ТВЕРДЫЕ ФОРМЫ 3-(2, 2-ДИФТОРБЕНЗО[D][1, 3] ДИОКСОЛ-5-ИЛ)ЦИКЛОПРОПАНКАРБОКСАМИДО)-3-МЕТИЛПИРИДИН-2-ИЛ)БЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2016 года по МПК C07D405/12 A61K31/44 A61P11/00 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка по 35 U.S.C., § 119, притязает на приоритет предварительной заявки на патент Соединенных Штатов № 61/321729, поданной 7 апреля 2010 года, и озаглавленной «Твердые формы 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)бензойной кислоты», включенной в данное описание в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к твердым формам, например кристаллическим формам, соединения 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)бензойной кислоты, фармацевтическим композициям на их основе и способам их применения.

Предпосылки создания изобретения

CFTR представляет собой опосредованный цАМФ/АТФ анионный канал, который экспрессируется в различных типах клеток, включая всасывающие и секреторные эпителиальные клетки, где он регулирует поток анионов через мембрану, а также активность других ионных каналов и белков. В эпителиальных клетках нормальное функционирование CFTR является критическим для поддержания транспорта электролитов в организме, включая ткань дыхательной и пищеварительной системы. CFTR состоит из приблизительно 1480 аминокислот, которые кодируют белок, составленный из тандемного повтора трансмембранных доменов, причем каждый содержит шесть трансмембранных спиралей и нуклеотидсвязывающий домен. Два трансмембранных домена соединены большим полярным регуляторным (R)-доменом с несколькими сайтами фосфорилирования, которые регулируют активность канала и направленную миграцию клеток.

Ген, кодирующий CFTR, идентифицирован и секвенирован (смотрите Gregory R.J. et al. (1990), Nature, 347: 382-386; Rich D.P. et al. (1990), Nature, 347: 368-362; Riordan J.R. et al. (1989), Science, 245: 1066-1073). Дефект в таком гене вызывает мутации в CFTR, приводящие к муковисцидозу («CF») - наиболее известному смертельному заболеванию у людей. Муковисцидоз поражает приблизительно одного из каждых 2500 детей в Соединенных Штатах. В общей популяции в Соединенных Штатах до 10 миллионов людей несут одну копию дефектного гена без явных патологических действий. В противоположность этому индивидуумы с двумя копиями CF-ассоциированного гена страдают от вызывающих слабость и пагубных действий CF, включая хроническую болезнь легких.

У пациентов с муковисцидозом мутации в CFTR, эндогенно экспрессированном в респираторном эпителии, ведут к пониженной верхушечной секреции анионов, что вызывает дисбаланс в транспорте ионов и жидкостей. Итоговое снижение в транспорте ионов вносит вклад в усиленное накопление слизи в легком и сопутствующим микробным инфекциям, которые в конечном итоге вызывают гибель больных CF. Кроме респираторных заболеваний больные CF обычно страдают от желудочно-кишечных проблем и недостаточности поджелудочной железы, которые при отсутствии лечения приводят к смерти. Кроме того, большинство мужчин с муковисцидозом являются бесплодными, и фертильность снижается у женщин с муковисцидозом. В противоположность тяжелым действиям двух копий CF-ассоциированного гена, индивидуумы с одной копией CF-ассоциированного гена показывают повышенную устойчивость к холере и обезвоживанию, являющемуся результатом диареи, что возможно объясняет относительно высокую частоту CF-гена в популяции.

Анализ последовательности гена CFTR CF-хромосом открыл ряд вызывающих заболевание мутаций (Cutting G.R. et al. (1990), Nature, 346: 366-369; Dean M. et al. (1990), Cell, 61: 863-870; и Kerem B-S. et al. (1989), Science, 245: 1073-1080; Kerem B-S. et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8447-8451). До сих пор идентифицировано свыше 1000 вызывающих заболевания мутаций в CF-гене (, последний просмотр 4 апреля 2011 года). Самой преобладающей мутацией является делеция фенилаланина в позиции 508 аминокислотной последовательности CFTR, что обычно обозначают как ΔF508-CFTR. Такая мутация встречается в приблизительно 70% случаев муковисцидоза и ассоциируется с тяжелым заболеванием.

Делеция остатка 508 в ΔF508-CFTR препятствует правильной укладке продуцируемого белка. Это приводит к неспособности мутантного белка выходить из эндоплазматического ретикулума (ER) и продвигаться к плазматической мембране. В результате число каналов, присутствующих в мембране, значительно меньше, чем наблюдаемое в клетках, экспрессирующих CFTR дикого типа. Кроме ухудшенного переноса мутация приводит к нарушению открывания каналов. Вместе пониженное число каналов в мембране и нарушение открывания каналов ведут к уменьшенному переносу анионов через эпителий, что ведет к нарушенному транспорту ионов и жидкостей (Quinton P.M. (1990), FASEB J., 4: 2709-2727). Однако исследования показали, что пониженное число ΔF508-CFTR в мембране является функциональным, хотя менее, чем CFTR дикого типа (Dalemans et al. (1991), Nature Lond., 354: 526-528; Denning et al., цит. выше; Pasyk and Fosket (1995), J. Cell. Biochem., 270: 12347-50). Кроме ΔF508-CFTR, для изменения секреции и модификации развития и/или тяжести заболевания можно было бы регулировать положительно или отрицательно другие вызывающие заболевания мутации в CFTR, которые приводят к нарушению транспорта, синтеза и/или открывания каналов.

Хотя CFTR также переносит различные молекулы, ясно, что транспорт анионов представляет один из элементов важного механизма переноса ионов и воды через эпителий. Другие элементы включают эпителиальный Na⁺-канал, ENaC, копереносчика Na⁺/2Cl^-/K⁺, насос Na⁺-K⁺-АТФ-азы и K⁺-каналы базолатеральной мембраны, ответственные за поглощение хлоридов в клетке.

Элементы действуют вместе для достижения направленного транспорта через эпителий через их селективную экспрессию и локализацию в клетке. Поглощение хлоридов происходит за счет координированной активности ENaC и CFTR, присутствующих на апикальной мембране, и насоса Na⁺-K⁺-АТФ-азы и Cl^--каналов, экспрессированных на базолатеральной поверхности клетки. Вторичный активный транспорт хлорида со стороны просвета ведет к накоплению внутриклеточного хлорида, который затем может пассивно покидать клетку через Cl^--каналы, что приводит к векторному транспорту. Расположение копереносчика Na⁺/2Cl^-/K⁺, насоса Na⁺-K⁺-АТФ-азы и K⁺-каналов базолатеральной мембраны на базолатеральной поверхности и CFTR на стороне просвета координирует секрецию хлорида через CFTR со стороны просвета. Поскольку вода вероятно никогда активно сама не переносится, ее поток через эпителий зависит от совсем небольших трансэпителиальных осмотических градиентов, генерированных потоком массы натрия и хлорида.

Как обсуждалось выше, полагают, что делеция остатка 508 в ΔF508-CFTR препятствует правильной укладке получающегося белка, что приводит к неспособности такого мутантного белка выходить из ER и перемещаться в плазматическую мембрану. В результате в плазматической мембране зрелый белок присутствует в недостаточных количествах, и хлоридный транспорт в эпителиальных тканях существенно снижается. Действительно, показано, что такой клеточный феномен нарушенного процессинга эндоплазматического ретикулума (ER) переносчиков АВС ER-механизмом лежит в основе не только болезни CF, но и широкого ряда других отдельных и наследственных заболеваний. Двумя путями, на которых может нарушиться функционирование ER-механизма, являются или утрата соединения с экспортом ER белков, что ведет к деградации, или накопление ER таких дефектных/с нарушенной функцией белков [Aridor M. et al., Nature Med., 5(7), pp. 745-751 (1999); Shastry B.S. et al., Neurochem. International, 43, pp. 1-7 (2003); Rutishauser J. et al., Swis. Med. Wkly, 132, pp. 211-222 (2002); Morello J.P. et al., TIPS, 21, pp. 466-469 (2000); Bross P. et al., Human Mut., 14, pp. 186-198 (1999)].

Соединение 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)бензойная кислота в солевой форме раскрывается в международной публикации РСТ WO 2007056341 (указанная публикация включена в данное описание в качестве ссылки) как модулятор активности CFTR и, таким образом, как применимое лечение в случае CFTR-опосредованных заболеваний, таких как муковисцидоз. Форма I 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)бензойной кислоты («форма I соединения 1»), которая, по существу, является кристаллической и несолевой формой, раскрывается в заявке на патент Соединенных Штатов 12/327902, зарегистрированной 4 декабря 2008 года, включенной в данное описание в качестве ссылки. Однако остается потребность в других устойчивых твердых формах указанного соединения, которые можно легко использовать в фармацевтических композициях, подходящих для применения в качестве терапевтических средств.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к твердым полиморфным формам соединения 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)бензойной кислоты (далее в данном описании «соединение 1»), которое имеет структуру

Полиморфизм является известным явлением для твердых форм соединений. Известно, что физические характеристики полиморфов влияют, например, на растворимость, скорость растворения, свойства текучести, скорость абсорбции и устойчивость. Поэтому выбор определенного полиморфа важен при разработке и получении композиций.

В одном воплощении соединение 1 находится в сольватированной форме, обозначенной в данном описании как «форма А сольвата соединения 1». В одном воплощении формой сольвата является форма А сольвата соединения 1 с метанолом. В другом воплощении сольват представляет собой форму А сольвата соединения 1 с этанолом. Другие воплощения включают

форму А сольвата соединения 1 с ацетоном;

форму А сольвата соединения 1 с 2-пропанолом;

форму А сольвата соединения 1 с ацетонитрилом;

форму А сольвата соединения 1 с тетрагидрофураном;

форму А сольвата соединения 1 с метилацетатом;

форму А сольвата соединения 1 с 2-бутаноном;

форму А сольвата соединения 1 с этилформиатом; и

форму А сольвата соединения с 1,2-метилтетрагидрофураном.

В еще одном аспекте соединение 1 находится в солевой форме. Солевая форма обозначается как «форма А соли HCl соединения 1».

Твердые формы соединения 1, раскрываемые в данном описании, и фармацевтические композиции с ними применимы для уменьшения тяжести CFTR-опосредованных заболеваний, таких как, например, муковисцидоз. Твердые формы соединения 1 можно использовать для получения других твердых форм соединения 1, а также фармацевтических композиций, включающих твердые формы соединения 1, с использованием способов, раскрываемых в данном описании.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой порошковую дифрактограмму формы А сольвата соединения 1.

Фиг.2 предоставляет дифрактограммы форм сольватов соединения 1, выбранных из

1) формы А сольвата соединения 1 с метанолом;

2) формы А сольвата соединения 1 с этанолом;

3) формы А сольвата соединения 1 с ацетоном;

4) формы А сольвата соединения 1 с 2-пропанолом;

5) формы А сольвата соединения 1 с ацетонитрилом;

6) формы А сольвата соединения 1 с тетрагидрофураном;

7) формы А сольвата соединения 1 с метилацетатом;

8) формы А сольвата соединения 1 с 2-бутаноном;

9) формы А сольвата соединения 1 с этилформиатом; и

10) формы А сольвата соединения 1 с 2-метилтетрагидрофураном.

Фиг.3 предоставляет дифрактограмму формы А сольвата соединения 1 с метанолом.

Фиг.4 предоставляет дифрактограмму формы А сольвата соединения 1 с этанолом.

Фиг.5 предоставляет дифрактограмму формы А сольвата соединения 1 с ацетоном.

Фиг.6 предоставляет дифрактограмму формы А сольвата соединения 1 с 2-пропанолом.

Фиг.7 предоставляет дифрактограмму формы А сольвата соединения 1 с ацетонитрилом.

Фиг.8 предоставляет дифрактограмму формы А сольвата соединения 1 с тетрагидрофураном.

Фиг.9 предоставляет дифрактограмму формы А сольвата соединения 1 с метилацетатом.

Фиг.10 предоставляет дифрактограмму формы А сольвата соединения 1 с 2-бутаноном.

Фиг.11 предоставляет дифрактограмму формы А сольвата соединения 1 с этилформиатом.

Фиг.12 предоставляет дифрактограмму формы А сольвата соединения 1 с 2-метилтетрагидрофураном.

Фиг.13 представляет собой кривую дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) формы А сольвата соединения 1 с ацетоном.

Фиг.14 представляет собой график термогравиметрического анализа (ТГА) формы А сольвата соединения 1 с ацетоном.

Фиг.15 представляет собой конформационное изображение формы А сольвата соединения 1 с ацетоном на основании рентгеноструктурного анализа монокристалла.

Фиг.16 представляет собой, на основании рентгеноструктурного анализа монокристалла, конформационное изображение формы А сольвата соединения 1 в виде димера.

Фиг.17 представляет собой, на основании рентгеноструктурного анализа монокристалла, конформационное изображение формы А сольвата соединения 1, показывающее водородную связь между карбоксильными группами.

Фиг.18 представляет собой конформационное изображение формы А сольвата соединения 1, показывающее ее на основании рентгеноструктурного анализа монокристалла как сольват с ацетоном.

Фиг.19 представляет собой конформационное изображение димера формы А соли HCl соединения 1.

Фиг.20 представляет собой диаграмму упаковки формы А соли HCl соединения 1.

Фиг.21 представляет собой дифрактограмму формы А соли HCl соединения 1, рассчитанную из кристаллической структуры.

Фиг.22 представляет собой спектр ¹³С-ЯМР (вращение при 15,0 кГц) твердого состояния формы А сольвата соединения 1 с ацетоном.

Фиг.23 представляет собой спектр ¹⁹F-ЯМР (вращение при 12,5 кГц) твердого состояния формы А сольвата соединения 1 с ацетоном.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Как используемые в данном описании будут применяться указанные далее определения, если не указано иное.

