КОМПОЗИЦИИ ГЕМОГЛОБИНА Российский патент 2016 года по МПК A61K38/42 A61K47/48 A61P9/10 A61P35/00 

ПЕРКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки Соединенных Штатов Америки с номером 61/185547, поданной 9 июня 2010 года, в полном объеме включенной в настоящий документ в качестве ссылки для всех целей.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение принадлежит к области заменителей крови и жидкостям для реанимации, включая составы с модифицированным полимерами белком, например, гемоглобином, способные к доставке кислорода или монооксида углерода в ткани.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Травма является одной из основных причин гибели в Соединенных Штатах Америки. Главной причиной высокого уровня смертности является невозможность поддерживать оксигенацию тканей пациента между моментом получения повреждения и моментом хирургического вмешательства в медицинском учреждении. Отсутствие оксигенации приводит к повреждению тканей, недостаточности органов и гибели. Таким образом, важной направленностью при лечении травматического шока является введение терапевтических средств, обеспечивающие внутренним тканям и органам пациентов настолько много кислорода, насколько возможно.

Очевидным подходом для поддержания оксигенации является переливание крови. Однако в отношении применения крови при лечении по месту оказания медицинской помощи существует множество значимых практических сложностей, что делает стандартное применение хранимой крови человека для применения вне медицинского учреждения на широкой основе невыполнимым. Стандартные подходы лечения травмы преимущественно включают поддержание внутрисосудистого циркулирующего объема посредством введения изотонических, гипертонических или гиперонкотических растворов. Эти способы лечения не могут с достаточной равномерностью увеличивать оксигенацию внутренних тканей и органов для эффективного предотвращения ишемии и недостаточности органов.

Как следствие, прикладываются большие усилия для разработки переносчиков кислорода на основе гемоглобина (HBOC), которые способны к восстановлению переносимого объема кислорода пациентов с травмой. По сравнению с применением консервированной крови человека HBOC обладают рядом преимуществ, включая сниженную вероятность передачи заболеваний, отсутствие иммунореактивности, отсутствие необходимости типирования и, наиболее важно, улучшенную доступность со сниженными требованиями к хранению. HBOC разработаны несколькими группами и несколько компаний провели клинические испытания с разработкой своих продуктов на основе гемоглобина, в качестве заменителей крови. Двумя типами заменителей крови, проходивших клинические испытания, являются гемоглобин (HGB), выделяемый из крови человека или животных, или синтетически получаемые носители кислорода, такие как перфторуглерод. Также разработаны и охарактеризованы для применения у пациентов другие заменители эритроцитов. (См., например, Red Blood Cell Substitutes, 1998, (Eds.) A. S. Rudolph, R. Rabinovici, and G. Z. Feuerstein, Dekker, New York, N.Y.). Такие заменители эритроцитов можно использовать в сочетании со стандартной лекарственной терапией, такой как переливаемая кровь или препараты крови. В качестве конкретного примера в Enzon, Inc. (Piscataway, N.J.) разработан модифицированный полиэтиленгликолем (PEG) бычий гемоглобин, сокращенный как PEG-HGB. PEG-HGB получают способом, в котором цепи PEG сшивают с поверхностями молекул HGB, например, как описано в патентах США №№ 5386014 и 5234903, выданных Nho et al.). Другие конкретные примеры включают гемопур (Hemopure™) и оксиглобин (Oxyglobin) (Biopure, Cambridge, Mass.). Однако ни для одного из этих продуктов не доказано, что они обеспечивают значимое увеличение оксигенации тканей, и ни один из них не получил одобрение FDA, потому, что они или неэффективны, или вызывают значительную токсичность.

Отсутствие подходящих HBOC значительно затрудняло фундаментальные исследования в физиологии оксигенации тканей и понимание ключевых механизмов, вовлеченных в шок и следующее за ним повреждение тканей. В отношении HBOC, прошедших клинические испытания и вызывающих значительную токсичность, доступно недостаточно информации о причине этой токсичности.

Таким образом, в настоящее время способы лечения вызванного травмой кровотечения являются неудовлетворительными. Хотя переливание крови может восстановить доставку кислорода в ткань и восполнить потерянный циркулирующий объем, использование крови как средства лечения кровотечения вне медицинских учреждений сопряжено со значительными практическими сложностями. Во-первых, как правило, доступно ограниченные количества крови и для каждого подвергаемого лечению индивидуума необходимо типирование для предотвращения гибели пациента вследствие иммунного ответа. Однако наиболее существенной сложностью в применении крови для лечения пациентов с травмой, вне медицинских учреждений являются ограничения в хранении и способах упаковки, свойственных применению этой ткани. Таким образом, переливание крови при лечении по месту оказания медицинской помощи пациентам с травмой, как правило, не применяют.

Фактически, стандартные подходы лечения травмы преимущественно включают поддержание внутрисосудистого циркулирующего объема посредством введения изотонических, гипертонических или гиперонкотических растворов. Эти подходы предназначены для обеспечения кратковременного пополнения объема циркулирующей крови, а также с их помощью можно увеличивать кровоток и, таким образом, доставку кислорода в ткани. Однако когда кровотечение является сильным, эти способы лечения не могут с достаточной равномерностью увеличивать оксигенацию внутренних тканей и органов для эффективного предотвращения ишемии и недостаточности органов. Как следствие, у индивидуумов, получивших тяжелую травму, высок уровень смертности.

В течение нескольких лет предпринимались попытки разработать переносчики кислорода на основе гемоглобина (HBOC), способные к обеспечению кислородом пациентов с травмой. По сравнению с применением консервированной крови человека HBOC обладают рядом преимуществ, при отсутствии многих сложностей, ассоциированных с применением для лечения травмы крови. Эти преимущества включают сниженную вероятность передачи заболеваний, отсутствие иммунореактивности, отсутствие необходимости типирования и, наиболее важно, улучшенную доступность со сниженными требованиями к хранению. Теоретически HBOC должны быть способны связывать кислород и высвобождать его в нуждающихся тканях. Они должны находиться в готовом к применению растворе, находящемся форме, стабильной в течение месяца в большинстве условий окружающей среды, особенно в условиях, как правило, встречающихся в условиях по месту оказания медицинской помощи, в которых пациентам с травмой необходимо лечение.

В течение нескольких лет предпринимался ряд попыток разработать в качестве кислородных лекарственных средств HBOC с применением природного или рекомбинантного гемоглобина человека, модифицированных форм гемоглобина человека или модифицированных форм гемоглобина других видов. Немодифицированный гемоглобин можно использовать в качестве кислородного терапевтического средства, однако он связывает NO_x и вызывает сильные вазоконстрикцию и гипертензию. Вследствие его молекулярной массы гемоглобин может вызывать значительную токсичность, особенно в почках, где он забивает гломерулярный аппарат. Как следствие, большинство видов гемоглобина, который тестировали у людей, модифицировали для увеличения времени их полувыведения и снижения их токсичности.

Целью изобретения является предоставление новых молекул, переносящих и доставляющих кислород и монооксид углерода, которые могут служить в качестве заменителей крови и/или обладают терапевтической активностью, и способов получения этих молекул.

