Способ усиления противометастатического действия цисплатина и снижения его побочного действия на систему гемостаза Российский патент 2024 года по МПК G09B23/28 A61K33/243 A61K36/26 A61P35/04 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии и гемостазиологии, и может быть использовано для ингибирования метастатического поражения легких и фармакологической коррекции гиперкоагуляционного состояния системы гемостаза, развивающегося при воздействии цисплатина на фоне опухолевого процесса.

Метастазирование является одной из основных причин смертности от онкологических заболеваний. Наиболее распространенными первичными опухолями, для которых характерно метастазирование в легкие являются рак молочной железы, желудка, кишечника, почки, печени и др. [1]. Для уничтожения, как самой опухоли, так и возможных метастазов широко используется химиотерапия. Частыми неблагоприятными последствиями, возникающими у пациентов онкологического профиля, являются тромботические осложнения, включающие венозную тромбоэмболию и артериальный тромбоз. Значительная часть риска возникновения тромботических осложнений связана не только с протеканием заболевания, но и с его терапией [2].

Цисплатин - химиотерапевтический препарат, лицензированный в 1978 году и в настоящее время включенный Всемирной организации здравоохранения в список основных лекарственных средств. Он широко используется как самостоятельно, так и в комбинации с другими цитостатиками для лечения рака яичек, яичников, шейки матки, мочевого пузыря, головы и шеи, легких, пищевода и желудка. Один из побочных эффектов применения цисплатина - развитие тромботических осложнений, включая как венозный, так и артериальный тромбоз. Так, было показано, что среди 932 пациентов, получавших схемы на основе цисплатина для лечения различных видов рака, частота тромбозов составила 18,1% [2].

Таким образом, актуальным является разработка новых схем дополнительной терапии, приводящих к повышению антиметастатического действия цитостатиков и при этом не вызывающих увеличение частоты развития тромботических осложнений, а напротив, способных осуществлять коррекцию данных нарушений. В данном аспекте интерес представляют вещества растительного происхождения, в частности, известно, что фурокумарины болиголова пятнистого (Conium maculatum L.) способны усиливать действие некоторых цитостатиков. Перспективным является оценка действия экстракта, полученного из культуры клеток Conium maculatum L. и содержащего фурокумарины, на состояние системы гемостаза при опухолевом процессе.

Известно антиметастатическое средство - жидкий экстракта рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.), полученный экстрагированием листьев рябины, измельченных до размера частиц диаметром 0,3-0,5 см, 40%-ным этиловым спиртом при температуре 75°С в течение 60 минут, в качестве антиметастатического и повышающего противометастатическое действие циклофосфана [4].

Средство представляет собой сумму фенолокислот в 40%-м экстракте листьев рябины обыкновенной, 17,86±0,12% в пересчете на хлорогеновую кислоту; сумму флавоноидов в пересчете на рутин - 3,70±0,11%, сумму антоцианов, в пересчете на цианид-3-о-глюкозид - 5,94±0,04%. Данная сумма соединений проявляет антиметастатические свойства и способна повышать противометастатическое действие циклофосфана. Используемый нами экстракт, получен из биотехнологического сырья, очищен и содержит фурокумарины, и его применение на фоне опухолевого процесса вызывает не только повышение противометастатического действия цисплатина, но и оказывает корректирующее действие на систему гемостаза.

Известен способ применения дигидробромида 2-(3,4-дигидроксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а] бензимидазола (эноксифол) в качестве средства для ингибирования метастазов. Фармакологическая субстанция дигидробромид 2-(3,4-дигидроксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а] бензимидазола (эноксифол) позволяет снижать частоту развития и количество метастазов в легких экспериментальной меланомы В16 мышей при внутрижелудочном введении в разовой дозе 50 мг/кг 1 раз в день [5].

Эноксифол при однократном внутрижелудочном введении в дозе 50 мг/кг вызывает снижение частоты развития и количества метастазов в легких экспериментальной меланомы В16 мышей, при этом отсутствуют эффекты в отношении системы гемостаза. В то время как в описанном нами способе экстракт полученных из культуры клеток болиголова пятнистого и содержащий фурокумарины не только вызывает снижение количества метастазов, но и оказывает корректирующее действие на нарушения гемостатического потенциала мышей-самок вызванное применением цисплатина на фоне опухолевого процесса.

В проанализированной патентной и научно-медицинской литературе адекватного прототипа не обнаружено.