Термин «CFTR», используемый в данном описании, обозначает трансмембранный регулятор муковисцидоза или его мутацию, способную к регуляторной активности, включая, но без ограничения, ΔF508 CFTR и G551D CFTR (смотрите, например, для мутаций CFTR , последний просмотр 28 мая 2009 года).

Используемый в данном описании термин «кристаллический» относится к соединениям или композициям, в которых структурные элементы расположены в фиксированных геометрических картинах или кристаллических решетках, так что кристаллические твердые вещества имеют жесткий дальний порядок. Структурные элементы, которые составляют кристаллическую структуру, могут представлять собой атомы, молекулы или ионы. Кристаллические твердые вещества показывают определенные температуры плавления.

Используемый в данном описании термин «по существу кристаллический» относится к твердому веществу с преимущественно дальним порядком в позиции его молекул. Например, по существу кристаллические вещества имеют кристалличность свыше примерно 85% (например, кристалличность свыше примерно 90%, или кристалличность свыше примерно 95%). Также отмечается, что термин «по существу кристаллический» включает дескриптор «кристаллический», который относится к веществам со 100% кристалличностью.

Используемый в данном описании термин «модуляция» обозначает возрастание или снижение, например, активности, на величину, поддающуюся измерению.

Используемый в данном описании термин «изоструктурный сольват» относится к кристаллической решетке соединения с несколькими или повторяющимися пустотами, при этом некоторые или все пустоты могут быть, необязательно, заняты молекулами растворителя, которые являются одинаковыми или различными.

Термин «ДСК» обозначает дифференциальную сканирующую калориметрию.

Термин «ТГА» обозначает термогравиметрический анализ.

Форма А сольвата соединения 1

В одном аспекте изобретение относится к твердой форме соединения 1, которая представляет собой изоструктурную форму сольвата, называемую «форма А сольвата соединения 1».

Форма А сольвата соединения 1, раскрываемая в данном описании, включает кристаллическую решетку соединения 1, в которой поры в кристаллической решетке являются пустыми или заняты или частично заняты одной или несколькими молекулами подходящего растворителя. Подходящие растворители включают, но не ограничиваются перечисленным, метанол, этанол, ацетон, 2-пропанол, ацетонитрил, тетрагидрофуран, метилацетат, 2-бутанон, этилформиат и 2-метилтетрагидрофуран. Некоторые физические характеристики изоструктурных форм сольватов соединения 1, такие как порошковая дифрактограмма, температура плавления и кривая ДСК, существенно не затрагиваются молекулой определенного рассматриваемого растворителя.

В одном воплощении форма А сольвата соединения 1 характеризуется одним или несколькими пиками при 21,50-21,90 градуса, 8,80-9,20 градуса и 10,80-11,20 градуса на дифрактограмме, полученной с использованием излучения Cu K-альфа.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 характеризуется одним или несколькими пиками при 21,50-21,90 градуса, 8,80-9,20 градуса, 10,80-11,20 градуса, 18,00-18,40 градуса и 22,90-23,30 градуса на дифрактограмме, полученной с использованием излучения Cu K-альфа.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 характеризуется одним или несколькими пиками при 21,70, 8,98 и 11,04 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 характеризуется одним или несколькими пиками при 21,70, 8,98, 11,04, 18,16 и 23,06 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 характеризуется пиком при 21,50-21,90 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 21,70 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 8,80-9,20 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 8,98 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 10,80-11,20 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 11,04 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 18,00-18,40 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 18,16 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 22,90-23,30 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 23,06 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 20,40-20,80 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 20,63 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 22,00-22,40 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 22,22 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 18,40-18,80 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 18,57 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 16,50-16,90 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 16,66 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 19,70-20,10 градуса.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 также характеризуется пиком при 19,86 градуса.

В некоторых воплощениях форма А сольвата соединения 1 характеризуется дифрактограммой, по существу, схожей с дифрактограммой на фиг.1.

В некоторых воплощениях форма А сольвата соединения 1 характеризуется дифрактограммами, по существу, схожими с дифрактограммами, представленными на фиг.2.

В других воплощениях сольват или смесь сольватов, которые образуют форму А сольвата с соединением 1, выбирают из группы, состоящей из молекул органического растворителя размера, достаточного для того, чтобы соответствовать порам в кристаллической решетке соединения 1. В некоторых воплощениях сольват имеет размер, достаточный для того, чтобы соответствовать порам, имеющим размер примерно 100 ų.

В другом воплощении сольват, который образует форму А сольвата соединения 1, выбирают из группы, состоящей из метанола, этанола, ацетона, 2-пропанола, ацетонитрила, тетрагидрофурана, метилацетата, 2-бутанона, этилформиата и 2-метилтетрагидрофурана. Приводятся дифрактограммы для следующих форм А сольвата соединения 1: с метанолом (фиг.3), этанолом (фиг.4), ацетоном (фиг.5), 2-пропанолом (фиг.6), ацетонитрилом (фиг.7), тетрагидрофураном (фиг.8), метилацетатом (фиг.9), 2-бутаноном (фиг.10), этилформиатом (фиг.11) и 2-метилтетрагидрофураном (фиг.12).

В другом воплощении изобретение относится к форме А сольвата соединения 1 с ацетоном, имеющей пространственную группу P2_l/n и следующие размеры элементарной ячейки: a=16,5235(10) Ǻ, b=12,7425(8) Ǻ, c=20,5512(13) Ǻ, α=90°, β=103,736(4)° и γ=90°.

В другом воплощении изобретение относится к форме А сольвата соединения 1, которая показывает два или больше фазовых переходов при определении ДСК или схожим аналитическим методом, известным специалистам в этой области техники. В некоторых воплощениях кривая ДСК формы А сольвата соединения 1 по существу схожа с кривой ДСК, отображенной на фиг.13.

В другом воплощении данного аспекта ДСК показывает два фазовых перехода.

В другом воплощении ДСК показывает три фазовых перехода.

В другом воплощении один из фазовых переходов происходит между 200 и 207°С.

В другом воплощении один из фазовых переходов происходит между 204 и 206°С.

В другом воплощении один из фазовых переходов происходит между 183 и 190°С.

В другом воплощении один из фазовых переходов происходит между 185 и 187°С.

В другом воплощении температура плавления формы А сольвата соединения 1 находится между 183°С и 190°С.

В другом воплощении температура плавления формы А сольвата соединения 1 находится между 185°С и 187°С.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 включает 1-10 массовых процентов (мас.%) сольвата при определении методом ТГА. В некоторых воплощениях кривая ТГА формы А сольвата соединения 1 по существу схожа с кривой ТГА, отображенной на фиг.14.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 включает 2-5 масс.% сольвата при определении методом ТГА или схожим аналитическим методом, известным специалистам в этой области техники.

В другом воплощении конформация формы А сольвата соединения 1 с ацетоном по существу схожа с конформацией, отображенной на фиг.15, которая основана на рентгеноструктурном анализе монокристалла.

В другом воплощении форма А сольвата соединения 1 с ацетоном имеет пространственную группу P2_l/n и следующие размеры элементарной ячейки:

a=16,5235(10) Ǻ, α=90°,

b=12,7425(8) Ǻ, β=103,736(4)°,

c=20,5512(13) Ǻ, γ=90°.

Форма А соли HCl соединения 1

В другом аспекте изобретение относится к твердой форме соединения 1, которая представляет собой кристаллическую соль с HCl. Такая твердая форма обозначается как форма А соли HCl соединения 1.

В одном воплощении форма А соли HCl соединения 1 характеризуется одним или несколькими пиками при 8,80-9,20 градуса, 17,30-17,70 градуса и 18,20-18,60 градуса на порошковой дифрактограмме, полученной с использованием излучения Cu K-альфа.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 характеризуется одним или несколькими пиками при 8,80-9,20 градуса, 17,30-17,70 градуса, 18,20-18,60 градуса, 10,10-10,50 и 15,80-16,20 градуса на порошковой дифрактограмме, полученной с использованием излучения Cu K-альфа.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 характеризуется одним или несколькими пиками при 8,96, 17,51 и 18,45 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 характеризуется одним или несколькими пиками при 8,96, 17,51, 18,45, 10,33 и 16,01 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 характеризуется пиком при 8,80-9,20 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 характеризуется пиком при 8,96 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 17,30-17,70 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 характеризуется пиком при 17,51 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 18,20-18,60 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 18,45 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 10,10-10,50 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 10,33 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 15,80-16,20 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 16,01 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 11,70-12,10 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 11,94 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 7,90-8,30 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 8,14 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 9,90-10,30 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 10,10 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 16,40-16,80 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 16,55 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 9,30-9,70 градуса.

В другом воплощении форма А соли HCl соединения 1 также характеризуется пиком при 9,54 градуса.

В некоторых воплощениях форма А соли HCl соединения 1 характеризуется как димер, отображенный на фиг.19.

В некоторых воплощениях форма А соли HCl соединения 1 характеризуется диаграммой упаковки, отображенной на фиг.20.

В некоторых воплощениях форма А соли HCl соединения 1 характеризуется дифрактограммой, по существу, схожей с дифрактограммой на фиг.21.

В другом воплощении изобретение относится к кристаллической форме А соли HCl соединения 1, имеющей пространственную группу Р'1 и следующие размеры элементарной ячейки: a=10,2702(2) Ǻ, b=10,8782(2) Ǻ, c=12,4821(3) Ǻ, α=67,0270(10)°, β=66,1810(10)° и γ=72,4760(10)°.

В другом воплощении изобретение относится к набору, включающему форму А сольвата соединения 1 или форму А соли HCl соединения 1 и инструкции по их применению.

Синтез формы А сольвата соединения 1 и формы А соли HCl соединения 1

Твердые формы по изобретению, обозначенные и описанные выше как форма А сольвата соединения 1 и форма А соли HCl соединения 1, можно получить из предшественников, включая соединение 1, и из других твердых форм соединения 1. В данном разделе описывается синтез соединения 1 и других твердых форм соединения 1, а также превращение указанных других твердых форм в твердые формы по изобретению, обозначенные как форма А сольвата соединения 1 и форма А соли HCl соединения 1.

Схема 1. Синтез хлорангидрида, используемого для получения соединения 1

Схема 1 отображает получение 1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбонилхлорида, который используют для получения соединения 1 (смотрите схему 4). Исходный материал 2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-карбоновая кислота, коммерчески доступен от Saltigo (филиал Lanxess Corporation). Восстановление карбоксильной группы в 2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-карбоновой кислоте дает первичный спирт, который превращают в соответствующий первичный алкилхлорид-5-(хлорметил)-2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол с использованием тионилхлорида. Затем алкилхлорид превращают в нитрил 2-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)ацетонитрил путем замещения с использованием цианида натрия. Обработка нитрила 1-бром-2-хлорэтаном в присутствии основания дает 1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбонитрил. Превращение нитрила в 1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоновую кислоту в основной среде с последующей обработкой тионилхлоридом дает нужный хлорангидрид.

Схема 2. Альтернативный синтез нужного хлорангидрида

Схема 2 представляет альтернативный синтез нужного хлорангидрида. Соединение 5-бромметил-2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол вводят в сочетание с этилцианоацетатом в присутствии палладиевого катализатор с образованием соответствующего сложного альфа-цианоэтилового эфира. Омыление сложноэфирной группы до карбоновой кислоты дает цианоэтилсодержащее соединение. Алкилирование цианоэтилсодержащего соединения 1-бром-2-хлорэтаном в присутствии основания дает цианоциклопропилсодержащее соединение. Обработка цианоциклопропилсодержащего соединения основанием дает соль карбоксилат, которую превращают в карбоновую кислоту обработкой кислотой. Затем карбоновую кислоту превращают в хлорангидрид с использованием агента хлорирования, такого как тионилхлорид или подобный агент.

Схема 3. Синтез амина, используемого для получения соединения 1

Схема 3 отображает получение трет-бутил-3-(6-амино-3-метилпиридин-2-ил)бензоата, который вводят в сочетание с 1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбонилхлоридом (смотрите схемы 1 и 2) по схеме 4, и получают соединение 1 в виде соли кислоты. Катализируемое палладием сочетание 2-бром-3-метилпиридина с 3-(трет-бутоксикарбонил)фенилбороновой кислотой дает трет-бутил-3-(3-метилпиридин-2-ил)бензоат, который затем превращают через ряд стадий в нужное соединение.

Схема 4. Образование соли кислоты соединения 1

Соединение 1 получают в виде соли кислоты, как показано на схеме 4. Сочетание хлорангидрида на схемах 1 или 2 с амином на схеме 3 с использованием триэтиламина и каталитического 4-диметиламинопиридина или подобного соединения сначала дает сложный трет-бутиловый эфир 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)-трет-бутилбензоат, который представляет собой сложный трет-бутиловый эфир предшественника соединения 1. Обработка сложного трет-бутилового эфира кислотой, такой как HCl, дает соль HCl соединения 1. Соль HCl соединения 1, которая обычно представляет собой кристаллическое твердое вещество, можно использовать для получения других твердых форм соединения 1, в том числе твердых форм по изобретению формы А сольвата соединения 1 и формы А соли HCl соединения 1.

Получение формы А сольвата соединения 1 из соли HCl соединения 1

Форму А сольвата соединения 1 можно получить путем диспергирования или растворения солевой формы, такой как соль HCl соединения 1, в соответствующем растворителе в течение эффективного периода времени с последующим выделением кристаллической формы А сольвата соединения 1 фильтрацией.

Получение формы А соли HCl соединения 1 из соли HCl соединения 1

Форму А соли HCl соединения 1 можно получить путем растворения соли HCl соединения 1 в минимальном количестве растворителя и удаления растворителя медленным выпариванием. В одном воплощении растворителем является спирт. В другом воплощении растворителем является этанол. Медленное выпаривание, как правило, осуществляют, задерживая выпаривание растворителя. Например, в одном воплощении медленное выпаривание включает растворение соли HCl соединения 1 в склянке, которую накрывают парапленкой, которая содержит проткнутое в ней отверстие.

