СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ БАКУЛОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2016 года по МПК A01N63/00 C12N7/00 A01M1/00 

Изобретение относится к области защиты растений, и может быть использовано в технологиях применения инсектицидных препаратов на основе бакуловирусов, повышая их эффективность.

На сегодняшний день большинство бакуловирусных препаратов не находят широкого применения из-за медленного действия на целевых насекомых, а также дорогой технологии производства таких препаратов. Между тем именно бакуловирусы обладают высокой избирательностью в действии и являются природным регулятором численности многих серьезных насекомых-вредителей, таких как непарный шелкопряд, хлопковая совка, американская белая бабочка и др. Много исследований направлено на увеличение скорости действия бакуловирусных препаратов путем генетической модификации вирусов. Благодаря системе своих антиапоптозных генов бакуловирусы эффективно сдерживают апоптоз клеток хозяина, что дает им возможность выиграть время для репликации, и этот же факт снижает скорость действия бакуловирусных препаратов.

Известен способ повышения эффективности действия бакуловирусных препаратов [Gramkow A.W., Perecmanis S., Sousa R.L.B., Noronha E.F., Felix C. R., Nagata Т., Ribeiro B.M. (2010). Insecticidal activity of two proteases against Spodoptera frugiperda larvae infected with recombinant baculoviruses. Virol. J. 29(7):143], в котором используются рекомбинантные бакуловирусы, получаемые путем биотехнологических приемов, таких как амплификация необходимого гена и его встраивание в целевой бакуловирус.

Недостатками этого метода являются дороговизна предлагаемого подхода и возможные экологические риски, связанные с применением генетически модифицированных бакуловирусов.

Техническим результатом изобретения является увеличение скорости действия бакуловирусных препаратов. За счет изменения технологических приемов обеспечивается быстрая смертность целевого насекомого-вредителя - непарного шелкопряда.

Поставленная задача решается таким образом, что способ повышения эффективности бакуловирусных препаратов включает предварительное заражение непарного шелкопряда вирусом ядерного полиэдроза, для чего в течение 2-х дней гусениц кормят питательной средой, содержащей 10³-10⁴ полиэдров на 1 мг среды, через 2-5 дней после этого пульверизатором осуществляют наружную обработку насекомого водным раствором короткого 18 нуклеотидов длиной консервативного антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда с последовательностью 5′-CGACGTGGTGGCACGGCG-3′ в концентрации 10 пмоль/мкл таким образом, чтобы на гусеницу I-III возрастов попало не менее 0,1-0,3 мкл раствора.

Причинно-следственная связь между отличительными признаками изобретения и достигаемым техническим результатом заключается в том, что антисмысловой фрагмент антиапоптозного гена бакуловируса смещает биохимические реакции зараженных клеток насекомого (в наших экспериментах - непарного шелкопряда) в сторону апоптоза, однако детали механизма смещения этих реакций в науке на данный момент окончательно не выяснены.

Автором заявляемого технического решения впервые выявлено достоверное инсектицидное влияние короткого антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена IAP-3 вируса ядерного полиэдроза на зараженных этим вирусом гусениц его хозяина - непарного шелкопряда. И поскольку влияние этого фрагмента на зараженных гусениц непарного шелкопряда выявлено впервые, это доказывает существенность отличий.

