СПОСОБ СНИЖЕНИЯ НЕФРОТОКСИЧНОСТИ МОЛИБДАТА АММОНИЯ Российский патент 2016 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании механизмов токсического действия молибдата аммония на функциональное состояние почек.

Молибден является эссенциальным микроэлементом, участвующим в различных физиологических процессах организма, однако его поступление в токсических дозах вызывает различные патологические состояния (Авцин А.П., Левина Э.Н., 1991; Израэльсон З.И., 1963; FairhallL. etal., 1963). Молибден имеет особенность накапливаться в различных растениях, чем создает условия для его попадания в организм животных и человека в количествах, превышающих суточную потребность человека. Избыточное поступление молибдена в организм приводит к молибденовой интоксикации, при которой поражаются различные органы и системы.

Известны различные детоксиканты, способные выводить тяжелые металлы из организма. К ним относятся тиоловые соединения - унитиол, сукцимер, тиосульфат натрия, различные комплексоны - пентацин, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, дефероксамин, α-пеницилламин и др. (Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т. 2. - Харьков "Торсинг", 1998. С. 212-220). Однако наряду с терапевтическим эффектом они могут вызывать различные побочные эффекты: расстройства ЖКТ, аллергические реакции, лейкопению, тромбоцитопению и др. Также наряду с токсинами они способны выводить из организма микроэлементы и такие жизненно важные ионы, как железо, кальций и др., и вызывать нарушение обменных процессов, что затрудняет их длительное и профилактическое применение.

Длительные клинические и экспериментальные исследования указывают на взаимодействие между некоторыми тяжелыми металлами и кальцием. Эти взаимодействия осуществляются на клеточном и молекулярном уровнях, где металл способен замещать кальций, вытеснять его из специфических мест связывания с лигандами, а также нарушать его пассивный транспорт [Peraza M.A., Ayala-FierroF., Barber D.S., Casarez E., Rael L.T. Effectsofmicronutrientsonmetaltoxicity./EnvironmentalHealthPerspectiver. - February, 1998. - Vol. 106. - Supplement 1]. B условиях истощения запасов кальция отмечается активация трансмембранного переноса металлов [Стародумов В.Л. Дефицит нутриентов как возможное условие развития интоксикации, вызванной воздействием малых доз свинца / Гигиена и санитария. - 2003. - №3. - С. 60-62].

В эксперименте на крысах показано, что на фоне интоксикации экспериментальных животных ацетатом свинца и сульфатом кадмия применение кальция способствует снижению всасывания, накоплению металлов в организме и уменьшает нефротоксическое действие на почки (Ахполова В.О. 2012; Хадарцева М.П. 2012).

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ профилактики токсического действия молибдена у экспериментальных животных при хроническом отравлении, включающий применение сорбента - цеолит ирлит-1 в виде 6% взвези (Патент RU 2410767, опубликованный 27.01.2011, заявка 20091392947/14 от 23.10.2009, G09B 39/00, МПК A61K 35/02, А61Р 39/00, авторы Албегова Ж.К., Брин В.Б.). В данном способе применяется природный сорбент «цеолит ирлит-1» в суточной дозе 2,5% массы. Препарат вводят через зонд в желудок.

Недостатком данного способа является не только нарушение всасывание молибдена, но и многих необходимых организму веществ, что ухудшает общие биохимические характеристики крови, нарушается обмен веществ.

Наиболее простой и доступный метод профилактики и лечения хронической интоксикации состоит в использовании гиперкальциемии.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа уменьшения нефротоксичности молибдата аммония у экспериментальных животных.

Решение этой задачи обеспечивает снижение токсического действия молибдена при хроническом отравлении у экспериментальных животных путем создания экспериментальной гиперкальциемии, оказывающей протекторную роль.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение - способ уменьшения нефротоксичности молибдата аммония включает: введение молибдата аммония на фоне экспериментальной гиперкальциемии. Для создания гиперкальциемии используют 10% раствор хлорида кальция в количестве 0,15 мл на 100 г массы тела животного в течение 20 дней. Раствор молибдата аммония вводят внутрижелудочно в дозировке 50 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 30 дней.

