СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ И АНТИМЕТАСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЦИКЛОФОСФАНА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2006 года по МПК A61K31/675 A61K35/48 A61P35/00 G09B23/28 

Изобретение относится к онкологии и может быть использовано при химиотерапии злокачественных опухолей.

Известен способ повышения противоопухолевой активности низких доз циклофосфана (60 мг/кг) с помощью саназола, синтетического соединения из группы триазолов [1]. На модели перевиваемой карциномы легких Льюис было показано, что применение циклофосфана в дозе 60 мг/кг, вводимого на 3 и 7 сутки и саназола в дозе 1 мг/кг, вводимого внутрибрюшинно ежедневно в течение 10 дней, является столь же эффективным, как и терапия высокими дозами циклофосфана (120 мг/кг), о чем судили по торможению роста легочных метастазов.

Недостатками данного способа является отсутствие выраженного противоопухолевого действия на первичный опухолевый узел и побочные явления, связанные с синтетической природой саназола.

Одним из широко применяемых в настоящее время цитостатических препаратов является алкилирующий агент циклофосфан. Алкилированию подвергаются многие органические соединения, но определяющим является повреждение ДНК. Однако циклофосфан в высоких дозах (120 мг/кг) не оказывает существенного противоопухолевого эффекта на первичный опухолевый узел. Основными побочными эффектами циклофосфана являются нарушение кроветворения, иммунодепрессия. истощение количества кроветворных клеток костного мозга [2, 3, 5].

Принципы современной химиотерапии опухолей предполагают введение максимально переносимых доз цитостатиков с целью наиболее полного повреждения опухолевых клеток. Высокая гематотоксичность противоопухолевых препаратов является серьезным ограничением в достижении максимального терапевтического эффекта. Таким образом, актуальным является создание оптимальных условий для реализации действия высоких доз цитостатиков при снижении их побочных эффектов.

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение выраженности противоопухолевого эффекта на первичный опухолевый узел при усилении антиметастатического действия цитостатика, снижение побочных эффектов.

Поставленная задача решается путем перевивки опухоли LLC (карцинома легких Льюиса) экспериментальному животному и во внутрибрюшинном введении на 3 и 7 сутки циклофосфана в дозе 120 мг/кг и внутривенной трансплантации экспериментальным животным стволовых клеток фетальной печени эмбрионов ранних стадий гестации в дозе 25×10⁶ клеток/кг суспензии по 0,05 мл через сутки после перевивки опухоли LLC (карциномы легких Льюиса).

Новым является то, что циклофосфан вводят в дозе 120 мг/кг, внутривенно трансплантируют стволовые клетки фетальной печени эмбрионов ранних стадий гестации через сутки после перевивки опухоли LLC (карцинома легких Льюиса) в дозе 25×10⁶ /кг по 0,05 мл.

Клетки фетальной печени эмбрионов ранних стадий гестации представляют собой суспензию отдельных клеток в среде RPMI-1640 с 90-95% жизнеспособностью. При этом выявлена также их иммуномодулирующая активность как в отношении Т- и В-лимфоцитов, так и эффекторных клеток естественной резистентности [4]. Свойства клеток фетальной печени эмбрионов ранних стадий гестации повышать противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана неизвестны.

Данные существенные признаки не выявлены из научно-медицинской и патентной литературы. Они явным образом не следуют из уровня техники для специалистов. Данный способ прошел экспериментальное исследование в лаборатории иммунологии НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН г.Томска.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения "новизна", "изобретательский уровень", "промышленно применимо".

Способ осуществляют следующим образом.

Экспериментальным животным перевивают опухоль LLC (карцинома легких Льюиса) и через сутки после перевивки опухоли трансплантируют внутривенно стволовые клетки фетальной печени эмбрионов ранних стадий гестации в дозе 25×10⁶ клеток/кг в суспензии по 0,05 мл, затем на 3-и и 7-е сутки вводят циклофосфан внутрибрюшинно.

Конкретный пример выполнения способа.

В качестве экспериментальных животных были использованы мыши линии C57BL/6 массой 20-22 грамма. В качестве модели экспериментального злокачественного роста использовали гематогенно метастазирующую карциному легких Льюис (LLC), перевиваемую внутримышечно по 10⁶ клеток/мышь.

Для проведения эксперимента все мыши с перевитой LLC были разделены на 4 группы:

1) «LLC»: мыши, получившие инъекцию физ. раствора по 0,05 мл внутривенно;

2) «LLC+CK» - мыши, получившие инъекцию стволовых клеток фетальной печени в дозе 25×10⁶ клеток/кг в физ. растворе по 0,05 мл внутривенно;

3) «LLC+циклофосфан»: мыши, получавшие циклофосфан в дозе 120 мг/кг внутрибрюшинно на 3-и и 7-е сутки после перевивки опухоли и получившие инъекцию физ. раствора по 0,05 мл внутривенно;

4) «LLC+циклофосфан+СК»: мыши, получавшие циклофосфан по аналогичной схеме и внутривенную трансплантацию стволовых клеток фетальной печени эмбрионов 10-15 дней гестации в дозе 25×10⁶ клеток/кг в физ. растворе по 0,05 мл.

Мышей забивали на 21-е сутки после перевивки LLC.

Эффективность воздействия оценивали по торможению роста опухоли, снижению частоты и интенсивности метастазирования, торможению роста метастазов.

