шприцы. Примеры заранее наполненных шприцов доступны от Vetter GmbH, Ravensburg, Германия.

Подходящая доза ("терапевтически эффективное количество") белка будет зависеть, например, от подлежащего лечению состояния, тяжести и протекания состояния, от того, вводят ли этот белок для профилактических или терапевтических целей, предыдущей терапии, клинической истории пациента и реакции на белок, типа используемого белка, а также от мнения лечащего врача. Белок подходящим способом вводят пациенту единовременно или на протяжении ряда введений, и он может вводиться пациенту в любое время после установления диагноза. Белок вводят как единственное терапевтическое средство или вместе с другими лекарственными средствами или способами терапии, применимыми в лечении рассматриваемого состояния.

В случае, когда выбранным белком является антитело, начальной кандидатной дозой является доза около 0,1-20 мг/кг для введения пациенту, например, посредством одного или более отдельных введений. Однако могут быть использованы и другие схемы введения доз. Ход такой терапии легко подвергается мониторингу с помощью общепринятых методик.

В еще одном варианте осуществления изобретения представлено изделие, которое содержит данную композицию и предпочтительно содержит инструкцию для ее применения. Это изделие содержит контейнер. Подходящие контейнеры включают, например, сосуды, флаконы (например, двухкамерные флаконы), шприцы (например, однокамерные или двухкамерные шприцы) и тест-пробирки. Контейнер может быть сделан из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию и имеет этикетку или прилагаемую к нему аннотацию с указаниями по восстановлению и/или использованию композиции. На этикетке может быть дополнительно указано, что данная композиция применима или предназначена для подкожного введения. Контейнер, содержащий данную композицию, может быть флаконом многоразового использования, который позволяет выполнять повторные введения (например, от 2 до 6 введений) восстановленной композиции. Изделие может дополнительно включать второй контейнер, содержащий подходящий разбавитель (например, BWFI). При смешивании разбавителя и лиофилизированной композиции конечная концентрация белка в восстановленной композиции будет обычно составлять по меньшей мере 50 мг/мл. Изделие может дополнительно включать другие материалы, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения пользователя, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши упаковки с инструкциями по применению.

Изобретение будет более понятно со ссылкой на нижеследующие примеры. Однако примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Все ссылки в описании настоящим включены посредством ссылки.

Пример 1: Изучение алкилгликозидов в качестве неионных поверхностно-активных веществ для предотвращения агрегации белков/антител

В данном примере иллюстрируется применение алкилгликозидов в качестве неионных поверхностно-активных веществ для предотвращения агрегации антител в водном растворе. Защитное действие различных алкилгликозидов и полисорбата 20 против агрегации различных моноклональных антител, вызываемой перемешиванием, в растворе оценивали для двух разных форм перемешивания: встряхивания и взбалтывания.

Вызываемая встряхиванием агрегация

В данном наборе исследований забуференный раствор (20 мМ буфера из фосфата натрия, pH 7,4) моноклонального антитела подвергали встряхиванию на орбитальном встряхивателе на 150 об/мин при контролируемой температуре 37°C. Данные исследования проводили с использованием 3 мл раствора антител, помещенного в стеклянный флакон объемом 6 см³. Образцы извлекали через регулярные интервалы и анализировали относительно процента мономеров с применением эксклюзионной хроматографии размеров. Различные поверхностно-активные вещества из класса алкилгликозидов оценивали на их эффективность по предотвращению агрегации белков во время встряхивания. Поверхностно-активные вещества использовали в концентрациях ниже соответствующих им критических концентраций мицеллообразования (CMC) или выше соответствующих им CMC.

