СПОСОБ УМЕНЬШЕНИЯ НЕФРОТОКСИЧНОСТИ АЦЕТАТА СВИНЦА Российский патент 2012 года по МПК G09B23/28 A61K33/06 A61P39/00 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании механизмов токсического действия ацетата свинца на функциональное состояние почек.

Избыточное поступление металлов в организм человека неблагоприятно сказывается на его здоровье. Особую опасность представляет свинец, который в значительных количествах из разных источников попадает в среду обитания человека, концентрируется в почве и водоемах и по цепи вода - почва - растения - животные попадает в продукты питания в количествах, значительно превосходящих его естественное содержание [Маганова Н.Б. Изучение мутагенных свойств свинца, поступающего в организм животных в биотрансформированной форме. //Вопросы питания. - 1987. - №2. - С 53-55].

В настоящее время довольно хорошо изучены патогенетические механизмы токсического действия ксенобиотика: нарушение кальциевого гомеостазиса, усиление ПОЛ и изменение активности клеточных органелл [Аксенова М.Е. Тяжелые металлы: механизмы нефротоксичности. / Нефрология и диализ. - 2000. - 1.2. - №1-2]. Являясь конкурентным биометаллом по отношению к кальцию, свинец способен вытеснять его из специфических мест связывания с лигандами, а также нарушать его пассивный транспорт. Выяснено, что для проникновения в кровь и клетки организма свинец использует кальциевую транспортную систему: кальциевые каналы, кальцийсвязывающие белки и кальциевые насосы. В условиях истощения запасов кальция отмечается активация трансмембранного переноса свинца [Стародумов В.Л. Дефицит нутриентов как возможное условие развития интоксикации, вызванной воздействием малых доз свинца. / Гигиена и санитария. - 2003. - №3. - С.60-62].

Наиболее близким к заявляемому является способ, описанный в статье: Суханов Б.П., Королев А.А., Марнинчик А.Н., Мерзлякова Н.М. Экспериментальное изучение протекторной роли кальция при свинцовой интоксикации. / Гигиена и санитария. - 1990. - №3. - С.47-49, - взятый нами за прототип, заключающийся в том, что животным ежедневно вводят ацетат свинца в дозировке 200 мг/кг через зонд в желудок перед кормлением пищей с высоким содержанием кальция (1600 мг %) за счет дополнительного введения костного препарата. Продолжительность эксперимента - 2 недели.

Недостатком данного способа является то, что кальций, применяемый с профилактической целью, добавляется к рациону всех опытных животных и в связи с этим трудно определить количество микроэлемента, которое потребляется каждой отдельной особью. Кроме того, дозировка ацетата свинца превосходит количество, предложенное для создания модели свинцовой интоксикации (Патент 2358327 С1, опубл. 10.06.2009, Бюл.16, заявка 2008108864/14 от 06.03.2008, МКИ G09B 23/28, авторы: Митциев А.К., Брин В.Б.).

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа уменьшения нефротоксичности ацетата свинца.

Решение этой задачи обеспечивает снижение токсического действия ацетата свинца при хроническом отравлении путем создания экспериментальной гиперкальциемии, оказывающей протекторную роль.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение - способ уменьшения нефротоксичности ацетата свинца - имеет следующие существенные признаки: введение ацетата свинца и кальцийсодержащего вещества, в качестве кальцийсодержащего вещества используют 10% раствор хлорида кальция, вводимый животным 1 раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозировке 0,3 мл на 200 г в течение 20 дней, а через 4 дня от начала эксперимента животным одновременно вводят подкожно ацетат свинца в дозировке 40 мг/кг, в пересчете на металл, в течение 16 дней.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что в качестве кальцийсодержащего вещества используют 10% раствор хлорида кальция, вводимый животным 1 раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозировке 0,3 мл на 200 г в течение 20 дней, а через 4 дня от начала эксперимента животным одновременно вводят подкожно ацетат свинца в дозировке 40 мг/кг, в пересчете на металл, в течение 16 дней.