Получение формы А сольвата соединения 1 из формы I соединения 1

Форма I соединения 1 (описанная выше как раскрытая в заявке на патент Соединенных Штатов 12/327902, зарегистрированной 4 декабря 2008 года) является другой твердой формой соединения 1, которую можно использовать для получения твердых форм по изобретению, в частности, формы А сольвата соединения 1.

Форму I соединения 1 можно получить из соли HCl соединения 1 путем диспергирования или растворения соли HCl в соответствующем растворителе в течение эффективного периода времени. Соответствующим растворителем может быть вода или смесь спирт/вода, такая как смесь 50% метанол/вода, даже если форма соли с HCl соединения 1 только слабо растворяется в воде.

Также можно использовать для получения формы I соединения 1 соли других кислот соединения 1, такие как, например, соли, полученные с другими минеральными или органическими кислотами. Другие соли также являются результатом гидролиза в кислой среде сложного трет-бутилового эфира предшественника соединения 1 (смотрите схему 4). Соли, образованные другими кислотами, могут включать, например, соли кислот азотной, серной, фосфорной, борной, уксусной, бензойной и малоновой. Такие солевые формы соединения 1 могут быть растворимыми или нерастворимыми, в зависимости от используемого растворителя, но отсутствие растворимости не препятствует образованию формы I соединения 1. Эффективный период времени для образования формы I соединения 1 из соли соединения 1 может составлять любое время от 2 до 24 часов или более. Признано, что необходимый период времени обратно пропорционален температуре. Иными словами, чем выше температура, тем меньше время, необходимое для воздействия на диссоциацию кислоты для образования формы I соединения 1. Когда растворителем является вода, перемешивание дисперсии в течение приблизительно 24 часов при комнатной температуре дает форму I с выходом приблизительно 98%. Если для целей способа нужен раствор соли соединения 1, можно использовать повышенную температуру. После перемешивания раствора в течение эффективного периода времени при повышенной температуре, перекристаллизация после охлаждения дает по существу чистую форму I соединения 1. «По существу чистая» относится к чистоте свыше примерно 90% или большей чем примерно 95%, или большей чем примерно 98%, или чистоте большей чем примерно 99%. Выбранная температура зависит частично от используемого растворителя и будет в пределах возможностей ее определения специалистом в данной области техники и типично находится в интервале от комнатной температуры до примерно 80°С.

С другой стороны, форму I соединения 1 можно получить непосредственно из предшественника соединения 1 сложного трет-бутилового эфира (смотрите схему 4) путем обработки соответствующей кислотой, такой как, например, муравьиная кислота, в соответствующих условиях реакции с образованием формы I соединения 1. Например, сложный трет-бутиловый эфир вводят во взаимодействие с соответствующей кислотой, такой как муравьиная кислота, при 60-80°С в течение 7-9 часов с последующим охлаждением до температуры окружающей среды, добавлением реакционной смеси к воде и повторным нагреванием до 60-80°С в течение эффективного периода времени. Затем форму I соединения 1 выделяют фильтрацией.

Форму I соединения 1 также можно очистить перекристаллизацией из органического растворителя. Примеры органических растворителей включают, но не ограничиваются указанным, толуол, кумол, анизол, 1-бутанол, изопропилацетат, бутилацетат, изобутилацетат, метил-трет-бутиловый эфир, метилизобутилкетон и смеси 1-пропанол-вода. Температура может быть такая, как описано выше. Например, форму I соединения 1 растворяют в 1-бутаноле при 75°С до тех пор, пока она полностью не растворится. Охлаждение раствора до 10°С со скоростью 0,2°С/мин дает кристаллы формы I соединения 1, которые можно отделить фильтрацией.

Как указано, форму I соединения 1 можно использовать для получения формы А сольвата соединения 1. Соответственно, некое количество формы I соединения 1 суспендируют в соответствующем растворителе в достаточной концентрации в течение достаточного времени. Затем взвесь фильтруют на центрифуге или в вакууме и сушат в условиях окружающей среды в течение достаточного времени, и получают форму А сольвата соединения 1.

В некоторых воплощениях примерно 20-40 мг формы I соединения 1 суспендируют в примерно 400-600 мкл соответствующего растворителя. В другом воплощении примерно 25-35 мг формы I соединения 1 суспендируют в примерно 450-550 мкл соответствующего растворителя. В другом воплощении примерно 30 мг формы I соединения 1 суспендируют в примерно 500 мкл соответствующего растворителя.

В некоторых воплощениях время, в течение которого форму А сольвата соединения 1 суспендируют в растворителе, составляет от 1 часа до четырех суток. В более частном случае время, в течение которого форму А сольвата соединения 1 суспендируют в растворителе, составляет от 1 до 3 суток. В более частном случае время составляет 2 суток.

В некоторых воплощениях соответствующий растворитель выбирают из органического растворителя с молекулами размера, достаточного для соответствия порам в кристаллической решетке соединения 1. В других воплощениях сольват имеет размер, достаточный для того, чтобы соответствовать порам, имеющим размер примерно 100 Ǻ³.

В других воплощениях растворитель выбирают из группы, включающей метанол, этанол, ацетон, 2-пропанол, ацетонитрил, тетрагидрофуран, метилацетат, 2-бутанон, этилформиат и 2-метилтетрагидрофуран.

В других воплощениях для получения формы А сольвата соединения 1 может быть использована смесь двух или большего числа указанных растворителей. С другой стороны, форму А сольвата соединения 1 можно получить из смеси, включающей один или несколько указанных растворителей и воду.

В некоторых воплощениях эффективный период времени для сушки формы А сольвата соединения 1 составляет 1-24 часа. В более частном случае время составляет 6-18 часов. В более частном случае время составляет примерно 12 часов.

ПРИМЕНЕНИЯ, КОМПОЗИЦИИ И ВВЕДЕНИЕ

Фармацевтически приемлемые композиции

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтически приемлемым композициям, при этом указанные композиции включают форму А сольвата соединения 1 или форму А соли HCl соединения 1, описанные в данном описании, и необязательно включают фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или наполнитель. В некоторых воплощениях такие композиции необязательно также включают одно или несколько дополнительных терапевтических средств.

Как описано выше, фармацевтически приемлемые композиции по настоящему изобретению дополнительно включают фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или наполнитель, которые, как используется в данном случае, включают любой и все растворители, разбавители или другие жидкие наполнители, вспомогательные диспергирующие или суспендирующие вещества, поверхностно-активные вещества, вещества, регулирующие тоничность, загустители или эмульгаторы, консерванты, твердые связующие вещества, смазывающие вещества и т.п., которые подходят для определенной нужной лекарственной формы. В Remington's Pharmaceutical Sciences, Sexteenth Edition, E.W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) раскрываются различные носители, используемые при получении фармацевтически приемлемых композиций, и известные способы их получения. За исключением случая, когда любой обычный носитель несовместим с соединениями по изобретению, например, когда производит какое-либо нежелательное биологическое действие или иначе взаимодействует нежелательным образом с любым(и) другим(и) компонентом(ами) фармацевтически приемлемой композиции, его применение предполагается в объеме данного изобретения. Некоторые примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают, но не ограничиваются указанным, ионообменные материалы; оксид алюминия; стеарат алюминия; лецитин; сывороточные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин; буферные вещества, такие как фосфаты; глицин; сорбиновую кислоту или сорбат калия; смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот; воду; соли или электролиты, такие как протаминсульфат, динатрийгидрофосфат, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния или трисиликат магния; поливинилпирролидон; полиакрилаты; воски; блоксополимеры полиэтилен-полиоксипропилен; ланолин; сахара, такие как лактоза, глюкоза или сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлозу и ее производные, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; порошок трагаканта; солод; желатин; тальк; эксципиенты, такие как масло какао и воски для суппозиториев; масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, сезамовое масло, оливковое масло, кукурузное масло или соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферирующие вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновую кислоту; апирогенную воду; изотонический солевой раствор; раствор Рингера; этиловый спирт и растворы, забуференные фосфатом, а также другие нетоксичные совместимые смазывающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, антиадгезивы, вещества для покрытия, подслащивающие вещества, корригенты и отдушки, консерванты и антиоксиданты также могут присутствовать в композициях в соответствии с решением составителя.

Способы лечения

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения состояния, заболевания или расстройства, к которому причастен CFTR. В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к способу лечения состояния, заболевания или расстройства, к которому причастен дефицит активности CFTR, причем способ включает введение субъекту, предпочтительно, млекопитающему, нуждающемуся в этом, композиции, включающей форму твердого состояния соединения 1, выбранную из формы А сольвата соединения 1 и формы А соли HCl соединения 1, описанных в данном описании.

Используемый в данном описании термин «заболевание, опосредованное CFTR» означает заболевание, выбранное из муковисцидоза, астмы, COPD, вызванного курением, хронического бронхита, риносинусита, констипации, панкреатита, недостаточности поджелудочной железы, мужского бесплодия, вызванного врожденным двусторонним отсутствием самявыносящих протоков (CBVAD), легкой формы заболевания легких, идиопатического панкреатита, аллергического бронхолегочного аспергиллеза (АВРА), болезни печени, наследственной эмфиземы, наследственного гемохроматоза, недостаточности коагуляции-фибринолиза, дефицита белка С, наследственного ангионевротического отека типа 1, дефицита процессинга липидов, семейной гиперхолестеринемии, хиломикронемии типа 1, абеталипопротеинемии, болезней накопления лизосом, болезни клеточных включений/псевдосиндрома Гурлер, мукополисахаридозов, болезни Сандхоффа/Тея-Сакса, синдрома Криглера-Найяра типа II, полиэндокринопатии/гиперинсулинемии, сахарного диабета, карликовости лароновского типа, дефицита миелопероксидазы, первичного гипопаратиреоидизма, меланомы, гликаноза CDG типа 1, врожденного гипертиреоидизма, несовершенного остеогенеза, наследственной гипофибриногенемии, дефицита АСТ, несахарного диабета (DI), нейрофизиального DI, нефрогенного DI, синдрома Шарко-Мари-Тута, болезни Пелицеуса-Мерцбахера, нейродегенеративных заболеваний, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза, прогрессирующего надъядерного паралича, болезни Пика, некоторых полиглутаминовых неврологических расстройств, болезни Гентингтона, спиноцеребральной атаксии типа 1, спинальной и бульбарной мышечной атрофии, дентато-рубро-паллидо-льюисовой атрофии, миотонической дистрофии, губчатой энцефалопатии, наследственной болезни Крейтцфельда-Якоба (из-за нарушения процессинга белков прионов), болезни Фабри, синдрома Штраусслера-Шейнкера, COPD, болезни сухих глаз, болезни Шегрена, остеопороза, остеопении, синдрома Горхама, каналопатии хлоридных каналов, врожденной миотонии (формы Томсена и Беккера), гиперальдостеронизма типа III, болезни Дента, врожденной патологической усиленной реакции испуга, эпилепсии, синдрома Ангельмана, первичной цилиарной дискинезии (PCD), наследственных расстройств структуры и/или функции цилиарного тела, PCD с транспозицией внутренних органов (также известной как синдром Картангенера), PCD без транспозиции внутренних органов или цилиарной аплазии.

В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к способу лечения CFTR-опосредованного заболевания у человека, включающему введение указанному человеку эффективного количества композиции, включающей форму А сольвата соединения 1 или форму А соли HCl соединения 1, описанные в данном описании.

Согласно другому предпочтительному воплощению, настоящее изобретение относится к способу лечения муковисцидоза у человека, включающему введение указанному человеку эффективного количества композиции, включающей форму А сольвата соединения 1 или форму А соли HCl соединения 1, описанные в данном описании.

В другом воплощении указанный человек имеет трансмембранный рецептор муковисцидоза (CFTR) с мутацией ΔF508. В другом воплощении указанный человек имеет трансмембранный рецептор муковисцидоза (CFTR) с мутацией R117H. В другом воплощении указанный человек имеет трансмембранный рецептор муковисцидоза (CFTR) с мутацией G551D.

Согласно изобретению, «эффективное количество» формы А сольвата соединения 1 или фармацевтической композиции с ней является количеством, эффективным для лечения или уменьшения тяжести любого из заболеваний, перечисленных выше.

Форму А сольвата соединения 1, форму А соли HCl соединения 1 или включающую их фармацевтическую композицию можно вводить с использованием любого количества и любого пути введения, эффективных для лечения или уменьшения тяжести одного или нескольких заболеваний, перечисленных выше.

В некоторых воплощениях форма А сольвата соединения 1 или форма А соли HCl соединения 1, описанные в данном описании, или включающие их фармацевтические композиции применимы для лечения или уменьшения тяжести муковисцидоза у пациентов, которые показывают остаточную активность CFTR в апикальной мембране респираторного и нереспираторного эпителия. Наличие остаточной активности CFTR на поверхности эпителия можно легко обнаружить с использованием методов, известных в технике, например, стандартных электрофизиологических, биохимических или гистохимических методов. В таких методах активность CFTR идентифицируют с использованием in vivo или ex vivo электрофизиологических методов, измерения концентраций Cl^- в поте или слюне или ex vivo биохимических или гистохимических методов для мониторинга плотности клеточной поверхности. С использованием таких методов остаточную активность CFTR можно легко обнаружить у пациентов, гетерозиготных или гомозиготных в отношении различных мутаций, включая пациентов, гомозиготных или гетерозиготных в отношении самой распространенной мутации ΔF508.

В одном воплощении форма А сольвата соединения 1 или форма А соли HCl соединения 1, описанные в данном описании, или включающие их фармацевтические композиции применимы для лечения или уменьшения тяжести муковисцидоза у пациентов в пределах некоторых генотипов, показывающих остаточную активность CFTR, например, мутации класса III (ухудшенные регуляция или открытие ионных каналов), мутации класса IV (измененная проводимость) или класса V (сниженный синтез) (Lee R. Choo-Kang, Pamela L., Zeitlin, Type I, II, III, IV, and V cystic fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Defects and Opportunities of Therapy; Current Opinion in Pulmonary Medicine, 6: 521-529, 2000). Другие генотипы пациентов, которые показывают остаточную активность CFTR, включают пациентов, гомозиготных в отношении одного из указанных классов, или гетерозиготных с любым другим классом мутаций, включая мутации класса I, мутации класса II или мутацию, которая не имеет классификации.

В одном воплощении форма А сольвата соединения 1 или форма А соли HCl соединения 1, описанные в данном описании, или включающие их фармацевтические композиции применимы для лечения или уменьшения тяжести муковисцидоза у пациентов в пределах некоторых клинических фенотипов, например, от умеренного до слабого клинического фенотипа, который обычно коррелирует с количеством остаточной активности CFTR в апикальной мембране эпителия. Такие фенотипы включают пациентов, показывающих недостаточность поджелудочной железы, или пациентов с диагнозом идиопатического панкреатита и врожденным двусторонним отсутствием семявыводящих протоков или с болезнью легких в легкой форме.

Точное требуемое количество будет изменяться от субъекта к субъекту в зависимости от вида, возраста и общего состояния субъекта, тяжести инфекции, определенного средства, способа его введения и т.п. Соединения по изобретению предпочтительно включают в стандартную лекарственную форму для простоты введения и равномерности дозировки. Выражение «стандартная лекарственная форма», используемое в данном описании, относится к физически дискретной единице средства, подходящей для пациента, которого лечат. Однако следует представлять, что общее суточное употребление соединений и композиций по настоящему изобретению будет определяться лечащим врачом в объеме нормальной медицинской оценки. Конкретный уровень эффективной дозы для любого определенного пациента или организма будет зависеть от различных факторов, включая расстройство, от которого лечат, и тяжесть расстройства; активность конкретного используемого соединения; конкретную используемую композицию; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и питание пациента; время введения, путь введения и скорость экскреции конкретного используемого соединения; длительность лечения; лекарственные средства, используемые в комбинации или сопутствующие конкретному используемому соединению, и подобные факторы, хорошо известные в области медицины. Термин «пациент» или «субъект», используемые в данном описании, обозначают животное, в частности, млекопитающее, и наиболее предпочтительно, человека.

Фармацевтически приемлемые композиции по данному изобретению можно вводить людям и другим животным перорально, ректально, парентерально, интрацистернально, интравагинально, интраперитонеально, местно (в виде порошков, мазей или капель), трансбуккально, как оральный или назальный спрей или подобным образом, в зависимости от тяжести инфекции, от которой лечат. В некоторых воплощениях для получения желательного терапевтического эффекта соединения по изобретению можно вводить перорально или парентерально при уровнях дозировки от примерно 0,01 мг/кг до примерно 50 мг/кг, и предпочтительно, от примерно 1 мг/кг до примерно 25 мг/кг массы тела субъекта в сутки один или несколько раз в сутки.

В некоторых воплощениях дозировочное количество формы А сольвата соединения 1 или формы А соли HCl соединения 1 в стандартной форме составляет от 100 мг до 1000 мг. В другом воплощении дозировочное количество формы А сольвата соединения 1 или формы А соли HCl соединения 1 составляет от 200 мг до 900 мг. В другом воплощении дозировочное количество формы А сольвата соединения 1 или формы А соли HCl соединения 1 составляет от 300 мг до 800 мг. В другом воплощении дозировочное количество формы А сольвата соединения 1 или формы А соли HCl соединения 1 составляет от 400 мг до 700 мг. В другом воплощении дозировочное количество формы А сольвата соединения 1 или формы А соли HCl соединения 1 составляет от 500 мг до 600 мг.

В другом воплощении настоящее изобретение включает струйный размол формы А сольвата соединения 1 или формы А соли HCl соединения 1 в подходящей мельнице с использованием давления воздуха, подходящего для получения частиц с существенной фракцией частиц размером от 0,1 мкм (микрон) до 50 мкм. В другом воплощении размер частиц составляет от 0,1 мкм до 20 мкм. В другом воплощении размер частиц составляет от 0,1 мкм до 10 мкм. В другом воплощении размер частиц составляет от 1,0 мкм до 5 мкм. В еще одном воплощении частицы формы А сольвата соединения 1 или формы А соли HCl соединения 1 имеют размер D50 2,0 мкм.

Препараты для инъекции, например, стерильные водные растворы или масляные суспензии для инъекции, можно получить согласно известным в технике способам с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих средств и суспендирующих средств. Стерильный препарат для инъекции также может представлять собой стерильный раствор, суспензию или эмульсию для инъекции в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, как, например, раствор в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых сред и растворителей, которые можно использовать, находятся вода, раствор Рингера, U.S.P., и изотоничный раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспензионной среды обычно используют стерильные жирные масла. Для такой цели может быть использовано любое успокаивающее жирное масло, в том числе, синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, при получении препаратов для инъекции используют жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.

Композиции для инъекции можно стерилизовать, например, фильтрацией через фильтр, задерживающий бактерии, или путем включения стерилизующих агентов в форме стерильных твердых композиций, которые перед использованием могут быть растворены или диспергированы в стерильной воде или другой стерильной среде для инъекции.

Композиции для ректального или вагинального введения предпочтительно представляют собой суппозитории, которые можно получить, смешивая форму А сольвата соединения 1 или форму А соли HCl соединения 1 с подходящими не вызывающими раздражение эксципиентами или носителями, такими как масло какао, полиэтиленгликоль или воск для суппозиториев, которые являются твердыми при температуре окружающей среды, но жидкими при температуре тела, и поэтому плавятся в прямой кишке или во влагалище и высвобождают активное соединение.

Твердые лекарственные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах форма А сольвата соединения 1 или форма А соли HCl соединения 1 смешана с, по меньшей мере, одним инертным фармацевтически приемлемым эксципиентом или носителем, таким как цитрат натрия или дикальцийфосфат, и/или а) наполнителями или сухими разбавителями, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота, b) связующими веществами, такими как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и аравийская камедь, с) увлажняющими средствами, такими как глицерин, d) веществами, способствующими рассыпанию, такими как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия, е) веществами, замедляющими растворение, такими как парафин, f) ускорителями абсорбции, такими как соединения четвертичного аммония, g) смачивающими веществами, такими как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина, h) абсорбентами, такими как каолин и бентонитовая глина, и i) смазывающими веществами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия, и их смесями. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственная форма также может включать буферирующие вещества.

Твердые композиции подобного типа также можно использовать в качестве наполнителей в мягких и твердых наполняемых желатиновых капсулах с использованием таких эксципиентов, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п. Твердые лекарственные формы таблетки, драже, капсулы, пилюли и гранулы можно получить с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные покрытия и другие покрытия, хорошо известные в технике в области получения фармацевтических препаратов. Они необязательно могут содержать вещества, придающие непрозрачность, и также могут представлять собой композиции, из которых активный(е) ингредиент(ы) высвобождается(ются) только или предпочтительно в определенной части желудочно-кишечного тракта, необязательно, замедленно. Примеры «заделывающих» композиций, которые можно использовать, включают полимеры и воски. Твердые композиции подобного типа также можно использовать в качестве наполнителей в мягких и твердых наполняемых желатиновых капсулах с использованием таких эксципиентов, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п.

Активные соединения также могут находиться в микрокапсулированной форме с одним или несколькими эксципиентами, указанными выше. Твердые лекарственные формы таблетки, драже, капсулы, пилюли и гранулы можно получить с покрытиями и оболочками, такими как энтеросолюбильные покрытия, покрытия, регулирующие высвобождение, и другие покрытия, хорошо известные в технике в области получения фармацевтических препаратов. В таких твердых лекарственных формах активное соединение может быть смешано с, по меньшей мере, одним инертным разбавителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие лекарственные формы также могут включать, как обычная практика, другие вещества, иные, чем инертные разбавители, например, смазывающие вещества, облегчающие таблетирование, и другие вещества, способствующие таблетированию, такие как стеарат магния и микрокристаллическая целлюлоза. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственные формы также могут включать буферирующие вещества. Они могут необязательно содержать вещества, придающие непрозрачность, и также могут представлять собой композицию, из которой активный(е) ингредиент(ы) высвобождается(ются) только или предпочтительно в определенной части желудочно-кишечного тракта, необязательно, замедленно. Примеры «заделывающих» композиций, которые можно использовать, включают полимеры и воски.

Также следует представлять, что форма А сольвата соединения 1 или форма А соли HCl соединения 1, описанные в данном описании, или включающие их фармацевтические композиции можно использовать в комбинированной терапии, иными словами, форму А сольвата соединения 1 или форму А соли HCl соединения 1 можно вводить вместе, до или после одного или нескольких других нужных терапевтических средств или медицинских процедур. Определенная комбинация типов лечения (терапевтических средств или процедур) для использования в комбинированном режиме будет учитывать совместимость нужных терапевтических средств и/или процедур и нужный терапевтический эффект, которого достигают. Также следует представлять, что используемые способы лечения могут давать нужный эффект для одного и того же расстройства (например, соединение по изобретению может быть введено совместно с другим средством, используемым для лечения того же расстройства) или они могут достигать различных эффектов (например, бороться с любыми вредными эффектами). Как используется в данном описании, дополнительные терапевтические средства, которые обычно вводят для лечения или предупреждения определенного заболевания или состояния, известны как «подходящие в случае заболевания или состояния, от которого лечат».

В одном воплощении дополнительное средство выбирают из муколитического средства, бронхорасширяющего средства, антибиотика, антибактериального средства, противовоспалительного средства, модулятора CFTR иного, чем соединение по настоящему изобретению, или питательного вещества.

В одном воплощении дополнительным средством является (R)-1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)-N-(1-(2,3-дигидроксипропил)-6-фтор-2-(1-гидрокси-2-метилпропан-2-ил)-1Н-индол-5-ил)циклопропанкарбоксамид. В другом воплощении дополнительным средством является N-(5-гидрокси-2,4-ди-трет-бутилфенил)-4-оксо-1Н-хинолин-3-карбоксамид. В другом воплощении дополнительное средство выбирают из соединений, указанных в таблице 1.

Таблица 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14    

В другом воплощении дополнительное средство представляет собой любую комбинацию из вышеуказанных средств. Например, композиция может включать соединение 1, (R)-1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)-N-(1-(2,3-дигидроксипропил)-6-фтор-2-(1-гидрокси-2-метилпропан-2-ил)-1Н-индол-5-ил)циклопропанкарбоксамид и N-(5-гидрокси-2,4-ди-трет-бутилфенил)-4-оксо-1Н-хинолин-3-карбоксамид. В другом примере композиция может включать соединение 1, N-(5-гидрокси-2,4-ди-трет-бутилфенил)-4-оксо-1Н-хинолин-3-карбоксамид и любое одно соединение из указанных в таблице 1, т.е. соединений 1-14 в таблице 1, или их любую комбинацию.

В одном воплощении дополнительным терапевтическим средством является антибиотик. Примеры антибиотиков, применимых в данном случае, включают тобрамицин, включая порошок тобрамицина для ингаляции (TIP), азитромицин, азтреонам, включая аэрозольную форму азтреонама, амикацин, включая его липосомные препараты, ципрофлоксацин, включая его препараты, подходящие для введения ингаляцией, левофлаксацин, включая его аэрозольные препараты, и комбинации двух антибиотиков, например, фосфомицина и тобрамицина.

В другом воплощении дополнительным средством является муколитическое средство. Примеры муколитических средств, применимых в данном случае, включают пульмозим®.

В другом воплощении дополнительным средством является бронхолитическое средство. Примеры бронхолитических средств включают альбутерол, сульфат метапротенерола, ацетат пирбутерола, сальметерол или сульфат тетрабулина.

В другом воплощении дополнительное средство является эффективным при восстановлении жидкости поверхности воздушных путей легких. Такие средства улучшают движение соли в и из клеток, позволяя слизи в воздушных путях легких быть более гидратированной и, следовательно, легче отделяться. Примеры таких средств включают гипертонический физиологический раствор, денуфозолтетранатрий ([[(3S,5R)-5-(4-амино-2-оксопиримидин-1-ил)-3-гидроксиоксолан-2-ил]метоксигидроксифосфорил][[[(2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-диоксопиримидин-1-ил)-3,4-дигидроксиоксолан-2-ил]метоксигидроксифосфорил]оксигидроксифосфорил]гидрофосфат) или бронхитол (препарат с маннитом для ингаляции).

В другом воплощении дополнительное средство представляет собой противовоспалительное средство, т.е. средство, которое может уменьшить воспаление в легких. Примеры таких средств, применимых в данном случае, включают ибупрофен, докозагексановую кислоту (DHA), силденафил, глутатион для ингаляции, пиоглитазон, гидроксихлорохин или симавастатин.

В другом воплощении дополнительное средство представляет собой модулятор CFTR иной, чем форма А сольвата соединения 1 или форма А соли HCl соединения 1, средство, которое оказывает модулирующее действие на активность CFTR. Примеры таких средств включают аталурен («РТС124®»; 3-[5-(2-фторфенил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил]бензойная кислота), синапулид, ланковутид, депелестат (ингибитор человеческой рекомбининтной нейтрофилэластазы) и кобипростон (7-{(2R,4aR,5R,7aR)-2-[(3S)-1,1-дифтор-3-метилпентил]-2-гидрокси-6-оксооктагидроциклопента[b]пиран-5-ил}гептановая кислота).

В другом воплощении дополнительное средство представляет собой питательное вещество. Примеры питательных веществ включают панкрелипазу (замена фермента поджелудочной железы), в том числе, панкреазу®, панкреакарб®, ультразу® или креон®, липротомазу® (ранее тризитек®), аквадекс® или глутатион для ингаляции. В одном воплощении дополнительное питательное вещество представляет собой панкрелипазу.

