СПОСОБ УМЕНЬШЕНИЯ НЕФРОТОКСИЧНОСТИ АЦЕТАТА СВИНЦА Российский патент 2012 года по МПК G09B23/28 A61K31/593 A61P13/12 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании механизмов токсического действия ацетата свинца на функциональное состояние почек.

Свинец является одним из наиболее токсичных металлов, включенных в списки приоритетных загрязнителей рядом международных организаций, в том числе ВОЗ и ЮНЕП. Загрязнение окружающей среды свинцом и его соединениями признается в международных кругах одной из главных проблем экологии и охраны здоровья населения [Ливанов Г.А., Соболев М.Б., Ревич Б.А. Свинцовая опасность и здоровье населения. / Российский семейный врач. - 1999. - №2. - C.18-25]. В связи с этим тщательно изучаются патогенетические механизмы токсического действия ксенобиотика.

Длительные клинические и экспериментальные исследования указывают на значимость взаимодействий между свинцом и кальцием. Эти взаимодействия осуществляются на клеточном и молекулярном уровнях, где свинец способен замещать кальций, вытеснять его из специфических мест связывания с лигандами, а также нарушать его пассивный транспорт[Peraza M.A., Ayala-Fierro F., Barber D.S., Casarez E., Rael L.T. Effects of micronutrients on metal toxicity./ Environmental Health Perspectives. - February, 1998. - Vol.106. - Supplement 1]. В условиях истощения запасов кальция отмечается активация трансмембранного переноса свинца [Стародумов В. Л. Дефицит нутриентов как возможное условие развития интоксикации, вызванной воздействием малых доз свинца. / Гигиена и санитария. - 2003. - №3. - С.60-62].

Наиболее близким к заявляемому является способ, описанный в статье: Суханов Б.П., Королев А.А., Марнинчик А.Н., Мерзлякова Н.М. Экспериментальное изучение протекторной роли кальция при свинцовой интоксикации. / Гигиена и санитария. - 1990. - №3. - С.47-49, - взятый нами за прототип, заключающийся в том, что животным ежедневно вводят ацетат свинца в дозировке 200 мг/кг через зонд в желудок перед кормлением пищей с высоким содержанием кальция (1600 мг %) за счет дополнительного введения костного препарата. Продолжительность эксперимента 2 недели.

Недостатком данного способа является то, что гиперкальциемия создается исключительно за счет кальция, добавляемого к рациону опытных животных. При этом не указываются значения содержания кальция в плазме крови, поэтому трудно судить об уровне гиперкальциемии. Кроме того, дозировка ацетата свинца превосходит количество, предложенное для создания модели свинцовой интоксикации (Патент 2358327 С1, опубликованный 10.06.2009. Бюл.16, заявка 2008108864/14 от 06.03.2008, МКИ G09B 23/28, авторы: Митциев А.К., Брин В.Б.).

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа уменьшения нефротоксичности ацетата свинца.

Решение этой задачи обеспечивает снижение токсического действия свинца при хроническом отравлении у экспериментальных животных путем создания экспериментальной гиперкальциемии, оказывающей протекторную роль.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение - способ уменьшения нефротоксичности ацетата свинца - имеет следующие существенные признаки: введение ацетата свинца на фоне экспериментальной гиперкальциемии, для создания гиперкальциемии используют препарат Аквадетрим, вводимый животным 1 раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозировке 3000 ME/100 г в течение 30 дней, а через 14 дней от начала эксперимента животным одновременно вводят подкожно ацетат свинца в дозировке 40 мг/кг, в пересчете на металл, в течение 16 дней.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что для создания гиперкальциемии используют препарат Аквадетрим, вводимый животным 1 раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозировке 3000 МЕ/100 г в течение 30 дней, а через 14 дней от начала эксперимента животным одновременно вводят подкожно ацетат свинца в дозировке 40 мг/кг, в пересчете на металл, в течение 16 дней.