Вызываемая взбалтыванием агрегация

В данном наборе исследований использовали покрытую тефлоном магнитную мешалку для перемешивания забуференного раствора (20 мМ гистидин-ацетата, pH 5,5) моноклонального антитела. 3 мл раствора антител помещали в стеклянный флакон объемом 6 см³ и раствор взбалтывали на 500 об/мин с использованием покрытой тефлоном мешалки. Раствор взбалтывали в течение 90 мин, образцы извлекали через регулярные интервалы и анализировали относительно мутности как указания на образование нерастворимых агрегатов. Различные поверхностно-активные вещества из класса алкилгликозидов оценивали на их эффективность по предотвращению агрегации белков во время взбалтывания. Поверхностно-активные вещества использовали в концентрациях ниже соответствующих им критических концентраций мицеллообразования (CMC) или выше соответствующих им CMC.

Результаты

На фиг.1 показана временная зависимость процента мономеров моноклонального антитела анти-MUC16 в растворе после встряхивания на 150 об/мин при 37°C в течение 64 ч в отсутствие поверхностно-активного вещества и в присутствии различных поверхностно-активных веществ, включая н-децил-β-D-глюкопиранозид, н-октил-β-D-глюкопиранозид или полисорбат 20. Поверхностно-активные вещества использовали в концентрации, равной половине соответствующих им значений CMC, то есть 1,1 мМ (0,035% масса/объем) для н-децил-β-D-глюкопиранозида, 9 мМ (0,24%) для н-октил-β-D-глюкопиранозида и 0,04 мМ (0,0035%) для полисорбата 20.

Как показано на фиг.1, при отсутствии какого-либо поверхностно-активного вещества наблюдалось снижение процента мономеров антитела после встряхивания в течение 64 ч. Полисорбат 20 не был эффективным в предотвращении вызываемой встряхиванием потери мономеров в данных условиях, тогда как два протестированных поверхностно-активных вещества из класса алкилгликозидов, то есть н-децил-β-D-глюкопиранозид и н-октил-β-D-глюкопиранозид, были эффективными в предотвращении потери мономеров моноклонального антитела анти-MUC16 после встряхивания. Следовательно, как н-децил-β-D-глюкопиранозид, так и н-октил-β-D-глюкопиранозид (то есть алкилгликозиды, имеющие значения CMC более чем 1,0 мМ) эффективно предотвращают агрегацию моноклонального антитела анти-MUC16 в растворе, вызываемую перемешиванием.

На фиг.2 и 3 показана временная динамика формирования замутнения в растворе моноклонального антитела анти-MUC16 после взбалтывания на 500 об/мин с использованием покрытой тефлоном магнитной мешалки при температуре окружающей среды в течение 90 мин. Мутность оценивали в растворах, не содержащих поверхностно-активных веществ, а также в растворах, содержащих различные поверхностно-активные вещества из класса алкилгликозидов или полисорбат 20. На фиг.2 используемая концентрация поверхностно-активных веществ составляла одну десятую соответствующих им значений CMC, то есть 1,8 мМ (0,053%) для н-октил-β-D-глюкопиранозида, 0,18 мМ (0,008%) для н-децил-β-D-мальтопиранозида, 0,22 мМ (0,007%) для н-децил-β-D-глюкопиранозида, 25 мМ (0,66%) для н-гексил-β-D-глюкопиранозида и 0,008 мМ (0,0007%) для полисорбата 20. На фиг.3 используемая концентрация поверхностно-активных веществ была в два раза выше соответствующих им значений CMC, то есть 36 мМ (1,0%) для н-октил-β-D-глюкопиранозида, 3,6 мМ (0,16%) для н-децил-β-D-мальтопиранозида, 4,4 мМ (0,14%) для н-децил-β-D-глюкопиранозида, 500 мМ (12%) для н-гексил-β-D-глюкопиранозида и 0,16 мМ (0,014%) для полисорбата 20.

Как видно на фиг.2, при концентрации, составляющей одну десятую соответствующих им значений CMC, н-октил-β-D-глюкопиранозид и полисорбат 20 были эффективны в предотвращении формирования замутненности по сравнению с раствором антитела, не содержащего поверхностно-активных веществ. Формирование замутненности обычно объясняют формированием больших нерастворимых агрегатов антитела.