Пример конкретного осуществления способа

Для эксперимента на Южном берегу Крыма была собрана яйцекладка непарного шелкопряда Lymantria dispar (Lepidoptera: Erebidae). Гусеницы до обработки фрагментами ДНК были заражены вирусом ядерного полиэдроза, для чего в течение 2-х дней гусениц кормили питательной средой, содержащей 10⁴ полиэдров на 1 мг среды. В среднем, для каждого варианта группы эксперимента было использовано 20-25 гусениц 1-го личиночного возраста. Через 2 дня на насекомых с помощью пульверизатора был нанесен водный раствор фрагментов ДНК в концентрации 10 пмоль/мкл в количестве не менее 0,1-0,3 мкл на гусеницу. Последовательность примененного антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена IAP-3 (Inhibitor of Apoptosis, ингибитор апоптоза) вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда была следующей: 5′-CGA CGT GGT GGC ACG GCG-3′. Гусеницы из контрольных групп были обработаны водой или олигонуклеотидами со следующими последовательностями: 5′-CG CG CG CG CG CG CG CG CG-3′, 5′-GCT GCA CCA CCG TGC CGC-3′. Фрагменты были синтезированы компанией Metabion international AG (Германия) с очисткой HPLC. Все насекомые выращивались на стандартной питательной среде, основанной на проростках пшеницы при температуре 25°С. Для заражения насекомых был использован бакуловирусный препарат "ВИРИН-НШ" (Россия). Для обнаружения эффективности заражения вирусом ядерного полиэдроза непарного шелкопряда была применена полимеразная цепная реакция и пара специфических праймеров: 5′-ACG ТТС TCG TTG AAC GTG CTG-3′ и 5′-CTG GTG AAC САС AAA АСС CTG-3′. Был использован χ²-критерий Пирсона с поправкой Йетса для оценивания инсектицидного действия фрагментов ДНК. Эксперимент повторили трижды.

Эксперимент впервые выявил достоверное инсектицидное влияние антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена IAP-3 вируса ядерного полиэдроза на зараженных этим бакуловирусом гусениц непарного шелкопряда по сравнению с контрольной группой, содержащей зараженных вирусом гусениц, обработанных водой. Наоборот, два контрольных олигонуклеотида не обнаружили достоверного инсектицидного действия на зараженных бакуловирусом гусениц непарного шелкопряда по сравнению с контролем в течение 14 дней исследования. Впервые достоверность в смертности по сравнению с контролем возникла на 7 день в группе зараженных бакуловирусом гусениц непарного шелкопряда и обработанных антисмысловым фрагментом антиапоптозного гена IAP-3 вируса и составила 74,1% против 53,3% в контроле (χ²=5,51; N=138; Р<0,05); в течение следующих 7 дней разница в смертности повысилась и составила 87,9% против 63,3% в контроле (χ²=9,62; N=138; Р<0,01). Таким образом, на фоне бакуловирусной инфекции антисмысловой фрагмент антиапоптозного гена IAP-3 вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда проявил достоверное инсектицидное действие на гусениц непарного шелкопряда.

По сравнению с прототипом заявленный способ повышения эффективности бакуловирусных препаратов отличается большей доступностью и представляется экологически более безопасным.

Полученные результаты показывают возможность совместного применения бакуловирусных препаратов и антисмысловых фрагментов антиапоптозных генов бакуловирусов в практике сельского и лесного хозяйства с целью защиты растений.

Изобретение относится к области защиты растений. Предложен способ повышения эффективности бакуловирусных препаратов. Способ включает заражение насекомых вирусом ядерного полиэдроза, для чего в течение 2-х дней гусениц I-III возрастов кормят питательной средой, содержащей 10³-10⁴ полиэдров на 1 мг среды. Через 2-5 дней после заражения пульверизатором осуществляют наружную обработку насекомого водным раствором консервативного короткого 18 нуклеотидов длиной антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена IAP-3 вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда с последовательностью 5′-CGACGTGGTGGCACGGCG-3′ в концентрации 10 пмоль/мкл. Изобретение обеспечивает увеличение скорости действия бакуловирусных препаратов.

Способ повышения эффективности бакуловирусных препаратов, включающий использование полиэдров вируса ядерного полиэдроза, избирательно действующих на гусениц непарного шелкопряда, отличающийся тем, что предварительно проводят заражение насекомых вирусом ядерного полиэдроза, для чего в течение 2-х дней гусениц I-III возрастов кормят питательной средой, содержащей 10³-10⁴ полиэдров на 1 мг среды, через 2-5 дней после этого пульверизатором осуществляют наружную обработку насекомого водным раствором консервативного короткого 18 нуклеотидов длиной антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена IAP-3 вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда с последовательностью 5′-CGACGTGGTGGCACGGCG-3′ в концентрации 10 пмоль/мкл.