Введение ацетата свинца на фоне экспериментальной гиперкальциемии приводит к снижению проявлений токсической нефропатии. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа уменьшения нефротоксичности ацетата свинца, включающего введение ацетата свинца на фоне экспериментальной гиперкальциемии, в качестве препарата, вызывающего гиперкальциемию, применяют «Аквадетрим», ацетат свинца вводят в дозе 40 мг/кг, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе уменьшения токсического действия свинца, путем снижения токсического действия тяжелого металла при хроническом отравлении, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

С целью создания экспериментальной гиперкальциемии Аквадетрим вводят через атравматичный зонд в желудок в количестве 0,2 мл (3000 ME) на 100 г массы крысы в течение 30 дней, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Предлагаемая дозировка кальцитриола вызывает повышение уровня кальция в крови интактных животных до 2,91±0,013 ммоль/л (фоновые значения 2,20±0,032). Для получения токсического вещества ацетат свинца растворяют в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 40 мг свинца (в пересчете на металл). На каждые 100 г веса крысы инъецируют 0,1 мл токсического раствора. Раствор ацетата свинца вводят подкожно в дозировке 40 мг/кг ежедневно 1 раз в сутки в течение 16 дней двум группам животных (№1, №2), причем группе №2 металл начинают вводить параллельно с кальцитриолом с 15 дня эксперимента.

По истечении времени эксперимента (30 дней) исследуют функциональное состояние почек, что включает определение диуреза (мл/час/100 г), клубочковой фильтрации (мл/час/100 г), канальцевой реабсорбции воды (%), осмолярности мочи, экскреции натрия, калия, белка. Крысы забивались с использованием тиопентала. Полученные результаты в группе №2 сравнивают с контролем (группа №1) и фоновыми показателями интактной группы.

Для гистологических исследований образцы тканей (почки) фиксируют в 10% нейтральном формалине, после чего подвергают заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 микрон. Срезы окрашиваются гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводится в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением 80*200*400.

Сущность способа подтверждается морфологически, где на Фиг. - 1 в опытной группе обнаруживаются атрофические изменения в клубочковом аппарате почек (а), расширение капсулы Боумена-Шумлянского (б), белок в полости капсулы (в), некроз отдельных канальцев (г), в просвете канальцев определяется тканевой детрит (д).

На Фиг. - 2 морфологическое исследование почек в группе №2 выявляет относительную сохранность ткани клубочка (а) и канальцев (б), при наличии признаков паренхиматозно-белковой атрофии (в). Некротические изменения в канальцевом аппарате отсутствуют.

Пример. Одной группе крыс-самцов линии Вистар массой 200-300 г ежедневно подкожно вводили ацетат свинца в дозировке 40 мг/кг в течение 16 дней. Второй группе животных каждый день внутрижелудочно вводился Аквадетрим в дозировке 3000 ME/100 г в течение 30 дней, причем с 15 дня одновременно с подкожным введением раствора ацетата свинца. По окончании эксперимента исследовали функциональное состояние почек в условиях 6-часового спонтанного диуреза, что включало в себя определение объема диуреза, скорости клубочковой фильтрации по клиренсу эндогенного креатинина, канальцевой реабсорбции воды, экскреции с мочой ионов натрия, калия и кальция, экскреции белка с мочой, осмолярности мочи.

Содержание натрия, калия в плазме крови и моче определяли методом пламенной фотометрии, с помощью пламенного анализатора жидкостей ФПА-1, концентрацию кальция и креатинина определяли спектрофотометрически (СФ-26) с помощью наборов «Кальций-Арсеназо-Агат», «Креатинин-Агат», «ООО» «Агат-Мед» (г.Москва, Россия). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически (СФ-26) по методу Лоури. Для определения осмотической концентрации мочи использовали метод криоскопии, измерения выполняли на миллиосмометре «OSMOMAT-2». Результаты всех серий опытов обработаны статистически с применением критерия «t» Стьюдента на ПЭВМ Pentium-4 с использованием программы Prizma 4.0.