В другом воплощении дополнительное средство представляет собой соединение, выбранное из гентамицина, куркумина, циклофосфамида, 4-фенилбутирата, миглустата, фелодипина, нимодипина, филоксина В, генистеина, апигенина, модуляторов цАМФ/сГМФ, таких как ролипрам, силденафил, милринон, тадалафил, амринон, изопротеренол, альбутерол и альметерол, дезоксиспергуалина, ингибиторов HSP, ингибиторов HSP 70, ингибиторов протеосом, таких как эпоксомицин, лактацистин и т.д.

В другом воплощении дополнительное средство представляет собой соединение, раскрытое в WO 20004028480, WO 2004110352, WO 2005094374, WO 2005120497 или WO 2006101740.

В другом воплощении дополнительное средство представляет собой производное бензо(с)хинолизиния, которое проявляет модулирующую активность в отношении CFTR, или производное бензопирана, которое проявляет модулирующую активность в отношении CFTR.

В другом воплощении дополнительное средство представляет собой соединение, раскрытое в US 7202262, US 6992096, US 20060148864, US 20060148863, US 20060035943, US 20050164973, WO 2006110483, WO 2006044456, WO 2006044682, WO 2006044505, WO 2006044503, WO 2006044502 или WO 2004091502.

В другом воплощении дополнительное средство представляет собой соединение, раскрытое в WO 2004080972, WO 2004111014, WO 2005035514, WO 2005049018, WO 2006099256, WO 2006127588 или WO 2007044560.

Количество дополнительного терапевтического средства, присутствующего в композициях по данному изобретению, не будет больше количества, которое обычно вводят в композицию, включающую такое терапевтическое средство как единственное активное вещество. Предпочтительно, количество дополнительного терапевтического средства в раскрываемых в данном описании композициях будет колебаться от примерно 50% до 100% от количества, обычно присутствующего в композиции, включающей такое средство как единственное терапевтически активное вещество.

Форма А сольвата соединения 1 или форма А соли HCl соединения 1, описанные в данном описании, или включающие их фармацевтически приемлемые композиции также могут быть включены в композиции для нанесения на имплантируемое медицинское устройство, такое как протезы, искусственные клапаны, сосудистые трансплантаты, стенты и катетеры. Соответственно, настоящее изобретение в другом аспекте относится к композиции для нанесения на имплантируемое устройство, включающей форму А сольвата соединения 1 или форму А соли HCl соединения 1, описанные в данном описании, или включающие их фармацевтически приемлемые композиции, и в классах и подклассах в данном описании, и носитель, подходящий для нанесения на указанное имплантируемое устройство. В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к имплантируемому устройству с покрытием из композиции, включающей форму А сольвата соединения 1 или форму А соли HCl соединения 1, описанные в данном описании, или включающие их фармацевтически приемлемые композиции, и носитель, подходящий для нанесения на указанное имплантируемое устройство. Подходящие покрытия и общее получение имплантируемых устройств с покрытием описываются в патентах США 6099562, 5886026 и 5304121. Покрытия типично представляют собой биосовместимые полимерные материалы, такие как полимерный гидрогель, полиметилдисилоксан, поликапролактон, полиэтиленгликоль, полимолочная кислота, сополимер этилена и винилацетата и их смеси. Необязательно на покрытия также может быть нанесен верхний слой покрытия из фторсиликона, полисахаридов, полиэтиленгликоля, фосфолипидов или их комбинаций для придания композиции характеристик регулируемого высвобождения.

Для того чтобы описанное изобретение можно было понять полнее, приводятся следующие далее примеры. Следует иметь в виду, что указанные примеры приводятся только для целей пояснения и не должны рассматриваться как ограничивающие изобретение каким-либо образом.

ПРИМЕРЫ

СПОСОБЫ И МАТЕРИАЛЫ

Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)

Данные дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) для формы А сольвата соединения 1 получают с использованием прибора DSC Q100 V9.6 Build 290 (TA Instruments, New Castle, DE). Температуру калибруют с индием, и теплоемкость калибруют с сапфиром. Образцы в 3-6 мг взвешивают в алюминиевых чашках, которые обжимают с использованием крышек с 1 микроотверстием. Образцы сканируют от 25°С до 350°С при скорости нагревания 1,0°С/мин и в токе азота 50 мл/мин. Данные собирают с помощью программы Thermal Advantage Q Series, версия 2.2.0.248, и анализируют с помощью программы Universal Analysis, версия 4.1D (TA Instruments, New Castle, DE). Приведенные величины представляют один анализ.

Описание струйного помола

Крупноизмельченную форму А сольвата соединения 1 или форму А соли HCl соединения 1 просеивают в целом перед загрузкой в бункер струйной мельницы. Все сита являются одноразовыми и перед использованием вытираются. Крупно измельченную форму А сольвата соединения 1 или форму А соли HCl соединения 1 загружают в бункер струйной мельницы с регулируемой скоростью подачи с использованием сжатого азота. Пределы давления газа ~276-310/310-483 кПа (40-45/45-70 ф/д²) (трубка Вентури/мельница), и интервал скорости загрузки составляет 0,5-1,6 кг/час. Форму А сольвата соединения 1 или форму А соли HCl соединения 1 измельчают в мельнице через соударения частица-частица и частица-стенка, и обработанную форму А сольвата соединения 1 или форму А соли HCl соединения 1 выгружают в емкости для тонкоизмельченного продукта. Полагают, что специалист в данной области техники также может достичь благоприятного размера частиц точным помолом, основанным частично на условиях, описанных выше.

XRPD (рентгенография)

Данные рентгенографии (XRD) набирают на рентгеновском дифрактометре или Bruker D8 DISCOVER, или Bruker АРЕХ II. Дифрактометр Bruker D8 DISCOVER с 2-мерным детектором и плоским графитовым монохроматором. Запаянную медную трубку с излучением K-альфа используют при 40 кВ, 35 мА. Образцы помещают на кремниевые подложки с нулевым фоном при 25°С. Для каждого образца собирают два набора данных при 120 секундах каждый при 2 различных углах θ₂ 8° и 26°. Данные интегрируют с помощью программы GADDS и соединяют с программой DIFFRACT^plusEVA. Погрешности для указанных позиций пиков составляют ±0,2 градуса.

Рентгеновский дифрактометр Bruker II снабжен источником запаянной трубкой CuK и детектором APEX II CCD. Структуры выясняют и уточняют с использованием программы SHELX (Sheldrick G.M., Acta Cryst. (2008) A64, 112-122).

Витрид® (бис(2-метоксиэтокси)алюмогидрид натрия [или NaAlH₂(OCH₂CH₂OCH₃)₂], 65 масс.% раствор в толуоле) закупают у Aldrich Chemicals.

2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-карбоновую кислоту закупают у Saltigo (филиал Lanxess Corporation).

В любом месте настоящей заявки, где название соединения может неправильно описывать структуру соединения, структура заменяет и определяет название.

Получение (2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)метанола

Коммерчески доступную 2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-карбоновую кислоту (1,0 экв.) смешивают с толуолом (10 об.). Добавляют витрид® (2 экв.) из капельной воронки со скоростью, при которой сохраняется температура 15-25°С. По окончании добавления температуру повышают до 40°С в течение 2 часов (час), и затем из капельной воронки осторожно добавляют 10% (масс./масс.) водный (водн.) раствор NaOH (4 экв.), сохраняя температуру 40-50°С. После перемешивания в течение дополнительных 30 минут (мин), слои разделяют при 40°С. Органическую фазу охлаждают до 20°С, затем промывают водой (2×1,5 об.), сушат (Na₂SO₄), фильтруют и концентрируют, и получают сырой (2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)метанол, который используют непосредственно на следующей стадии.

Получение 5-хлорметил-2,2-дифтор-1,3-бензодиоксола

(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)метанол (1,0 экв.) растворяют с МТВЕ (5 об.). Добавляют из капельной воронки каталитическое количество 4-(N,N-диметил)аминопиридина (DMAP) (1 моль.%) и SOCl₂ (1,2 экв.). SOCl₂ добавляют со скоростью, при которой в реакторе сохраняется температура 15-25°С. Температуру повышают до 30°С в течение 1 часа, и затем смесь охлаждают до 20°С. Добавляют из капельной воронки воду (4 об.), поддерживая температуру ниже 30°С. После перемешивания в течение дополнительных 30 минут слои разделяют. Органический слой перемешивают и добавляют 10% (масс./об.) водн. раствор NaOH (4,4 об.). После перемешивания в течение 15-20 минут, слои разделяют. Затем органическую фазу сушат (Na₂SO₄), фильтруют и концентрируют, и получают сырой 5-хлорметил-2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол, который используют непосредственно на следующей стадии.

Получение (2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)ацетонитрила

Раствор 5-хлорметил-2,2-дифтор-1,3-бензодиоксола (1 экв.) в ДМСО (1,25 об.) добавляют к взвеси NaCN (1,4 экв.) в ДМСО (3 об.), в то же время поддерживая температуру 30-40°С. Смесь перемешивают в течение 1 часа, и затем добавляют воду (6 об.) и затем метил-трет-бутиловый эфир (МТВЕ) (4 об.). После перемешивания в течение 30 минут, слои разделяют. Водный слой экстрагируют MTBE (1,8 об.). Объединенные органические слои промывают водой (1,8 об.), сушат (Na₂SO₄), фильтруют и концентрируют, и получают сырой (2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)ацетонитрил (95%), который используют непосредственно на следующей стадии.

Синтез (2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)-1-этилацетатацетонитрила

Реактор продувают азотом и загружают толуол (900 мл). Растворитель обезгаживают барботированием азота в течение не менее 16 часов. Затем в реактор загружают Na₃PO₄ (155,7 г, 949,5 ммоль), а затем бис(дибензилиденацетон)палладий(0) (7,28 г, 12,66 ммоль). В течение 10 минут при 23°С загружают 10% масс./масс. раствор трет-бутилфосфина в гексане (51,23 г, 25,32 ммоль) из продутой азотом капельной воронки. Смесь перемешивают в течение 50 минут, после чего добавляют в течение 1 минуты 5-бром-2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол (75 г, 316,5 ммоль). После перемешивания в течение дополнительных 50 минут к смеси в течение 5 минут добавляют этилцианоацетат (71,6 г, 633,0 ммоль), а затем воду (4,5 мл) в один прием. Смесь нагревают до 70°С в течение 40 минут и анализируют ВЭЖХ каждые 1-2 часа на процент конверсии реагента в продукт. После того, как отметят полную конверсию (обычно 100% конверсию через 5-8 часов), смесь охлаждают до 20-25°С и фильтруют через слой целита. Слой целита промывают толуолом (2×450 мл), и объединенные органические растворы концентрируют до 300 мл в вакууме при 60-65°С. К концентрату добавляют ДМСО (225 мл) и концентрируют в вакууме при 70-80°С до тех пор, пока не прекратится активная дистилляция растворителей. Раствор охлаждают до 20-25°С и разбавляют 900 мл ДМСО при подготовке к стадии 2.

¹Н-ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 7,16-7,10 (м, 2Н), 7,03 (д, J=8,2 Гц, 1Н), 4,63 (с, 1Н), 4,19 (м, 2Н), 1,23 (т, J=7,1 Гц, 3Н).

Синтез (2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)ацетонитрила

К полученному выше раствору (2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)-1-этилацетатацетонитрила в ДМСО добавляют 3 н. HCl (617,3 мл, 1,85 моль) в течение 20 минут, поддерживая внутреннюю температуру ниже 40°С. Затем смесь нагревают до 75°С в течение 1 часа и анализируют ВЭЖХ каждые 1-2 часа на процент конверсии. Когда отметят конверсию, превышающую 99% (обычно через 5-6 часов), реакционную смесь охлаждают до 20-25°С и экстрагируют МТВЕ (2×525 мл) с достаточным временем для полного разделения фаз во время экстракции. Объединенные органические экстракты промывают 5% раствором NaCl (2×375 мл). Затем раствор переносят в аппаратуру, соответствующую перегонке в вакууме при 200-335 Па (1,5-2,5 Торр), которую снабжают охлаждаемой колбой-приемником. Раствор концентрируют в вакууме для удаления растворителей при температуре ниже 60°С. Затем из полученного масла отгоняют (2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)ацетонитрил при 125-130°С (температура термостата) и 200-267 Па (1,5-2,0 Торр). (2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)ацетонитрил выделяют в виде прозрачного масла с выходом 66% относительно 5-бром-2,2-дифтор-1,3-бензодиоксола (2 стадии) и с чистотой по ВЭЖХ 91,5% AUC (соответствует 95% в анализе масс./масс.).

¹Н-ЯМР (500 МГц, ДМСО) δ 7,44 (уш.с, 1Н), 7,43 (д, J=8,4 Гц, 1Н), 7,22 (дд, J=8,2, 1,8 Гц, 1Н), 4,07 (с, 2Н).

Получение (2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)циклопропанкарбонитрила

Смесь (2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)ацетонитрила (1,0 экв.), 50 масс.% водного раствора KOH (5,0 экв.), 1-бром-2-хлорэтана (1,5 экв.) и Oct₄NBr (0,02 экв.) греют при 70°С в течение 1 часа. Реакционную смесь охлаждают и затем обрабатывают МТВЕ и водой. Органическую фазу промывают водой и солевым раствором. Растворитель удаляют, и получают (2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)циклопропанкарбонитрил.

Получение 1-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)циклопропанкарбоновой кислоты

(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)циклопропанкарбонитрил гидролизуют с использованием 6 М раствора NaOH (8 экв.) в этаноле (5 об.) при 80°С в течение ночи. Смесь охлаждают до комнатной температуры, и этанол выпаривают в вакууме. Остаток растворяют в воде и МТВЕ, добавляют 1 M HCl, и слои разделяют. Затем МТВЕ-слой обрабатывают дициклогексиламином (DCHA) (0,97 экв.). Взвесь охлаждают до 0°С, фильтруют и промывают гептаном, и получают соответствующую соль DCHA. Соль растворяют в МТВЕ и 10% лимонной кислоте и перемешивают до тех пор, пока все твердые вещества не растворятся. Слои разделяют, и МТВЕ-слой промывают водой и солевым раствором. Замена растворителя на гептан и последующие фильтрация и сушка в вакуумном шкафу при 50°С в течение ночи дают 1-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)циклопропанкарбоновую кислоту.

