СПОСОБ СОЗДАНИЯ МОДЕЛИ ТРАНЗИТОРНОЙ ИШЕМИИ СЕТЧАТКИ Российский патент 2016 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной офтальмологии, и может быть использовано для моделирования ишемических состояний сетчатки на крысах, в том числе транзиторной окклюзии глазной артерии и ее ветвей, и изучения на моделях методов коррекции данных патологических состояний.

Транзиторная ретинальная ишемия - частая причина снижения и потери зрения, возникающая на фоне сосудистых заболеваний (оптические нейропатии, окклюзии ретинальных сосудов и каротидных артерий, острый приступ закрытоугольной глаукомы и т.д.). Ретинальная ишемия возникает на фоне гипоксии, когда недостаточное содержание кислорода приводит к угнетению метаболических процессов в тканях глаза и апоптозу клеток сетчатки, при этом ее наружные слои более резистентны к гипоксическому стрессу [Janáky М., Grósz A., Tóth Е., Benedek К., Benedek G. Hypobaric hypoxia reduces the amplitude of oscillatory potentials in the human ERG. Doc Ophthalmol. 2007; 114 (1): 45-51; Tinjust D., Kergoat H., Lovasik J. V. Neuroretinal function during mild systemic hypoxia. Aviat Space Environ Med. 2002; 73 (12): 1189-94]. В связи с этим остается актуальным вопрос разработки и выбора экспериментальных моделей сосудистой патологии глаз, что имеет теоретическое значение для расширения понимания механизмов нарушения кровообращения и практическую значимость для оценки эффективности лечения сосудистых заболеваний сетчатки и зрительного нерва.

Для оценки микроциркуляции глаза у животных можно использовать разных животных, например кроликов [Xuan В., Wang Т., Chiou G. С., Dalinger I., Shkineva Т. К., Shevelev S. A. Effects of N-nitropyrazoles on ocular blood flow of rabbits and retinal function recovery of rat eyes after ischemic insults J Ocul Pharmacol Ther. 2001; 17(6): 505-15], но их ретинальные сосуды развиты слабо, и кровоснабжение глаза осуществляется преимущественно из системы хориоидальных сосудов.

У крысы, как и у человека, отмечается преобладание ретинального кровотока, за счет которого осуществляется питание большей части сетчатки, поэтому крысы являются наилучшим объектом для моделирования ишемического поражения сетчатки [Liu Т., Hui L., Wang Y.S., Guo J.Q., Li R., Su J.B., Chen J.K., Xin X.M., Li W.H. In-vivo investigation of laser-induced choroidal neovascularization in rat using spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT). Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 2013; 251(5): 1293-1301; Sun C., Li X.X., He X. J, Zhang Q., Tao Y. Neuroprotective effect of minocycline in a rat model of branch retinal vein occlusion. Exp Eye Res. 2013; 113: 105-116.].

Известно, что эндотелин -1 (ЭТ-1) - самый мощный из известных сосудосуживающих агентов, состоит из 21 аминокислоты и играет ключевую роль в гомеостазе кровеносных сосудов. Связываясь со специфическими рецепторами клеточных мембран (ЕТА и ЕТВ), эндотелин-1 повышает внутриклеточную концентрацию ионов Ca²⁺, что ведет к усилению сокращения гладких мышц сосудистой стенки.

Доказано, что повышенный уровень ЭТ-1 в крови связан с увеличением частоты развития ишемии. Введение ЭТ-1 внутрь глаза с целью моделирования ишемии впервые было предложено в 1993 году K. Takei и соавт.[Takei K., Sato Т., Nonoyama Т., Miyauchi Т., Goto К., Hommura S. А new model of transient complete obstruction of retinal vessels induced by endothelin-1 injection into the posterior vitreous body in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1993; 231(8): 476-81]. После инъекции ЭТ-1 в стекловидное тело или зрительный нерв у животных возникали клеточные повреждения, обструкция ретинального кровотока, повышение скотопической b-волны ЭРГ и апоптоз клеток в ганглиозном слое сетчатки [Lau J., Dang М., Hockmann K., Ball А. К. Effects of acute delivery of endothelin-1 on retinal ganglion cell loss in the rat. Exp Eye Res. 2006; 82(1): 132-145].

Введение препарата в стекловидное тело имеет несколько недостатков: возможность перфорации глаза, повреждения хрусталика, развития эндофтальмита.