Дополнительной целью настоящего изобретения является предоставление стабилизированных гемоглобина и конъюгатов гемоглобина с водорастворимыми полимерами с проведенной инактивацией вирусов, пригодных в качестве терапевтических средств в трансфузионной медицине, где инактивация вирусов обеспечивает в гемоглобине и конечных составах гемоглобина фактически полное отсутствие передающихся инфекционных агентов. Конъюгаты способны к доставке в ткани кислорода или монооксида углерода, связанных с гемоглобином.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Среди многих вариантов его осуществления настоящее изобретение относится к молекуле PEG-гемоглобин ("PEG-Hb"), которая может переносить кислород или монооксид углерода (CO) и обеспечивать их диффузию в сосудистой системе млекопитающих и в тканях, находящихся в контакте с сосудистой системой и/или в контакте с гемоглобином. Композиции по изобретению содержат водорастворимый функциональный восстановленный природный гемоглобин. Композиция содержит компонент водорастворимого гемоглобина, который содержит группу функциональных природных молекул гемоглобина. Каждый представитель этой группы молекул гемоглобина находится в восстановленном состоянии, по существу не содержит химических сшивающих средств, и в иллюстративных вариантах осуществления его P₅₀ составляет от приблизительно 22 мм рт.ст. до приблизительно 26 мм рт.ст. Композиция также содержит водорастворимый стабилизирующий компонент. Стабилизирующий компонент помогает поддержанию группы молекул гемоглобина в восстановленном состоянии. В различных вариантах осуществления стабилизирующий компонент содержит стабилизатор. Иллюстративные стабилизаторы содержат структурный элемент, более реакционноспособный в отношении кислорода (или активных форм кислорода (ROS)), чем молекулы восстановленного гемоглобина. Композиция необязательно содержит компонент водного разбавителя. Компонент разбавителя включает фармацевтически приемлемый разбавитель, в котором растворим компонент гемоглобина и стабилизирующий компонент. В иллюстративных вариантах осуществления композиция содержит менее 10% метгемоглобина. В различных вариантах осуществления в соединении проведена инактивация вирусов, что обеспечивает по существу полное отсутствие вирусной активности в композиции.

В иллюстративных вариантах осуществления изобретение относится к конъюгату гемоглобина, способному к переносу кислорода или монооксида углерода от молекулы гемоглобина в ткани in vivo (например, в ткани). Композиция содержит ковалентный конъюгат между функциональной восстановленной природной молекулой гемоглобина и по меньшей мере одной группой водорастворимого полимера, например, поли(этиленгликоля). Гемоглобин конъюгирован с водорастворимым полимером, например, пегилирован, потому, что эта модификация продлевает время полувыведения природного гемоглобина. Это преодолевает значительную проблему короткого времени полувыведения самого природного гемоглобина in vivo и некоторых ранее разработанных HBOC. Кроме того, при увеличении времени полувыведения гемоглобина посредством присоединения таких полимеров, увеличивается физический размер молекулы. В иллюстративных вариантах осуществления конъюгация приводит к образованию меньшего количества продуктов распада, снижая вероятность токсичности для почек, выявляемую при применении природного гемоглобина, а также других, менее стабильных HBOC. Пегилирование снижает иммунологическое распознавание гемоглобина. Таким образом, в композициях и способах по изобретению можно использовать гемоглобин видов, не являющихся человеком. В иллюстративном варианте осуществления гемоглобин представляет собой бычий гемоглобин. В иллюстративных вариантах осуществления композиция представляет собой композицию конъюгата гемоглобина с инактивированными вирусами.

В различных вариантах осуществления композиция содержит водорастворимый компонент гемоглобина, содержащий группу молекул гемоглобина. Группа молекул гемоглобина является восстановленной и ковалентно конъюгирована по меньшей мере с одной группой водорастворимого полимера, например, поли(этиленгликоля). Иллюстративные конъюгаты с водорастворимым полимером получают посредством ковалентного связывания водорастворимого полимера с полипептидом посредством аминогруппы аминокислотного остатка, при этом в объем настоящего изобретения входит образование конъюгата посредством любого аминокислотного остатка гемоглобина. Конъюгат гемоглобина в компоненте гемоглобина по существу не содержит химических сшивающих средств; и его P₅₀ составляет от приблизительно 9 мм рт.ст. до приблизительно 12 мм рт.ст. Иллюстративные композиции также содержат водорастворимый стабилизирующий компонент, обеспечивающий устойчивость группы молекул гемоглобина к окислению. Стабилизирующий компонент содержит стабилизатор. Иллюстративные стабилизаторы содержат структурный элемент, который предотвращает реоксигенацию восстановленного гемоглобина. В различных вариантах осуществления стабилизатор более реакционноспособен в отношении кислорода, чем представители группы молекул гемоглобина. В различных вариантах осуществления композиция также содержит компонент разбавителя. Иллюстративные компоненты разбавителя представляют собой фармацевтически приемлемый разбавитель, в котором растворим компонент гемоглобина. В иллюстративном варианте осуществления композиция по существу лишена вирусной активности и содержит менее чем приблизительно 10% метгемоглобина.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к композиции гемоглобина с инактивированными вирусами, содержащей водорастворимый функциональный восстановленный природный гемоглобин. Композицию получают способом, включающим подвергание раствора восстановленного гемоглобина и стабилизатора способу термической инактивации вирусов. Способ термической инактивации вирусов включает воздействие на раствор температуры, в достаточной степени высокой для инактивации по существу всей вирусной активности в растворе. Обработку повышенной температурой проводят в течение периода времени, достаточного для достижения инактивации по существу всей вирусной активности в растворе. Стабилизатор содержит структурный элемент, предотвращающий реоксигенацию восстановленного гемоглобина. В иллюстративном варианте осуществления этот структурный элемент выбран так, чтобы он являлся более реакционноспособным в отношении кислорода или ROS, чем в отношении восстановленного гемоглобина. Стабилизатор служит функции минимизации связывания кислорода восстановленным гемоглобином. В различных вариантах осуществления раствор содержит количество стабилизатора, достаточное для предотвращения образования более чем приблизительно 10% метгемоглобина в ходе процесса термической инактивации вирусов.

В иллюстративных вариантах осуществления изобретение относится к композиции гемоглобина, содержащей водорастворимый функциональный восстановленный природный гемоглобин. Эта композиция содержит менее 10% метгемоглобина. Когда в композиции проводят инактивацию вирусов, ее необязательно получают способом, включающим нагревание исходного раствора гемоглобина приблизительно до 60°C в течение времени приблизительно до 12 часов (например, от приблизительно 1 до приблизительно 4 часов). Исходный раствор содержит стабилизатор. Стабилизатор содержит структурный элемент, предотвращающий реоксигенацию восстановленного гемоглобина. В иллюстративном варианте осуществления этот структурный элемент выбран так, что он является более реакционноспособным в отношении кислорода, чем в отношении восстановленного гемоглобина. Стабилизатор служит функции минимизации связывания кислорода восстановленным гемоглобином.

В иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к способу получения композиции гемоглобина по изобретению. Композиция содержит водорастворимый функциональный восстановленный природный гемоглобин. В иллюстративном варианте осуществления композиция содержит водорастворимый компонент гемоглобина, содержащий группу функциональных природных молекул гемоглобина, где каждый представитель группы молекул гемоглобина находится в восстановленном состоянии; по существу не содержит химических сшивающих средств; и его P₅₀ составляет от приблизительно 22 мм рт.ст. до приблизительно 26 мм рт.ст. В различных вариантах осуществления композиция содержит водорастворимый стабилизирующий компонент, содержащий стабилизатор. Стабилизатор содержит структурный элемент, предотвращающий реоксигенацию восстановленного гемоглобина. В иллюстративном варианте осуществления этот структурный элемент выбран так, что он является более реакционноспособным в отношении кислорода, чем в отношении восстановленного гемоглобина. Стабилизатор служит функции минимизации связывания кислорода с восстановленным гемоглобином, таким образом, поддерживая молекулы гемоглобина в восстановленном состоянии. В иллюстративном варианте осуществления композиция содержит компонент разбавителя. В различных вариантах осуществления компонент разбавителя содержит фармацевтически приемлемый разбавитель, в котором растворим компонент гемоглобина. Различные композиции по существу лишены вирусной активности и содержит менее 10% метгемоглобина. В иллюстративном варианте осуществления в композиции проведена инактивация вирусов. Иллюстративный способ получения композиции с инактивированными вирусами включает подвергание смеси, содержащей компонент гемоглобина и стабилизирующий компонент способу термической инактивации вирусов. Иллюстративный способ термической инактивации вирусов включает воздействие на смесь температурой, в достаточной степени высокой для инактивации по существу всей вирусной активности в смеси. Период времени, в течение которого смесь подвергают воздействию повышенной температуры, является достаточным для достижения указанной инактивации по существу всей вирусной активности в указанной смеси.

В каждой из указанных выше композиций гемоглобин необязательно является реоксигенированным. В одном из вариантов осуществления гемоглобин реоксигенируют после инактивации вирусов. Альтернативно гемоглобин связан с монооксидом углерода. Связывание с монооксидом углерода можно проводить по существу в любой момент получения композиции или после получения композиции. В иллюстративном варианте осуществления Fe(II) гемоглобина в восстановленной композиции связан с монооксидом углерода.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения травмы, шока, ишемии и других заболеваний, которые поддаются улучшению при увеличении содержания кислорода или монооксида углерода в тканях или органах. Композиции по изобретению быстро восстанавливают оксигенацию тканей и полностью компенсируют дефицит кислорода в моделях тяжелого травматического шока на животных, в которых в норме от геморрагического шока погибают по меньшей мере 50% особей. Одна единица композиции с использованием иллюстративного состава по изобретению компенсирует дефицит кислорода во всех основных органах, открывает микроциркуляторное русло и восстанавливает среднее артериальное давление. Различные композиции по изобретению являются более эффективными и быстрыми в отношении устранения дефицита кислорода, чем эритроцитарная масса. В иллюстративном варианте осуществления состав по изобретению компенсирует по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% дефицита кислорода у индивидуума приблизительно в течение от 60 минут до приблизительно 160 минут после введение состава индивидууму. Альтернативно, композиции по изобретению увеличивают концентрацию монооксида углерода в ткани. В иллюстративном варианте осуществления состав, устраняющий дефицит кислорода или увеличивающий содержание монооксида углерода в ткани, содержит пегилированный конъюгат гемоглобина по изобретению.

Таким образом, в иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к способу доставки кислорода или монооксида углерода в объект, выбранный из тканей и органов индивидуума, нуждающегося в такой доставке. В иллюстративном варианте осуществления способ включает введение индивидууму количества композиции любого средства по изобретению, достаточного для осуществления доставки кислорода или монооксида углерода в одно или несколько из тканей и/или органов.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к способу устранения дефицита кислорода в объекте, выбранном из тканей и органов субъекта, страдающего от геморрагического шока. В иллюстративном варианте осуществления способ включает введение индивидууму количества композиции любого средства по изобретению, достаточного для устранения дефицита кислорода. Сходный способ предоставлен для увеличения содержания монооксида углерода в ткани в ответ на потерю содержания монооксида углерода вследствие заболевания, повреждения и т.д. или в качестве средства получения терапевтического эффекта от увеличения содержания монооксида углерода в ткани по сравнению с нормальными уровнями, присутствующими в ткани в здоровом состоянии или в состоянии болезни.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к способу индукции ангиогенеза в тканях индивидуума посредством введения индивидууму количества композиции по изобретению, эффективного для индукции ангиогенеза. В иллюстративных вариантах осуществления ангиогенез индуцируют в тканях, страдающих от недостатка кислорода. В дополнительных иллюстративных вариантах осуществления ткани или органы, в которых индуцируют ангиогенез, представляют собой ткани или органы индивидуума, страдающие от недостатка кислорода. В иллюстративном варианте осуществления способ включает введение индивидууму количества композиции любого средства по изобретению, достаточного для устранения недостатка кислорода.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к способу увеличения кровотока в ткани, страдающей от недостатка кислорода. Способ состоит из введения индивидууму количества композиции по изобретению, эффективного для увеличения кровотока в ткани, страдающей от недостатка кислорода. В иллюстративном варианте осуществления ткань или орган представляют собой ткань или орган индивидуума, страдающие от плохого кровотока. В иллюстративном варианте осуществления способ включает введение индивидууму количества композиции любого средства по изобретению, достаточного для устранения плохого кровотока.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к способу уменьшения количества ткани с неврологическим повреждением и/или инфарктом в тканях, страдающих от недостатка кислорода. В иллюстративном варианте осуществления способ включает введение индивидууму количества композиции по изобретению, достаточного для снижения неврологического повреждения и/или инфаркта в ткани, страдающей от недостатка кислорода. В иллюстративном варианте осуществления способ включает введение индивидууму количества композиции любого средства по изобретению, достаточного для уменьшения количества пораженной инфарктом и/или неврологически поврежденной ткани.

В каждом из указанных выше вариантов осуществления гемоглобин в составе может быть связан с кислородом, монооксидом углерода или ни с одним из них. Кроме того, составы, в которые введен конъюгат гемоглобина, относительно тоничности крови индивидуумов могут являться гипотоническими, изотоническими или гипертоническими.

Другие варианты осуществления, цели и преимущества по изобретению понятны из предоставленного далее подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

ФИГ. 1 представляет собой блок-схему получения иллюстративного PEG-Hb.

ФИГ. 2 представляет собой графическое сравнение PEG-Hb/HS и других лечебных средств, для устранения дефицита кислорода в модели травматического шока на животных.

На ФИГ. 3 представлено артериальное давление (A) и лазерное доплеровское измерение потока, измеряемые в латеральной теменной коре и выражаемые в виде процента от исходного уровня (B), в течение 2 часов окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) и первых 30 мин реперфузии в группах крыс, которым или не проводили трансфузии, или проводили трансфузию 10 мл/кг PEG-альбумина или PEG-COHb на 20 мин MCAO (среднее ± SE (станд. ошибка); n=10 в группе).

На ФИГ. 4 представлен показатель неврологического расстройства по шкале 0-4 (0 = отсутствие расстройства) через 1 или 24 час реперфузии после 2 час MCAO в группах без трансфузии или с трансфузией PEG-альбумина или PEG-COHb на 20 мин MCAO (среднее ± SE; n=10). *P < 0,05 для групп PEG-COHb по сравнению с группами без трансфузии и с трансфузией PEG-альбумина.

ФИГ. 5 представляет собой графическое представление объема инфаркта в каждом из 7 коронарных срезов коры головного мозга (A) и полосатого тела (B) и общего объема инфаркта суммированного по 7 срезам коры головного мозга и полосатого тела (C). Значения выражены в виде процента от общей контралатеральной структуры (средние ± SE; n=10). *P < 0,05 для групп PEG-COHb по сравнению с группами без трансфузии и с трансфузией PEG-альбумина.