Получение 1-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)циклопропанкарбонилхлорида

1-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)циклопропанкарбоновую кислоту (1,2 экв.) суспендируют в толуоле (2,5 об.), и смесь нагревают до 60°С. Из капельной воронки добавляют SOCl₂ (1,4 экв.). Через 30 минут толуол и SOCl₂ отгоняют из реакционной смеси. Добавляют еще толуол (2,5 об.), и полученную смесь снова перегоняют, получая продукт хлорангидрид в виде масла, которое используют без дополнительной очистки.

Получение трет-бутил-3-(3-метилпиридин-2-ил)бензоата

2-бром-3-метилпиридин (1,0 экв.) растворяют в толуоле (12 об.). Добавляют K₂СО₃ (4,8 экв.) и затем воду (3,5 об.). Полученную смесь нагревают до 65°С в токе N₂ в течение 1 часа. Затем добавляют 3-(трет-бутоксикарбонил)фенилбороновую кислоту (1,05 экв.) и Pd(dppf)Cl₂-CH₂Cl₂ (0,015 экв.), и смесь нагревают до 80°С. Через 2 часа нагрев прекращают, добавляют воду (3,5 об.), и слои разделяют. Затем органическую фазу промывают водой (3,5 об.) и экстрагируют 10% водным раствором метансульфоновой кислоты (2 экв. MsOH, 7,7 об.). Водную фазу подщелачивают 50% водным раствором NaOH (2 экв.) и экстрагируют EtOAc (8 об.). Органический слой концентрируют, и получают сырой трет-бутил-3-(3-метилпиридин-2-ил)бензоат (82%), который используют непосредственно на следующей стадии.

Получение 2-(3-(трет-бутокскарбонил)фенил-3-метилпиридин-1-оксида

Трет-бутил-3-(3-метилпиридин-2-ил)бензоат (1,0 экв.) растворяют в EtOAc (6 об.). Добавляют воду (0,3 об.) и затем смесь мочевина-пероксид водорода (3 экв.). Затем к смеси добавляют по частям фталевый ангидрид (3 экв.) в виде твердого вещества со скоростью, при которой температура реакционной смеси в реакторе остается ниже 45°С. По завершении добавления фталевого ангидрида смесь нагревают до 45°С. После перемешивания еще в течение 4 часов нагрев прекращают. Из капельной воронки добавляют 10%, масс./масс., водный раствор Na₂SO₃ (1,5 экв.). По завершении добавления раствора Na₂SO₃ смесь перемешивают еще в течение 30 минут, и слои разделяют. Органический слой перемешивают, и добавляют 10%, масс./масс., водный раствор Na₂CO₃ (2 экв.). После перемешивания в течение 30 минут слои разделяют. Органическую фазу промывают 13%, масс./об., водн. раствором NaCl. Затем органическую фазу фильтруют и концентрируют, и получают сырой 2-(3-(трет-бутокскарбонил)фенил-3-метилпиридин-1-оксид (95%), который используют непосредственно на следующей стадии.

Получение трет-бутил-3-(6-амино-3-метилпиридин-2-ил)бензоата

Раствор 2-(3-(трет-бутоксикарбонил)фенил-3-метилпиридин-1-оксида (1 экв.) и пиридина (4 экв.) в ацетонитриле (8 об.) нагревают до 70°С. Из капельной воронки в течение 50 минут добавляют раствор метансульфонового ангидрида (1,5 экв.) в MeCN (2 об.), сохраняя в то же время температуру ниже 75°С. По завершении добавления смесь перемешивают в течение дополнительных 0,5 часа. Затем смесь охлаждают до температуры окружающей среды. Из капельной воронки добавляют этаноламин (10 экв.). После перемешивания в течение 2 часов, добавляют воду (6 об.), и смесь охлаждают до 10°С. После перемешивания в течение 3 часов, твердое вещество собирают фильтрацией и промывают водой (3 об.), смесью ацетонитрил/вода 2:1 (3 об.) и ацетонитрилом (2×1,5 об.). Твердое вещество сушат до постоянного веса (различие менее 1%) в вакуумном шкафу при 50°С в слабом токе N₂, и получают трет-бутил-3-(6-амино-3-метилпиридин-2-ил)бензоат в виде красно-желтого твердого вещества (выход 53%).

Получение 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)-трет-бутилбензоата

Неочищенный хлорангидрид, описанный выше, растворяют в толуоле (2,5 об. относительно хлорангидрида), и из капельной воронки добавляют к смеси трет-бутил-3-(6-амино-3-метилпиридин-2-ил)бензоат (1 экв.), DMAP (0,02 экв.) и триэтиламин (3,0 экв.) в толуоле (4 об. относительно трет-бутил-3-(6-амино-3-метилпиридин-2-ил)бензоата). Через 2 часа к реакционной смеси добавляют воду (4 об. относительно трет-бутил-3-(6-амино-3-метилпиридин-2-ил)бензоата). После перемешивания в течение 30 минут, слои разделяют. Затем органическую фазу фильтруют и концентрируют, и получают густое масло 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)-трет-бутилбензоат (количественный выход сырого продукта). Добавляют ацетонитрил (3 об. относительно сырого продукта), и проводят перегонку до тех пор, пока не произойдет кристаллизация. Добавляют воду (2 об. относительно сырого продукта), и смесь перемешивают в течение 2 часов. Твердое вещество собирают фильтрацией, промывают смесью ацетонитрил/вода 1:1 (по объему) (2×1 объем относительно сырого продукта), и частично сушат на фильтре в вакууме. Твердое вещество сушат до постоянного веса (различие менее 1%) в вакуумном шкафу при 60°С в слабом токе N₂, и получают 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)-трет-бутилбензоат в виде коричневого твердого вещества.

Получение соли HCl 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)бензойной кислоты

К взвеси 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)-трет-бутилбензоата (1,0 экв.) в MeCN (3,0 об.) добавляют воду (0,83 об.) и затем концентрированную водную HCl (0,83 об.). Смесь нагревают до 45±5°С. После перемешивания в течение 24-48 часов, реакцию завершают, и смесь охлаждают до температуры окружающей среды. Добавляют воду (1,33 об.), и смесь перемешивают. Твердое вещество собирают фильтрацией, промывают водой (2×0,3 об.) и частично сушат на фильтре в вакууме. Твердое вещество сушат до постоянного веса (различие менее 1%) в вакуумном шкафу при 60°С в слабом токе N₂, и получают соль HCl 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)бензойной кислоты в виде не совсем белого твердого вещества.

Получение формы I 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)бензойной кислоты, способ А

Взвесь соли HCl 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)бензойной кислоты (1 экв.) в воде (10 об.) перемешивают при температуре окружающей среды. После перемешивания в течение 24 часов, берут образец. Образец фильтруют, и твердое вещество промывают водой (2 раза). Образец твердого вещества подвергают анализу методом ДСК. Когда анализ ДСК показывает полную конверсию в форму I, твердое вещество собирают фильтрацией, промывают водой (2×1,0 об.) и частично сушат на фильтре в вакууме. Затем твердое вещество сушат до постоянного веса (различие менее 1%) в вакуумном шкафу при 60°С в слабом токе N₂, и получают форму I в виде не совсем белого твердого вещества (выход 98%).

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) 9,14 (с, 1Н), 7,99-7,93 (м, 3Н), 7,80-7,78 (м, 1Н), 7,74-7,72 (м, 1Н), 7,60-7,55 (м, 2Н), 7,41-7,33 (м, 2Н), 2,24 (с, 3Н), 1,53-1,51 (м, 2Н), 1,19-1,17 (м, 2Н).

Получение формы I 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)бензойной кислоты, способ В

Раствор 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)-трет-бутилбензоата (1,0 экв.) в муравьиной кислоте (3,0 об.) нагревают до 70±10°С при перемешивании в течение 8 часов. Реакцию считают завершившейся, когда согласно хроматографическим методам остается не более 1,0% AUC 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)-трет-бутилбензоата. Смесь охлаждают до температуры окружающей среды. Раствор выливают в воду (6 об.), греют при 50°С и перемешивают. Затем смесь нагревают до 70±10°С до уровня 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)-трет-бутилбензоата не более 0,8% (AUC). Твердое вещество собирают фильтрацией, промывают водой (2×3 об.) и частично сушат на фильтре в вакууме. Затем твердое вещество сушат до постоянного веса (различие менее 1%) в вакуумном шкафу при 60°С в слабом токе N₂, и получают соединение 1 в форме I в виде не совсем белого твердого вещества.

Получение формы А сольвата формы I соединения 1

Форму I соединения 1 (приблизительно 30 мг) суспендируют в 500 мкл соответствующего растворителя (например, метанола, этанола, ацетона, 2-пропанола, ацетонитрила, тетрагидрофурана, метилацетата, 2-бутанона, этилформиата и 2-метилтетрагидрофурана) в течение 2 суток. Затем взвесь фильтруют на центрифуге или в вакууме и оставляют сушиться при температуре окружающей среды в течение ночи, и получают форму А сольвата соединения 1.

Кривая ДСК формы А сольвата соединения 1 с ацетоном показана на фиг.13, причем показывает два фазовых перехода. Температура плавления формы А сольвата соединения 1 с ацетоном составляет примерно 188°С и 205°С.

Реальная порошковая дифрактограмма формы А сольвата соединения 1 приводится на фиг.1. В таблице 2 приводятся фактические пики на фиг.1 в убывающем порядке относительной интенсивности.

Таблица 2 Угол 2θ [градусы] Относительная интенсивность [%] 21,70 100,0 8,98 65,5 11,04 57,4 18,16 55,9 23,06 55,4

20,63 53,1 22,22 50,2 18,57 49,1 16,66 47,2 19,86 35,0

Конформационные отображения формы А сольвата соединения 1 с ацетоном на основании рентгеноструктурного анализа монокристалла показаны на фиг.15-18. Фиг.15 на основании рентгеноструктурного анализа монокристалла показывает конформационное изображение формы А сольвата соединения 1 с ацетоном. Фиг.16 на основании рентгеноструктурного анализа монокристалла показывает конформационное изображение формы А сольвата соединения 1 с ацетоном как димера с показом водородной связи между карбоксильными группами. Фиг.17 на основании рентгеноструктурного анализа монокристалла показывает конформационное изображение тетрамера формы А сольвата соединения 1 с ацетоном. Фиг.18 на основании рентгеноструктурного анализа монокристалла показывает конформационное изображение формы А сольвата соединения 1 с ацетоном. Стехиометрическое отношение между формой А сольвата соединения 1 и ацетоном составляет приблизительно 4,4:1 (из ЯМР вычислено 4,48:1; из рентгенографии - 4,38:1). Кристаллическая структура показывает упаковку молекул, когда существует две поры или пустоты на элементарную ячейку или 1 пора на молекулу-хозяина. В сольвате с ацетоном приблизительно 92% пустот занято молекулами ацетона. Форма А сольвата соединения 1 представляет собой моноклиническую пространственную группу P2_l/n со следующими размерами элементарной ячейки: a=16,5235(10) Ǻ, b=12,7425(8) Ǻ, c=20,5512(13) Ǻ, α=90°, β=103,736(4)°, γ=90°, V=4203,3(5) Ǻ³, =4. Плотность соединения 1 в форме А сольвата соединения 1, вычисленная из структурных данных, составляет 1,430/см³ при 100 К.

Спектр ¹³С-ЯМР твердого состояния формы А сольвата соединения 1 с ацетоном приводится на фиг.22. Таблица 3 показывает химические сдвиги релевантных пиков.

Таблица 3   Форма А сольвата соединения 1 с ацетоном, химические сдвиги ¹³С № пика F1 [м.д.] Интенсивность 1 202,8 6,05 2 173,3 62,66 3 171,9 20,53 4 153,5 28,41 5 150,9 21,68 6 150,1 19,49 7 143,2 45,74 8 142,3 42,68 9 140,1 37,16 10 136,6 26,82 11 135,9 30,1 12 134,6 39,39 13 133,2 23,18 14 131,0 60,92

15 128,5 84,58 16 116,0 34,64 17 114,2 23,85 18 112,4 25,3 19 110,9 24,12 20 107,8 18,21 21 32,0 54,41 22 22,2 20,78 23 18,8 100

Спектр ¹⁹F-ЯМР твердого состояния формы А сольвата соединения 1 с ацетоном приводится на фиг.23. Пики, отмеченные звездочкой, обозначают боковые полосы вращения. Таблица 4 показывает химические сдвиги релевантных пиков.

Таблица 4   Форма А сольвата соединения 1 с ацетоном, химические сдвиги ¹⁹F № пика F1 [м.д.] Интенсивность 1 -41,6 12,5 2 -46,4 6,77 3 -51,4 9,05

Получение формы А соли HCl соединения 1

Бесцветные кристаллы формы А соли HCl соединения 1 получают из концентрированного раствора соли HCl соединения 1 в этаноле медленным выпариванием. Отбирают кристалл с размерами 0,30×1/5×0,15 мм, очищают с использованием минерального масла, устанавливают на MicroMount и центрируют на дифрактометре Bruker APEXII. Получают три партии из 40 элементов, разделенных в обратном пространстве, для получения ориентационной матрицы и начальных параметров ячейки. Конечные параметры ячейки получают и уточняют на основании полного набора данных.

Фиг.19 предоставляет конформационное изображение формы А соли HCl соединения 1 как димера на основании анализа монокристалла. Фиг.20 предоставляет схему упаковки формы А соли HCl соединения 1 как димера на основании анализа монокристалла. Дифрактограмма формы А соли HCl соединения 1, вычисленная из кристаллической структуры, показана на фиг.21. Таблица 5 содержит пики, вычисленные для фиг.21, в убывающем порядке относительной интенсивности.