Задачей, решаемой настоящим изобретением является поиск способов усиления действия цитостатической терапии с одновременным снижением ее негативных эффектов на систему гемостаза.

Поставленная задача решается путем ежедневного внутрижелудочного введения мышам-самкам линии C57BL/6 с перевиваемой карциномой Льюис экстракта, полученного из культуры клеток болиголова пятнистого очищенного и представляющего собой смесь из 3-х фурокумаринов (бергаптен, изопимпинеллин и ксантотоксин) с содержанием не менее 90%, в дозе 30 мг/кг с 16-х по 19-е сутки после перевивки опухоли на фоне однократного введения цисплатина внутрибрюшинно в дозе 9 мг/кг на 10-е сутки. На 20-е сутки после перевивки опухоли проводят забор биологического материала для исследования эффективности химиотерапии и оценки характеристик гемостаза.

Новым в предлагаемом изобретении является то, что экстракт, полученный культуры клеток болиголова пятнистого (Conium maculatum L.), при введении в дозе 30 мг/кг с 16-х по 19-е сутки после перевивки опухоли способен повышать противометастатическое действие цисплатина с сопутствующей коррекцией гиперкоагуляционного состояния у экспериментальных животных с перевитой карциномой легких Льюис.

Новые признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков не обнаружено в патентной и научно -медицинской литературе.

Предлагаемый в качестве изобретения способ может быть использован для создания новых схем терапии, повышающих действие цитостатиков с дополнительной коррекцией гиперкоагуляционного состояния, вызванного применением химиотерапевтических препаратов, в частности, цисплатина, в онкологической практике.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему фигур.

На фиг. 1 изображено изменение константы тромбиновой активности (КТА) мышей-самок с перевитой карциномой легких Льюис опухолями на фоне применения цисплатина после коррекции с использованием экстракта, полученного из культуры клеток болиголова пятнистого, при этом здесь и далее столбец а - здоровые животные, б - опухолевый контроль, в - цисплатин, г - экстракт, д - варфарин.

На фиг. 2 изображено изменение интенсивности коагуляционного драйва (ИКД) мышей-самок с перевитой карциномой легких Льюис опухолями на фоне применения цисплатина после коррекции с использованием экстракта, полученного из культуры клеток болиголова пятнистого а - здоровые животные, б - опухолевый контроль, в - цисплатин, г - экстракт, д - варфарин.

На Фиг. 3 изображено изменение времени желирования крови (t3) мышей-самок с перевитой карциномой легких Льюис опухолями на фоне применения цисплатина после коррекции с использованием экстракта, полученного из культуры клеток болиголова пятнистого а - здоровые животные, б - опухолевый контроль, в - цисплатин, г - экстракт, д - варфарин.

На Фиг. 4 изображено изменение времени образования сгустка (t5) мышей-самок с перевитой карциномой легких Льюис опухолями на фоне применения цисплатина после коррекции с использованием экстракта, полученного из культуры клеток болиголова пятнистого а - здоровые животные, б - опухолевый контроль, в - цисплатин, г - экстракт, д - варфарин.

Самкам мышей линии C57BL/6 перевивают карциному легких Льюис, затем на 10-е сутки внутрибрюшинно вводят цисплатин в дозе 9 мг/кг, далее с 16-х по 19-е сутки ежедневно внутрижелудочно животным вводят экстракт, полученный из культуры клеток болиголова пятнистого, в дозе 30 мг/кг, и на 20-е сутки после перевивки опухолей осуществляют забор биологического материала (кровь, легкие) для оценки эффективности действия препаратов на развитие метастазов и параметров гемостаза методом НПТЭГ.

Способ осуществляется следующим образом. Самкам мышей линии C57BL/6 внутримышечно перевивают опухолевые клетки в количестве 5×10⁶ клеток в 0,1 мл физиологического раствора, затем на 10-е сутки внутрибрюшинно однократно вводят цисплатин в дозе 9 мг/кг, далее с 16-х по 19-е сутки ежедневно внутрижелудочно животным вводят экстракт, полученный из культуры клеток болиголова пятнистого, в дозе 30 мг/кг. Затем на 20-е сутки осуществляют забор крови методом пункции сердца у наркотизированных животных, кровь в течение 15-20 сек помещают в кювету объемом 0,45 мл, расположенную в термостате аппаратно-программного комплекса для клинико-диагностических исследований реологических свойств крови (тромбоэластограф) НПТЭГ «Меднорд» (ООО «Меднорд-Т», Россия) прибора, при этом оценивают следующие параметры: константа тромбиновой активности (КТА, о.е.), t3 (время желирования, мин), интенсивность коагуляционного драйва (ИКД, о.е.), t5 (время образования сгустка, мин).