Введение молибдата аммония на фоне экспериментальной гиперкальциемии приводит к снижению проявлений токсической нефропатии. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа уменьшения нефротоксичности молибдата аммония, включающего введение молибдата аммония на фоне экспериментальной гиперкальциемии, в качестве препарата, вызывающего гиперкальциемию, применяют 10% раствор хлорида кальция, молибдат аммония вводят в дозе 50 мг/кг, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе уменьшения токсического действия молибдена, путем снижения токсического действия тяжелого металла при хроническом отравлении, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Между признаками заявляемого способа и результатом существует причинно-следственная связь: введение 10% раствора хлорида кальция в количестве 0,15 мл на 100 г массы тела животного в течение 20 дней, после чего одновременно через зонд в желудок вводят раствор молибдата аммония в течение 30 дней, что приводит к снижению его концентрации в организме и уменьшению выраженности молибденовой нефропатии.

Данный способ осуществляется следующим образом.

С целью создания экспериментальной гиперкальциемии в желудок через атравматичный зонд вводят раствор хлорида кальция в количестве 0,15 мл на 100 г массы крысы, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Предлагаемые дозы хлорида кальция вызывают повышение уровня кальция в крови интактных животных до 2,78±0,036 ммоль/л (фоновые значения - 2,16±0,041). Для получения токсического вещества молибдат аммония растворяют в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 25 мг молибдена (в пересчете на металл). Раствор молибдата аммония вводят внутрижелудочно в дозировке 50 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 30 дней двум группам животных (№1, №2), причем группе №2 каждый день внутрижелудочно через атравматичный зонд одновременно вводят раствор хлорида кальция в дозе 0,15 мл на 100 г в течение 20 дней, а в последующие 30 дней этот же препарат вводят предварительно за 1 час до введения металла.

По истечении времени эксперимента исследуют функциональное состояние почек, что включает определение диуреза (мл/час/100 г), клубочковой фильтрации (мл/час/100 г), канальцевой реабсорбции воды (%), экскреции натрия, калия, кальция, белка. Крысы забивались с использованием тиопентала. Полученные результаты в группе №2 сравнивают с контролем (группа №1) и фоновыми показателями интактной группы.

Для гистологических исследований образцы тканей (почки) фиксируют в 10% нейтральном формалине, после чего подвергают заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 4-5 микрон. Срезы окрашиваются гематоксилином и эозином. Изучение срезов и фотографии получены при помощи микроскопа PrimoStarzeizzc цифровой камеры AxioCamERc 5s.

Сущность способа подтверждается результатами гистологического исследования, где на Фиг. - 1 в опытной группе №1 с изолированным введением металла отмечается расширение мочевых пространств (а), сморщивание клубочка (б). А также гиалиново-капельная дистрофия (в) и некроз эпителия почечных канальцев (в).

На Фиг. - 2 морфологическое исследование почек в группе №2 выявляет относительную сохранность ткани клубочка (а), хотя отмечается дистрофия эпителия почечных канальцев (б). Некротические изменения в канальцевом аппарате отсутствуют.

Пример. Исследования проведены на крысах самцах линии Вистар массой 200-250 г, разделенных на 4 группы: 1-я группа - интактные животные; 2-я группа - животные с внутрижелудочным введением 10% раствора хлорида кальция в количестве 0,15 мл на 100 г массы тела в течение 30 дней; 3-я группа - животные с внутрижелудочным введением молибдата аммония в дозе 50 мг/кг каждый день в течение месяца; 4-я группа - животные с хронической молибденовой интоксикацией в сочетании с внутрижелудочным введением хлорида кальция в течение 1,5 месяца. Выбранная доза молибдата аммония соответствовала эффективной дозе, применяемой ранее для моделирования токсической молибденовой нефропатии. По окончании эксперимента исследовали функциональное состояние почек в условиях 6-часового спонтанного диуреза, что включало в себя определение: объема диуреза, скорости клубочковой фильтрации по клиренсу эндогенного креатинина, канальцевой реабсорбции воды, экскреции с мочой ионов натрия, калия и кальция, экскреции белка с мочой, осмолярности мочи.

