СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ РИСКА ФОРМИРОВАНИЯ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ НЕМЕДЛЕННОГО ТИПА Российский патент 2016 года по МПК G01N33/48 G01N33/53 

Изобретение относится к аллергологии, иммунологии, лабораторной диагностике и касается способа выявления риска формирования гиперчувствительности немедленного типа.

Увеличение уровня заболеваемости инфекционной аллергией, обусловленной гиперчувствительностью к возбудителям инфекционных болезней (бактериям, вирусам, паразитическим грибкам) или продуктам их жизнедеятельности, остро ставит вопрос необходимости дифференцирования для выявления истинной реакции гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ). В настоящее время существует общепринятый способ диагностики и прогнозирования ГНТ по увеличению содержания иммуноглобулинов Е или реагинов в периферической венозной крови пациентов [Тотолян А.А. Иммуноглобулин Е: структура, продукция, биологические эффекты и диагностическое использование // Аллергология. - 1998. - №2. - С. 4-7; Методы диагностики в аллергологии и иммунологии / Е.Н. Медуницына, P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011].

Нужно отметить, что концентрации IgE являются самыми низкими, составляют всего 0,002% от общего содержания в крови иммуноглобулинов и могут оставаться невысокими при бронхиальной астме, атопическом дерматите, аллергическом риноконъюнктивите [Гущин И.С. Индукция и регуляция синтеза IgE // Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии 22-24 сентября 1998 г.: Сб. тр. - М., 1998. - С. 81-103; Добродеева Л.К., Сенькова Л.В., Репина В.П. и др. Физиологическая роль IgE // Вестник Уральской мед. акад. науки. - 2009. - №2-1. - С. 32; Добродеева Л.К. Содержание иммуноглобулина Е в сыворотке крови у людей, проживающих на Европейской территории России // Экология человека. - 2010. - №5. - С. 3-10].

Механизм патогенетического действия реагинов реализуется путем повторного связывания антигенов с фиксированными на мембранах тучных клеток и базофилов антителами IgE, вследствие чего происходит перекрестное сшивание FcεR1 рецепторов и выделение пресинтезированных вазоактивных медиаторов (гистамин, серотонин, простагландины и лейкотриены), ответственных за развитие ранней фазы атопической реакции [Гущин И.С. Иммуноглобулин Е мишень противоаллергического действия // Российский аллергологический журнал. - 2004. - №1. - С. 5-9; А.А. Тотолян, И.С. Фрейдлин Клетки иммунной системы. - Т. 4. Базофилы и тучные клетки. - 2001. - С-ПБ, Наука. - С. 266-269]. Однако концентрация IgE повышается не только при атопии, но и при инфицировании бактериями из семейства Streptococcaceae, Staphylococcus haemolyticus и Escherichia coli, в ряде случаев гиперглобулинемия регистрируется в условиях поливалентной бактериальной сенсибилизации [Аллергология и иммунология / под ред. P.M. Хаитова, Н.И. Ильиной. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009]. Активизация реагинового механизма происходит также при опухолевых новообразованиях наряду с повышением концентрации раково-эмбрионального антигена и интерлейкина-10 [Кривоногова О.В. Влияние раково-эмбрионального антигена на состояние иммунных реакций у практически здоровых людей: Автореф. дис… канд. биол. наук. - Архангельск. - 2011. - 18 с.], и хронических воспалительных процессах, что сопровождается увеличением сорбционной способности эпителия слизистых на фоне дефицита содержания IgA [Штаборов В.А. Соотношение общих и местных реакций иммунной защиты у жителей Севера: Автореф. дис… канд. биол. наук. - Архангельск. - 2009. - 16 с.].

Известен способ прогнозирования развития сочетанных форм атопического дерматита у детей при помощи выявления клинических и социальных факторов риска развития указанного заболевания [Патент РФ №2297796, опубл. 27.04.2007]. Всего в формуле предлагается учитывать 34 фактора риска путем присвоения им прогностических коэффициентов с последующим суммированием. Использование данного метода требует изучения многочисленных клинических показателей, проведения анкетирования с целью выявления социальных факторов риска развития атопического дерматита, разработку и внедрение компьютерной программы, что увеличивает временную и трудовую затратность. Предложенное нами изобретение использует лишь два иммунологических показателя, широко применяемых в стандартной клинико-лабораторной практике.

Известен способ прогнозирования аллергических реакций у детей раннего возраста [Патент РФ №2187817, опубл. 20.08.2002], заключающийся в том, что выделяют лейкоциты из пуповинной крови новорожденного, раздельно инкубируют с аллергеном домашней пыли и фактором активации тромбоцитов. В надосадочной жидкости с помощью жидкостной хроматографии выявляют лейкотриены, и при их обнаружении в пробе с аллергеном и/или при уровне лейкотриена Е4 более 3 нг/10⁷ лейкоцитов и лейкотриена В4 более 4 нг/10⁷ лейкоцитов в пробе с фактором активации тромбоцитов прогнозируют развитие аллергической патологии на первом году жизни. В отличие от указанного аналога предложенное нами изобретение можно применять не только среди детей раннего возраста, но и для остальных возрастных категорий обследуемых лиц. При реализации заявленного способа исключается период инкубации с аллергеном и фактором активации тромбоцитов, что сокращает пробоподготовку.

Поставленная цель достигается путем изучения содержания IgE и В-лимфоцитов CD23+ в периферической венозной крови обследуемых лиц. При содержании CD23+ более 0,6×10⁹ кл./л и низкой сывороточной концентрации IgE менее 30 МЕ/мл можно судить о риске формирования ГНТ. Способ позволяет выявить лиц, имеющих риск аллергологической патологии при профотборе для работы с вредными условиями труда, в том числе на химическом производстве, в условиях Арктики.

Заявленный способ осуществляется стандартно следующим образом. Кровь для исследования берется из локтевой вены в минимальном объеме (1 мл) до 10 часов утра, натощак. Количественное содержание IgE изучают в сыворотке крови при помощи иммуноферментного метода с применением диагностического набора для ИФА. Результаты реакции оцениваются на спектрофотометре с длиной волны 450 нм. Содержание В-лимфоцитов CD23+ определяют с помощью непрямой иммуннопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител на препаратах лимфоцитов типа «высушенной капли» производства НПЦ МедБиоСпектр г. Москва. Указанным способом в 2007 году были обследованы 30 человек, проходившие реабилитацию в медицинской компании «Биокор» г. Архангельска, в возрасте от 24 до 68 лет с установленным диагнозом основного заболевания по результатам исследования городских клиник г. Архангельска, где наблюдались пациенты. В ноябре 2013 года проведен ретроспективный анализ анамнеза жизни исследуемых людей за данный период. В качестве группы сравнения были взяты 100 практически здоровых людей г. Архангельска. Обследование проводили с соблюдением основных норм биомедицинской этики. Результаты обработаны с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0» («StatSoft», США). Тип исследования ретроспективный, выборки случайные, одномоментные. Генеральная совокупность - жители севера Европейской территории России. Достоверность различий между группами оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрического критерия U-Манна-Уитни. Статистическая достоверность присваивалась при значении p<0,05.

Проведенные нами исследования показали, что возрастание содержания IgE и необходимость его связывания клеточными рецепторами наиболее выражено при регистрации повышенных уровней экспрессии мембранной формы CD23 (выше 0,6×10⁹ кл./л) и составляет 92,3±29,5 МЕ/мл, что значительно выше по сравнению с контролем (58,2±12,5 МЕ/мл) и в 3,7 раза выше (25,2±7,6 МЕ/мл) по отношению к пониженным уровням лимфоцитов CD23+ (менее 0,2×10⁹ кл./л), p<0,05.

Молекула CD23 (FceRII) - низкоаффинный рецептор лектинового типа для IgE, появляется на зрелых активированных В-лимфоцитах, моноцитах, макрофагах и эозинофилах, играет важную роль в дифференцировке В-лимфоцитов [Диагностическое значение клеточной экспрессии низкоаффинного рецептора для IgE (FcεRII, CD23) при гемобластозах человека / Рамазанова P.M., Тупицын Н.Н., Шолохова Е.Н. и др. // Гематол. и трансфузиол. - 2003. - №1. - С. 6-10]. Особенным свойством этого белка является способность к аутопротеолитическому перевариванию, за счет которого рецептор распадается на растворимые фрагменты с молекулярной массой 37; 33; 25-27 и 12 kD, обладающие способностью (за исключением последнего) связывать IgE [Гущин И.С. Аллергия: аллергены, индукция и регуляция синтеза IgE // Патол. физиол. - 1999. - №1. - С. 24-32].

При продолжительной экспрессии mCD23 покидает мембрану В-лимфоцита и переходит в растворимое состояние. При этом растворимая форма sCD23 обладает цитокиноподобным действием, сохраняя способность к взаимодействию с IgE в плазме крови, а присутствие sCD23 в плазме крови или в среде инкубации активированных лимфоцитов ведет к повышению уровня синтеза IgE [Порядин Г.В. Салмаси Ж.М., Казимирский А.Н. Активационные маркеры лимфоцитов как показатели дизрегуляции иммунной системы при воспалении // Патол. физиология и эксперим. медицина. - 2006. - №1. - С. 2-7].

На увеличение содержания IgE также влияет IL-4, который является основным продуктом секреции Th2-клеток, в В-лимфоцитах IL-4 способствует переключению синтеза IgM на IgE [Coffman R.L., Ohara J., Bond M.W., et al. В cell stimulatory factor-1 enhances the IgE response of lipopolysaccharide-activated B cells // J. Immunol. - 1986. - Vol.136. - P. 4538-4541; Romagnani S. Regulation and deregulation of human IgE synthesis // Immunol. Today. - 1990. - Vol. 11. - P. 316-321]. Наши исследования доказывают факт увеличения уровня IL-4 наряду с повышением содержания реагинов, концентрации которых при пониженных уровнях IL-4 составляли 20,1±8,8 МЕ/мл, на фоне повышенных концентраций цитокина - 47,7±10,8 МЕ/мл (p<0,05). Максимальные значения mCD23 на фоне повышенных концентраций IL-4 (выше 20,0 пг/мл) встречались достоверно чаще, чем при значениях IL-4, не превышающих 1,7 пг/мл (p<0,05). Результаты исследований позволили установить взаимосвязь роста уровня экспрессии мембранной формы CD23 на поверхности зрелых В-лимфоцитов под влиянием IL-4 (p<0,05).

Частные примеры использования способа.

1. Пациентка Г., возраст 49 лет. Обратилась в МК «Биокор» в октябре 2007 года с диагнозом: миома матки. При комплексном лабораторном обследовании периферической венозной крови концентрация IgE в сыворотке крови составила 9,57 МЕ/мл, уровень содержания лимфоцитов CD23 - 0,73×10⁹ кл./л. Сделан вывод о риске формирования гиперчувствительности немедленного типа. Через 7 месяцев женщина повторно обратилась в МК «Биокор» с жалобами на кожный зуд и появление волдырей. При обследовании у пациентки была выявлена крапивница.

2. Пациентка В., возраст 46 лет. Обратилась в МК «Биокор» в июле 2007 года с диагнозом: хронический сальпингит. При комплексном лабораторном обследовании периферической венозной крови концентрация IgE в сыворотке крови составила 18,8 МЕ/мл, уровень содержания лимфоцитов CD23 - 0,84×10⁹ кл./л. Сделан вывод о риске формирования гиперчувствительности немедленного типа. Через год женщина повторно обратилась в МК «Биокор» с жалобами на кожный зуд и высыпания. При обследовании у пациентки был выявлен атопический дерматит.

3. Пациентка К., 68 лет. Обратилась в МК «Биокор» в мае 2007 года с диагнозом: фибробластома, дерматит. При комплексном лабораторном обследовании периферической венозной крови концентрация IgE в сыворотке крови составила 12 МЕ/мл, уровень содержания лимфоцитов CD23 - 0,16×10⁹ кл./л. Сделан вывод об отсутствии риска формирования гиперчувствительности немедленного типа, и назначено дополнительное исследование цитограммы, микрофлоры и иммунологических показателей кала на дисбактериоз. Назначена соответствующая иммунокорригирующая терапия.

Изобретение относится к медицинской аллергологии, иммунологии, медицинской лабораторной диагностике. Сущность способа состоит в том, что в периферической крови обследуемых лиц определяют концентрацию IgE и абсолютное содержание лимфоцитов СD23+. При содержании СD23+ более 0,6×10⁹ кл./л выявляют риск формирования гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ). Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность формирования гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ). 3 пр.

Способ выявления риска формирования гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ) у лиц с низкой сывороточной концентрацией IgE менее 30 МЕ/мл, отличающийся тем, что в периферической венозной крови дополнительно изучают абсолютное содержание лимфоцитов CD23+ и при уровне содержания CD23+ более 0,6×10⁹ кл./л свидетельствуют о риске формирования ГНТ.