На ФИГ. 6 показано, что количество жизнеспособной ткани головного мозга (окрашено темным) больше у крыс с трансфузией PEG-COHb (правое изображение) по изобретению, чем у контрольной крысы без инфузии PEG-COHb по изобретению (левое изображение).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Введение

Существует необходимость в средстве для переноса кислорода для лечения или предотвращения гипоксии, являющейся результатом заболевания, повреждения и кровоизлияния, например, кровопотери (например, вследствие острого кровотечения или при хирургических операциях), являющейся результатом анемии (например, пернициозной анемии или серповидно-клеточной анемии) или являющейся результатом шока (например, гиповолемического шока, анафилактического шока, септического шока или аллергического шока). Применение цельной крови или компонентов крови в таких условиях сопряжено с недостатками. Например, применение цельной крови часто сопровождается риском передачи любого количества вирусов, включая вирусы, вызывающие гепатит, и вирусы, вызывающие СПИД, которые могут осложнять восстановление пациента или приводить к гибели пациента. Кроме того, применение цельной крови требует типирование крови и проверки на перекрестную совместимость во избежание иммуногематологических нарушений и несочетаемости между донорами.

Также существует необходимость в терапевтических средствах, способных к доставке кислорода или монооксида углерода в ткани индивидуума. В частности, терапевтическое средство необходимо для применения для лечения состояний, ассоциированных с кровопотерей и ишемией.

Настоящее изобретение удовлетворяет обе эти потребности посредством предоставления составов с PEG-гемоглобином, в которых гемоглобин связан с кислородом, связан с монооксидом углерода или не связан ни с одним из них. Конъюгат гемоглобина формулируют в среде, которая является гипотонической, изотонической или гипертонической по отношению к тоничности крови индивидуума, которому вводят состав.

Гемоглобин человека, в качестве средства доставки кислорода, средства доставки CO и/или кровезаменителя, обладает осмотической активностью и способностью к транспорту и переносу кислорода, но у него существует недостаток быстрого выведения из кровотока почечным путем и через стенки сосудов, что приводит к повреждению органов и очень короткому и, таким образом, неудовлетворительному времени полувыведения. Кроме того, гемоглобин человека также часто загрязнен токсическими уровнями эндотоксинов, бактерий и/или вирусов.

Не принадлежащий человеку гемоглобин страдает теми же недостатками, что и гемоглобин человека. Кроме того, гемоглобин из не принадлежащих человеку источников обладает потенциалом вызывать иммунный ответ у реципиента.

Настоящее изобретение относится к составу с гемоглобином и способам применения этого состава для лечения и улучшения гипоксии вследствие заболевания, повреждения и кровоизлияния или для доставки CO в ткани при этих состояниях. В иллюстративных составах проведена инактивация вирусов, и в определенных вариантах осуществления гемоглобин конъюгирован с водорастворимым полимером, например, пегилирован. Иллюстративные составы с гемоглобином по изобретению содержат молекулы гемоглобина с P₅₀, отличающимся от P₅₀ природного гемоглобина человека. Составы с гемоглобином по изобретению устраняют дефицит кислорода при травме, как показано в модели тяжелой травмы на животных, что указывает, что он обладает наибольшим переносимым объемом кислорода in vivo по сравнению с другими продуктами. Иллюстративный состав по изобретению способен к быстрому восстановлению оксигенации тканей и полной компенсации дефицита кислорода при травме, как показано в модели тяжелого травматического шока на животных, в которой по меньшей мере 50% особей в норме погибает от геморрагического шока. Одна единица иллюстративного состава по изобретению компенсирует дефицит кислорода во всех основных органах, открывает микроциркуляторное русло, и восстанавливает среднее артериальное давление. Иллюстративные составы также обеспечивают наибольшую стабильность и способность к хранению по сравнению с любым другим HBOC. Иллюстративный состав в достаточной степени стабилен, чтобы оставаться полностью эффективным в модели на животных после хранения в течение по меньшей мере 4 недель при 45°C (113°F), в экстремальных условиях окружающей среды, что подтверждает, что иллюстративные составы по изобретению пригодны в экстремальных ситуациях по месту оказания медицинской помощи.

Различные составы по изобретению для клинического применения содержат пегилированный гемоглобин, например, бычий гемоглобин, и изотонический или гипертонический солевой раствор (PEG-Hb/HS) и пегилированный гемоглобин в форме с CO (PEG-Hb-CO) с высокими концентрациями солей (т.е. изотоническими или гипертоническими) или без них. Иллюстративные составы по этим вариантам осуществления увеличивают переносимый объем кислорода крови вследствие содержания в них гемоглобина и увеличивают доставку кислорода в ткани, расширяя сосудистую систему (посредством своего гипертонического-онкотического действия или действия CO) и действуя как средство для переноса кислорода между эритроцитами и тканями. Иллюстративные составы по изобретению также применяют для лечения серповидно-клеточной анемии, инсульта или периферической ишемии вследствие диабета. Иллюстративный состав содержит PEG-Hb-CO и является высокостабильным и обладает желаемыми фармакологическими свойствами. В различных вариантах осуществления PEG-Hb-CO обладает сосудорасширяющими свойствами. В различных вариантах осуществления PEG-Hb-CO обладает антиоксидантными свойствами. В различных вариантах осуществления составы с PEG-Hb по изобретению приводят к увеличению активных форм кислорода в количествах, достаточных для того, чтобы вызывать повреждение тканей. Этот состав можно использовать для лечения любого из заболеваний, кровоизлияний или повреждений, обсуждаемых в настоящем документе. В иллюстративном варианте осуществления состав применяют для лечения ишемии. Иллюстративные типы ишемии, поддающиеся лечению этой композицией, включают ишемию головного мозга и диабетическую ишемию. Таким образом, изобретение относится к способам лечения, облегчения и предотвращения нисходящего повреждения вследствие ишемических эпизодов. Иллюстративный тип ишемии, поддающийся лечению композициями по изобретению, представляет собой периферическую ишемию, например, периферическую диабетическую ишемию.

Определения

"CO" относится к монооксиду углерода.

"HS" относится к высокосолевому, гипертоническому составу.

Как применяют в настоящем документе "сангвинат" (Sanguinate™) относится к композиции PEG-HbCO по изобретению.

Термины "заменитель крови", "жидкость для реанимации", "PEG-Hb", PEG-CO-Hb", "переносчик кислорода на основе гемоглобина" (HBOC) и "PEG-Hb/HS" относятся к композициям пегилированного Hb по изобретению и к составам, содержащим эти композиции. Термины также содержат в себе раскрытие иллюстративного применения композиции и состава с ней. Например, "заменитель крови" пригоден для замены крови в случае, например, травмы, инсульта, ишемии/реперфузионного повреждения, хирургического вмешательства, анемии или других повреждений, кровоизлияний и заболеваний, при которых может быть показано переливание крови. Как применяют в настоящем документе, эти термины также относятся к составам с Hb, способным к доставке кислорода или монооксида углерода в ткань. Эти составы пригодны при повреждениях, кровоизлияниях и заболеваниях, характеризующихся тем, что у индивидуума содержится достаточный объем крови, но кровь обладает недостаточной способностью переносить и/или доставлять кислород или монооксид углерода в ткани. Производные PEG-гемоглобин формулируют в гипотонических, изотонических или гипертонических солевых растворах. Таким образом, иллюстративную композицию восстановленного PEG-Hb, в котором Fe(II) не связан или связан с CO, можно формулировать в изотоническом или гипертоническом растворе. Подобным образом, в изотонических или гипертонических носителях можно формулировать иллюстративный оксигенированный PEG-Hb.