Содержание Na и K в моче и плазме определяли методом пламенной фотометрии, с помощью пламенного анализатора жидкостей ПФА-378, концентрацию кальция, креатинина, белка определяли спектрофотометрически (PV 1251С) с помощью наборов "Кальций-Арсеназо-Агат", "Креатинин-Агат", ООО "Агат-Мед" (г. Москва, Россия.) Результаты обработаны статистически с применением t-критерия Стьюдента с использованием программы Prism 5.0 и Excel.

При внутрижелудочном введении молибдата аммония экспериментальным животным в дозе 50 мг/кг уже через 2 недели выявлялось увеличение объема 6 часового спонтанного диуреза (V), связанное со снижением относительной канальцевой реабсорбции воды (R_H2O). К концу эксперимента уровень диуреза был еще выше, вследствие более значительного падения канальцевой реабсорбции воды, несмотря на уменьшение скорости клубочковой фильтрации (F) (р<0,05), наблюдалась заметная протеинурия (табл. 1).

Изучение ионовыделительной функции почек выявило увеличение экскреции натрия с мочой относительно фона при снижении канальцевой реабсорбции катиона, несмотря на то, что выявлялось уменьшение фильтрационного заряда вследствие снижения скорости клубочковой фильтрации.

Экскреция калия повышалась вследствие увеличения фильтрационного заряда катиона, что было обусловлено достоверным ростом его концентрации в плазме крови.

Уровень экскреции кальция также повышался из-за уменьшения его канальцевой реабсорбции, а фильтрационный заряд катиона оставался в пределах показателей интактных животных. При этом кальциурез сопровождался гиперкальциемией, что вероятно в условиях неизменного уровня поступления в организм экспериментальных животных кальция с пищей можно объяснить пополнением кальция из костной ткани (табл. 2).

Таблица 2 Влияние молибдена на почечную обработку натрия, калия и кальция у крыс в условиях спонтанного диуреза при гиперкальциемии Процессы почечной обработки электролитов Стат. показат. Фон Молибдат аммония CaCl₂ Молибдат+CaCl₂ E_Na, мкмоль/час/100 г M±m 8.55±0.34 9.94±0.403* 8.64±0.46 9.86±0.53* F_Na, мкмоль/час/100 г M±m 2440.82±98.38 1983.27±99.36* 2475.21±72.22 2486.59±102.35** R_Na, % M±m 99.65±0.031 99.499±0.041* 99.62±0.027 99.60±0.042** E_K, мкмоль/час/100 г M±m 5.32±0.273 6.13±0.261* 5.36±0.403 5.32±0.330* F_K, мкмоль/час/100 г M±m 78.41±2.49 85.18±3.52 79.26±2.11 83.10±3.14 E_Ca, мкмоль/час/100 г M±m 0.153±0.0044 0.199±0.0072* 0.165±0.0034* 0.218±0.015** F_Ca, мкмоль/час/100 г M±m 25.66±0.84 23.51±0.97 27.63±0.72*^/** 29.03±0.87*^/** R_Ca, % M±m 99.392±0.042 99.153±0.059* 99,34±0,031 99.276±0.052 Примечание: (*) - достоверное (р≤0.05) изменение по сравнению с фоном; (**) - достоверное (р≤0.05) изменение по сравнению с изолированным введением молибдена; E_Na - экскреция Na; F_Na - фильтрационный заряд Na; R_Na - относительная канальцевая реабсорбция Na; F_K - фильтрационный заряд калия; E_K - экскреция калия; F_Ca - фильтрационный заряд кальция; E_Ca - экскреция кальция; R_Ca - канальцевая реабсорбция кальция.

