ШТАММ ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА LYMANTRIA DISPAR L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 1998 года по МПК C12N7/00 A01N63/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству биологических инсектицидов для лесного и сельского хозяйства на основе нового штамма вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), патогенного для личинок непарного шелкопряда (НШ), являющихся опасным вредителем лиственичных лесов.

ВЯП НШ может быть использован как активная основа энтомопатогенного препарата для подавления вспышек массового размножения непарного шелкопряда Lymantria dispar L. (Porthetria dispar). Применение подобного препарата является экономически и экологически оправдано, поскольку, во-первых, стоимость препарата, созданного на основе ВЯП НШ, в пересчете на обрабатываемую площадь оказывается ниже, чем стоимость используемых в настоящее время химических пестицидов; во-вторых, вызывая заболевание и гибель только личинок непарного шелкопряда, он не оказывает вредного воздействия на другие виды животных (насекомых и позвоночных).

Известен штамм S-13-p ВЯП Porthetria dispar, используемый для производства вирусного инсектицидного препарата против непарного шелкопряда Вирин-ЭНШ и полученный путем адаптации ВЯП ивовой волянки к НШ (Итоги и перспективы производства и применения вирусных препаратов в сельском и лесном хозяйстве. Сб. , М., 1984, с.3-14). Биологическая активность препарата, полученного на основе штамма S-13-p, для гусениц Porthetria dispar имеет ЛК₅₀ 4•10⁵ полиэдров на гусеницу.

Недостатком штамма S-13-p ВЯП является низкая вирулентность по отношению к непарному шелкопряду Porthetria dispar.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм ВЯП Porthetria dispar (Pd-1-5) ВКПМ virus-1, используемый для производства инсектицидного препарата против непарного шелкопряда (Авторское свидетельство СССР N 1638161, кл.C 12 N 7/00, опубл. 30.03.91). Биологическая активность препарата, полученного на основе штамма Pd-1-5, для гусениц Porthetria dispar имеет ЛК₅₀ 0,2•10⁵ полиэдров на гусеницу.

Недостатком штамма-прототипа Pd-1-5, также как и аналога, является низкая вирулентность по отношению к непарному шелкопряду Porthetria dispar.

Задачей предлагаемого изобретения является создание такого нового штамма ВЯП Lymantria dispar L. (Porthetria dispar) для производства инсектицидного препарата, который бы обладал большей вирулентностью по отношению к непарному шелкопряду по сравнению с аналогами.

Указанная задача решается путем получения нового штамма ВЯП НШ-2-85 (авторское название), который задепонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером Гкв N 2156.

Родословная штамма: штамм НШ-2-85 (ГКВ N 2156) получен путем перемежающих пассажей на гусеницах непарного шелкопряда различных популяций (оренбургской, московской, тюменской) вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда, выделенного из павших в инсектарии ГНЦ ВБ "Вектор" гусениц непарного шелкопряда вследствие спонтанного полиэдроза в 1985 году.

Стандартные условия культивирования: личинки непарного шелкопряда инкубируют при температуре 20^oC, влажности - 60%, фотопериоде - 16 часов. Состав искусственной питательной среды (ИПС): кормовые дрожжи 20 - 40 г, мука кукурузная 60 - 90 г, мука соевая 10 - 25 г, кислота аскорбиновая 3 - 5 г, агар-агар 5 - 7 г, метабен 1 г в 10 мл 96% спирта, формалин 10% - 4 мл, H₂O - до 500 мл.

Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования: штамм прошел 9 пассажей на гусеницах непарного шелкопряда при заражении перорально и интралимфально.

Чувствительность к химическим веществам: чувствителен к эфиру, формалину, хлорамину, хлороформу, дезоксихолату, не чувствителен к ацетону.

Физико-химические свойства: размеры полиэдров: 1,6 - 3,8 мкм; размеры вирионов 400•30 нм; количество нуклеокапсидов в пучке 4 - 5; ДНК кольцевая, ковалентнозамкнутая, мол.м. - 80 мегадальтон.

Рестрикционный анализ ДНК вируса: сайты рестрикции (количество) для Hind III - 14: Eco RI - 12: Bam HI - 11; Pst I - 30.

Белковый состав вируса: 28 полипептидов.

Биологическая активность: lgLD₅₀ - 2,6± 0,23 (4•10² полиэдров/мл); LT₅₀ - 7,5 суток (биологическая активность штамма оценивалась при инфицировании гусениц непарного шелкопряда третьего возраста оренбургской, тюменской и московской популяций).

Антигенные свойства штамма: преципитирующая активность антисыворотки с гомологичным вирусом методом двойной иммунодиффузии составляет 1/32.