Таблица 5 Угол 2θ [градусы] Относительная интенсивность [%] 8,96 100,00 17,51 48,20 18,45 34,60 10,33 32,10 16,01 18,90 11,94 18,40 8,14 16,20 10,10 13,90 16,55 13,30 9,54 10,10 16,55 13,30

АНАЛИЗЫ

Анализы для детекции и определения свойств соединений по коррекции ΔF508-CFTR

Оптические методы с мембранным потенциалом для анализа свойств соединений в отношении модуляции ΔF508-CFTR

В оптическом анализе мембранного потенциала используют датчики FRET, чувствительные к напряжению, описанные Gonzalez and Tsien (смотрите Gonzalez J.E. and R.Y. Tsien (1995), “Voltage sensing by fluorescence resonance energy transfer in single cells”, Biophys. J., 69(4): 1272-80, и Gonzalez J.E. and R.Y. Tsien (1997), “Improved indicators of cell membrane potencial that use fluorescence resonance energy transfer”, Chem. Biol., 4(4): 269-77), в комбинации с приборами для измерения изменений флуоресценции, такими как Voltage/Ion Probe Reader (VIPR) (смотрите Gonzalez J.E., K. Oades et al. (1999), “Cell-based assays and instrumentations for screening ion-channel targets”, Drug Discov. Today, 4(9): 431-439).

Такие чувствительные к напряжению анализы основаны на изменении резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) между растворимым в мембране чувствительным к напряжению красителем DiSBAC₂(3) и флуоресцентным фосфолипидом СС2-DMPE, который присоединен к другому лепестку плазматической мембраны и действует как донор FRET. Изменения мембранного потенциала (V_m) вызывают перераспределение отрицательно заряженного DiSBAC₂(3) в плазматической мембране и, соответственно, изменения в переносе энергии от СС2-DMPE. Изменения испускания при флуоресценции контролируют с использованием VIPR™ II, который представляет собой объединенные жидкостный манипулятор и детектор флуоресценции, созданный для скрининга на основе клеток в 96- или 384-луночных титрационных микропланшетах.

1. Идентификация корректирующих соединений

Для того, чтобы идентифицировать молекулы, которые корректируют дефект перемещения, связанный с ΔF508-CFTR, разрабатывают формат анализа с однократным добавлением HTS. Клетки инкубируют в бессывороточной среде в течение 16 часов при 37°С в присутствии или в отсутствие (отрицательный контроль) испытываемого соединения. В качестве положительного контроля клетки, высеянные в 384-луночные планшеты, инкубируют в течение 16 часов при 27°С для «коррекции температурой» ΔF508-CFTR. Затем клетки промывают три раза раствором Кребса-Рингера и нагружают красителями, чувствительными к напряжению. Для того, чтобы активировать ΔF508-CFTR, в каждую лунку добавляют 10 мкМ форсколин и усилитель CFTR генистеин (20 мкМ) вместе со средой, свободной от Cl^-. Добавление среды, свободной от Cl^-, промотирует отток Cl^- в ответ на активацию ΔF508-CFTR, и полученную деполяризацию мембраны оптически контролируют с использованием красителей датчиков напряжения на основе FRET.

2. Идентификация потенцирующих соединений

Для того, чтобы идентифицировать усилители ΔF508-CFTR, разрабатывают формат анализа с двукратным добавлением HTS. Во время первого добавления в каждую лунку добавляют среду, свободную от Cl^-, с или без испытываемого соединения. Через 22 секунды для активации ΔF508-CFTR добавляют второй раз среду, свободную от Cl^-, содержащую 2-10 мкМ форсколина. Внеклеточная концентрация Cl^- после двух добавлений составляет 28 мМ, что промотирует отток Cl^- в ответ на активацию ΔF508-CFTR, и полученную деполяризацию мембраны оптически контролируют с использованием красителей датчиков напряжения на основе FRET.

3. Растворы

Раствор электролита № 1 (в мМ): 160 NaCl, 4,5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES, pH 7,4 с помощью NaOH.

Раствор электролита, свободного от Cl^-: хлориды в растворе электролита № 1 заменяют солями глюконатами.

Получают как 10-мМ исходный раствор в ДМСО и хранят при -20°С.

Получают как 10-мМ смесь в ДМСО и хранят при -20°С.

4. Клеточная культура

Мышиные фибробласты NIH3T3, устойчиво экспрессирующие ΔF508-CFTR, используют для оптических измерений мембранного потенциала. Клетки поддерживают при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ и 90% влажностью в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко, с добавлением 2 мМ глутамина, 10% сыворотки плода коровы, 1×NEAA, β-ME, 1×пенициллин/стрептомицин и 25 мМ HEPES, на 175-см² матрасах. Для всех оптических анализов клетки высевают при плотности 30000/лунку в 384-луночные сенсибилизированные матригелем планшеты и культивируют в течение 2 часов при 37°С перед культивированием при 27°С в течение 24 часов для анализа усилителей. Для анализов на коррекцию клетки культивируют с соединениями или без них при 27°С или 37°С в течение 16-24 часов.

Электрофизиологические анализы для оценки свойств соединений по модуляции ΔF508-CFTR

1. Анализ с использованием камеры

На поляризованных эпителиальных клетках, экспрессирующих ΔF508-CFTR, выполняют эксперименты с камерой для дополнительной характеризации модуляторов ΔF508-CFTR, идентифицированных в оптических анализах. Эпителиальные клетки FRT^ΔF508-CFTR, выращенные на вставках клеточных культур Costar Snapwell, заключают в камере Ussing (Physiologic Insruments, Inc., San Diego, CA), и монослои непрерывно коротко замыкают с использованием системы фиксации потенциала (Departament of Bioengineering, University of Iowa, IA, и Physiologic Insruments, Inc., San Diego, CA). Измеряют трансэпителиальное сопротивление, применяя импульс 2 мВ. В таких условиях FRT эпителия показывают сопротивление 4 кОм/см² или больше. Растворы сохраняют при 27°С и продувают воздухом. Электродный потенциал смещения и сопротивление жидкости корректируют с использованием бесклеточной вставки. В таких условиях ток отражает поток Cl^- через ΔF508-CFTR, экспрессированный в апикальной мембране. I_SC получают в числах с использованием интерфейса МР100А-СЕ и программы AcqKnowledge (v3.2.6; BIOPAC Systems, Santa Barbara, CA).

2. Идентификация корректирующих соединений

Типично по протоколу используют градиент концентрации Cl^- в базолатеральной - апикальной мембране. Для того чтобы установить такой градиент, используют обычный раствор Рингера на базолатеральной мембране, в то время как на апикальной NaCl заменяют эквимолярным раствором глюконата натрия (титрованным до рН 7,4 раствором NaOH), и получают большой градиент концентрации Cl^- по эпителию. Все эксперименты выполняют с интактными монослоями. Применяют полностью активированный ΔF508-CFTR, форсколин (10 мкМ) и ингибитор PDE IMBX (100 мкМ) с последующим добавлением усилителя CFTR генистеина (50 мкМ).

Как наблюдают на других типах клеток, инкубация при низких температурах клеток FRT, устойчиво экспрессирующих ΔF508-CFTR, повышает функциональную плотность CFTR в плазматической мембране. Для того, чтобы определить активность корректирующих соединений, клетки инкубируют с 10 мкМ испытываемого соединения в течение 24 часов при 37°С и затем промывают три раза перед регистрацией. Опосредованный цАМФ и генистеином I_SC в клетках, обработанных соединением, нормализуют к контролям при 27°С и 37°С и выражают в виде процентной активности. Предварительная инкубация клеток с корректирующим соединением существенно повышает опосредованный цАМФ и генистеином I_SC по сравнению с контролями при 37°С.

3. Идентификация потенцирующих соединений

Типично по протоколу используют градиент концентрации Cl^- в базолатеральной - апикальной мембране. Для того чтобы установить такой градиент, используют обычный раствор Рингера на базолатеральной мембране, предварительно пропитанной нистатином (360 мкг/мл), в то время как на апикальной NaCl заменяют эквимолярным раствором глюконата натрия (титрованным до рН 7,4 раствором NaOH), и получают большой градиент концентрации Cl^- по эпителию. Все эксперименты выполняют через 30 минут после пропитки нистатином. Форсколин (10 мкМ) и все испытываемые соединения добавляют на обе стороны вставок клеточных культур. Эффективность предполагаемых усилителей ΔF508-CFTR сравнивают с эффективностью известного усилителя генистеина.

4. Растворы

Базолатеральный раствор (в мМ): NaCl (135), CaCl₂ (1,2), MgCl₂ (1,2), K₂HPO₄ (2,4), KHPO₄ (0,6), N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота (HEPES) (10) и декстроза (10). Раствор титруют до рН 7,4 раствором NaOH.

Апикальный раствор (в мМ): такой же, как латеральный раствор, с заменой NaCl на глюконат Na (135).

5. Клеточная культура

Используют крысиные эпителиальные клетки Фишера (FRT), экспрессирующие ΔF508-CFTR (FRT^ΔF508-CFTR), для экспериментов с камерой Ussing для предполагаемых модуляторов ΔF508-CFTR, индентифицированных из оптических анализов. Клетки культивируют на вставках клеточных культур Costar Snapwell и культивируют в течение пяти суток при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ в модифицированной по способу Куна среде Хамфа F-12 с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Перед использованием для характеризации потенцирующей активности соединений клетки инкубируют при 27°С в течение 16-24 часов для коррекции в отношении ΔF508-CFTR. Для того, чтобы определить активность корректирующих соединений, клетки инкубируют при 27°С или 37°С с и без соединений в течение 24 часов.

6. Регистрация целых клеток

Макроток ΔF508-CFTR (I_ΔF508) в корректированных температурой и испытываемыми соединениями клетках NIH3T3, устойчиво экспрессирующих ΔF508-CFTR, контролируют с использованием регистрирующего целые клетки перфорированного пэтча. Коротко, записи фиксации потенциала I_ΔF508 осуществляют при комнатной температуре с использованием усилителя пэтч-клампа Axopatch 200B (Axon Instruments Inc., Foster City, CA). Все записи получают при образцовой частоте 10 кГц и low-pass, фильтрованном при 1 кГц. Пипетки имеют сопротивление 5-6 МОм, когда заполнены внутриклеточным раствором. В указанных условиях регистрации вычисленный обратимый потенциал для Cl^- (E_Cl) при комнатной температуре составляет -28 мВ. Все записи имеют скрепленное сопротивление свыше 20 ГОм и последовательное сопротивление менее 15 МОм. Генерацию импульсов, сбор данных и анализ выполняют с использованием ПК, снабженного интерфейсом Digidata 1320 A/D в сочетании с Clampex 8 (Axon Instruments Inc.). Электролит содержит менее 250 мкл физиологического раствора и непрерывно перфузируется со скоростью 2 мл/мин с использованием перфузионной системы с подачей самотеком.

7. Идентификация корректирующих соединений

Для того, чтобы определить активность корректирующих соединений для повышения плотности функционального ΔF508-CFTR в плазматической мембране, используют описанные выше методы регистрации с перфорированным пэтчем для измерения плотности тока после 24-часовой обработки корректирующими соединениями. Для того чтобы полностью активировать ΔF508-CFTR, к клеткам добавляют 10 мкМ форсколина и 20 мкМ генистеина. В указанных условиях регистрации плотность тока после 24-часовой инкубации при 27°С выше, чем плотность тока, наблюдаемая после 24-часовой инкубации при 37°С. Такие результаты совпадают с известными действиями низкотемпературной инкубации на плотность ΔF508-CFTR в плазматической мембране. Для того чтобы определить действие корректирующих соединений на плотность тока CFTR, клетки инкубируют с 10 мкМ испытываемого соединения в течение 24 часов при 37°С, и плотность тока сравнивают с контролями при 27°С и 37°С (% активности). Перед регистрацией клетки промывают три раза внеклеточной средой для регистрации для удаления любого оставшегося испытываемого соединения. Предварительная инкубация с 10 мкМ корректирующих соединений существенно повышает цАМФ- и генистеинзависимый ток по сравнению с контролями при 37°С.

8. Идентификация потенцирующих соединений

Способность усилителей ΔF508-CFTR повышать макроток ΔF508-CFTR Cl^- (I_ΔF508) в клетках NIH3T3, устойчиво экспрессирующих ΔF508-CFTR, также исследуют с использованием методов регистрации с перфорированным пэтчем. Усилители, идентифицированные из оптических анализов, вызывают зависимое от дозы повышение I_ΔF508 с силой и эффективностью, наблюдаемыми в оптических анализах. Во всех проверенных клетках обратимый потенциал до и во время применения потенцирующих средств составляет около -30 мВ, что является вычисленным E_Cl (-28 мВ).

9. Растворы

Внутриклеточный раствор (в мМ): аспартат Cs (90), CsCl (50), MgCl₂ (1), HEPES (10) и 240 мкг/мл амфотерицина-В (рН доводят до 7,35 CsOH).

Внеклеточный раствор (в мМ): N-метил-D-глюкамин (NMDG)-Cl (150), MgCl₂ (2), CaCl₂ (2) и HEPES (10) (рН доводят до 7,35 HCl).

10. Клеточная культура

Используют для регистрации целых клеток мышиные фибробласты NIH3T3, устойчиво экспрессирующие ΔF508-CFTR. Клетки поддерживают при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ и 90% влажностью в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко, с добавлением 2 мМ глутамина, 10% сыворотки плода коровы, 1×NEAA, β-ME, 1×пенициллин/стрептомицин, и 25 мМ HEPES, на 175-см² матрасах. Для регистрации целых клеток 2500-5000 клеток высевают на сенсибилизированные поли-L-лизином покровные стекла, культивируют в течение 24-48 часов при 27°С перед использованием для проверки активности потенцирующих средств и инкубируют с корректирующими соединениями или без них при 37°С для измерения активности корректоров.

