СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СНИЖЕНИЯ ЭСТРИОЛА В ГОМОГЕНАТЕ ПЛАЦЕНТЫ В СВЯЗИ С УВЕЛИЧЕНИЕМ СИНТЕЗА ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/53 

1. Цель изобретения - разработать способ оценки снижения поступления в синцитиотрофобласт ворсинок плаценты эстриола при увеличении синтеза в мембране синцитиотрофобласта фосфодиэстеразы на фоне обострения в организме беременной на третьем триместре гестации цитомегаловирусной инфекции.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа, позволяющего выяснить причину снижения в плаценте беременной эстриола в связи с нарастанием содержания в плаценте фосфодиэстеразы при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации, что создает угрозу формирования фетоплацентарной недостаточности и развития плода.

3. Раскрытие изобретения

Фосфодиэстеразы - это ферменты, участвующие в регуляции сигнальных путей. В первую очередь к ним относятся цАМФ-фосфодиэстеразы и цГМФ-фосфодиэстеразы [1,2,6,7,11,12]. Гормональный сигнал в клетку обеспечивается как минимум пятью белками: рецептор гормона; фермент - аденилатциклаза, выполняющий функцию синтеза циклического аденозинмонофосфата (цАМФ); G-белок, осуществляющий связь между аденилатциклазой и рецептором; цАМФ-зависимая протеинкиназа, катализирующая фосфорилирование внутриклеточных ферментов или белков-мишеней, изменяя их активность, и, наконец, фосфодиэстераза, которая вызывает распад цАМФ и тем самым обрывает действие сигнала. Фосфодиэстераза и аденилатциклаза являются регуляторами процессов фосфорилирования белков [4,5,8]. Клетка, получая сигнал, превращает его в химический процесс на уровне рецептора с участием G-белка и вторичного мессенджера, которым в первую очередь выступает цАМФ. Синтезируется цАМФ ферментом аденилатциклазой из АТФ. Аденилатциклаза представляет собой интегральный белок плазматической мембраны, и ее множественные формы активизируются при действии множественных агентов и прежде всего Gs. При увеличении содержания фосфодиэстеразы цАМФ удаляется путем гидролиза [13]. Самым ранним этапом в цепи событий является фосфорилирование рецептора, которое катализируется киназой рецептора, сопряженной с G-белком (GPK). Фосфорилирование блокирует способность рецептора активировать G-белок. При стимуляции синтеза фосфодиэстеразы, приводящего к его увеличению, разрушается цАМФ и аденилциклаза, что подавляет рецепторную активность мембраны синцитиотрофобласта и поступление в плаценту эстриола.

4. Новая техническая задача

Разрабатывается способ оценки причин недостаточного содержания в гомогенате плаценты беременной гормона эстриола при увеличении в ней фосфодиэстеразы при обострении на третьем триместре гестации цитомегаловирусной инфекции.

5. В работе способ определения снижения эстриола в гомогенате плаценты в связи с увеличением синтеза фосфодиэстеразы при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации отмечается, что в экспериментальных условиях фосфодиэстераза при большом содержании разрушат цАМФ. В наших исследованиях мы проводили определение содержания фосфодиэстеразы в мембранах синцитиотрофобласта плаценты при обострении в организме беременной цитомегаловирусной инфекции до титра 1:1600 и отметили, что повышенное содержание фосфодиэстеразы в наружной мембране синцитиотрофобласта подавляет содержание в гомогенате плаценты эстриола, создавая угрозу формирования фетоплацентарной системы и развития плода.

6. Осуществление изобретения

6.1. Обследовано 20 беременных в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией (ХЦМВИ) в стадии обострения на 25-26 неделе гестации и 15 беременных, не болевших ЦМВИ. Диагноз обострения ХЦМВИ устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM к ЦМВ или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности более 65%, а также наличия ДНК ЦМВ. Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекс авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (США) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), методами ПЦР на аппарате ДТ-96 использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

6.2. Статистический анализ и обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ STATISTICA v. 6.0 (StatSoft Inc., США). Для определения достоверности различий использовали непарный параметрический критерий Стьюдента. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений - непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни. Критический уровень значимости был принят за 5% (0,05). Данные представлены как среднее арифметическое (М) ± стандартная ошибка среднего арифметического (m).

6.3. Содержание эстриола в гомогенате плаценты роженицы определяли иммуноферментным методом наборами ЗАО «НОВО Имунотех» (Москва).

6.4. Активность аденилатциклазы изучали в синцитиотрофобласте гистохимическим методом по прописи J. Reik [10].

6.5. Фосфодиэстераза определялась гистохимическим методом в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты по прописи Флоренко, Барнетта и Грингарда [3].

Гистохимические препараты рассматривались под цифровым микроскопом (Япония), соединенным с компьютером, и анализировались цитофотометрическим методом по программе «Scion» (США).

