СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ И АНТИМЕТАСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ, ПОВЫШАЮЩЕЕ ПРОТИВОМЕТАСТАТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ЦИКЛОФОСФАНА Российский патент 2016 года по МПК A61K36/73 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и может быть использовано для подавления развития опухолевого процесса и одновременного повышения эффективности цитостатического лечения онкологических больных.

Современные методы лечения больных со злокачественными новообразованиями зачастую не гарантируют полного выздоровления в связи с возможностью развития в дальнейшем вторичных опухолей и рецидивов. Кроме того, успех в лечении таких пациентов часто определяется наличием, распространенностью метастазов, их чувствительностью к антибластомным препаратам. Поэтому средства, обладающие способностью ингибировать рост опухоли и метастазов, а также повышающие эффективность химиотерапии, представляют большой интерес и могут найти применение на всех этапах лечения онкологических пациентов.

Наиболее близким по фармакологическим эффектам является экстракт родиолы розовой жидкий [1]. Экстракт родиолы розовой жидкий относится к группе препаратов, оказывающих тонизирующее действие на центральную нервную систему. К противопоказаниям экстракта родиолы розовой относятся состояния возбуждения, гипертонические кризы, лихорадочные состояния больного [2]. При применении данного экстракта могут наблюдаться возбуждение, бессонница, головная боль. Недостатком указанного средства является ограничение при назначении больным с сопутствующим заболеванием - гипертонической болезнью, вследствие способности повышать кровяное давление.

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала средств растительного происхождения, ингибирующих развитие опухолевого процесса и повышающих противометастатическое действие циклофосфана.

Для решения этой задачи используют жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.), полученный методом динамической дробной мацерации. Для получения экстракта использовали лабораторный реактор с паровой рубашкой («Radleys», Германия), подключенный к погруженному циркуляционному блоку регулирования температуры «М01» («Термэкс», Россия), верхнеприводной мешалке RZR 2020 («Heidolph», Германия) и шариковому холодильнику. Плоды рябины измельчали до размера частиц диаметром 0,3-0,5 см. Навеску плодов помещали в реактор, добавляли 95% подкисленный этиловый спирт. Экстрагировали при температуре 80°C в течение 60 минут. Полученным извлечением экстрагировали новую порцию сырья.

Подкисленный этиловый спирт готовили из расчета 6,49 г концентрированной кислоты хлористоводородной на 200 мл 95% спирта этилового.

Готовый экстракт отстаивали при температуре не выше +10°C не менее 2 суток до получения прозрачной жидкости, затем фильтровали и хранили при температуре не выше +5°C, в защищенном от света месте.

Экстракт на 95% подкисленном спирте представляет собой темно-вишневую жидкость, со специфическим фруктовым запахом кисловато-горького вкуса.

Сухой остаток жидкого экстракта плодов рябины обыкновенной определяли с помощью весового влагомера MS-70 («AND», Япония). Сухой остаток исследуемого экстракта составляет 14±0,22%.

По данным химического анализа, проведенного общепринятыми методами [3], основными действующими веществами экстракта являются фенолокислоты и антоцианы. Количественное определение данных групп БАВ в исследуемом экстракте проводили методом прямой спектрофотометрии [4,5]. Содержание суммы фенолокислот, в пересчете на хлорогеновую кислоту, в экстракте рябины обыкновенной составляет 2,97±0,15%, а суммы антоцианов, в пересчете на цианид-3-о-глюкозид - 1,09±0,05%.

Новым в предлагаемом изобретении является свойство жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.) проявлять противоопухолевую и антиметастатическую активность и одновременно повышать противометастатическое действие циклофосфана.

Новое свойство явным образом не вытекает из уровня техники в данной области, не очевидно для специалиста и не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе. Предлагаемое в качестве изобретения средство может быть использовано в клинической онкологии.

Предлагаемое изобретение соответствует условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость».

Данное средство прошло экспериментальное исследование в лаборатории онкофармакологии НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (Томск) и на кафедре фармакогнозии с курсами ботаники и экологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.

Новые свойства жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной были обнаружены экспериментальным путем. Изучение проведено на мышах-самках линии C57BL/6 массой 20-22 г в возрасте 3 мес. В качестве модели экспериментального злокачественного роста использовали гематогенно метастазирующую карциному легких Льюис (3LL), перевиваемую внутримышечно по 5 млн. опухолевых клеток на мышь.

Для проведения экспериментов животные (мыши-самки линии C57BL/6) были распределены на группы:

1. Контроль - животные с опухолью, которым зондом в желудок вводили 0,2 мл дистиллированной воды, начиная с 7 суток (сут) после перевивки в течение 12 сут. На 11 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно инъецировали физиологический раствор в объеме 0,1 мл.

2. Циклофосфан (ЦФ) - животные с опухолью, которым зондом в желудок вводили 0,2 мл дистиллированной воды, начиная с 7 сут после перевивки в течение 12 сут. На 11 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.

3. Жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной (1 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок жидкий экстракт плодов рябины обыкновенной в дозе 1 мл/кг в 0,2 мл дистиллированной воды, начиная с 7 сут после перевивки опухоли в течение 12 сут. На 11 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно инъецировали физиологический раствор в объеме 0,1 мл.

4. Жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной (5 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок жидкий экстракт плодов рябины обыкновенной в дозе 5 мл/кг в 0,2 мл дистиллированной воды в течение 11 сут, начиная с 7 сут после перевивки. На 11 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно инъецировали физиологический раствор в объеме 0,1 мл.

5. ЦФ + жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной (1 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок экстракт рябины обыкновенной в дозе 1 мл/кг в 0,2 мл дистиллированной воды, начиная с 7 сут после перевивки в течение 12 сут. На 11 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.

6. ЦФ + жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной (5 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок жидкий экстракт плодов рябины обыкновенной в дозе 5 мл/кг в 0,2 мл дистиллированной воды в течение 11 сут, начиная с 7 сут после перевивки. На 11 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.

По окончании эксперимента (на 21 сут) животных умерщвляли, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные Министерством здравоохранения РФ. Проводили вскрытие животных, ревизию внутренних органов, выделение опухоли, подсчет метастазов. Эффективность проведенных курсов лечения оценивали по противоопухолевому и противометастатическому действию препаратов, определяя массу опухоли, процент торможения ее роста, частоту метастазирования, количество и площадь метастазов в легких [6, 7].

Обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрических критериев Вилкоксона-Манна-Уитни (u) и углового преобразования Фишера (φ). Различия считали достоверными при Р<0,05 [8].

Для выявления фармакологического действия жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной на развитие карциномы легких Льюис и эффективность лечения циклофосфаном мышей линии C57BL/6 был поставлен следующий эксперимент.

Пример 1.

В эксперименте на мышах-самках линии C57BL/6 с карциномой легких Льюис обнаружено, что при изолированном назначении мышам жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной в дозах 1 и 5 мл/кг достоверно тормозился рост первичной опухоли (12 и 20%). Кроме того, у мышей, получавших жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной в дозе 1 мл/кг, количество метастазов в легких и их площадь оказались в 1,8 и 3,4 (Р<0,01) раза меньше таковых у нелеченых животных контроля; индекс ингибирования метастазирования в этой группе животных составил 44% (табл. 1).

Под влиянием циклофосфана масса опухоли у мышей уменьшилась в 1,6 раза, количество метастазов снизилось в 3,3 раза, их площадь оказалась многократно меньше контрольных значений (Р<0,05), индекс ингибирования метастазирования составил 72% (табл. 1).