Термин "аминокислота" относится к природным, например, к цистеину, и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют сходным с природными аминокислотами образом. Природные аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые в генетическом коде, а также аминокислоты, получаемые посредством более поздними модификациями, например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Аналоги аминокислот относятся к соединениям, которые обладают той же основной химической структурой, что и природная аминокислота, например, α-атомом углерода, связанным с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и группой R, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги содержат модифицированные R группы (например, норлейцин) или модифицидные пептидные каркасы, но сохраняют, такую же основную химическую структуру, как у природных аминокислот. Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, которые обладают структурой, отличной от основной химической структуры аминокислоты, но функционирующие сходным с природной аминокислотой образом.

"Пептид" и "полипептид" относятся к полимеру, в котором мономерами являются аминокислоты, и которые соединены амидными связями, альтернативно обозначаемому как полипептид. Дополнительно, также включены неприродные аминокислоты, например, β-аланин, фенилглицин и гомоаргинин. Также по настоящему изобретению можно использовать аминокислоты, некодируемые в генах. Кроме того, по настоящему изобретению можно использовать аминокислоты, модифицированные так, чтобы содержать реакционноспособные группы, участки гликозилирования, полимеры, терапевтические группы, биомолекулы и т.п. Все аминокислоты, применяемые по настоящему изобретению, могут представлять собой D - или L-изомер. В основном, предпочтителен L-изомер. Кроме того, по настоящему изобретению также пригодны другие пептидомиметики. Как применяют в настоящем документе, "пептид" относится к гликозилированным и негликозилированным пептидам. Также включены пептиды, которые системой, экспрессирующей пептид, гликозилированы не полностью. Для общего обзора см., Spatola, A. F., в Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983). Иллюстративным пептидом является гемоглобин.

Термин "конъюгат пептида" и "конъюгат гемоглобина" относятся к соединениям по изобретению, в которых полипептид гемоглобина конъюгирован с водорастворимым полимером, например, поли(этиленгликолем) (PEG), как указано в настоящем документе.

Как применяют в настоящем документе "гемоглобин", относится к связывающему кислород (или связывающему CO) активному полипептиду, который не является химически сшитым посредством обработки химическими сшивающими средствами, например, диальдегидами и т.д. Иллюстративный гемоглобин представляет собой природный белок без модификаций, отличных от конъюгации с одной или несколькими группами PEG (например, m-PEG). Как применяют в настоящем документе, "по существу, несодержащий химических сшивающих средств", относится к молекулам гемоглобина, которые намеренно не сшивали химическими сшивающими средствами. Эти препараты гемоглобина содержат менее 5%, менее 3% или менее 1% сшитого гемоглобина.

Термин "водорастворимый" относится к молекулам с некоторой детектируемой степенью растворимости в воде. Способы детекции и/или количественного определения водорастворимости хорошо известны в данной области. Иллюстративные водорастворимые полимеры включают пептиды, сахариды, поли(простые эфиры), поли(амины), поли(карбоновые кислоты) и т.п. Пептиды могут иметь смешанные последовательности, состоящие из одной аминокислоты, например, поли(лизин). Иллюстративный полисахарид представляет собой поли(сиаловую кислоту). Иллюстративный поли(простой эфир) представляет собой поли(этиленгликоль). Поли(этиленимин) представляет собой иллюстративный полиамин, а поли(акриловая) кислота является характерной поли(карбоновой кислотой). Термин "водорастворимый", как в "водорастворимом полимере", представляет собой полимер, который растворим в воде при комнатной температуре. Как правило, раствор водорастворимого полимера пропускает по меньшей мере приблизительно 75%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% света, пропускаемого этим же раствором после фильтрации. На основании массы водорастворимый полимер или его участок, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 35% (по массе) растворены в воде, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 50% (по массе) растворены в воде, еще более предпочтительно приблизительно на 70% (по массе) растворены в воде, а еще более предпочтительно приблизительно на 85% (по массе) растворены в воде. Однако наиболее предпочтительно, чтобы водорастворимый полимер или его участок приблизительно на 95% (по массе) растворялись в воде или являлись полностью растворенными в воде.

Как применяют в настоящем документе, термин "водорастворимый полимер" включает водорастворимые полимеры, которые являются биологически совместимыми и неиммуногенными, и конкретно не содержит никаких участков водорастворимых полимеров, которые не являются биологически совместимыми и неиммуногенными. В отношении биологической совместимости вещество считают биологически совместимым, если положительное воздействие, ассоциированное с применением вещества отдельно или с другим веществом (например, активным средством) в применении к живым тканям (например, введение пациенту) превосходит любые вредные воздействия по оценкам клиницистов, например, врачей. В отношении неиммуногенности вещество полагают неиммуногенным, если назначаемое применение вещества in vivo не приводит к нежелательному иммунному ответу (например, образованию антител) или, если возникает такой иммунный ответ, что такой ответ не считают клинически значимым или важным по оценкам клиницистов. Особенно предпочтительно, чтобы участки водорастворимых полимеров, описываемых в настоящем документе, а также конъюгаты являлись биологически совместимыми и неиммуногенными.

Каркас полимера в водорастворимом полимере может представлять собой поли(этиленгликоль) (т.е. PEG). Однако следует понимать, что пригодными для применения в практическом осуществлении настоящего изобретения также являются другие родственные полимеры и что полагают, что в этом отношении использование термина PEG или поли(этиленгликоль) является включительным, а не исключительным. Термин PEG включает поли(этиленгликоль) в любой из его форм, включая алкокси-PEG, дифункциональный PEG, PEG с несколькими плечами, раздваивающийся PEG, разветвленный PEG, PEG с боковыми группами (т.е. PEG или родственными полимеры с одной или несколькими функциональными группами, отходящими от каркаса полимера) или PEG с желательными связями в нем.

Каркас полимера может являться линейным или разветвленным. Разветвленные каркасы полимеров в основном известны в данной области. Как правило, разветвленный полимер содержит центральную разветвленную коровую группу и группу линейных полимерных цепей, связанных с центральным разветвленным кором. PEG часто используют в разветвленных формах, которые можно получать, добавляя этиленоксид к различным полиолам, таким как глицерин, пентаэритрит и сорбит. Центральную разветвленную группу также можно получать из нескольких аминокислот, таких как лизин. Разветвленный поли(этиленгликоль) в основной форме можно представить как R(-PEG-OH)_m, где R представляет собой коровую группу, такую как глицерин или пентаэритрит, а m представляет собой количество ветвей. Также в качестве каркаса полимера можно использовать молекулы PEG с несколькими ветвями, такими как молекулы, описанные в патент США № 5932462, который полностью включен в настоящий документ в качестве ссылки.

Также по настоящему изобретению подходят множество других полимеров. Особенно пригодны по изобретению каркасы полимеров, которые являются непептидными и водорастворимыми, формирующие от 2 до приблизительно 300 концов. Примеры подходящих полимеров в качестве неограничивающих примеров включают другие поли(алкиленгликоли), такие как поли(пропиленгликоль) ("PPG"), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля и т.п., поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксипропилметакриламид), поли(α-гидрокси кислота), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолин, поли(N-акрилоилморфолин), так как описано в патенте США № 5629384, который полностью включен в настоящий документ в качестве ссылки, и их сополимеры, терполимеры и смеси. Хотя молекулярная масса каждой цепи каркаса полимера может варьировать, как правило, она находится в диапазоне от приблизительно 100 Да до приблизительно 100000 Да, часто от приблизительно 6000 Да до приблизительно 80000 Да.