Результаты исследования показали, что у крыс с изолированным введением ацетатата свинца (группа №1), происходило достоверное увеличение объема 6-часового спонтанного диуреза, относительно значений интактной группы животных спустя 16 дней эксперимента, несмотря на уменьшение скорости клубочковой фильтрации, что было обусловлено значительным снижением канальцевой реабсорбции воды. В случае сочетания свинцовой интоксикации с экспериментальной гиперкальциемией (группа №2) отмечались схожие изменения, однако выраженность их была меньшей.

У животных, получавших металл подкожно (группа №1), достоверно повышалась экскреция белка относительно фоновых значений. В сочетанной модели цифры протеинурии были не столь высокими (табл.1).

Таблица 1 Влияние внутрижелудочного (в/ж) введения Аквадетрима на основные процессы мочеобразования и экскрецию белка с мочой у крыс при подкожном (п/к) введении ацетата свинца (М±м) Условия опыта Стат. показатель Процессы мочеобразования Белок экскреция, мг/час/100 г Диурез, мл/час/100 г F, мл/час/100 г RH20,% Фон М±m 0,06±0,004 18,53±0,737 99,70±0,019 1,228±0,021 Ацетат свинца п/к (16 дней) М±m 0,19±0,008 15,51±0,735 98,73±0,105 3,973±0,033 Р *) **) *) *) Аквадетрим в/ж (30 дней) + Ацетат свинца п/к (16 дней) М±m 0,15±0,006 15,26±0,731 99,00±0,061 2,804±0,088 Р *)#) - *) ###) *)#) Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном;
(**) - достоверное (р≤0,05) изменение по сравнению с фоном;
(#) - достоверное (р≤0,001) изменение относительно изолированного введения ацетата свинца;
(###) - достоверное (р≤0,05) изменение относительно изолированного введения ацетата свинца;
F - скорость клубочковой фильтрации, R_H2O - канальцевая реабсорбция воды.

Экскреция натрия увеличивалась при парентеральном введении ацетата свинца (группа №1), несмотря на снижение фильтрационного заряда электролита. Натрийурез был обусловлен уменьшением канальцевой реабсорбции катиона. Гиперкальциемия в сочетании со свинцовой интоксикацией (группа №2) также увеличивала выведение электролита с мочой. Однако в этом случае экскреция натрия была достоверно ниже, чем в первой группе, за счет более высоких значений канальцевой реабсорбции катиона (табл.2).

Таблица 2 Влияние внутрижелудочного (в/ж) введения Аквадетрима на почечную обработку натрия у крыс при подкожном (п/к) введении ацетата свинца (М±м). Условия опыта Стат. показатель Процессы почечной обработки натрия E_Na F_Na R_Na мкмоль/час/100 г % I II III IV V Фон M±m 8,33±0,752 2559,36±66,645 99,68±0,024 Ацетат свинца п/к (16 дней) M±m 15,84±0,510 1945,49±92,129 99,17±0,068 р *)   *) Аквадетрим в/ж (30 дней) + Ацетат свинца п/к (16 дней) M±m 12,64±0,385 1930,81±92,441 99,34±0,027 р *)#) *) *)###) Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном;
(#) - достоверное (р≤0,001) изменение относительно изолированного введения ацетата свинца;
(###) - достоверное (р≤0,05) изменение относительно изолированного введения ацетата свинца;
E_Na - экскреция Na, F_Na - фильтрационный заряд Na, R_Na - относительная канальцевая реабсорбция Na.

Свинцовая интоксикация в обеих экспериментальных группах (№1, №2) усиливала выведение калия с мочой по сравнению фоновыми значениями, что было обусловлено увеличением его фильтрационного заряда. Достоверных различий между группами в этом случае не отмечалось (табл.3).