Введение ацетата свинца на фоне экспериментальной гиперкальциемии приводит к снижению проявлений токсической нефропатии и уменьшению нефротоксичности ацетата свинца. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа уменьшения нефротоксичности ацетата свинца, включающего введение ацетата свинца на фоне экспериментальной гиперкальциемии, вызванной введением 10% раствора хлорида кальция, ацетат свинца вводят в дозе 40 мг/кг, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе уменьшения токсического действия свинца путем снижения токсического действия тяжелого металла при хроническом отравлении, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

С целью создания экспериментальной гиперкальциемии 10% раствор хлорида кальция вводят через атравматичный зонд в желудок в количестве 0,3 мл на 200 г массы крысы в течение 20 дней, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Предлагаемая дозировка хлорида кальция вызывает повышение уровня кальция в крови интактных животных до 2,89±0,011 ммоль/л (фоновые значения - 2,20±0,032). Для получения токсического вещества ацетат свинца растворяют в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 40 мг свинца (в пересчете на металл). На каждые 100 г веса крысы инъецируют 0,1 мл токсического раствора. Введение металла начинают с 5 дня эксперимента, подкожно в дозировке 40 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 16 дней.

По истечении времени эксперимента (20 дней) исследовали функциональное состояние почек, что включало определение диуреза (мл/час/100 г), клубочковой фильтрации (мл/час/100 г), канальцевой реабсорбции воды (%), осмолярности мочи, экскреции натрия, калия, белка. Крысы забивались с использованием тиопентала. Полученные результаты в группе №2 сравнивали с контролем (группа №1) и фоновыми показателями интактной группы.

Для гистологических исследований образцы тканей (почки) фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 микрон. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением 80·200·400.

Сущность способа подтверждается морфологически, где на Фиг. - 1 в группе №1 выявляются выраженные дистрофические явления в клубочковом и канальцевом аппарате почек, наблюдаются выраженные альтеративные, некробиотические изменения в тканях почек в виде: отека и дистрофических изменений в клубочке (а), выраженной паренхиматозно-белковой дистрофии (б) и частичного некроз канальцев (в), имеется очаговое кровоизлияние (г).

При морфологическом исследовании почек в группе №2 (Фиг. - 2) отмечаются менее выраженные проявления токсического поражения почек: относительная сохранность клубочка (а), умеренная степень паренхиматозно-белковой дистрофии канальцев (б), наличие неизмененных канальцев (в).

Пример. Двум группам крыс-самцов линии Вистар массой 200-300 г вводили подкожно раствор ацетата свинца в дозе 40 мг/кг каждый день в течение 16 дней. Группа №1 получала изолированное введение металла. Группе №2 вводили через атравматичный зонд в желудок 0,3 мл 10% раствора хлорида кальция в течение 4 дней до введения ацетата свинца и 16 дней одновременно с ним. По окончании эксперимента исследовали функциональное состояние почек в условиях 6-часового спонтанного диуреза, что включало в себя определение: объема диуреза, скорости клубочковой фильтрации по клиренсу эндогенного креатинина, канальцевой реабсорбции воды, экскреции с мочой ионов натрия, калия и кальция, экскреции белка с мочой, осмолярности мочи.

Содержание натрия, калия в плазме крови и моче определяли методом пламенной фотометрии с помощью пламенного анализатора жидкостей ФПА-1, концентрацию кальция и креатинина определяли спектрофотометрически (СФ-26) с помощью наборов «Кальций-Арсеназо-Агат», «Креатинин-Агат», «ООО» «Агат-Мед» (г.Москва, Россия). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически (СФ-26) по методу Лоури. Для определения осмотической концентрации мочи использовали метод криоскопии, измерения выполняли на миллиосмометре «OSMOMAT-2». Результаты всех серий опытов обработаны статистически с применением критерия «t» Стьюдента на ПЭВМ Pentium-4 с использованием программы Prizma 4.0.