Как также можно видеть на фиг.3, при концентрации в два раза больше соответствующих им значений CMC все поверхностно-активные вещества из класса алкилгликозидов были эффективны в предотвращении агрегации антитела в растворе в соответствии с измерениями формирования замутненности.

На фиг.4 приведено исследование влияния изменения концентрации н-октил-β-D-глюкопиранозида на мутность композиций моноклонального антитела анти-MUC16 во время встряхивания на 300 об/мин в течение 72 ч при 37°C. Как показано на фиг.4, при всех протестированных концентрациях, то есть 0,72 мМ (0,02 масса/объем), 1,8 мМ (0,05 масса/объем), 3,6 мМ (0,1 масса/объем), 9 мМ (0,25 масса/объем), 18 мМ (0,5 масса/объем) н-октил-β-D-глюкопиранозид эффективно подавлял образование видимых агрегатов антител после встряхивания, в соответствии с измерениями формирования замутненности.

На фиг.5 приведено исследование влияния изменения концентрации н-октил-β-D-глюкопиранозида на процент мономеров моноклонального антитела анти-MUC16 после встряхивания на 300 об/мин при 37°C в течение 72 ч. Как показано на фиг.5, при всех протестированных концентрациях н-октил-β-D-глюкопиранозид эффективно поддерживал процент мономеров антитела анти-MUC16 после встряхивания по сравнению с образцом, не подвергавшимся встряхиванию, который хранился в аналогичных условиях.

На фиг.6-9 приведено исследование влияния 0,23 мМ (0,02% масса/объем) полисорбата 20 и 3,6 мМ (0,1% масса/объем) н-октил-β-D-глюкопиранозида на мутность водных композиций моноклонального антитела анти-MUC16 (фиг.6), моноклонального антитела анти-IgE (фиг.7), моноклонального антитела анти-CD11a (фиг.8) и моноклонального антитела анти-CD22 (фиг.9) во время встряхивания на 300 об/мин в течение 72 ч при 37°C. Как показано на фиг.6-9, как полисорбат 20, так и н-октил-β-D-глюкопиранозид эффективно подавляли образование видимых агрегатов антител для всех протестированных антител после встряхивания в соответствии с измерениями формирования замутненности.

На фиг.10-13 приведено исследование влияния 0,23 мМ (0,02% масса/объем) полисорбата 20 и 3,6 мМ (0,1% масса/объем) н-октил-β-D-глюкопиранозида на процент мономеров в водных композициях моноклонального антитела анти-MUC16 (фиг.10), моноклонального антитела анти-IgE (фиг.11), моноклонального антитела анти-CD11a (фиг.12) и моноклонального антитела анти-CD22 (фиг.13) во время встряхивания на 300 об/мин в течение 72 ч при 37°C. Как показано на фиг.10-13, н-октил-β-D-глюкопиранозид эффективно поддерживал процент мономеров для различных протестированных антител после встряхивания по сравнению с образцом, не подвергавшимся встряхиванию, который хранился в аналогичных условиях.

Пример 2: Изучение алкилгликозидов в качестве неионных поверхностно-активных веществ для предотвращения окисления белков/антител

В данном примере проиллюстрировано применение алкилгликозидов в качестве неионных поверхностно-активных веществ для предотвращения окисления антител в водном растворе.

В первом эксперименте растворы поверхностно-активных веществ из класса алкилгликозидов, то есть н-децил-β-D-глюкопиранозида, н-октил-β-D-глюкопиранозида и н-децил-β-D-мальтопиранозида, а также полисорбата 20 при концентрации 0,1% масса/объем в воде хранили при 40°C в течение одного месяца. Затем образцы извлекали и анализировали на предмет наличия пероксида водорода с использованием анализа на пероксид водорода Amplex Red; результаты этих анализов показаны на фиг.14.

