СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЯ ТРАНСАМИНИРОВАНИЯ ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ В СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТЕ ПЛАЦЕНТЫ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/50 

1. Цель изобретения - выявить, что при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации снижается активность процесса трансаминирования глутаминовых аминокислот.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа диагностики снижения процессов трансаминирования глутаминовой кислоты, приводящего к снижению активности трансаминирования белка в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты.

3. Раскрытие изобретения

Аминокислоты, не использованные для синтеза белка, накапливаются в клетках в большом количестве. Они подвергаются различным ферментативным превращениям с последующим распадом. В азотистом обмене большая роль принадлежит процессам переноса одних аминокислот на другие в процессе ферментативных реакций, получивших название трансаминирования: NH₂-группы от L-аминокислоты переносятся на L-кетокислоту. Эти реакции катализируются ферментами трансаминазами. Коферментом трансаминаз является пиридоксаль-5-фосфат, являясь промежуточным переносчиком аминогрупп от аминокислоты на кетокислоту [1, 3-5, 8]. Из всех природных аминокислот в животных тканях с высокой скоростью дезаминируются только L-глутаминовая кислота с образованием γ-глутаминовой кислоты. Образовавшаяся γ-глутаминовая кислота [3, 6-8, 10] подвергается окислительному дезаминированию под действием глутаматдегидрогеназы [9, 11]. В случае подавления активности глутаматтрансферазы в цитозоле накапливается большое количество аминокислот, которые нарушают синтез белка и работу конформационной упаковки аминокислот цитозоля с помощью белка теплового шока Hsp-70, что приводит к дезорганизации фетоплацентарного барьера плаценты.

4. Новая техническая задача

Определять уровень активности глутаматтрансферазы при обострении цитомегаловирусной инфекции у беременных на третьем триместре гестации с целью диагностировать характер состояния фетоплацентарного барьера во время беременности, от чего зависит нормальное развитие плода.

5. В доступной литературе по данному вопросу аналогов не отмечено.

6. Осуществление изобретения

6.1. Обследованы 45 беременных 18-25 лет (срок гестации 20-22 нед.). Основную группу составили 25 беременных с хронической ЦМВИ в стадии обострения, контрольную - 20 беременных без этой патологии. У беременных симптоматически ЦМВИ проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз (обострение ЦМВИ) устанавливался по результатам комплексного исследования периферической крови на наличие ДНК цитомегаловируса (ЦМВ), JgM или увеличение титра антител JgG в парных сыворотках (в 4 раза и более) в динамике через 10 суток, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводили с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

6.2. Верификацию ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществляли методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест», ДНК ЦМВ выявляли методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология».

6.3. Глутаматтрансферазу определяли в периферической крови с помощью наборов «Sentinel diagnostics» (Италия) на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (США).

6.4. Биохимически активность белка теплового шока Hsp-70 в гомогенате плаценты определяли с помощью наборов ELISA Kit (США) методом ИФА.

6.5. Гистохимически активность глутаматдегидрогеназы определяли на гистологических срезах плаценты по методу Лойда [2] с последующим цитофотометрическим компьютерным анализом с помощью программы Scion (США).

6.6. Статистический анализ и обработка данных проводились с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений М±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=n₁+n₂-2. Для определения достоверности различий использовался непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимались во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений - непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.

В процессе исследования получены следующие результаты: при нарастании титра антител к ЦМВ до 1:1600 в третьем триместре гестации в периферической крови беременных отмечается резкое снижение активности глутаматтрансферазы до 28,3±0,98 Ед/л (контроль - 74,6±2,2 Ед/л). У здоровых беременных при содержании 74,6±2,2 Ед/л глутаматтрансферазы обеспечиваются полностью процессы трансаминирования L-аминоглутаминовой кислоты, которая в избытке может оказывать токсическое действие на ферментативные процессы (активность глутаматдегидрогеназы) и процессы конформационного построения белков цитозоля в синцитиотрофобласте с участием белка теплового шока Hsp-70. При обострении цитомегаловирусной инфекции до титра 1:1600 активность белков теплового шока Hsp-70 снижалась до 30,5±1,7 нг/мл (контроль - 52,7±1,8 нг/мл). На гистохимических срезах плаценты рожениц, перенесших обострение ЦМВИ до титра антител к 1:1600, определяли активность глутаматдегидрогеназы цитофотометрическим компьютерным методом по программе Scion (США). Отмечается, что обострение ЦМВИ приводит к снижению активности глутаматдегидрогеназы до 39,7±1,9 усл. ед. (контроль - 62,5±2,3 усл. ед.) (фигуры 1 и 2).