Для оценки развития процесса гематогенного метастазирования используют следующие критерии: торможение роста опухоли (ТРО, %) [6], частоту метастазирования (ЧМ), среднее количество метастазов у одного животного в группе, индекс ингибирования метастазирования (ИИМ, %) [7].

Достигаемый технический результат заключается в том, что использование экстракта, полученного из культуры клеток болиголова пятнистого и содержащего фурокумарины, для повышения эффективности противометастатического действия цисплатина, вызывает снижение количества метастазов в 12,8 раз и многократное сокращение площади метастазов в легких в сравнении с группой, получавшей только цисплатин. При этом индекс ингибирования метастазирования у животных, получавших фурокумарины на фоне действия цисплатина, составляет 99% против 74% в группе мышей получавших цисплатин. Экстракт корректирует гиперкоагуляционное состояние системы гемостаза экспериментальных животных, вызванное перевивкой опухоли и химиотерапией цисплатином и вызывает значимые изменения параметров системы гемостаза (снижение КТА и ИКД на 20,9% и 12,5% от группы опухолевого контроля и от на 18,7% и 19,8% от группы получавшей цисплатин) с достижением значений здоровых животных.

Пример

Экстракт получали следующим образом: высушенную клеточную биомассу культур болиголова пятнистого (Conium maculatum L.) обезжиривали петролейным эфиром и настаивали с добавлением 500 мл 70%-го водного раствора ацетона. Далее полученный раствор поэтапно обрабатывали 30 мл 10%-го спиртового раствора калия гидроксида, 100 мл 10%-ного водного раствора калия гидроксида и 100 мл 10%-го раствора кислоты хлористоводородной. После чего добавляли к экстракту 150 мл хлороформа и с помощью делительной воронки отделяли хлороформный слой, который высушивали в вытяжном шкафу при комнатной температуре. Для выделения суммы фурокумаринов экстракт подвергали очистке методом жидкостной колоночной хроматографии на сорбенте Toyopearl HW-50 (Tosoh Bioscience GmbH, Германия). В результате был получен кристаллический порошок светложелтого цвета, без запаха [9].

При проведении экспериментов мыши-самки линии C57BL/6 были распределены по группам:

1. Здоровые животные - мыши-самки, которым внутрибрюшинно однократно вводили 0,5 мл физиологического раствора на 10-е сутки и с 16-х по 19-е сутки включительно крахмальный гель по 0,5 мл внутрижелудочно.

2. Опухолевый контроль - мыши-самки, которым внутримышечно вводили опухолевые клетки карциномы легких Льюис, получавшие внутрибрюшинно однократно 0,5 мл физиологический раствора на 10-е сутки и с 16-х по сутки 19-е включительно вводили крахмальный гель по 0,5 мл внутрижелудочно.

3. Цисплатин - мыши-самки, которым внутримышечно вводили опухолевые клетки карциномы легких Льюис, затем внутрибрюшинно однократно вводили цисплатин дозе 9 мг/кг и с 16-х по сутки 19-е включительно вводили крахмальный гель по 0,5 мл внутрижелудочно.

4. Экстракт - мыши-самки, которым внутримышечно вводили опухолевые клетки карциномы легких Льюис, затем на 10-е стуки внутрибрюшинно однократно вводили цисплатин дозе 9 мг/кг, и с 16-х по сутки 19-е включительно внутрижелудочно вводили экстракт в дозе 30 мг/кг.

5. Варфарин - мыши-самки, которым внутримышечно вводили опухолевые клетки карциномы легких Льюис, затем на 10-е стуки внутрибрюшинно однократно вводили цисплатин дозе 9 мг/кг, и с 16-х по сутки 19-е включительно внутрижелудочно вводили варфарин в дозе 4 мг/кг.