Хотя молекулярная масса водорастворимого полимера (а также полимерного реагента, применяемого для получения конъюгата) может варьировать, молекулярная масса удовлетворяет одному или нескольким из следующих значений: более 100 дальтон; более 200 дальтон; более 400 дальтон; более 500 дальтон, более 750 дальтон; более 900 дальтон; более 1000 дальтон, более 1400 дальтон; более 1500 дальтон, более 1900 дальтон; более 2000 дальтон; более 2200 дальтон; более 2500 дальтон; более 3000 дальтон; более 4000 дальтон; более 4900 дальтон; более 5000 дальтон; более 6000 дальтон; более 7000 дальтон; более 7500 дальтон, более 9000 дальтон; более 10000 дальтон; более 11000 дальтон; более 14000 дальтон, более 15000 дальтон; более 16000 дальтон; более 19000 дальтон; более 20000 дальтон; более 21000 дальтон; более 22000 дальтон, более 25000 дальтон и более 30000 дальтон. Следует понимать, что максимальный предел молекулярной массы любого взятого участка водорастворимого полимера, пригодного по настоящему документу, составляет приблизительно 300000 дальтон.

Молекулярную массу водорастворимого полимера (а также всего полимерного реагента, применяемого для получения конъюгата) также можно выражать, как значение в диапазоне молекулярных масс. Иллюстративные диапазоны включают: от приблизительно 100 дальтон до приблизительно 100000 дальтон; от приблизительно 500 дальтон до приблизительно 80000 дальтон; от приблизительно 1000 дальтон до приблизительно 60000 дальтон; от приблизительно 2000 дальтон до приблизительно 50000 дальтон и от приблизительно 5000 дальтон до приблизительно 40000 дальтон.

Иллюстративные молекулярные массы любого взятого водорастворимого полимера (а также всего полимерного реагента) в полимерном реагента включают приблизительно 100 дальтон, приблизительно 200 дальтон, приблизительно 300 дальтон, приблизительно 400 дальтон, приблизительно 500 дальтон, приблизительно 600 дальтон, приблизительно 700 дальтон, приблизительно 750 дальтон, приблизительно 800 дальтон, приблизительно 900 дальтон, приблизительно 1000 дальтон, приблизительно 2000 дальтон, приблизительно 2200 дальтон, приблизительно 2500 дальтон, приблизительно 3000 дальтон, приблизительно 4000 дальтон, приблизительно 4400 дальтон, приблизительно 5000 дальтон, приблизительно 6000 дальтон, приблизительно 7000 дальтон, приблизительно 7500 дальтон, приблизительно 8000 дальтон, приблизительно 9000 дальтон, приблизительно 10000 дальтон, приблизительно 11000 дальтон, приблизительно 12000 дальтон, приблизительно 13000 дальтон, приблизительно 14000 дальтон, приблизительно 15000 дальтон, приблизительно 20000 дальтон, приблизительно 22500 дальтон, приблизительно 25000 дальтон, приблизительно 30000 дальтон, приблизительно 40000 дальтон, приблизительно 50000 дальтон, приблизительно 60000 дальтон, приблизительно 75000 дальтон и приблизительно 80000 дальтон.

Специалистам в данной области понятно, что приведенное выше описание, по существу относящееся к водорастворимым полимерам, является далеко не полным и является всего лишь иллюстративным, и что предусмотрены все полимерные вещества с описываемыми выше качествами. Как применяют в настоящем документе, термин "полимерный реагент" в основном относится ко всей молекуле, которая может содержать водорастворимый полимер и функциональную группу. Термин "водорастворимый полимер" в основном принят для применения в описании одной части более крупной молекулярной структуры, такой как полимерный реагент, молекула-предшественник, конъюгат и т.д.

Каждую часть (например, функциональная группа, активное средство, водорастворимый полимер и т.д.) полимерного реагента и других структур, описываемых в настоящем документе, можно непосредственно связывать с любой другой посредством прямой ковалентной связи. Однако более характерно, что каждая часть присоединена посредством спейсерной группы, содержащей один или несколько атомов, служащей для связывания частей вместе в единое целое.

Предпочтительные спейсерные группы, которыми соединены различные части полимерных реагентов и других структур, описываемых в настоящем документе, включают цепь атомов, сформированную из атомов углерода, азота, кислорода и/или серы. К этой цепи атомов можно присоединять один несколько других атомов, таких как атомы углерода, азота, кислорода, серы и водорода. Цепь может быть короткой и содержать настолько короткую цепь, как цепь от двух до пяти атомов. Также предусмотрены более длинные цепи длиной, например, десять, пятнадцать или более атомов. Кроме того, спейсерная группа может содержать кольцо атомов, которое может быть насыщенным или ненасыщенным, а также ароматическим. Когда она присутствует, спейсерная группа предпочтительно содержит последовательность приблизительно из 1-20 атомов, за исключением любых атомов функциональных групп. Предпочтительно атомы, составляющие спейсерную группу (включая любые атомы функциональных групп), составляют определенную комбинацию атомов кислорода, углерода, азота, серы и водорода. Спейсерные группы могут иметь любой пригодный формат.

Как применяют в настоящем документе термин "время полувыведения" или "tЅ" в отношении введения лекарственного средства пациенту определяют как время, необходимое для снижения концентрации лекарственного средства в плазме пациента наполовину. Дополнительное объяснение "времени полувыведения" находится в Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin and RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101-120). В иллюстративном варианте осуществления время полувыведения конъюгата с PEG по изобретению составляет от приблизительно 12 до приблизительно 22 часов, что значительно дольше, чем у непегилированного гемоглобина.

Как применяют в настоящем документе, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любое вещество, которое при комбинации с конъюгатом сохраняет активность конъюгата и не реагирует с иммунной системой индивидуума. Примеры, в качестве неограничивающих примеров, включают любой из стандартных фармацевтических носителей, таких как фосфатно-солевой буферный раствор, вода, эмульсии, такие как эмульсия масло/вода, и различные типы увлажнителей. Другие носители также могут включать стерильные растворы, таблетки, включающие покрытые таблетки и капсулы. Как правило, такие носители содержат эксципиенты, такие как крахмал, молоко, сахар, определенные типы глины, желатин, стеариновую кислоту или ее соли, стеарат магния или кальция, тальк, растительные жиры или масла, камеди, гликоли или другие известные эксципиенты. Такие носители также могут включать ароматизаторы и красители или другие ингредиенты. Композиции, содержащие такие носители, готовят хорошо известными способами. Иллюстративными носителями являются гипертонический хлорид натрия и изотонический хлорид натрия (например, фосфатно-солевой буфер). Гипертонический и изотонический носители пригодны для изготовления композиций восстановленного пегилированного гемоглобина по изобретению (например, с железом, связанным с монооксидом углерода, и с несвязанным железом) и пегилированного гемоглобина по изобретению, в котором атом железа связан с кислородом.

Как применяют в настоящем документе, "введение", означает внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное, внутриочаговое или подкожное введение. Парентеральное введение включает, например, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, внутрикожное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрижелудочковое и внутричерепное.