В исследовании B.C. Chauhan и соавт. [Chauhan В.С, LeVatte Т.L., Jollimore С.A., Yu Р. K., Reitsamer Н.A., Kelly М.Е., Yu D.Y., Tremblay F., Archibald M. L. Model of endothelin-1-induced chronic optic neuropathy in rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45(1): 144-52] после длительного ретробульбарного введения ЭТ-1 крысам с помощью микропомпы, установленной на 84 дня, отмечали снижение ретинального кровотока в среднем на 68% и уменьшение толщины слоя ганглиозных клеток. Недостатком методики является дополнительная травма от хирургического вмешательства, необходимого для установки микропомпы, трудности правильной ее установки и дороговизна. Кроме того, постепенное выделение препарата рассчитано на моделирование хронической ишемии.

Наименее инвазивным и простым методом краткосрочной ишемии считают временную окклюзию сосудов глаза с помощью субконьюнктивального введения ЭТ-1.

Ближайшим аналогом (прототипом) предлагаемого изобретения является модель, которую предложили К. Masuzawa и соавт. [Masuzawa К., Jesmin S., Maeda S., Kaji Y., Oshika Т., Zaedi S., Shimojo N., Yaji N., Miyauchi Т., Goto K. A model of retinal ischemia-reperfusion injury in rats by subconjunctival injection of endothelin-1. Exp Biol Med (Maywood). 2006; 231(6): 1085-9]. Они использовали субконъюнктивальное введение ЭТ-1 крысам в дозе 0,3 мл 4*10⁵ М, при этом перфузия восстанавливалась в течение 5-35 минут после инъекции. Были получены доказательства, что высокие дозы ЭТ-1 при субконъюнктивальной инъекции вызывают окклюзию ЦАС с потерей ганглиозных и активацией глиальных клеток без повреждения других тканей.

Модель легко воспроизводима, не требует операционной и риск возникновения инфекции минимален. Существенным недостатком является необходимость высокой дозы ЭТ-1 для моделирования ишемии, поэтому нельзя исключить вероятность побочных эффектов со стороны системной циркуляции и повреждения других тканей, а также высокую экономическую стоимость такого исследования.

Задачей изобретения является создание простого, воспроизводимого и экономичного способа моделирования транзиторной ишемии ретинальных сосудов у крыс.

Технический результат заключается в профилактике осложнений, обусловленных нарушением системной циркуляции крови, и повреждений тканей глаза экспериментального животного; повышении экономичности; упрощении способа за счет уменьшения дозы сосудосуживающего препарата путем оптимизации пути его введения при сохранении адекватной воспроизводимости модели транзиторной ишемии сетчатки.

Нами установлено, что благодаря оригинальному пути введения препарата, обеспечивающему усиленное воздействие на ретробульбарные сосуды, предлагаемый способ позволяет в сравнении с прототипом уменьшить как дозу действующего вещества в десять раз, так и объем вводимого раствора на 1/3 при моделировании транзиторной ишемии сетчатки.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Моделирование транзиторной ишемии сетчатки осуществляют путем введения крысе раствора ЭТ-1. Новым является то, что введение ЭТ-1 осуществляют следующим образом. Выполняют вкол инсулиновой иглы размером 0,4×13 мм (27G) при развороте среза иглы к верхнему веку в область экватора глаза верхне-наружного квадранта конъюнктивы. Проводят иглу субконъюнктивально не менее чем на половину ее длины в направлении заднего полюса глаза. Вводят по игле 0, 2 мл 4·10^-6 М раствора ЭТ-1 в фосфатном буфере, имеющем pH 7,4.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Готовят раствор ЭТ-1 из сухого вещества. В ампуле ЭТ-1 (Sigma-Aldrich) содержится 0, 1 мг ЭТ-1 в виде белого порошка. Его Mr=2491,9, значит 1 моль вещества = 2491,9 г.

Если 2491,9 г - 1 моль, то 1 г вещества=1 г*1 моль/2491,9 г=0,0004 моль=4*10^-4 моль.

1 г (1000 мг) - 4*10^-4 моль.

0,1 мг ЭТ-1 во флаконе = х моль.

х=0,1 мг * 4*10^-4 моль/ 1000 мг=4*10^-8 моль ЭТ-1 во флаконе.

