СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА АКТИВНОСТЬ ЛИПОЕВОЙ КИСЛОТЫ В СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТЕ ПЛАЦЕНТЫ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/48 

1. Цель изобретения - разработать способ оценки влияния цитомегаловирусной инфекции на активность липоевой кислоты в синцитиотрофобласте плаценты на третьем триместре гестации.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа, позволяющего оценить влияние цитомегаловирусной инфекции на активность липоевой кислоты, играющей роль кофермента в окислительно-восстановительном процессе цикла Кребса.

3. Раскрытие изобретения

Липоевая кислота - это химическое соединение из группы витаминоподобных кислот, которое в небольших количествах синтезируется в организме. Липоевая кислота является коферментом в комплексах (дегидрогеназ), обеспечивающих этапы метаболизма глюкозы [2, 6, 7]. Липоевая кислота как кофактор вовлечена в митохондриальный метаболизм. В аэробных условиях пируват проникает в митохондрии и в ходе комплексной реакции пируватдегидрогеназы конвертируется в ацетил-СоА для участия в цикле Кребса. В этом процессе участвует целый ряд коферментов, в том числе и липоевая кислота [7-9]. Увеличение липоевой кислоты повышает эффективность конвертации пирувата в ацетил-СоА и тем самым увеличивает количество медиаторов анаэробного метаболизма. Липоевая кислота наряду с участием в синтезе ацетил-СоА выполняет в организме еще и роль антиоксиданта[1-5].

4. Новая техническая задача

Разрабатывается способ, позволяющий путем определения активности липоевой кислоты в синцитиотрофобласте оценить влияние цитомегаловирусной инфекции на характер окислительно-восстановительных процессов в плаценте в период гестации.

5. В доступной литературе не имеется сведений, касающихся оценки активности липоевой кислоты в окислительно-восстановительном процессе в синцитиотрофобласте плаценты. В настоящем исследовании учитывается еще и характер участия липоевой кислоты в окислительно-восстановительных процессах в плаценте при обострении цитомегаловирусной инфекции.

6. Осуществление изобретения

6.1. Обследовано 20 беременных в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией (ХЦМВИ) в стадии обострения на 25-26 неделях гестации с титром антител к ЦМВ 1:1600 и 10 беременных, не болевших на всем протяжении беременности. Диагноз обострения ХЦМВИ устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM к ЦМВ или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности более 65%, а также наличия ДНК ЦМВ. Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г. Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекс авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (США) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), методами ПНР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

6.2. Статистический анализ и обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica v. 6.0» (StatSoft Inc., США). Для определения достоверности различий использовали непарный параметрический критерий Стьюдента. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений - непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни. Критический уровень значимости был принят за 5% (0,05). Данные представлены как среднее арифметическое (М) ± стандартная ошибка среднего арифметического (m).

6.3. Реакция проводилась на свежезамороженных срезах. Активность липоевой кислоты определяли гистохимическим методом. Субстратом служил 0,1 М раствор липоевой кислоты фирмы ICN (США) на фосфатном 0,1 М буфере рН 7,5-1 мл, нитросиний тетразолий фирмы ICN (США) - 1 мг. Инкубация проводилась при температуре 37°С в течение 30 мин. Срезы промывались в дистиллированной воде, слегка подсушивались и заключались в глицерин-желатин. Полученные препараты изучались под цифровым микроскопом, соединенным с компьютером по программе Scion (США), с целью цитофотометрическим методом по количеству продуктов реакции на липоевую кислоту определять ее активность в синцитиотрофобласте.

7. Полученные данные

В процессе исследования получены следующие результаты. В синцитиотрофобласте ворсинок плаценты рожениц, перенесших на 25-26 неделях гестации обострение цитомегаловирусной инфекции до титра антител к ЦМВ 1:1600, резко подавлялась активность на липоевую дегидрогеназу, выполненную гистохимическим методом: 0,1М раствор липоевой кислоты на фосфатном буфере рН 7,5-1 мл с добавлением нитросинего тетразолия - 1 мг, с инкубацией в течение 30 мин при температуре 37°С. Срезы промывались в дистиллированной воде и заключались в глицерин-желатин. Интенсивность реакции подсчитывали цитофотометрическим способом по программе Scion до 23,50±0,95 усл. ед. (контроль - 68,30±1,50 усл. ед.). Полученные данные свидетельствуют, что при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации в синцитиотрофобласте снижается активность кофакторов, обеспечивающих синтез ацетил-СоА, подавляя тем самым уровень окислительно-восстановительных процессов в фетоплацентарном барьере, что снижает функциональную активность плаценты беременной и создает угрозу развития плода.