Как показано на фиг.14, в растворах, содержащих в качестве поверхностно-активных веществ алкилгликозиды, образовывалось незначительное количество пероксида водорода после хранения данных растворов при 40°C в течение одного месяца. Напротив, около 10 мкΜ пероксида водорода образовалось в содержащем полисорбат 20 растворе в тех же условиях хранения. Эти данные показывают, что применение алкилгликозидов в качестве стабилизирующих белок агентов в водных композициях может являться предпочтительным по сравнению с полисорбатом 20 по причине относительно низкой предрасположенности алкилгликозидов к образованию окисляющего пероксида водорода в растворе с течением времени.

Во втором эксперименте оценивали окисление аминокислотного остатка Met256 в моноклональном антителе анти-CD11a в растворах, содержащих н-децил-β-D-глюкопиранозид, н-октил-β-D-глюкопиранозид или полисорбат 20. Для этой цели 3 мл забуференного раствора антител (pH 6,0), содержащего 0,1% масса/объем поверхностно-активного вещества, хранили во флаконах объемом 6 см³ при 5°C или 40°C в течение 2 или 4 недель. Затем образцы извлекали и анализировали на предмет окисления остатка Met256, аминокислоты в первичной последовательности анти-CD11a, относительно которой ранее было показано, что она является чувствительной к окислению; результаты этих анализов показаны на фиг.15.

Как показано на фиг.15, в растворах, содержащих н-децил-β-D-глюкопиранозид или н-октил-β-D-глюкопиранозид, не наблюдалось значимого увеличения процента окисленного Met256 в анти-CD11a после хранения, как описано выше, по сравнению с первоначальным образцом. Однако в растворах анти-CD11a, содержащих полисорбат 20, было обнаружено окисление приблизительно 16% остатков Met256 после хранения при 40°C в течение 4 недель по сравнению с приблизительно 2% окислением того же аминокислотного остатка в нулевой момент времени. Таким образом, эти данные показывают, что применение алкилгликозидов в качестве стабилизирующих белок агентов в водных композициях может являться предпочтительным по сравнению с полисорбатом 20 по причине относительно низкой предрасположенности алкилгликозидов к окислению белка в композиции с течением времени.

В третьем эксперименте анализировали вызываемое реактивом Фентона окисление аминокислотных остатков Met и Trp (то есть аминокислот, известных как чувствительные к окислению) в моноклональном антителе анти-CD22. В частности, получали забуференные (20 мМ гистидин-ацетата, pH 5,5) растворы моноклонального антитела анти-CD22, содержащие 0,1 ч/млн Fe и 1 ч/млн пероксида водорода, и хранили в течение 2 или 4 недель при 40°C в отсутствие поверхностно-активных веществ или в присутствии 0,23 мМ (0,02% масса/объем) полисорбата 20 или 3,6 мМ (0,1% масса/объем) н-октил-β-D-глюкопиранозида. Затем образцы извлекали и определяли процент окисления остатков Met и Trp по процентным пикам перед основным компонентом при элюировании антитела через фенильную колонку ОФ-ВЭЖХ. Результаты данных анализов показаны на фиг.16.

Как показано на фиг.16, вызываемое реактивом Фентона окисление чувствительных аминокислот (Trp, Met) в моноклональном анти-CD22 подавляется в растворах, содержащих н-октил-β-D-глюкопиранозид, по сравнению с растворами, содержащими полисорбат 20, и сравнимо с растворами, не содержащими поверхностно-активных веществ. Таким образом, эти данные показывают, что применение алкилгликозидов в качестве стабилизирующих белок агентов в водных композициях может являться предпочтительным по сравнению с полисорбатом 20 по причине относительно низкой предрасположенности алкилгликозидов к окислению белка в композиции с течением времени.

Пример 3: Изучение алкилгликозидов в качестве неионных поверхностно-активных веществ для предотвращения вызываемого светом окисления остатков триптофана в белках/антителах

В данном примере проиллюстрировано применение алкилгликозидов в качестве неионных поверхностно-активных веществ для предотвращения вызываемого светом окисления остатков триптофана в белках/антителах в водном растворе.

Все приведенные ниже эксперименты проводили следующим образом.