Разводим сухое вещество ЭТ-1 в 10 мл 0,05 М стерильного раствора калиевого фосфатного буфера, имеющего pH 7,4. Могут быть использованы, например, следующие фосфатные буферы: нитратный, магниевый, калиевый, натриевый.

Если в 10 мл - 4*10^-8 моль ЭТ-1,

то в 1000 мл (1 л) - х моль/л (М),

х=4*10^-6 моль/л(М).

Таким образом, в результате проведенных расчетов определена концентрация вещества в полученном растворе.

Набирают инсулиновым шприцем 0,2 мл полученного раствора ЭТ-1.

2. После анестезии (системный наркоз в сочетании с местным анестетиком), делают вкол инсулиновой иглы размером 0,4×13 мм (27G) субконъюнктивально (срез иглы, направляют к верхнему веку) в экватор глаза, расположенный в верхне-наружном квадранте конъюнктивы. Проводят иглу субконъюнктивально не менее чем на половину ее длины в направлении заднего полюса глаза.

Медленно вводят 0,2 мл 4*10^-6 М раствора ЭТ-1 в калиевом фосфатном буфере 0,05 М, имеющем pH 7,4. Через несколько секунд отмечают побледнение конъюнктивальных сосудов, еще через несколько секунд начинается исчезновение рефлекса с глазного дна. Полное прекращение тока крови может быть подтверждено офтальмоскопически. Извлекают иглу и наносят на глаз гелевый слезозаменитель или кератопротекор.

По данным ультразвукового дуплексного сканирования в режимах цветового допплеровского энергетического картирования и импульсной допплерографии на 20 крысах породы Wistar 200-250 г (20 глаз) после введения 0,2 мл 4*10^-6 М раствора ЭТ-1 в калиевом фосфатном буфере с рН=7,4 по предложенному способу отмечалось полное прекращение кровотока в ретробульбарных сосудах с частичным восстановлением кровотока (реперфузией) в течение 5-50 минут. Эти данные подтверждают эффективность модели транзиторной ишемии.

Морфологические изменения сетчатки при исследовании энуклеированных глаз после моделирования по предлагаемому способу на 7 день после создания модели: сетчатка резко отечная, складчатая, увеличение толщины слоя внутренних волокон за счет отека. Визуализируются сосуды с утолщенной стенкой за счет отека и клеточной гиперплазии. Также некоторые ядра клеток частично ориентированы перпендикулярно просвету сосуда, что свидетельствует о сохраняющемся спазме гладких мышц. На внутренней поверхности сетчатки скопления детрита из разрушенных гемолизированных эритроцитов. Вокруг обилие макрофагов с большой цитоплазмой, заполненной гомогенизированным содержимым. Просвет центральной артерии сетчатки сохранен, в то время как в мелких артериях просвет отсутствует. Вокруг зрительного нерва кровоизлияние. Такие изменения свидетельствуют об ишемическом повреждении сетчатки вследствие транзиторной ишемии по механизму спазма глазных сосудов.

Таким образом, предлагаемая нами концентрация ЭТ-1 в сочетании со способом введения раствора этого вещества в верхне-наружний квадрант (ближе к ретробульбарным сосудам) показала свою эффективность в создании экспериментальной модели транзиторной ишемии сетчатки у крыс.

Эффективность модели подтверждена с помощью ультразвукового дуплексного сканирования в режимах цветового допплеровского энергетического картирования и импульсной допплерографии пораженного и парного глаза на системе Voluson и патогистологического исследования сетчатки и сосудистой оболочки с помощью светового микроскопа на микросистеме Leica на базе ФГБУ «МНИИГБ им. Гельмгольца» Минздрава России.

Пример 1.

Крысе массой 230 г введен интраперитонеально анестетик общего действия. Наркоз наступил через 5 минут. Сделали вкол инсулиновой иглой 0,4×13 мм (27 G) субконъюнктивально срезом иглы, направленным к верхнему веку, в верхние-наружний квадрант в область экватора глаза, к заднему полюсу глаза на ½ длины иглы согласно предлагаемому способу моделирования. Медленно ввели 0,2 мл 4*10^-6 М раствора ЭТ-1 в калиевом фосфатном буфере, pH последнего 7,4. Через несколько секунд отмечалось побледнение конъюнктивальных сосудов, еще через несколько секунд пропал рефлекс с глазного дна. Полное прекращение тока крови подтвердили офтальмоскопически. На роговицу нанесен гелевый слезозаменитель видисик.