Способ хранения: штамм хранится при -30^oC в виде очищенных и лиофильно высушенных при -20^oC полиэдров.

Круг хозяев: личинки непарного шелкопряда.

Патогенность для человека: непатогенен.

Пример 1. Технология получения вирусного инсектицидного препарата.

Технология производства вирусных препаратов осуществляется по следующей схеме: выращивание насекомых, культивирование в них вирусов, сбор погибших гусениц, выделение вирусной биомассы и получение готового продукта.

На чертеже представлена схема получения вирусного препарата.

Партию гусениц непарного шелкопряда по достижению ими четвертой возрастной стадии инфицируют вирусом ядерного полиэдроза (штамм НШ-2-85). Для этого искусственную питательную среду (корм) опрыскивают вирусной суспензией штамма НШ-2-85 (ГКВ N 2156) с титром 1-2•10⁷ полиэдров/мл и скармливают зараженный корм гусеницам НШ. Гусениц НШ содержат при 28±1^oC и влажности 65%. Время инкубирования инфицированных гусениц 11 - 12 дней. При этом гибель насекомых составляет не менее 75%. Затем личинки собирают и замораживают при минус 20^oC в течение 18 часов, лиофилизируют и переносят в аппарат для удаления волосков, являющихся сильным аллергеном. Аппарат представляет собой специальный барабан для стряхивания волосков, которые затем удаляют посредством вакуумной системы. Лишенные волосков лиофилизированные гусеницы размалывают для получения сухого вирусного порошка. В качестве наполнителя используют цеолит или кремниевую кислоту. Препарат в сухой форме представляет собой порошок белого цвета с титром не менее (2-5)•10⁹ полиэдров/г. Для получения жидкой формы препарата (в виде суспензии) перед применением сухой препарат растворяют в воде до нужной концентрации с добавлением поверхностно-активного вещества (ПАВ), например ОП-7. Титр жидкой формы препарата составляет не менее 1•10⁹ полиэдров/мл. Расход препарата при наземно-очаговой обработке составляет 1,1± 0,3 мл/га.

Пример 2. Исследование токсичности и патогенности вирусного препарата на основе штамма НШ-2-85 (ГКВ N 2156).

Проведена инфекционно-токсикологическая оценка препарата на основе штамма НШ-2-85 (ГКВ N 2156) в КНИИЭИБ Минздрава УССР (зав. лаборатории медицинской оценки вирусных инсектицидов, д.м.н., профессор В.Л.Васильева). Испытания безопасности для теплокровных выполнены в соответствии с "Методическими указаниями по оценке новых пестицидов. МЗ СССР, 1988 г" и рекомендациями ВОЗ/ФАО, Женева 1975 г. по испытанию безопасности бакуловирусов.

Проведены эксперименты по выявлению токсичности-патогенности препарата на мышах. 5 группам мышей по 10 в каждой вводили суспензию препарата в желудок и в брюшину из расчета по 1 мг препарата на 1 г веса, а в контрольной группе - внутрибрюшинно (физраствор).

Введение дозы 1000 мг на 1 кг веса не приводит к гибели животных при введении в желудок. Внутрибрюшинное введение вызывало гибель отдельных животных. При вскрытии обнаружены кремнийсодержащие конгломераты в месте введения и частично в брюшной полости. Гибель животных вызвана токсичным действием наполнителей. При внутрибрюшинном введении LD₅₀ находится за пределами 1500 мг/кг, что по гигиенической классификации токсичности пестицидов расценивается, как малотоксичное вещество (4 группа).

Кожно-резорбтивное действие изучалось на морских свинках при разовом и многократном воздействии препарата на основе штамма НШ-2-85, а также его действующего начала на неповрежденную и скарифицированную кожу. Однократное или многократное нанесение препарата на поврежденную кожу каких-либо заметных реакций на месте введения или в организме животных не вызывало. На скарифицированной коже однократное нанесение реакций не вызывало, а в процессе многократного воздействия отмечалось местное раздражение, которое исчезало через 2-3 дня после окончания воздействия.

Изучение раздражающего действия препарата на слизистую глаз кроликов показало, что однократное воздействие не вызывает раздражение слизистых, а многократное приводило к развитию конъюнктивитов. Выздоровление наступало через 5-7 дней после последнего воздействия.

Инфекционная оценка препарата проведена на теплокровных. Для осуществления экспериментов предварительно изготавливают специфические ингредиенты: гипериммунные кроличьи сыворотки против ВЯП НШ, выделяют LgG на их основе, разрабатывают и получают эритроцитарные диагностикумы для использования в иммунологических реакциях РПГА и РОПГА.