Таблица 3 Влияние внутрижелудочного (в/ж) введения Аквадетрима на почечную обработку калия с мочой у крыс при подкожном (п/к) введении ацетата свинца (М±м). Условия Стат. показатель Процессы почечной обработки калия опыта   Е_К F_K мкмоль/час/100 г I II III IV Фон М±m 6,97±0,440 74,08±1,929 Ацетат свинца п/к (16 дней) М±m 8,60±0,547 84,30±3,992 Р **) **) Аквадетрим в/ж (30 дней) + ацетат свинца п/к (16 дней) М±m 8,90±0,394 81,18±3,886 Р **) - Примечание: (**) - достоверное (р≤0,005) изменение по сравнению с фоном.
F_K - фильтрационный заряд калия, Е_К - экскреция калия.

Подкожное введение ацетата свинца приводило к значительному кальциурезу, вызванному уменьшением канальцевой реабсорбции электролита при сниженном фильтрационном заряде. Сочетание хронической свинцовой интоксикации с внутрижелудочным введением Аквадетрима также характеризовалось усилением экскреции кальция, но менее выраженным. Это объяснялось более высокими цифрами канальцевой реабсорбции катиона (табл.4).

Таблица 4 Влияние внутрижелудочного (в/ж) введения Аквадетрима на почечную обработку кальция у крыс при подкожном (п/к) введении ацетата свинца (М±м). Условия опыта Стат. показатель Процессы почечной обработки кальция Е_Са F_Ca R_Ca ммоль/час/100 г % I II III IV V Фон М±m 0,15±0,009 26,55±0,691 99,44±0,032 Уцетат свинца п/к (16 дней) М±m 0,31±0,003 17,85±0,845 98,204±0,198 р *) *) *) Аквадетрим в/ж (30 дней) + ацетат свинца п/к (16 дней) М±m 0,25±0,002 20,33±0,973 98,75±0,093 р *)#) *) *)###) Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном;
(#) - достоверное (р≤0,001) изменение относительно изолированного введения ацетата свинца;
(###) - достоверное (р≤0,05) изменение относительно изолированного введения ацетата свинца.
F_Ca - фильтрационный заряд кальция, Е_Са - экскреция кальция, R_Ca - канальцевая реабсорбция кальция.

Снижение осмолярности мочи было более выражено при изолированном введении металла, нежели в сочетанной модели (табл. 5).

Таблица 5 Влияние внутрижелудочного (в/ж) введения Аквадетрима на показатели осмолярности мочи при подкожном (п/к) введении ацетата свинца (М±м) Условия опыта Стат. показатель Osm осм/л I II III Фон М±m 2,120±0,041 Ацетат свинца п/к (16 дней) М±m 0,642±0,035 р *) Аквадетрим в/ж (30 дней) + ацетат свинца п/к (16 дней) М±m 0,757±0,029 р *)###) Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном;
(###) - достоверное (р≤0,05) изменение относительно изолированного введения ацетата свинца;
Osm - осмолярность мочи.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что формирование хронической свинцовой интоксикации на фоне экспериментальной гиперкальциемии, вызванной введением Аквадетрима, характеризуется менее выраженной картиной нефропатии.

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании механизмов токсического действия ацетата свинца на функциональное состояние почек. Способ включает введение ацетата свинца на фоне экспериментальной гиперкальциемии. Для создания гиперкальциемии используют препарат Аквадетрим, который вводят животным 1 раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозировке 3000 МЕ/100 г в течение 30 дней. Через 14 дней от начала эксперимента животным одновременно вводят подкожно ацетат свинца в дозировке 40 мг/кг, в пересчете на металл, в течение 16 дней. Способ обеспечивает уменьшение токсического действия свинца, в т.ч. на почки, при контролируемом содержании кальция в крови и необходимой токсической дозы свинца в эксперименте. 2 ил., 5 табл., 1 пр.

Способ уменьшения нефротоксичности ацетата свинца, включающий введение ацетата свинца на фоне экспериментальной гиперкальциемии, отличающийся тем, что для создания гиперкальциемии используют препарат Аквадетрим, вводимый животным 1 раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозировке 3000 МЕ/100 г в течение 30 дней, а через 14 дней от начала эксперимента животным одновременно вводят подкожно ацетат свинца в дозировке 40 мг/кг в пересчете на металл, в течение 16 дней.