По данным ультразвукового дуплексного сканирования в режимах цветового допплеровского энергетического картирования и импульсной допплерографии сразу после введения отмечалось полное прекращение кровотока в ретробульбарных сосудах с частичным восстановлением кровотока, который начался через 30 минут.

Морфологические изменения сетчатки при исследовании энуклеированного глаза на 7 день: сетчатка резко отечная, складчатая, увеличение толщины слоя внутренних волокон за счет отека. Визуализируются сосуды с утолщенной стенкой за счет отека и клеточной гиперплазии. Также некоторые ядра клеток частично ориентированы перпендикулярно просвету сосуда, что свидетельствует о сохраняющемся спазме гладких мышц. На внутренней поверхности сетчатки скопления детрита из разрушенных гемолизированных эритроцитов. Вокруг обилие макрофагов с большой цитоплазмой, заполненной гомогенизированным содержимым. Просвет центральной артерии сетчатки сохранен, в то время как в мелких артериях просвет отсутствует. Вокруг зрительного нерва кровоизлияние.

Пример 2.

Крысе массой 250 г введен интраперитонеально анестетик общего действия. Наркоз наступил через 4 минуты. В левый глаз инсталляция на конъюнктиву местный анестетик (инокаин). Игла введена субконъюнктивально по предлагаемому способу. Медленно ввели 0,2 мл 4*10^-6 М раствора ЭТ-1 в калиевом фосфатном буфере, pH последнего 7,4. Через несколько секунд побледнели конъюнктивальные сосуды, еще через несколько секунд пропал рефлекс с глазного дна. Полное прекращение тока крови подтвердили офтальмоскопически. На роговицу нанесен гелевый слезозаменитель видисик.

По данным ультразвукового дуплексного сканирования в режимах цветового допплеровского энергетического картирования и импульсной допплерографии сразу после введения отмечалось полное прекращение кровотока в ретробульбарных сосудах с частичным восстановлением кровотока, который начался через 50 минут.

Морфологические изменения сетчатки при исследовании энуклеированного глаза на 7 день: сетчатка резко отечная и складчатая, увеличение толщины слоя внутренних волокон за счет отека. Ядра клеток некоторых сосудов частично ориентированы перпендикулярно просвету сосуда, что свидетельствует о сохраняющемся спазме гладких мышц. На внутренней поверхности сетчатки скопления детрита из разрушенных гемолизированных эритроцитов. Вокруг обилие макрофагов с большой цитоплазмой, заполненной гомогенизированным содержимым. Просвет центральной артерии сетчатки сохранен, в то время как в мелких артериях просвет отсутствует. Вокруг зрительного нерва кровоизлияние.

Таким образом, мы провели моделирование по предлагаемому способу на 20 крысах породы Wistar массой 200-250 г (20 глаз) Во всех случаях получена транзиторная ишемия сетчатки, подтвержденная подобными у всех животных изменениями кровотока по данным УЗИ и морфологии.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной офтальмологии, и может быть использовано для моделирования транзиторной ишемии сетчатки. Моделирование осуществляют путем введения в глаз крысы раствора эндотелина-1 (ЭТ-1). Для этого выполняют вкол инсулиновой иглы размером 0,4×13 мм (27G) при развороте среза иглы к верхнему веку в область экватора глаза верхне-наружного квадранта конъюнктивы. Проводят иглу субконъюнктивально не менее чем на половину ее длины в направлении заднего полюса глаза. Вводят по игле 0, 2 мл 4·10^-6 М раствора ЭТ-1 в фосфатном буфере, имеющем pH 7,4. Способ обеспечивает адекватную воспроизводимость транзиторной ишемии сетчатки в эксперименте без повреждений тканей глаза и при уменьшении дозы вводимого препарата. 2 пр.

Способ моделирования транзиторной ишемии сетчатки путем введения крысе раствора эндотелина-1 (ЭТ-1), отличающийся тем, что выполняют вкол инсулиновой иглы размером 0,4×13 мм (27G) при развороте среза иглы к верхнему веку в область экватора глаза верхне-наружного квадранта конъюнктивы, проводят иглу субконъюнктивально не менее чем на половину ее длины в направлении заднего полюса глаза и вводят по ней 0,2 мл 4-10^-6 М раствора ЭТ-1 в фосфатном буфере, имеющем рН 7,4.