Термин "улучшающий" или "улучшение" относится к любым признакам успеха при лечении патологии или патологического состояния, включая любой объективный или субъективный параметр, такой как ослабление, смягчение или уменьшение симптомов или улучшение физического или психического самочувствия пациента. Улучшение симптомов может основываться на объективных или субъективных параметрах, включая результаты медицинского осмотра и/или психиатрического освидетельствования.

Термин "терапия" относится к "лечению" или "терапии" заболевания или патологического состояния, включающим обеспечение ослабления симптомов или побочных эффектов заболевания (включая паллиативное лечение) и ослабление заболевания (вызывая ремиссию заболевания). Эти термины также относятся к лечению повреждения, включая геморрагический шок, инсульт, ишемию/реперфузионное повреждение, травму и т.п. В различных вариантах осуществления эти термины также относятся к предотвращению возникновения заболевания или патологического состояния у индивидуума, который может являться предрасположенным к заболеванию, но который еще не перенес или не продемонстрировал симптомы заболевания (профилактическое лечение), подавляя заболевание (замедляя или останавливая его развитие).

Термин "эффективное количество" или "количество, эффективное для" или "терапевтически эффективное количество" или любой грамматически эквивалентный термин означает количество, которого при введении индивидууму для лечения заболевания, патологического состояния или повреждения достаточно для эффективного лечения этого заболевания. В иллюстративных вариантах осуществления этот термин относится к любому количеству конъюгата по изобретению (или состава, содержащего конъюгат по изобретению), достаточному для компенсации по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или вплоть до приблизительно 100% дефицита кислорода в тканях или органах, обусловленного заболеванием, инсультом или повреждением. При использовании в отношении доставки CO в ткань, этот термин относится к вводимому количеству, достаточному для обеспечения детектируемого терапевтического эффекта от доставки CO в ткань.

Иллюстративную композицию гемоглобина по изобретению обозначают как "способную к переносу связанного с ним компонента, выбранного из кислорода и монооксида углерода, в ткань". Эта фраза относится к композиции гемоглобина со способностью к переносу кислорода или монооксида углерода, связанных с атомом железа гемоглобина, в ткань. В иллюстративных композициях перенос измеряют по изменению тканевого параметра (например, расширение сосудов, оксигенация тканей) или по детектируемому изменению клинически значимого показателя (например, окончание некротического процесса, снижение ишемии/реперфузионного повреждения). В иллюстративном варианте осуществления перенос монооксида углерода или кислорода в ткань измеряют по величине количества дефицита кислорода "компенсированного" введением выбранного объема композиции по изобретению индивидууму (или в ткань) с дефицитом кислорода. В другом иллюстративном варианте осуществления количество кислорода или монооксида углерода, доставляемое в ткань измеряют по величине массы кислорода или CO, переносимых в предварительно отобранную массу ткани (например, один грамм) при введении предварительно выбранной дозы композиции по изобретению. Способность к переносу кислорода или CO в ткань также можно измерять функционально in vivo и посредством сравнения с известными заменителями крови на основе гемоглобина. В иллюстративном варианте осуществления гемоглобин находится в "контакте" или "функциональном контакте" с тканью, в которую он доставляет кислород или монооксид углерода. Под функциональным контактом подразумевают, что гемоглобин находится в достаточной близости к ткани, чтобы переносить кислород или монооксид углерода непосредственно, посредством промежуточного носителя или посредством диффузии в ткань.

Как применяют в настоящем документе, "природный гемоглобин" относится к гемоглобину, который преднамеренно химически не сшивали или не конъюгировали с другими соединениями. Природный гемоглобин включает молекулы гемоглобина, в которых атом железа не связан, связан с кислородом или связан с монооксидом углерода. По настоящему изобретению природный гемоглобин может формировать гемоглобиновый кор конъюгатов PEG-Hb по изобретению.

"Восстановленный" относится к гемоглобину, в котором атом Fe(II) связан с соединениями, отличными от кислорода (например, монооксидом углерода) или не связан с кислородом или любыми другими соединениями.

Термин "выделенный" относится к веществу, которое в значительной степени очищено от компонентов или по существу не содержит компонентов, которые обычно сопутствуют этому веществу, которые применяют для получения вещества или которые представляют собой побочные продукты или продукты разрушения при получении этого вещества. Для конъюгатов с пептидами по изобретению, термин "выделенный" относится к веществу, которое в значительной степени очищено от компонентов или по существу не содержит компонентов, которые обычно сопутствуют этому веществу в смеси, для получения конъюгата пептида. "Выделенный" и "чистый" используют взаимозаменяемо. Как правило, выделенные конъюгаты с пептидами по изобретению обладают уровнем чистоты, предпочтительно выражаемым в виде диапазона. Нижний предел диапазона чистоты конъюгатов с пептидами составляет приблизительно 60%, приблизительно 70% или приблизительно 80%, а верхний предел диапазона чистоты составляет приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или более чем приблизительно 90%. Как правило, композиции гемоглобина с инактивированными нагреванием вирусами по изобретению до конъюгации с водорастворимым полимером выделяют. В иллюстративных вариантах осуществления гемоглобин, используемый для получения конъюгата, является выделенным. В различных вариантах осуществления конъюгат гемоглобина с PEG является выделенным. В иллюстративных вариантах осуществления гемоглобин или конъюгат гемоглобина с PEG является выделенным, за исключением наличия стабилизатора или других эксципиентов. В различных вариантах осуществления гемоглобин или конъюгат гемоглобина с PEG является выделенным из других белков и в частности из белков, выбранных из димеров или олигомеров гемоглобина и других переносящих кислород белков.

Когда конъюгаты с пептидами являются чистыми более чем приблизительно на 90%, их чистоту тоже предпочтительно выражают в виде диапазона. Нижний предел диапазона чистоты составляет приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 94%, приблизительно 96% или приблизительно 98%. Верхний предел диапазона чистоты составляет приблизительно 92%, приблизительно 94%, приблизительно 96%, приблизительно 98% или приблизительно 100% чистоты. Для целей по настоящему изобретению "чистый" конъюгат или раствор чистого конъюгата может содержать стабилизатор.

Чистоту определяют посредством любого известного в данной области способа анализа (например, интенсивности полос на окрашенном серебром геле, электрофореза в полиакриламидном геле, ВЭЖХ или подобных средств).

Термин "реакционноспособная" или "активированная" при применении в сочетании с конкретной функциональной группой относится к реакционноспособной функциональной группе, которая быстро реагирует с электрофилом или нуклеофилом на другой молекуле. Она отличается от групп, которым для реакции необходимы сильные катализаторы или практически неосуществимые условия реакции (т.е. "нереакционноспособных" или "инертных" групп).

Выражение "каждый представитель группы" применяют для обозначения представителей одной из подгрупп в составе по изобретению с конкретными характеристиками. Таким образом, указание каждого представителя группы молекул гемоглобина в компоненте состава по изобретению, не обязательно подразумевает, что каждая молекула гемоглобина в состав обладает указываемой характеристикой, но относится к группе (подгруппе) молекул гемоглобина в составе с указываемой характеристикой.