Результаты исследования показали, что у крыс при хронической интоксикации ацетатом свинца (группа №1) происходило достоверное увеличение объема 6-часового спонтанного диуреза относительно значений интактной группы животных спустя 16 дней эксперимента, что было обусловлено значительным снижением канальцевой реабсорбции воды при уменьшении скорости клубочковой фильтрации. В группе с экспериментальной гиперкальциемией (№2) отмечались схожие изменения, однако выраженность их была меньшей, нежели при изолированном введении металла.

У животных, получавших подкожно ацетат свинца (группа №1), определялось достоверное повышение экскреции белка по сравнению с показателями интактной группы животных. Протеинурия отмечалась и в сочетанной модели, но степень ее проявления была достоверно меньшей (табл.1).

Экскреция натрия увеличивалась при парентеральном введении металла (группа №1), несмотря на снижение фильтрационного заряда электролита. Натрийурез был обусловлен уменьшением канальцевой реабсорбции катиона. Гиперкальциемия в сочетании со свинцовой интоксикацией также увеличивала выведение электролита с мочой. Однако в этом случае экскреция натрия была достоверно ниже, чем в первой группе, за счет более высоких значений канальцевой реабсорбции катиона (табл.2).

В обеих группах (№1, №2) происходило усиление экскреции калия с мочой, что было обусловлено увеличением его фильтрационного заряда относительно фоновых значений. В отношении почечной обработки этого катиона достоверных отличий между группами не отмечалось (табл.3).

Подкожное введение ацетата свинца приводило к значительному кальциурезу, вызванному снижением канальцевой реабсорбции электролита. Фильтрационный заряд катиона при этом уменьшался. Сочетание хронической свинцовой интоксикации с гиперкальциемией также характеризовалось усилением экскреции кальция, но менее выраженным. Это объяснялось более высокими цифрами канальцевой реабсорбции катиона (табл.4).

Осмолярность мочи уменьшалась во всех моделях с хронической свинцовой интоксикацией, но была наименьшей при изолированном введении металла (табл.5).

Таблица 5 Влияние внутрижелудочного (в/ж) введения раствора хлорида кальция на показатели осмолярности мочи при подкожном (п/к) введении ацетата свинца (М±м). Условия опыта Стат. показатель Osm осм/л I II III Фон М±m 2,120±0,041 Ацетат свинца п/к (16 дней М±m 0,642±0,035 Р *) СаСl₂ в/ж (20 дней)+ М±m 0,787±0,037 Ацетат свинца п/к (16 дней) Р *)##) Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном; (##) - достоверное (р≤0,01) изменение относительно изолированного введения ацетата свинца; Osm - осмолярность мочи.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что формирование хронической свинцовой интоксикации на фоне экспериментальной гиперкальциемии, вызванной ежедневным внутрижелудочным введением 10% раствора хлорида кальция в течение 20 дней, характеризуется менее выраженной картиной нефропатии, т.е. гиперкальциемия способна уменьшать нефротоксичность ацетата свинца.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании механизмов токсического действия ацетата свинца на функциональное состояние почек и при изучении путей профилактики и лечения хронической свинцовой интоксикации. Способ включает введение ацетата свинца и кальцийсодержащего вещества. Для этого 10% раствор хлорида кальция вводят крысам 1 раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозировке 0,3 мл на 200 г в течение 20 дней. Через 4 дня от начала эксперимента животным одновременно вводят подкожно ацетат свинца в дозировке 40 мг/кг в пересчете на металл в течение 16 дней. Способ легко воспроизводим, экономичен и при этом обеспечивает эффективное снижение токсического действия свинца, в т.ч. снижение проявлений токсической нефропатии. 5 табл., 2 ил., 1 пр.

Способ уменьшения нефротоксичности ацетата свинца, включающий введение ацетата свинца и кальцийсодержащего вещества, отличающийся тем, что в качестве кальцийсодержащего вещества используют 10%-ный раствор хлорида кальция, вводимый животным 1 раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозировке 0,3 мл на 200 г в течение 20 дней, а через 4 дня от начала эксперимента животным одновременно вводят подкожно ацетат свинца в дозировке 40 мг/кг, в пересчете на металл, в течение 16 дней.