7. Полученные данные

Исследования показали, что при обострении ХЦМВИ на третьем триместре гестации до титра антител к ЦМВ 1:1600 у беременной в гомогенате плаценты резко снижалось содержание эстриола до 177,50±7,80 нмоль/л (контроль - 270,60±8,50 нмоль/л). Гистохимические исследования показали, что в наружной мембране снижается активность аденилатциклазы до 10,0±0,2 усл. ед. (контроль 33,9±0,95 усл. ед.). На этом фоне активность фосфодиэстеразы в мембране синцитиотрофобласта возросла до 18,00±0,31 усл. ед. (контроль - 3,2±0,03 усл. ед.). Повышение активности фосфодиэстеразы приводит к уничтожению аденилатциклазы, создающей в мембране синцитиотрофобласта ворсинок плаценты мессенджер второго типа цАМФ, что лишает возможность эстриолу проникновение через синцитиотрофобласт в кровь пуповины, снижая тем самым формирования фетоплацентарной системы беременной и развития плода.

Литература

1. Beavo I.A., Bechtel P., Klrebs E.G. Mechanisms of control for с AMP-dependent protein kinase from skeletal muscle. Adv. Cyclic Nucleotide Res. 1975. V. 5. P. 241-251.

2. Clapperton I.A., Martin S.R., Smerdon S.J., Gamblin S.I., Bayley P.N. Structure of calmodulin dependent protein kinase I: Studies of the kinase activation mechanism. 2002. Biochemistry. V. 41. P. 14669-14679.

3. Florenko N., Barrent P., Greengard P. Cyclic 3,5-nucleotide phosphodiesterase: chemical localication in cerebral cortex // Science. 1971. V. 173. P. 645-747.

4. Ginty D., Kornhauser I., Thompson M., Bading H., Mayo K., Takahashi J., Greenberg M. Regulation of CREB phosphorylation in the suprachiasmatic nucleus by light and acircadianclock. 1993. Scionce. V. 260. P. 238-241.

5. Kobe В., Heierhorst I., Kemp B. Intrasteric regulation of protein kinases. Adv. Second. Messenger. Phosphoprotein Res. 1977. V. 31. P. 29-40.

6. Kuboniwa H., Tjandra N., Gresiek S., Ren H., Klee C, Bax A. Solution structure of calcium - free calmodulin. Nat. Struct. Biol. 1995. V. 2. P. 768-776.

7. Newton A.C. Protein kinase C: structural and spatial regulation by phosphorylation, cofactors, and macromobculur interactions. 2001. Chem. Rev. V. 101. P. 2353-2364.

8. Perkins I., Hausdorff W., Lefkowitz R. Mechanisms of ligand-induced desensitization of ***-adrenergie receptors. 1990. In. Th Beta-Adrenergic Receptors. J. P. Perkins, ed. Clifton, NI: Humana Press. P 73-124.

9. Pawson Т., Nash P. Assembly of cell regulation systems through protein interaction domains // Science. 2003. V. 300. P. 445-452.

10. Reik J., Petzold C., Higgins J. Hormonesensitive adenyl cyclase: cytochemical localization in rat liver // Science. 1970. V. 168. P. 382-384.

11. Sauro H.M., Kholodenko B.N. Quantitative analysis of signaling networks. 2004. Prog. Biophys. Mol. Biol. V. 86. P. 5-43.

12. Turk B.E., Cantley L. Peptide libraries: at the crossouds of proteomics and bioinformatics. Curr. Opin. Chem. Biol. 2003. V. 7. P. 84-90.

13. Wong W., Scotty D. AKAP signaling complexesi focal points in space and time // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2004. V. 5. P. 1065-1076.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для диагностики формирования фетоплацентарной недостаточности при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации. Для этого измеряют в периферической крови титр антител к ЦМВ, а также активность аденилатциклазы и фосфодиэстеразы в мембране синцитиотрофобласта и содержание эстриола в гомогенате плаценты, и при титре антител к ЦМВ 1:1600, снижении аденилатциклазы в мембране синцитиотрофобласта до 10,0±0,2 усл. ед., повышении активности в мембране синцитиотрофобласта фосфодиэстеразы до 18,00±0,31 усл. ед. и снижении содержания эстриола в гомогенате плаценты до 177,50±7,80 нмоль/л создается угроза формирования фетоплацентарной недостаточности. 2 ил.

Способ диагностики формирования фетоплацентарной недостаточности при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации, включающий изменение в периферической крови титра антител к ЦМВ, а также активность аденилатциклазы и фосфодиэстеразы в мембране синцитиотрофобласта и содержания эстриола в гомогенате плаценты, и при титре антител к ЦМВ 1:1600, снижении аденилатциклазы в мембране синцитиотрофобласта до 10,0±0,2 усл. ед., повышении активности в мембране синцитиотрофобласта фосфодиэстеразы до 18,00±0,31 усл. ед. и снижении содержания эстриола в гомогенате плаценты до 177,50±7,80 нмоль/л создается угроза формирования фетоплацентарной недостаточности.