Экспериментальная гиперкальциемия, полученная у крыс путем внутрижелудочного введения раствора хлорида кальция в течение 30 дней (контрольная группа №2), не вызывала достоверных изменений основных процессов мочеобразования, хотя имелась тенденция к увеличению объема спонтанного 6-часового диуреза (табл. 1). Скорость клубочковой фильтрации и канальцевая реабсорбция воды были на фоновом уровне. Электролитовыделительная функция почек животных также оставалась в пределах показателей интактных крыс, за исключением изменения почечной обработки кальция, в результате чего отмечалось усиление выведения кальция с мочой вследствие увеличения фильтрационного заряда катиона (табл. 2).

В сочетанной модели, с параллельным введением тяжелого металла и хлорида кальция, полиурия была выше, чем в группе животных, получавших молибдат аммония изолированно. В этом случае повышение диуреза было обусловлено угнетением канальцевой реабсорбции воды (р<0,05) (Табл. 1).

При совместном введении металла и хлорида кальция экскреция натрия была выше фоновых значений, но в тоже время была ниже, чем в группе животных, получавших только металл. Фильтрационный заряд элемента при этом не отличался от показателей интактных крыс. В плазме крови уровень натрия был в пределах показателей фоновых животных.

Почечная обработка калия у группы крыс, получавших хлорид кальция, мало изменялась по отношению к показателям контрольной группы. У группы животных с молибденовой интоксикацией экскреция катиона увеличивалась, что связано с ростом его фильтрационного заряда. В сочетанной модели почечная обработка калия не отличалась от фоновых значений.

Изолированное введение молибдата аммония интактным животным повысило экскрецию кальция с мочой (р<0,05) в результате снижения канальцевой реабсорбции (р<0,05), фильтрационный заряд катиона при этом оставался в пределах показателей фоновых значений. В сочетанной модели отмечалась тенденция к еще большему увеличению экскреции. В плазме крови уровень кальция относительно фона был повышен.

В этой группе крыс также наблюдалась протеинурия, хотя она была менее выражена, чем при изолированном введении металла.

Таким образом избыточное поступление молибдена в организм в течение месяца вызывает у крыс развитие нефропатии с нарушениями гистологической структуры почек, водо- и ионовыделительной функции почек. Экспериментальная модель гиперкальциемии смягчает выраженность морфологических и нефротических эффектов молибденовой интоксикации, оказывает благоприятное влияние на сохранность основных показателей функционального состояния и концентрирующей способности почек, что может свидетельствовать о наличии взаимоконкурентных отношений кальция с молибденом.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной биологии, экологии, токсикологии, и может быть использовано при исследовании механизмов токсического действия молибдата аммония на функциональное состояние почек. Для этого экспериментальным животным 1 раз в сутки ежедневно внутрижелудочно вводят 10% хлорид кальция в количестве 0,15 мл/100 г в течение 50 дней. При этом, начиная с 20 дня от начала эксперимента, животным через час после введения кальцийсодержащего раствора интрагастрально вводят молибдат аммония в дозировке 50 мг/кг в пересчете на металл в течение 30 дней. Способ обеспечивает создание такого уровня гиперкальциемии в организме, который оказывает благоприятное влияние на сохранность функционального состояния почек в условиях молибденовой интоксикации. 1 пр., 2 табл., 2 ил.

Способ снижения нефротоксичности молибдата аммония у экспериментальных животных при хроническом отравлении, отличающийся тем, что животным 1 раз в сутки ежедневно внутрижелудочно вводят 10% хлорид кальция в количестве 0,15 мл/100 г в течение 50 дней, а начиная с 20 дня от начала эксперимента животным через час после введения кальцийсодержащего раствора интрагастрально вводят молибдат аммония в дозировке 50 мг/кг в пересчете на металл в течение 30 дней.