Забор крови для исследования осуществляли инсулиновым шприцом методом пункции сердца. Аликвоту крови в течение 15-20 сек переносили в кювету объемом 0,45 мл, расположенную в термостате аппаратно-программного комплекса для клинико-диагностических исследований реологических свойств крови (тромбоэластограф) НПТЭГ «Меднорд» и начинали исследование с применением программы ИКС-ГЕМО 3. Оценивали следующие параметры: константа тромбиновой активности (КТА, о.е.), t3 (время желирования, мин), интенсивность коагуляционного драйва (ИКД, о.е.), t5 (время образования сгустка, мин). Далее животных умерщвляли путем эвтаназии в СО₂ камере, соблюдая "Правила проведения работ с использованием экспериментальных животными" [7], проводили вскрытие, ревизию внутренних органов, выделение опухоли и метастазов.

Для оценки развития процесса гематогенного метастазирования использовали следующие критерии:

1) Торможение роста опухоли (ТРО, %) вычисляли по формуле (1).

А - средняя масса опухоли в контрольной группе;

В - средняя масса опухоли в опытной группе;

2) частоту метастазирования (ЧМ) опухоли - вычисляют в процентах (по отношению числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе);

2) среднее количество метастазов у одного животного в группе. Среднюю площадь метастатического поражения высчитывают по формуле S=πr2, определяя при этом диаметр метастазов, учитывая, что при использовании карциномы легких Льюис метастазы располагались преимущественно субплеврально;

3) индекс ингибирования метастазирования (ИИМ, %) - интегральный показатель, позволяющий оценить величину различия в метастазировании опухоли между контролем и опытом, вычисляют по формуле (2).

А1 - частота метастазирования в контрольной группе;

А2 - частота метастазирования в опытной группе;

В1 - среднее количество метастазов у животных контрольной группы;

В2 - среднее количество метастазов у животных опытной группы [7];

Критериями оценки противометастатического действия изучаемого растительного экстракта является их способность достоверно повышать эффективность химиотерапевтического лечения при тестировании на моделях спонтанного метастазирования опухолей [8].

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ Statistica 10. Межгрупповые различия были оценены с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни и углового преобразования Фишера. Различия определяли при 0,05% уровне достоверности.

При оценке влияния экстракта, полученного из культуры клеток болиголова пятнистого, на эффективность химиотерапии показано, что его добавление в схему лечения цисплатином, приводит к повышению противометастатического действия антибластомного препарата: количество метастазов снизилось в 12,8 раза (Р<0,05), также многократно уменьшилась площадь метастатического поражения в легких. Кроме того, комбинированное использование цитостатика с экстрактом привело к достоверному снижению количества животных с метастазами относительно показателя в группе монохимиотерапии, при этом ИИМ составил 99% против 74% в группе животных, получавшей только цисплатин (таблица 1) Значимой разницы в массе первичного опухолевого узла между группами не выявлено.

На фигуре 1 изображено изменения КТА мышей-самок с перевитой карциномой легких Льюис опухолями на фоне применения цисплатина после коррекции с использованием экстракта, полученного из культуры клеток болиголова пятнистого. Здесь и далее на фигурах группа здоровых животных взята за 100%, маркером * обозначали выявленные различия (р<0,05) при сравнении с группой здоровых животных; маркером # обозначали выявленные различия (р<0,05) при сравнении с группой опухолевого контроля; маркером ^ обозначали выявленные различия (р<0,05) при сравнении с группой цисплатина; маркером & обозначали выявленные различия (р<0,05) при сравнении с группой варфарина, столбец а - здоровые животные, б - опухолевый контроль, в - цисплатин, г - экстракт, д - варфарин. В результате применения экстракта, содержащего фурокумарины, у мышей-самок с перевиваемой карциномой легких Льюис на фоне действия цисплатина наблюдали снижение КТА в сравнении с группой, получавшей цисплатин и группой опухолевого контроля на 18,7%(Р<0,05) и 20,9%(Р<0,05) (фиг 1).

На фигуре 2 изображено уменьшение ИКД при применении экстракта у мышей-самок на 19,8%(Р<0,05) и 12,5% (Р<0,05) от групп получавших цисплатин и опухолевого контроля (фиг 2). При этом значения КТА и ИКД у животных получавших экстракт, полученный из культуры клеток болиголова пятнистого, не отличались от группы здоровых животных.

На фигуре 3 изображено увеличение показателя t3 у животных получавших экстракт на 56,9%(Р<0,05) от значений группы цисплатина и на 56,9%(Р<0,05) от группы опухолевого контроля. Отмечено что в группе экстракта показатель t3 был выше значений здоровых животных на 39,9%(Р<0,05) но ниже на 35,0% при сравнении с группой животных получавших варфарин (фиг 3).