Образцы моноклональных антител и обработка светом: гуманизированное противоокислительное моноклональное антитело LDL получали от Genentech, Inc. из клеточной линии CHO. Было подготовлено три независимых образца для изучения светоустойчивости: 1) контрольный образец, флакон, обернутый алюминиевой фольгой; 2) тестовый образец, подверженный воздействию света флакон (необернутый); 3) тестовый образец, подверженный воздействию света флакон (необернутый), содержащий заданное неионное поверхностно-активное вещество. Контрольный и подверженные воздействию света образцы хранили на световой панели в течение 24 ч. Воздействие света соответствовало руководству ICH со следующими настройками для световой панели Atlas SUNTEST CPS+: уровень освещенности=250 Вт/м²; настройка времени 24 ч; суммарная УФ-доза=538 Вт·ч/м²; суммарная видимая доза=1320000 лк·ч.

ЖХ/МС/МС трипсиновой пептидной карты моноклонального антитела: образцы расщепляли трипсином после восстановления и алкилирования. Полученные в результате пептиды анализировали на масс-спектрометре Thermo LTQ-Orbitrap, соединенном с капиллярной ВЭЖХ-системой Agilent 1200. ВЭЖХ-колонка: Jupiter 5мкм C18 250×1,0 мм, скорость потока: 70 мкл/мин, температура термостата колонки: 55°C. Растворитель A: 0,1% TFA в воде, B: 0,09% TFA в 90% ACN. Настройки Orbitrap: разрешение MS 60000, MS/MS собирали в режиме зависимости от данных с использованием LTQ.

Измерения флуоресценции: присущий триптофану спектр флуоресцентного излучения растворов получали с использованием спектрофлуориметра Horiba Jobin Yvon Fluoromax-4 (Edison, NJ), оборудованного водяной баней с регулируемой температурой. Спектр излучения триптофана получали в диапазоне от 300 до 450 нм после возбуждения при 295 нм.

Определяли влияние света и защитный эффект неионных поверхностно-активных веществ относительно окисления остатков триптофана в противоокислительном антителе LDL. Протестированное антитело содержало остатки триптофана в положениях 33 (то есть Trp33) и 92 (то есть Trp92), и процент вызываемого светом окисления в этих местах определяли, как описано выше; результаты этих анализов показаны в табл. 2.

Таблица 2 Условия/поверхностно-активное вещество % окисленного Trp33 % окисленного Trp92 Нет света/отсутствует поверхностно-активное вещество 0,0% 0,6% Свет/отсутствует поверхностно-активное вещество 0,3% 6,0% Свет/0,39 мМ н-гексил-β-D-глюкопиранозида 0,3% 4,9%

Свет/300 мМ н-гексил-β-D-глюкопиранозида 0,0% 1,6% Свет/0,39 мМ н-гексил-β-D-мальтопиранозида 0,3% 5,7% Свет/300 мМ н-гексил-β-D-мальтопиранозида 0,0% 2,2% Свет/0,03 мМ н-додецил-β-D-мальтопиранозида 0,0% 10,6% Свет/0,39 мМ н-додецил-β-D-мальтопиранозида 0,1% 2,7% Свет/0,03 мМ н-додецил-β-D-глюкопиранозида 0,4% 8,9% Свет/0,02% полисорбат 20 0,6% 8,9%

Выводы

Алкилгликозиды, имеющие значения CMC около 1 мМ или более, придают стабильность против вызванной перемешиванием агрегации белков, включая моноклональные антитела.

Стабильность против вызванной перемешиванием агрегации, придаваемая алкилгликозидами, имеющими значения CMC около 1 мМ или более, не зависит от антитела в том отношении, что благоприятный эффект наблюдается с различным антителами различных аминокислотных последовательностей.

Как ни странно, стабильность относительно вызванной перемешиванием агрегации, придаваемая алкилгликозидами, имеющими значения CMC около 1 мМ или более, наблюдается, когда алкилгликозид используется в концентрации, которая меньше его соответствующего значения CMC.

В отличие от полисорбата 20, алкилгликозиды, имеющие значения CMC около 1 мМ или более, не образуют пероксид водорода после хранения в течение длительного периода времени.