Статистическая обработка результатов. Результаты исследований обрабатывали методами вариационной статистики. Значимость различий показателей между группами оценивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксона - Манна - Уитни при р≤0,05. Расчеты проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0 для Windows.

Результаты исследования совместного применения циклофосфана и трансплантации стволовых фетальных клеток печени эмбрионов ранних сроков гестации при терапии карциномы легких Льюис показали, что у мышей при комбинированном лечении трансплантации стволовых клеток и циклофосфаном в дозе 120 мг/кг наблюдалось наиболее выраженное торможение роста первичного опухолевого узла (торможение роста опухоли по массе составило 84% по сравнению с 63% в группе, леченной только циклофосфаном в дозе 120 мг/кг, торможение роста опухоли по объему составило соответственно: 71% при комбинированном лечении циклофосфаном и с трансплантацией стволовых клеток фетальной печени и 58% при введении только циклофосфана), при этом наблюдается торможение образования метастазов, так, частота метастазирования в группе с введением циклофосфана составила 56%, в то же время в группе с комбинацией циклофосфана и стволовых клеток фетальной печени она равна 22%, суммарная площадь метастатических колоний в группе с комбинацией циклофосфана и стволовых клеток фетальной печени в 3 раза меньше, чем в группе, где циклофосфан вводился без стволовых клеток. Индекс ингибиции метастазирования в опытной «LLC+циклофосфан+СК» группе составил - 98%, в то время как в группе «LLC+циклофосфан» - 82% (табл.1). Также отмечено ингибирование роста уже образовавшихся метастазов.

Таким образом, в результате проведенного исследования получен следующий положительный эффект: совместное использование циклофосфана в дозе 120 мг/кг и внутривенной трансплантации стволовых клеток фетальной печени эмбрионов ранних сроков гестации в дозе 25×10⁶ клеток/кг в суспензии по 0,05 мл приводит к усилению торможения первичной опухоли и более выраженному антиметастатическому эффекту, чем при сравнении с прототипом (табл.2).

Литература

1. Коновалова Н.П., Дьячковская Р.Ф., Волкова Л.М., Кагия В.Т. Потенцирование антиметастатической активности циклофосфана радиосенсибилизатором АК-2123 // Экспериментальная онкология. - 1994. - Т.16. - С.419-422.

2. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шерстобоев Е.Ю. Механизмы локальной регуляции кроветворения. - Томск: STT, 2000. - 148 с.

3. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США // под ред. Софьиной З.П. - М.: Медицина. - 1979. - 296 с.

4. Кокорев О.В. Противоопухолевое действие трансплантатов фетальных тканей на пористом носителе из никелида титана. Автореферат, дис..., канд. мед. наук - М. - 2000.

5. Стволовые клетки и опухолевый рост: Сб. науч. тр. / Отв. ред. Пинчук В.Г., Бутенко З.А. Киев: Наук. думка, 1985. - 256 с.

Таблица 1 LLCLLC+CKLLC+ЦФ (120 мг/кг)LLC+ЦФ (120 мг/кг)+СКмасса первичной опухоли, г3,486±0,2713,626±0,3241,486±0,114¹1,026±0,110²Объем первичной опухоли, см³2,6±0,32,85±0,230,976±0,13¹0,43±0,14²торможение роста опухоли (масса), %0125871торможение роста опухоли (объем), %0106384число метастазов/мышь8,63±1,388,18±1,11,56±0,53¹0,44±0,3²частота метастазирования, %10010056¹22²площадь метастазов, мм²31,38±4,7326,25±2,762,56±0,78¹0,56±0,12²торможение роста метастазов, %-168798Индекс ингибиции метастазирования, %02,98298Примечание: ¹ - различия достоверны при р<0,05 для «LLC+ЦФ» по сравнению с «LLC» и «LLC+CCK»,² - различия достоверны при р<0,05 для «LLC+ЦФ+СК» - по сравнению с «LLC+ЦФ».Таблица 2. LLC+ЦФ (60 мг/кг)LLC+ЦФ (60 мг/кг)+саназолLLC+ЦФ (120 мг/кг)LLC+ЦФ (120 мг/кг)+СКТорможение роста опухоли (объем), %55636384*Частота метастазирования, %10025*10022*Индекс ингибиции метастазирования, %3098*8298*• - достоверные отличия с "LLC+ЦФ", р<0,05

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и онкологии. Способ включает внутрибрюшинное введение циклофосфана в дозе 120 мг/кг и внутривенную трансплантацию стволовых клеток фетальной печени экспериментальному животному. При этом стволовые клетки фетальной печени трансплантируют за 3 дня до введения циклофосфана, в дозе 25×10⁶ клеток на килограмм массы. Способ позволяет многократно увеличить эффект торможения роста опухоли, уменьшить частоту и площадь метастазирования за счет оптимально подобранного режима введения циклофосфана и стволовых клеток. 2 табл.

Способ повышения противоопухолевого и антиметастатического эффекта в эксперименте, заключающийся во внутрибрюшинном введении циклофосфана в дозе 120 мг/кг и внутривенной трансплантации стволовых клеток фетальной печени экспериментальному животному, отличающийся тем, что стволовые клетки фетальной печени трансплантируют за 3 дня до введения циклофосфана, в дозе 25·10⁶ клеток на килограмм массы.