На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция на глутаматдегидрогеназу в плаценте роженицы, перенесшей на третьем триместре гестации обострение цитомегаловирусной инфекции с титром антител 1:1600. Интенсивность гистохимической реакции - 39,7±1,9 усл. ед. Подсчет выполнялся методом компьютерной цитофотометрии по программе Scion (США). Увеличение - 10×100.

На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция на глутаматдегидрогеназу в плаценте роженицы, не болевшей на всем протяжении гестации. Интенсивность гистохимической реакции - 62,5±2,3 усл. ед. Подсчет выполнялся методом компьютерной цитофотометрии по программе Scion (США). Увеличение - 10×100.

Таким образом, снижение глутаматтрансферазы в периферической крови, подавление активности белка теплового шока Hsp-70 в гомогенате синцитиотрофобласта плаценты, снижение гистохимической активности глутаматдегидрогеназы на гистологических срезах плаценты при нарастании титра антител к ЦМВ до 1:1600 приводит к дезинтеграции белкового обмена в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, влияющей на развитие плода.

Литература

1. Браунштейн А.Е., Шемякин М.М. Теория процессов аминокислотного обмена, катализируемых пиридоксалевыми энзимами. М.: 1953. 393 с.

2. Лойда З., Гроссрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. М.: 1962. 270 с.

3. Ferard G., Imbert-Bismet F., Messou D. Influence of pyridoxal phosphate in measuring aminotransferases activities in patients with virial hepatitis // Ann. Biol. Clin. 2004. V. 62, №6. P. 717-720.

4. Filipowicz A., Wolowiec S. Solubility and in vitro transdermal diffusion of riboflavin assisted by РАМАМ dendrimers // Int J. Pharm. 2011. №408. P. 152-156.

5. Filipowicz A., Wolowiec S. Bioconjugates of РАМАМ dendrimers with trans-retinal, pyridoxal, and pyridoxal phosphate // Int J. Nanomedicine. 2012. №7. P. 4819-4822.

6. Hermanussen M., Tresguerres J. Does the thrifty phenotype result from chronic glutamate intoxication a typothesis // J. Perinat. Med. 2003. V. 31. P. 311-326.

7. Kelly A., Stanley C. Disordes of glutamate metabolism // Men. Retard Dev. Disabk. Res. Rev. 2011. V. 7. P. 287-295.

8. Nichols T.W., Gaiteri C. Morton′s foot and pyridoxal 5-phosphate deficiency: genetically linked traits // Med. Hypotheses. 2014. Sep 16. V. 83, №6. P. 644-648.

9. Sookoian S., Pirola C. Alanine and aspartate aminotransferase and glutamine-cycling path way: ther roles in pathogenesis of metabolic syndrome // Word J. Gastroenterol. 2012. V. 78, №29. P. 3779-3781.

10. Stumvoll M., Perriell G., Meyer C. Role of glutamine in human carbohydrate metabolism in kidney and other tissue // Kidney Int. 1999. V. 55. P. 778-792.

11. Trebery J., Banh S., Weihrach D. Intertissu differences for the role of glutamate gehydrogenas in metabolism // Neurochem Res. 2014. V. 3, №3. P. 516-526.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для диагностики нарушения трансаминирования глутаминовой кислоты в синцитиотрофобласте плаценты беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации. Сущность способа: определяют титр антител к ЦМВ, содержание в периферической крови глутаматтрансферазы, активность белка теплового шока Hsp в гомогенате плаценты, а на гистологических срезах гистохимически определяют активность глутаматдегидрогеназы. При титре антител к ЦМВ до 1:1600, снижении содержания в периферической крови глутаматтрансферазы до 28,3±0,98 Ед/л, снижении активности в гомогенате плаценты белка теплового шока Hsp-70 до 30,5±1,7 нг/мл, снижении глутаматдегидрогеназы на гистологических срезах до 39,7±1,9 усл. ед. нарушается трансаминирование глутаминовой кислоты в синцитиотрофобласте плаценты, что создает угрозу нарушения белкового обмена в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты. 2 ил.

Способ диагностики нарушения трансаминирования глутаминовой кислоты в синцитиотрофобласте плаценты беременных при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации, характеризующийся тем, что определяют титр антител к ЦМВ, содержание в периферической крови глутаматтрансферазы, активность белка теплового шока Hsp в гомогенате плаценты, а на гистологических срезах гистохимически определяют активность глутаматдегидрогеназы, и при титре антител к ЦМВ до 1:1600, снижении содержания в периферической крови глутаматтрансферазы до 28,3±0,98 Ед/л, снижении активности в гомогенате плаценты белка теплового шока Hsp-70 до 30,5±1,7 нг/мл, снижении глутаматдегидрогеназы на гистологических срезах до 39,7±1,9 усл. ед. нарушается трансаминирование глутаминовой кислоты в синцитиотрофобласте плаценты, что создает угрозу нарушения белкового обмена в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты.