Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и медицины.
Распространенным методом лечения ряда заболеваний в настоящее время является гормонотерапия - метод лечения, предполагающий воздействие с помощью гормонов или антигормонов.
Одним из хорошо исследованных и широко применяемых аналогов гонадотропин рилизинг-гормона, используемых для медикаментозной терапии, является Трипторелин (Triptorelin, Triptorelin pamoate, Triptorelin acetate) - противоопухолевый препарат, синтетический аналог гонадотропин-рилизинг гормона.
Трипторелин оказывает антигонадотропное, противоопухолевое, цитостатическое действие и используется при эндометриозе, миоме матки (для уменьшения размеров перед хирургическим удалением), в симптоматическом лечении прогрессирующего гормонозависимого рака предстательной железы (альтернатива хирургической кастрации, для подавления секреции тестостерона), раннем половом созревании, программе экстракорпорального оплодотворения, гипогонадотропной аменорее.
Для применения в медицине и для медико-биологических исследований необходимы гомогенные высокоочищенные препараты. Поэтому исследователи в данной области большое внимание уделяют разработке новых эффективных способов очистки гормональных препаратов.
Известен способ синтеза трипторелина, который описан в патенте US 4301066, опубл. 1981-11-17. Предпочтительный способ очистки согласно данному источнику включает следующие шаги. Декапептиды, полученные из реакции, обрабатывают раствором гидроксида аммония в водном метаноле и раствор выпаривают. Остаток помещают затем на колонку с силикагелем, используя раствор хлороформ-метанол-уксусная кислота в качестве элюанта. Очищенная фракция декапептидов подвергается другой хроматографии с использованием карбоксиметилцеллюлозы и буферного градиента водного ацетата аммония.
Заявка CN 103122023 А, 2013.05.29 описывает двустадийный метод очистки трипторелина. Метод включает в себя следующие шаги: растворение образца с использованием водного раствора, содержащего органические растворители, и проведение градиентного элюирования на образец, используя октадецилсилан химически связанного кремнезема в качестве неподвижной фазы, в качестве буфера солей фосфорной кислоты или серной кислоты в качестве фазы А, с ацетонитрилом в качестве фазы В; затем преобразование трипторелин фосфатов в ацетаты с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) и сублимационную сушку полученных ацетатов, так что трипторелин ацетат с чистотой более чем 99,7%. Способ обеспечивает процесс очистки с низкой себестоимостью, высоким выходом, простой в технологическом процессе, уменьшением примесей.
В качестве ближайшего аналога может быть указан патент CN 103012564 В, 2013.11.13, который касается высокоочищенного трипторелина и способа его очистки. Способ включает следующие шаги: (а) растворение трипторелина, фильтрацию; (b) загрузку фильтрата на ионообменную колонку, элюирование с подвижной фазой, преобразование трипторелина в соль и сбор основного пика элюата; (с) нагрузку элюата, полученного на этапе (b), на колонку из силикагеля, элюирование с подвижной фазой, собирая основной пик элюата, и удаление растворителя. Метод имеет высокий выход, стабильное качество продукции и низкую себестоимость.
Задача изобретения состоит в разработке нового оптимизированного способа очистки трипторелина.
Задача решается способом очистки трипторелина, включающим растворение трипторелина в 0,5-2% водном растворе уксусной кислоты, фильтрование методом ультрафильтрации, добавление к раствору изопропилового спирта до концентрации 2% по объему и перемешивания, проведение жидкостной хроматографии низкого давления на колонке с сферическим полистиролом, сшитым дивинилбензолом типа LPS-500, используя элюирование водным раствором изопропилового спирта (ИПС) и уксусной кислоты (УК) в градиенте концентраций от 2-7% ИПС+0,2-2% УК до 8-15% ИПС+0, 2-2% УК с последующей изократикой водным раствором, содержащим 8-15% ИПС+0, 2-2%УК, проведение ионообменной хроматографии на колонне с сульфоэтильными группами на сшитом полиакрилате марки СПС-Био SP Сульфопропил (SPS-bio) с размером частиц 75 мкм, используя градиентное элюирование: линейный градиент 0 до 0,8М ацетата аммония за 3 объема колонки, далее изократика 0,8М ацетатом аммония, проводят высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке с обращенно-фазным сорбентом на основе силикагеля с частицами сферической формы и размером 5 мкм типа Kromasil С18, используя в качестве элюента водный раствор, содержащий 2-7% ИПС и 0, 2-2% УК, полученные фракции очищенного продукта с содержанием трипторелина более 98% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором, содержащим смесь изопропилового спирта и уксусной кислоты, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием.
Технический результат: получение желаемого конечного продукта с высокими выходами, селективностью и степенью чистоты.
Способ осуществляют следующим образом.
1. Растворение и фильтрование трипторелина-сырца
Готовят раствор «0,6% уксусной кислоты (УК)».
Растворяют трипторелин-сырец в «0,6% УК» из расчета 1,0 л на 100 г трипторелина-сырца.
В ходе растворения следует периодически измерять с помощью индикаторной бумаги рН раствора сырца. В случае если значение рН выше 5, следует понизить его, добавляя уксусную кислоту.
Образовавшийся в результате раствор фильтруют через стеклянный фильтр пор. 3. Закрытую емкость с отфильтрованным раствором убирают в холодильник на ночь.
Если после фильтрации и отстаивания в растворе образовался осадок, раствор подвергают осветлению на установке проточной ультрафильтрации «Pellicon» с мембранами 100 кДа.
К отфильтрованному раствору добавляют изопропиловый спирт (ИПС) до концентрации 2% по объему и тщательно перемешивают.
2. Предварительная очистка трипторелина-сырца с помощью жидкостной хроматографии низкого давления ЖХ НД на колонне с LPS-500
Уравновешивание колонны
Уравновешивают колонну с сорбентом LPS-500 до стабилизации базовой линии «2,0% ИПС и 0,6% УК».
Наносят раствор трипторелина-сырца на колонну с LPS-500 из расчета 20-70 г трипторелина-сырца на 1 л упакованного сорбента.
Элюция трипторелина с колонны LPS-500.
Линейный градиент 4% ИПС+0,25% УК до 10% ИПС+0,25% УК за 3 объемов колонки, далее изократика 10% ИПС+0,25% УК.
Объединенные фракции после предварительной очистки на LPS-500 подвергают дальнейшей очистке с помощью ионообменной хроматографии на колонне, упакованной полиакрильным сорбентом СПС-Био SP Сульфопропил (Сульфопропильные группы на сшитом полиакрилате).
3. Ионообменная хроматография низкого давления на колонне упакованной СПС-био
Уравновешивают колонну с сорбентом СПС-Био SP Сульфопропил до стабилизации рН раствором «0,6% УК».
Наносят «раствор после предварительной очистки на LPS-500» на колонну с СПС-Био SP Сульфопропил из расчета 20-30 г трипторелина на 1 л упакованного сорбента.
Элюция трипторелина с колонны СПС-Био SP Сульфопропил.
Линейный градиент 0 до 0,8М ацетата аммония за 3 объема колонки, далее изократика 0,8М ацетатом аммония
Объединенные фракции после очистки на СПС-Био SP Сульфопропил подвергают дальнейшей очистке с помощью обращенно-фазовой хроматографии на колонне Kromasil С18.
4. Очистка трипторелина с помощью ВЭЖХ на колонне с Kromasil
Уравновешивание колонны.
Уравновешивают колонну с сорбентом Kromasil С18 до стабилизации базовой линии раствором «3% ИПС+0,25% УК».
К «раствору после очистки на СПС-Био SP Сульфопропил» добавляют до 3% ИПС и подкисляют уксусной кислотой до рН=5.
Загружают полученный раствор на колонну с Kromasil С18 из расчета 4-7 г трипторелина на 1 л упакованного сорбента.
Элюируют трипторелин с колонны Kromasil «5% ИПС+0,25% УК».
Дополнительно, после осуществления ВЭЖХ полученные фракции очищенного продукта с содержанием трипторелина более 98% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором изопропилового спирта, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием.
Ниже приведен конкретный пример осуществления очистки.
850 г трипторелина-сырца (чистота 18% по ВЭЖХ), полученного в результате пептидного синтеза трипторелина, содержащего 150 г целевого пептида перемешивают в 10 л 0,6% раствора уксусной кислоты в течение 8 часов и оставляют на 8 часов для отстаивания.
Осадок отделяют на целлюлозном фильтре 0,2 мкм и промывают 0,5 л 0,6% раствором уксусной кислоты. К фильтрату добавляют изопропиловый спирт до концентрации 2% и наносят на колонну 200X500 мм, заполненную сополимером стирола с дивинилбензолом марки LPS-500 с размером частиц 75 мкм, предварительно уравновешенную раствором 2% ИПС+0,6%УК. Проводят градиентное элюирование: Линейный градиент 4% ИПС+0,25% УК до 10% ИПС+0,25% УК за 3 объема колонки, далее изократика 10% ИПС+0,25% УК. Собирают фракции с чистотой трипторелина по хроматограмме не менее 40%. Выход трипторелина на стадии предварительной очистки составляет 85%.
Полученный раствор полупродукта подвергают ионообменной хроматографии на колонне 150×300 мм, упакованной СПС-Био SP Сульфопропил с размером частиц 75 мкм, предварительно уравновешенную 0,6% водным раствором уксусной кислоты. Проводят градиентное элюирование: линейный градиент 0 до 0,8М ацетата аммония за 3 объема колонки, далее изократика 0,8М ацетатом аммония. Собирают фракции с чистотой трипторелина по хроматограмме не менее 60%. Выход трипторелина на стадии ионообменной хроматографии составляет 95%.
Полученный раствор полупродукта подвергают ВЭЖХ. Раствор наносят порциями по 2,5-3 л (со скоростью 200 мл/мин) на стальную колонну аксиального сжатия диаметром 100 мм и высотой 300 мм, заполненную обращенно-фазным сорбентом Kromasil С18 10 мкм 100А и уравновешенную буфером, представляющим собой водный раствор, содержащий 3% изопропилового спирта и 0,25% уксусной кислоты. Элюируют трипторелин водным раствором, содержащим 5% ИПС+0,25% УК, затем регенерируют сорбент водным раствором, содержащим 15% ИПС+0,25% УК и уравновешивают водным раствором, содержащим 3% ИПС+0,25% УК. Скорость элюирования 200 мл/мин. Детектирование ведут по УФ поглощению при 254 нм. Фракции собирают объемом не более 1 л. Чистоту фракций контролируют по аналитической ВЭЖХ.
Фракции с содержанием трипторелина более 98% объединяют, упаривают на роторном испарителе в 2 раза и концентрируют на колонке с гидрофобным сорбентом, элюируя смесью 25% ИПС+0,25% УК. Элюат собирают и упаривают на роторном испарителе и лиофильно высушивают. Получают 104 г лиофильно высушенного продукта.
Степень очистки более 99,8%.
Биодоступность при в/м введении - 45,8%, при и/к - 76%. В интервале месяц повторные инъекции не вызывают повышения концентрации. Распределение по органам и тканям заканчивается через 4 ч, объем распределения - 104 л. Т1/2 - 7.6 ч. Плазменный клиренс - 161.5 мл/мин, двухфазный.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ ОЧИСТКИ ГОЗЕРЕЛИНА | 2015 |
|
RU2578414C1 |
СПОСОБ ОЧИСТКИ ДЕСМОПРЕССИНА (ВАРИАНТЫ) | 2015 |
|
RU2581019C1 |
СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ БУСЕРЕЛИНА | 2007 |
|
RU2332248C1 |
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОЧИСТКИ ЭРЕМОМИЦИНА | 2006 |
|
RU2333963C1 |
СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ СРОКА ЭКСПЛУАТАЦИИ СОРБЕНТА ПРИ ПРОМЫШЛЕННОЙ ОЧИСТКЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА | 2008 |
|
RU2383624C2 |
Способ очистки человеческого @ -интерферона | 1983 |
|
SU1523046A3 |
СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ ОКТРЕОТИДА | 2010 |
|
RU2441018C1 |
СПОСОБ ОЧИСТКИ СВИНОГО ИНСУЛИНА И ИНСУЛИНА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | 1994 |
|
RU2057542C1 |
СПОСОБ ОЧИСТКИ АЗАЦИКЛОГЕКСАПЕПТИДА ИЛИ ЕГО СОЛИ | 2011 |
|
RU2528635C2 |
СПОСОБ ОЧИСТКИ ИНСУЛИНА И/ИЛИ ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ | 1991 |
|
RU2037500C1 |
Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и медицины. Способ очистки трипторелина, заключающийся в том, что растворяют трипторелин в 0,6% водном растворе уксусной кислоты, фильтруют методом ультрафильтрации, к раствору добавляют изопропиловый спирт до концентрации 2% по объему и перемешивают, проводят жидкостную хроматографию низкого давления на колонке с сферическим полистиролом, сшитым дивинилбензолом типа LPS-500, используя градиентное элюирование водным раствором изопропилового спирта (ИПС) и уксусной кислоты (УК), затем полученный раствор полупродукта подвергают ионообменной хроматографии на колонне с сульфоэтильными группами на сшитом полиакрилате марки типа СПС-Био SP Сульфопропил (SPS-bio) с размером частиц 75 мкм, используя градиентное элюирование, проводят высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке с обращенно-фазным сорбентом на основе силикагеля с частицами сферической формы и размером 5 мкм типа Kromasil С18, используя в качестве элюента водный раствор, содержащий 5% ИПС и 0,25% УК, полученные фракции очищенного продукта с содержанием трипторелина более 98% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором, содержащим смесь изопропилового спирта и уксусной кислоты, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием. Техническим результатом является высокий выход и чистота субстанции, которая имеет высокую биодоступность и может использоваться для получения медицинских препаратов.
Способ очистки трипторелина, включающий растворение трипторелина, фильтрование и хроматографическую очистку, отличающийся тем, что трипторелин растворяют в 0,5-2% водном растворе уксусной кислоты, после фильтрования методом ультрафильтрации к раствору добавляют изопропиловый спирт до концентрации 2% по объему и перемешивают, проводят жидкостную хроматографию низкого давления на колонке с сорбентом, представляющим собой сферический полистирол, сшитый дивинилбензолом марки LPS-500, используя элюирование водным раствором изопропилового спирта (ИПС) и уксусной кислоты (УК) в градиенте концентраций от 2-7% ИПС+0, 2-2% УК до 8-15% ИПС+0,2-2% УК с последующей изократикой водным раствором, содержащим 8-15% ИПС+0,2-2% УК, затем полученный раствор полупродукта подвергают ионообменной хроматографии на колонне с сульфопропильными группами на сшитом полиакрилате марки типа СПС-Био SP Сульфопропил (SPS-bio) с размером частиц 75 мкм, используя градиентное элюирование: линейный градиент 0 до 0,8М ацетата аммония за 3 объема колонки, далее изократика 0,8М ацетатом аммония, проводят высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке с обращенно-фазным сорбентом на основе силикагеля с частицами сферической формы и размером 5 мкм типа Kromasil С18, используя в качестве элюента водный раствор, содержащий 2-7% ИПС и 0,2-2% УК, полученные фракции очищенного продукта с содержанием трипторелина более 98% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором, содержащим смесь изопропилового спирта и уксусной кислоты, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием.
CN 103012564 A, 29.05.2013 | |||
US 0004301066 A1, 17.11.1981 | |||
CN 103122023 A, 29.05.2013. |
Авторы
Даты
2016-05-27—Публикация
2015-03-26—Подача