При добавлении в схему химиотерапии жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной масса первичной опухоли 3LL у мышей достоверно не менялась, прослеживалась лишь тенденция к ее уменьшению по сравнению с таковой у животных, получавших циклофосфан. В то же время, совместное использование циклофосфана с жидким спиртовым экстрактом плодов рябины обыкновенной привело к достоверному повышению противометастатического действия цитостатика. Так, количество метастазов и их площадь у мышей, получавших совместно с циклофосфаном жидкий спиртовый экстракт плодов рябины обыкновенной в дозах 1 и 5 мл/кг, оказались многократно меньше (в 10,7 и 16,8 раза и 34,8 и 11,6 раза соответственно, Р<0,01), частота метастазирования составила 20 и 38% против 90% у животных, леченных только циклофосфаном. В этих группах животных, получавших в комбинации с циклофосфаном спиртовой экстракт плодов рябины обыкновенной в обеих дозах, индекс ингибирования метастазирования оказался наивысшим, достигая 99% (табл. 1).

Установлена способность жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной тормозить рост опухоли.

Выявлена возможность уменьшения количества и площади метастазов в легочной ткани животных с опухолями с помощью жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной.

Обнаружено повышение противометастатического действия циклофосфана при его совместном использовании с жидким спиртовым экстрактом плодов рябины обыкновенной.

Таким образом, в эксперименте на мышах-самках линии C57BL/6 с перевитой метастазирующей карциномой легких Льюис выявлена способность спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной тормозить рост первичной опухоли, метастазов и одновременно повышать противометастатическое действие цитостатика.

Список использованной литературы

1. Пат. 2023446 Российская Федерация, МПК А61K 35/78. Антиметастатическое средство [Текст] Яременко К.В., Дементьева Л.А., Саратиков А.С.: заявитель и патентообладатель: Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра РАМН (RU). - №4082815/14; заявл. 13.05.1993; опубл. 30.11.1994.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 2014. - С. 130.

3. Государственная фармакопея СССР. Вып.2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. М., 1989. С. 160-161; 323-325.

4. Коломиец Н.Э., Калинкина Г.И., Сапронова Н.Н. Стандартизация листьев крапивы двудомной // Фармация. - 2011. - №6. - С. 22-24.

5. Андреева В.Ю., Калинкина Г.И., Коломиец Н.Э. и др. Методика определения антоцианов в плодах аронии черноплодной // Фармация. - 2013. - №3. - С. 19-21.

6. Архипов С.А., Юнкер В.М. Изменение интенсивности метастазирования в легкие перевиваемых опухолей мышей в зависимости от величины перевивочной дозы опухолевых клеток // Исследование по индукции и метастазированию опухолей у экспериментальных животных. - Новосибирск, 1984. - С. 14-32.

7. Софьина З.П. и др. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. - М.: Медицина, 1980. - С. 131.

8. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. - Л.: Медицина, 1978. - С. 210-211.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к применению жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной в качестве средства, обладающего противоопухолевой, противометастатической активностью и одновременно повышающего противометастатическую активность циклофосфана. Применение жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.), полученного путем экстрагирования методом динамической дробной мацерации измельченных плодов рябины обыкновенной подкисленным этиловым спиртом, отстаивания экстракта, фильтрования, при определенных условиях, в качестве средства, обладающего противоопухолевой, противометастатической активностью и одновременно повышающего противометастатическую активность циклофосфана. Вышеописанное средство обладает выраженной противоопухолевой, противометастатической активностью и одновременно эффективно повышает противометастатическую активность циклофосфана. 1 табл., 1 пр.

Применение жидкого спиртового экстракта плодов рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.), полученного путем экстрагирования методом динамической дробной мацерации измельченных до 0,3-0,5 см плодов рябины обыкновенной 95% подкисленным этиловым спиртом при температуре 80°С в течение 60 минут, отстаивания экстракта при температуре не выше 10°С не менее 2 суток, фильтрования; в качестве средства, обладающего противоопухолевой, противометастатической активностью и одновременно повышающего противометастатическую активность циклофосфана.