На фигуре 4 изображен рост значений показателя t5 как относительно величин группы цисплатина на 27,0%(Р<0,05) и опухолевого контроля на и 25,3%(Р<0,05) так и от здоровых животных и 29,7%(Р<0,05) (фиг. 4). Введение экстракта, полученного из болиголова пятнистого и содержащего фурокумарины, приводит к снижению гиперкоагуляции, вызванной применением цисплатина на фоне опухолевого процесса. При этом корректирующее действие экстракта сравнимо по эффективности с препаратом сравнения - варфарином, за исключением значений показателя t3, высокие значения которого в группе варфарина могут свидетельствовать о гипокоагуляционных изменениях ГП.

Таким образом, курсовое внутрижелудочное применение экстракта, содержащего фурокумарины, на фоне действия цисплатина у животных с перевитой карциномой легких Льюис вызывает уменьшение количества и площади метастазов и оказывает корректирующее действие на систему гемостаза, сходное с применением варфарина.

Список литературы

1. Gerull, W. D., Puri, V., Kozower, В. D. The epidemiology and biology of pulmonary metastases / Journal of thoracic disease. 2021. Vol. 13. №4. P. 2585-2589.

2. Abdel-Razeq, H., Mansour, A., Abdulelah, H., Al-Shwayat, A., Makoseh, M, Ibrahim, M., Abunasser, M, Rimawi, D., Al-Rabaiah, A., Alfar, R., Abufara, A., Ibrahim, A., Bawaliz, A., & Ismael, Y. Thromboembolic events in cancer patients on active treatment with cisplatin-based chemotherapy: another look! / Thrombosis journal. 2018. Vol. 16. №2.

3. Ahmed S., Khan H., Aschner M., Mirzae H., Kiipeli Akkol E., Capasso R. Anticancer Potential of Furanocoumarins: Mechanistic and Therapeutic Aspects / Int J Mol Sci. 2020. Vol. 21. №16. P. 5622.

4. Патент РФ №2657814, опубл. 15.06.2018

5. Патент РФ №2632703 С1, опубл. 10.09.2017

6. Софьина З.П. Методические рекомендации по первичному отбору противоопухолевых препаратов. - М., 1980. С 58.

7. Архипов, С.А. Изменение интенсивности метастазирования в легкие перевиваемых опухолей мышей в зависимости от величины перевивочной дозы опухолевых клеток / С.А. Архипов, В.М. Юнкер, Е.В. Грунтенко // Исследование по индукции и метастазированию опухолей у экспериментальных животных. - Новосибирск, 1984. С. 14-32.

8. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2013. С. 944.

9. Филонова М.В. Фурокумарины в коррекции нарушений гемостаза, миело- и гепатотоксичности, вызванных применением цисплатина (экспериментальное исследование) диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук / ФГБНУ "Томский национальный исследовательский медицинский центр российской академии наук". 2021

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии и гемостазиологии, и может быть использовано для усиления противометастатического действия цисплатина и снижения его побочного действия на систему гемостаза. Мышам-самкам линии C57BL/6 с перевитой карциномой легких Льюиса на фоне однократного внутрибрюшинного введения цисплатина в дозе 9 мг/кг на 10-е сутки после перевивки опухоли, ежедневно с 16-х по 19-е сутки внутрижелудочно вводят экстракт, полученный из культуры клеток Conium maculatum L., в дозе 30 мг/кг. Основные показатели метастазирования и характеристики гемостаза оценивают на 20-е сутки после перевивки опухоли. Изобретение обеспечивает снижение количества и площади метастазов в легких, а также значимые изменения параметров системы гемостаза. 4 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ усиления противометастатического действия цисплатина и снижения его побочного действия на систему гемостаза, характеризующийся тем, что мышам-самкам линии C57BL/6 с перевитой карциномой легких Льюиса на фоне однократного внутрибрюшинного введения цисплатина в дозе 9 мг/кг на 10-е сутки после перевивки опухоли, ежедневно с 16-х по 19-е сутки внутрижелудочно вводят экстракт, полученный из культуры клеток Conium maculatum L., в дозе 30 мг/кг при этом основные показатели метастазирования и характеристики гемостаза оценивают на 20-е сутки после перевивки опухоли.