На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция на активность липоиддегидрогеназы в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты рожениц, не болевших на всем протяжении гестации. Гистохимическая реакция по Лойда. Цитофотометрически активность - 68,30±1,50 усл. ед. Увеличение - 10×90.

На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция на активность липоиддегидрогеназы в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты рожениц с обострением ХЦМВИ на 25-26 неделях гестации. Цитофотометрически по сравнению с контролем активность липоиддегидрогеназной реакции цитофотометрически снижена до 23,50±0,95 усл. ед. Увеличение - 10×90.

Литература

1. Burges S., Burges S.A. The role of chickens in vitamin discoveries // Intern. J. of Poultry Science. 2006. Vol. 5, №8. P. 704-707.

2. Greene E., Nelson K., Robinson M. Buse alpha-Lipoic acid prevents the development of glucose-induced insulin resistance in 3T3-1 adipocytes and accelerates the decline in immunoreactive insulin during cell incubation // Metabolism. 2001. Vol. 50. P. 1063-1069.

3. Lojda Z., Gossrau R. Enzyme Histocheristry. New York: 1979. 270 p.

4. Miquel J. Can antioxidant diet supplementation protect against age-related mitochondrial damage // Ann NY Acad Sci. 2002. Vol. 959. P. 508-516.

5. Motawi Т., Sadik N., Refaat A. Cytoprotective effect of DL-α-lipoic or squalene on cyclophosphamide-induced oxidative injury: anexperimental study on rat myocardium, testicles and urinary bladder // Food Chem Toxicol. 2001. Vol. 48, №8-9. P. 2326-2336.

6. Packer L., Kramer G. Molecular aspects of lipoic acid in prevention of diabetes complication//Nutrition. 2001. Vol. 17. P. 888-895.

7. Petersen S., Moreau R., Smith E. Is a-lipoic acid a scavenger of reactive oxygen species in vivo? Evidence for its initiation stress signaling pathways that promote endogenous antioxidant capacity // JUBMB Life. 2008. Vol. 60, №6. P. 362-367.

8. Souza G., Saldanha G., Freitas R. Lipoic acid increases glutathione peroxidase, Na⁺, K⁺ - ATPase and acetylcholinesterase activities in rat hippocampus after pilocarpine-induced seizures? // Arq. Neuropsiquiart. 2010. Vol. 68, №4. P. 586-591.

9. Stites Т., Mithell A., Rucker R. Physiological importance of quinoenzymes and the O-quinone family of cofactors // Journal of Nutrition. 2000. Vol. 130, №8. P. 719-727.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки индуцирующего действия цитомегаловирусной инфекции на активность липоевой кислоты в синцитиотрофобласте плаценты на третьем триместре гестации. Для этого в периферической крови определяют титр антител к цитомегаловирусу и выполняют гистохимическую реакцию на выявление липоевой кислоты. При титре антител к ЦМВ до 1:1600 и снижении активности липоиддегидрогеназы до 23,50±0,95 усл. ед. развивается угроза функционирования плаценты и развития плода. Способ позволяет оценить индуцирующее действие цитомегаловирусной инфекции на активность липоевой кислоты в синцитиотрофобласте плаценты. 2 ил.

Способ оценки индуцирующего действия цитомегаловирусной инфекции на активность липоевой кислоты в синцитиотрофобласте плаценты на третьем триместре гестации, включающий определение в периферической крови титра антител к цитомегаловирусу, выполнение гистохимической реакции на выявление липоевой кислоты, и при титре антител к ЦМВ до 1:1600, снижении активности липоиддегидрогеназы до 23,50±0,95 усл. ед. развивается угроза функционирования плаценты и развития плода.