В отличие от полисорбата 20, алкилгликозиды, имеющие значения CMC около 1 мМ или более, не вызывают значительного окисления подверженных окислению аминокислот в различных моноклональных антителах.

В отличие от полисорбата 20, алкилгликозиды, имеющие значения CMC около 1 мМ или более, способны подавлять или снижать количество вызываемого светом окисления остатков триптофана в антителах и других белках, особенно при использовании в концентрации, которая выше соответствующих им значений CMC.

Группа изобретений относится к области фармацевтики и касается водной композиции, содержащей антитело и алкилгликозид, имеющий значение СМС около 1,0 мМ или более в воде при 25°С, где алкилгликозид присутствует в концентрации, которая меньше значения СМС алкилгликозида в воде при 25°С. Заявлены также способ ингибирования агрегации антитела и способ предотвращения окисления антитела в водном растворе с использованием водной композиции. Группа изобретений обеспечивает повышение стабильности антител в терапевтически пригодных составах. 3 н. и 30 з.п. ф-лы, 16 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Водная композиция, содержащая антитело и алкилгликозид, имеющий значение CMC около 1,0 мМ или более в воде при 25°C, где алкилгликозид присутствует в концентрации, которая меньше значения CMC алкилгликозида в воде при 25°C.

2. Композиция по п. 1, в которой антитело представляет собой моноклональное антитело.

3. Композиция по п. 1 или 2, в которой алкилгликозид выбран из группы, состоящей из н-гексил-β-D-глюкопиранозида, н-гептил-β-D-глюкопиранозида, н-октил-β-D-глюкопиранозида, н-нонил-β-D-глюкопиранозида, н-децил-β-D-глюкопиранозида, 3-циклогексил-1-пропил-β-D-глюкозида, 3-циклогексил-1-бутил-β-D-глюкозида, н-гексил-β-D-мальтопиранозида, н-октил-β-D-мальтопиранозида, н-нонил-β-D-мальтопиранозида, н-децил-β-D-мальтопиранозида, циклогексилметил-β-D-мальтозида, 2-циклогексилэтил-β-D-мальтозида, 3-циклогексилпропил-β-D-мальтозида, 4-циклогексилбутил-β-D-мальтозида и 5-циклогексилпентил-β-D-мальтозида.

4. Композиция по п. 3, в которой алкилгликозид представляет собой н-октил-β-D-глюкопиранозид.

5. Композиция по п. 3, в которой алкилгликозид представляет собой н-децил-β-D-глюкопиранозид.

6. Композиция по п. 3, в которой алкилгликозид представляет собой н-децил-β-D-мальтопиранозид.

7. Композиция по п. 3, в которой алкилгликозид представляет собой н-гексил-β-D-глюкопиранозид.

8. Композиция по п. 1 или 2, содержащая количество указанного алкилгликозида, ингибирующее агрегацию, вызванную перемешиванием.

9. Композиция по п. 1 или 2, содержащая количество указанного алкилгликозида, предотвращающее окисление.

10. Композиция по п. 1 или 2, которая является стабильной при температуре около 2-8°C в течение по меньшей мере одного года.

11. Композиция по п. 1 или 2, которая является стабильной при температуре около 30°C в течение по меньшей мере одного месяца.

12. Композиция по п. 1 или 2, которая является нелиофилизированной и не подвергалась предшествующей лиофилизации.

13. Композиция по п. 1 или 2, которая представляет собой ресуспендированный лиофилизированный состав.

14. Композиция по п. 1 или 2, в которой антитело подвержено агрегации.

15. Композиция по п. 1 или 2, в которой антитело подвержено окислению.

16. Способ ингибирования агрегации антитела,, присутствующего в первом водном растворе, где агрегация вызвана перемешиванием, включающий стадию добавления к указанному первому водному раствору количества алкилгликозида, ингибирующего агрегацию, вызванную перемешиванием, при этом алкилгликозид имеет значение CMC около 1,0 мМ или более в воде при 25°C, где алкилгликозид добавляют до конечной концентрации, которая меньше значения CMC алкилгликозида в воде при 25°C, обеспечивая, таким образом, второй водный раствор.