11. Одноканальные регистрации

Активности отдельных каналов корректированного температурой ΔF508-CFTR, устойчиво экспрессируемого в клетках NIH3T3, и активность потенцирующих соединений наблюдают с использованием вырезанного перевернутого мембранного пэтча. Коротко, записи активности отдельных каналов при фиксированном потенциале выполняют при комнатной температуре с помощью усилителя пэтч-клампа Axopatch 200B (Axon Instruments Inc.). Все записи получают при образцовой частоте 10 кГц и low-pass, фильтрованном при 400 Гц. Пэтч-пипетки изготовлены из стекла Corning Kovar Sealing #7052 (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL) и имеют сопротивление 5-8 МОм, когда заполнены внеклеточным раствором. ΔF508-CFTR активируют после вырезания путем добавления 1 мМ Mg-АТФ и каталитической субъединицы 75 нМ цАМФ-зависимой протеинкиназы (PKA; Promega Corp., Madison, WI). После стабилизации активности каналов пэтч перфузируют с использованием микроперфузионной системы с подачей самотеком. Приток размещают рядом с пэтчем, что приводит к полному обмену раствора в пределах 1-2 секунд. Для того чтобы поддержать активность ΔF508-CFTR во время быстрой перфузии, к раствору электролита добавляют неспецифический ингибитор фосфатазы F^- (10 мМ NaF). В таких условиях регистрации активность канала остается постоянной на протяжении записи с пэтча (до 60 минут). Токи, создаваемые положительным зарядом, движущимся из внутриклеточных во внеклеточные растворы (причем анионы двигаются в противоположном направлении), показаны как положительные токи. Потенциал пипетки (V_p) поддерживают при 80 мВ.

Активность канала анализируют из мембранных пэтчей, содержащих ≤2 активных канала. Максимальное число одновременных открытий определяют как число активных каналов в ходе эксперимента. Для того, чтобы определить амплитуду тока в одном канале, данные, записанные за 120 секунд активности ΔF508-CFTR, фильтруют «автономно» при 100 Гц и затем используют для построения гистограмм амплитуд во всех точках, которые приводят в соответствие с многогауссовыми функциями с использованием программы Bio-Patch Analysis (Bio-Logic Comp., Франция). Суммарный микроток и вероятность открытия (Р_о) определяют из 120-секундной активности канала. Р_о определяют с использованием программы Bio-Patch или из соотношения P_o=I/i(N), где I = средний ток, i = амплитуда тока в одном канале, и N = число активных каналов в пэтче.

12. Растворы

Внеклеточный раствор (в мМ): NMDG (150), аспарагиновая кислота (150), CaCl₂ (5), MgCl₂ (2) и HEPES (10) (рН доводят до 7,35 основанием трис).

Внутриклеточный раствор (в мМ): NMDG-Cl (150), MgCl₂ (2), EGTA (5), TES (10) и основание трис (14) (рН доводят до 7,35 HCl).

13. Клеточная культура

Мышиные фибробласты NIH3T3, устойчиво экспрессирующие ΔF508-CFTR, используют для регистрации вырезанного из мембраны пэтч-клампа. Клетки поддерживают при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ и 90% влажностью в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко, с добавлением 2 мМ глутамина, 10% сыворотки плода коровы, 1×NEAA, β-ME, 1×пенициллин/стрептомицин, и 25 мМ HEPES, на 175-см² матрасах. Для регистрации отдельных каналов 2500-5000 клеток высевают на сенсибилизированные поли-L-лизином покровные стекла и культивируют в течение 24-48 часов при 27°С перед использованием.

С использованием процедур, описанных выше, активность, например, ЕС₅₀, соединения 1 измеряют методами, указанными выше, и приводят в таблице 6.

Таблица 6   Столбики гистограммы IC₅₀/EC₅₀: +++<=2,0<++<=5,0<+   Столбики гистограммы, активность в %: +<=25,0<++<=1000<+++  

№ соединения EC₅₀ по гистограмме Максимальная эффективность по гистограмме 1 +++ +++

ДРУГИЕ ВОПЛОЩЕНИЯ

Все публикации и патенты, упомянутые в данном описании, включены в него в качестве ссылок так, как если бы включалась в качестве ссылки каждая отдельная публикация или заявка на патент. Если значение терминов в любом из патентов или публикаций, включенных в качестве ссылок, вступает в конфликт со значением терминов, используемых в данном раскрытии, предполагается, что регулирующим является значение терминов в данном раскрытии. Кроме того, вышеуказанное обсуждение раскрывает и описывает только примеры воплощений настоящего изобретения. Специалист в данной области техники из такого обсуждения и из прилагаемых чертежей и формулы изобретения легко выяснит, что можно произвести различные изменения, модификации и вариации без отхода от сущности и объема изобретения, что определяется приведенной далее формулой изобретения.

Изобретение относится к по существу твердой форме 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)бензойной кислоты (форме А сольвата соединения 1 и форме А соли HCl соединения 1), фармацевтическим композициям на их основе и способам лечения с ними. 4 н. и 35 з.п. ф-лы, 23 ил., 6 табл.

1. Твердая форма 3-(6-(1-(2,2-дифторбензо[d][1,3]диоксол-5-ил)циклопропанкарбоксамидо)-3-метилпиридин-2-ил)бензойной кислоты (соединение 1), характеризующаяся одним или несколькими пиками при 21,5-21,9 градуса, 8,8-9,2 градуса и 10,8-11,2 градуса на порошковой дифрактограмме, полученной с использованием излучения Cu K-альфа, характеризованная как форма A сольвата соединения 1.

2. Форма A сольвата соединения 1 по п. 1, причем форма A сольвата соединения 1 характеризуется как кристаллическая решетка соединения 1, содержащая множество повторяющихся пустот, которые являются незаполненными или, по меньшей мере, частично заняты сольватом.

3. Форма A сольвата соединения 1 по п. 1, причем форма A сольвата соединения 1 характеризуется как кристаллическая решетка соединения 1, содержащая множество повторяющихся пустот, при этом пустоты являются незаполненными.

4. Форма A сольвата соединения 1 по п. 1, характеризующаяся одним или несколькими пиками при 21,5-21,9 градуса, 8,8-9,2 градуса, 10,8-11,2 градуса, 18,0-18,4 градуса и 22,9-23,3 градуса на порошковой дифрактограмме, полученной с использованием излучения Cu K-альфа.

5. Форма A сольвата соединения 1 по п. 1, характеризующаяся одним или несколькими пиками при 21,70, 8,98, 11,04, 18,16 и 23,06 градуса.

6. Форма A сольвата соединения 1 по п. 1, характеризующаяся пиком при 21,5-21,9 градуса.

7. Форма A сольвата соединения 1 по п. 1, характеризующаяся пиком при 21,70 градуса.

8. Форма A сольвата соединения 1 по п. 7, также характеризующаяся пиком при 8,8-9,2 градуса.

9. Форма A сольвата соединения 1 по п. 8, также характеризующаяся пиком при 8,98 градуса.

10. Форма A сольвата соединения 1 по п. 9, также характеризующаяся пиком при 10,8-11,2 градуса.

11. Форма A сольвата соединения 1 по п. 10, также характеризующаяся пиком при 11,04 градуса.

12. Форма A сольвата соединения 1 по п. 11, также характеризующаяся пиком при 18,0-18,4 градуса.

13. Форма A сольвата соединения 1 по п. 12, также характеризующаяся пиком при 18,16 градуса.

14. Форма A сольвата соединения 1 по п. 13, также характеризующаяся пиком при 22,9-23,3 градуса.

15. Форма A сольвата соединения 1 по п. 14, также характеризующаяся пиком при 23,06 градуса.

16. Форма A сольвата соединения 1 по п. 2, которая характеризуется дифрактограммой, по существу совпадающей с дифрактограммой на фиг. 1.

17. Форма A сольвата соединения 1 по п. 2, где сольват выбирают из группы, состоящей из органического сольвата достаточного размера для соответствия множеству повторяющихся пустот.

18. Форма A сольвата соединения 1 по п. 17, где растворитель выбирают из группы, состоящей из метанола, этанола, ацетона, изопропанола, ацетонитрила, тетрагидрофурана, метилацетата, 2-бутанона, этилформиата, этилацетата и 2-метилтетрагидрофурана.

19. Форма A сольвата соединения 1 по п. 17, где по определению ТГА форма А сольвата соединения 1 на 1-10 мас.% состоит из сольвата.

20. Форма A сольвата соединения 1 по п. 19, где по определению ТГА форма А сольвата соединения 1 на 2-5 мас.% состоит из сольвата.

21. Форма A сольвата соединения 1 по п. 2, в которой температура плавления составляет 185-190°C.

22. Форма A сольвата соединения 1 по п. 2, имеющая пространственную группу P2_l/n и следующие размеры элементарной ячейки:
а=16,5235 (10) , α=90°,
b=12,7425 (8) , β=103,736 (4)°,
c=20,5512 (13) , γ=90°.

23. Форма A сольвата соединения 1 по п. 1, при этом форма А сольвата соединения 1 имеет частицы размером от 0,1 микрона до 50 микрон.

24. Форма A сольвата соединения 1 по п. 1, при этом форма А сольвата соединения 1 имеет частицы размером от 0,1 микрона до 20 микрон.

25. Форма A сольвата соединения 1 по п. 1, при этом форма А сольвата соединения 1 имеет частицы размером от 0,1 микрона до 10 микрон.

26. Форма A сольвата соединения 1 по п. 1, при этом форма А сольвата соединения 1 имеет частицы размером от 1,0 микрона до 5 микрон.

27. Форма А сольвата соединения 1 по п. 1, при этом форма А сольвата соединения 1 имеет частицы размером D50 2,0 микрона.

28. Фармацевтическая композиция для лечения опосредуемого CFTR заболевания у млекопитающего, включающая форму А сольвата соединения 1 по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель.

29. Фармацевтическая композиция по п. 28, также включающая дополнительное терапевтическое средство, выбранное из муколитического средства, бронхорасширяющего средства, антибиотика, антибактериального средства, противовоспалительного средства, модулятора CFTR или питательного вещества.

30. Способ лечения опосредуемого CFTR заболевания у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества формы А сольвата соединения 1 по п. 1.

31. Способ по п. 30, при этом опосредуемое CFTR заболевание выбирают из муковисцидоза, астмы, COPD, вызванного курением, хронического бронхита, риносинусита, констипации, панкреатита, недостаточности поджелудочной железы, мужского бесплодия, вызванного врожденным двусторонним отсутствием семявыносящих протоков (CBVAD), легкой формы заболевания легких, идиопатического панкреатита, аллергического бронхолегочного аспергиллеза (ABPA), болезни печени, наследственной эмфиземы, наследственного гемохроматоза, недостаточности коагуляции-фибринолиза, дефицита белка С, наследственного ангионевротического отека типа 1, дефицита процессинга липидов, семейной гиперхолестеринемии, хиломикронемии типа 1,
абеталипопротеинемии, болезней накопления лизосом, болезни клеточных включений/псевдосиндрома Гурлер, мукополисахаридозов, болезни Сандхоффа/Тея-Сакса, синдрома Криглера-Найяра типа II, полиэндокринопатии/гиперинсулинемии, сахарного диабета, карликовости лароновского типа, дефицита миелопероксидазы, первичного гипопаратиреоидизма, меланомы, гликаноза CDG типа 1, врожденного гипертиреоидизма, несовершенного остеогенеза, наследственной гипофибриногенемии, дефицита ACT, несахарного диабета (DI), нейрофизиального DI, нефрогенного DI, синдрома Шарко-Мари-Тута, болезни Пелицеуса-Мерцбахера, нейродегенеративных заболеваний, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза, прогрессирующего надъядерного паралича, болезни Пика, некоторых полиглутаминовых неврологических расстройств, болезни Гентингтона, спиноцеребральной атаксии типа 1, спинальной и бульбарной мышечной атрофии, дентато-рубро-паллидо-льюисовой атрофии, миотонической дистрофии, губчатой энцефалопатии, наследственной болезни Крейтцфельда-Якоба из-за нарушения процессинга белков прионов, болезни Фабри, синдрома Штраусслера-Шейнкера, COPD, болезни сухих глаз, болезни Шегрена, остеопороза, остеопении, синдрома Горхама, каналопатии хлоридных каналов, врожденной миотонии (формы Томсена и Беккера), гиперальдостеронизма типа III, болезни Дента, врожденной патологической усиленной реакции испуга, эпилепсии, лизосомной болезни накопления, синдрома Ангельмана, первичной цилиарной дискинезии (PCD), наследственных расстройств структуры и/или функции цилиарного тела, PCD с транспозицией внутренних органов, PCD без транспозиции внутренних органов или цилиарной аплазии.

32. Способ по п. 31, где опосредуемым CFTR заболеванием является муковисцидоз, эмфизема, COPD, болезнь сухих глаз или остеопороз.

33. Способ по п. 31, где опосредуемым CFTR заболеванием является муковисцидоз.

34. Способ по п. 33, где указанный пациент имеет трансмембранный регулятор муковисцидоза (CFTR) с мутацией ΔF508.

35. Способ по п. 33, где указанный пациент имеет трансмембранный регулятор муковисцидоза (CFTR) с мутацией R117H.

36. Способ по п. 33, где указанный пациент имеет трансмембранный регулятор муковисцидоза (CFTR) с мутацией G551D.

37. Способ по п. 33, где способ включает введение дополнительного терапевтического средства, выбранного из муколитического средства, бронхорасширяющего средства, антибиотика, антибактериального средства, противовоспалительного средства, модулятора CFTR или питательного вещества.

38. Набор для лечения опосредуемого CFTR заболевания у млекопитающего, включающий форму А сольвата соединения 1 по п. 1 и инструкции по их применению.

39. Фармацевтическая композиция по п. 29, где дополнительным терапевтическим средством является N-(5-гидрокси-2,4-ди-трет-бутилфенил)-4-оксо-1H-хинолин-3-карбоксамид.