Эксперименты проводили на белых мышах 18 - 20 г, которым вводили суспензию полиэдров ВЯП НШ в желудок, внутрибрюшинно и интраназально по 0,2, 0,5 и 0,4•10⁹ полиэдров/мл соответственно. Контрольной группе вводили по 0,5 мл физраствора в брюшину. Животных термометрировали и в динамике исследовали сыворотку крови на наличие антител и антигена во внутренних органах животных.

Во всех случаях визуальные наблюдения и термометрия не выявили отклонений от физиологической нормы. С помощью РПГА в сыворотках крови выявляли антитела в невысоких титрах на 5, 7-9 дни при всех способах введения. У животных с помощью РОПГА выявляли специфический бакуловирусный антиген в постепенно убывающих количествах до 7 суток. Такая динамика подтверждает активную элиминацию антигена из организма и отсутствие репродуктивного процесса.

Таким образом, результаты исследования токсичности-патогенности вирусного препарата на основе штамма НШ-2-85 (ГКВ N 2156) показали, что препарат можно отнести к малотоксичным веществам по гигиенической классификации (LD₅₀ более 1000 мг/кг). Действующее начало препарата ВЯП НШ-2-85 не токсично для теплокровных, не репродуцируется в теплокровном организме, не вызывает инфекционного процесса.

Пример 3. Испытание опытных образцов вирусного препарата на основе штамма НШ-2-85 (ГКВ N 2156).

Испытания проведены на садах совхоза Люберецкий Киевской области и Бобровицкого МПП Черниговской области против непарного шелкопряда Lymantria dispar L. согласно методическим указаниям (Методические указания по применению вирусного препарата Вирин-НШ в защите сада от непарного шелкопряда. Киев, 1988 г. ). Препарат использовался с титром 5•10⁷ полиэдров/г в виде водного 0,1%-ного раствора с ПАВ ОП-7. Всего обработаны территории площадью 369,9 га. Расход препарата составил 1,0-1,5 г/га. Всего израсходовано препарата 460-470 г. Обработка проводилась при помощи моторного ранцевого опрыскивателя F-320.

Численность гусениц до обработки оценивалась в соответствии с методическими указаниями.

В процессе испытаний установлено: гибель насекомых наступала через 7-12 суток после обработки. При обследовании гусениц НШ через 10 суток обнаружено, что процент их гибели составляет 32,5%, а при последующем обследовании через 15 суток - 71,4%.

Биологическая эффективность препарата составляет 95,3 - 99,0%.

Препарат удобен для применения в производственных условиях с использованием любых существующих марок мелкодисперсных опрыскивателей, является экологически чистым и обладает избирательным действием к целевому насекомому - непарному шелкопряду Lymantria dispar L.

Пример 4. Сравнительные данные биологической активности заявляемого штамма НШ-2-85 и штаммов-аналогов.

Для получения сравнительных данных параллельно из разных партий гусениц, инфицированных разными штаммами вирусов, получают вирусный материал на основе известных штаммов S-13-p и Pd-1-5 и заявляемого штамма НШ-2-85.

Биологическую активность штаммов вирусов оценивают путем определения величины LD₅₀ - дозы вируса (полиэдров на гусеницу), вызывающей гибель 50% инфицированных насекомых, и LT₅₀ - время (в сутках), за которое погибает 50% гусениц, инфицированных дозой 10⁷ полиэдров/гусеницу (пэ/гус). Расчет проводят по методу Кербера, гибель насекомых определяют с поправкой по формуле Аббота (Ашмарин И.П., Воробьев А.А. //Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л. : Медгиз, 1962, с.350). Данные приведены в таблице (LT₅₀ по каждому штамму находится в интервале 7-8 суток) .

Анализ таблицы показывает, что заявляемый штамм НШ-2-85 позволяет получить вирусный инсектицидный препарат, который патогенен для гусениц НШ Lymantria dispar L. (Porthetria dispar), причем по своей активности на два порядка превышает инсектицид, полученный на основе известных штаммов S-13-p и Pd-1-5.

Промышленная применимость. Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, а именно к производству вирусных инсектицидных препаратов.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству биологических инсектицидов для лесного и сельского хозяйства на основе нового штамма вируса ядерного полиэдроза, патогенного для личинок непарного шелкопряда. Получен штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда (ВЯП НШ - 2 - 85 - авторское название) Lymantria dispard для производства инсектицидного препарата, который обладает большей вирулентностью по отношению к непарному шелкопряду в сравнении с известными аналогичными штаммами ВЯП S - 13 - р и Pd - 1 - 5. 1 ил., 1 табл.

Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar L. ГКВ N 2156, используемый для получения инсектицидного препарата.