17. Способ по п. 16, в котором антитело представляет собой моноклональное антитело.

18. Способ по п. 16 или 17, в котором алкилгликозид выбран из группы, состоящей из н-гексил-β-D-глюкопиранозида, н-гептил-β-D-глюкопиранозида, н-октил-β-D-глюкопиранозида, н-нонил-β-D-глюкопиранозида, н-децил-β-D-глюкопиранозида, 3-циклогексил-1-пропил-β-D-глюкозида, 3-циклогексил-1-бутил-β-D-глюкозида, н-гексил-β-D-мальтопиранозида, н-октил-β-D-мальтопиранозида, н-нонил-β-D-мальтопиранозида, н-децил-β-D-мальтопиранозида, циклогексилметил-β-D-мальтозида, 2-циклогексилэтил-β-D-мальтозида, 3-циклогексилпропил-β-D-мальтозида, 4-циклогексилбутил-β-D-мальтозида и 5-циклогексилпентил-β-D-мальтозида.

19. Способ по п. 18, в котором алкилгликозид представляет собой н-октил-β-D-глюкопиранозид.

20. Способ по п. 18, в котором алкилгликозид представляет собой н-децил-β-D-глюкопиранозид.

21. Способ по п. 18, в котором алкилгликозид представляет собой н-децил-β-D-мальтопиранозид.

22. Способ по п. 18, в котором алкилгликозид представляет собой н-гексил-β-D-глюкопиранозид.

23. Способ по п. 16 или 17, включающий дополнительную стадию лиофилизации указанного второго водного раствора.

24. Способ предотвращения окисления антитела, присутствующего в первом водном растворе, включающий стадию добавления к указанному первому водному раствору количества алкилгликозида, предотвращающего окисление, при этом алкилгликозид имеет значение CMC около 1,0 мМ или более в воде при 25°C, где алкилгликозид добавляют до конечной концентрации, которая меньше значения CMC алкилгликозида в воде при 25°C, обеспечивая, таким образом, второй водный раствор.

25. Способ по п. 24, в котором антитело представляет собой моноклональное антитело.

26. Способ по п. 24 или 25, в котором алкилгликозид выбран из группы, состоящей из н-гексил-β-D-глюкопиранозида, н-гептил-β-D-глюкопиранозида, н-октил-β-D-глюкопиранозида, н-нонил-β-D-глюкопиранозида, н-децил-β-D-глюкопиранозида, 3-циклогексил-1-пропил-β-D-глюкозида, 3-циклогексил-1-бутил-β-D-глюкозида, н-гексил-β-D-мальтопиранозида, н-октил-β-D-мальтопиранозида, н-нонил-β-D-мальтопиранозида, н-децил-β-D-мальтопиранозида, циклогексилметил-β-D-мальтозида, 2-циклогексилэтил-β-D-мальтозида, 3-циклогексилпропил-β-D-мальтозида, 4-циклогексилбутил-β-D-мальтозида и 5-циклогексилпентил-β-D-мальтозида.

27. Способ по п. 26, в котором алкилгликозид представляет собой н-октил-β-D-глюкопиранозид.

28. Способ по п. 26, в котором алкилгликозид представляет собой н-децил-β-D-глюкопиранозид.

29. Способ по п. 26, в котором алкилгликозид представляет собой н-децил-β-D-мальтопиранозид.

30. Способ по п. 26, в котором алкилгликозид представляет собой н-гексил-β-D-глюкопиранозид.

31. Способ по п. 24 или 25, включающий дополнительную стадию лиофилизации указанного второго водного раствора.

32. Способ по п. 24 или 25, в котором указанное окисление представляет собой вызываемое светом окисление.

33. Способ по п. 32, в котором вызываемое светом окисление имеет место для остатков триптофана в указанном антителе.