Термин "стабилизатор" относится к соединениям, которые предотвращают или замедляют реоксигенацию восстановленного гемоглобина. Иллюстративный стабилизатор представляет собой содержащее амин соединение, условно, хотя и не исключительно, аминокислоту. В качестве стабилизатора в составах по изобретению может служить любое содержащее амин соединение. Дополнительный иллюстративный стабилизатор содержит один или несколько структурных элементов, которые предпочтительнее реагируют с кислородом, чем гемоглобин реагирует с кислородом. Иллюстративный структурный элемент, находящийся в стабилизаторах по изобретению представляет собой тиольную группу. Иллюстративные сульфгидрильные соединения, применяемые в качестве стабилизаторов, в качестве неограничивающих примеров включают, N-ацетил-L-цистеин (NAC) D,L-цистеин, γ-глутамилцистеин, глутатион, 2,3-димеркапто-1-пропанол, 1,4-бутандитиол и другие биологически совместимые сульфгидрильные соединения. Как правило, предпочтительно, чтобы стабилизатор являлся биологически совместимым и нетоксичным в количествах, в которых его включают в композиции и составы по изобретению. В иллюстративном варианте осуществления стабилизатором является сам PEG. Таким образом, в различных вариантах осуществления PEG, конъюгированный с Hb, устраняет необходимость в отдельном стабилизаторе или в отдельном водорастворимом стабилизирующем компоненте. Таким образом, изобретение относится к составам, эквивалентным указанным в настоящем документе составам, содержащим водорастворимый стабилизирующий компонент, которые фактически не содержат этот компонент.

Как применяют в настоящем документе, такие термины, как "индивидуум", "пациент" и "млекопитающее" используют взаимозаменяемо и их примером является человек.

Как применяют в настоящем документе, "донор оксида азота" или "донор NO" относится к соединениям, служащим донорами, высвобождающим и/или непосредственно или опосредованно переносящим молекулы монооксида азота, и/или стимулирующим эндогенную продукцию оксида азота или эндотелиального фактора релаксации (EDRF) in vivo, и/или повышающим эндогенные уровни оксида азота или EDRF in vivo и/или, окисляющимся с получением оксида азота, и/или являющимися субстратами для синтазы оксида азота и/или цитохрома P450. "Донор NO" также включает соединения, которые являются предшественниками L-аргинина, ингибиторами фермента аргиназы и медиаторами оксида азота.

Термин "оксид азота" включает соединения незаряженного оксида азота (NO) и заряженного монооксида азота, предпочтительно заряженные соединения монооксида азота, такие как ион нитрозония (NO⁺) и ион нитроксила (NO^-). Реакционноспособную форму оксида азота можно обеспечить посредством газообразного оксида азота. Структура высвобождающих, доставляющих или переносящих монооксид азота соединений представляет собой F-NO, где F представляет собой высвобождающую, доставляющую или переносящую монооксид азота группу и включает любое и все такие соединения, которые обеспечивают монооксид азота в предназначенном для него месте действия в форме, активной для заданной цели.

Термины "продукты присоединения NO, "предшественник NO" и "высвобождающее NO средство" используют взаимозаменяемо.

В иллюстративных вариантах осуществления термин "гипертонический" относится к раствору пегилированного Hb, содержащего от приблизительно 3% до приблизительно 7% соли.

Варианты осуществления

Приведенное ниже описание относится к вариантам осуществления, приведенным ниже в настоящем документе, а также к вариантам осуществления, указанным выше и в приложенной формуле изобретения. Полагают, что элементы вариантов осуществления можно комбинировать любым образом, и что предоставленное в настоящем документе описание является описанием иллюстративных комбинаций и не является ограничивающим.

В иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к композиции, содержащей водорастворимый функциональный восстановленный природный гемоглобин. В иллюстративных композициях проведена инактивация вирусов. Композиция содержит водорастворимый компонент гемоглобина, содержащий группу функциональных природных молекул гемоглобина. Каждый представитель этой группы молекул гемоглобина находится в восстановленном состоянии, не содержит химических сшивающих средств, и его P₅₀ составляет от приблизительно 22 мм рт.ст. до приблизительно 26 мм рт.ст. Альтернативно, в различных вариантах осуществления P₅₀ гемоглобина составляет от приблизительно 9 мм рт.ст. до приблизительно 12 мм рт.ст.). Композиция также необязательно содержит водорастворимый стабилизирующий компонент. Стабилизирующий компонент помогает поддерживать группу молекул гемоглобина в восстановленном состоянии. В различных вариантах осуществления стабилизирующий компонент содержит стабилизатор. Иллюстративные стабилизаторы содержат структурный элемент, более реакционноспособный в отношении кислорода, чем восстановленные молекулы гемоглобина. Также композиция содержит компонент водного разбавителя. Компонент разбавителя содержит фармацевтически приемлемый разбавитель, в котором растворимы компонент гемоглобина и стабилизирующий компонент. В различных вариантах осуществления композиция по существу лишена вирусной активности. В иллюстративных вариантах осуществления композиция содержит менее 10% метгемоглобина.

Fe (II) восстановленного гемоглобина любого из соединений по изобретению может быть связан с CO или он по существу может быть не связан с кислородом или CO. В различных вариантах осуществления Fe (II) молекул восстановленного гемоглобина не связано ни с кислородом, ни с монооксидом углерода. В различных вариантах осуществления молекула гемоглобина является представителем группы молекул гемоглобина. В этом варианте осуществления иллюстративная группа молекул гемоглобина содержит менее 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или менее 1% молекул гемоглобина в оксигенированном состоянии.

Стабилизирующий компонент композиции содержит средство, предотвращающее или задерживающее окисление восстановленного гемоглобина. Можно использовать любой удобный и эффективный стабилизатор. В различных вариантах осуществления стабилизатор представляет собой стабилизатор, хорошо переносимый биологическими системами, и который можно безопасно вводить млекопитающим. Иллюстративным стабилизатором в стабилизирующем компоненте является амин, такой как аминокислота или тиольное соединение. Иллюстративным стабилизатором является тиолсодержащая аминокислота, аналог аминокислоты или миметик аминокислоты. В различных вариантах осуществления аминокислота выбрана из природных и неприродных аминокислот, например, цистеина.

В различных вариантах осуществления композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, такой как компонент разбавителя, содержащий соль. Соль можно выбирать по существу из любой соли, хотя в настоящее время предпочтительными являются соли, которые фармацевтически приемлемы для доставки млекопитающему. В различных вариантах осуществления композиция содержит хлорид натрия. Композиции по изобретению являются изотоническими, гипертоническими или гипотоническими. В различных вариантах осуществления композиция является гипертонической. В иллюстративном варианте осуществления композиция содержит достаточно хлорида натрия, чтобы она была гипертонической. В других вариантах осуществления разбавитель представляет собой тонический фосфатно-солевой буфер.

В иллюстративных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к компонентам гемоглобина по существу без синтетических сшивающих групп, ковалентно связывающих две или более молекул гемоглобина. Хотя при получении или хранении композиций по изобретению может образовываться небольшой процент сшивок между молекулами гемоглобина, эти сшитые соединения представляют собой небольшой процент всего гемоглобина, и их преднамеренно не получают и не отбирают при очистке. Таким образом, иллюстративные композиции по изобретению, как правило, содержат группу молекул гемоглобина, в которой менее 10%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2% или менее 1% всего содержания гемоглобина находится в форме двух или более молекул гемоглобина в сшитом состоянии.

Гемоглобин, применяемый по настоящему изобретению, получают по существу из любого источника млекопитающих. Иллюстративные источники гемоглобина включают обычных домашних животных, например, коров, свиней, овец и т.п. Изобретение не ограничено источником гемоглобина. В различных вариантах осуществления гемоглобин представляет собой бычий гемоглобин.

Композиции гемоглобина по изобретению содержат минимальные количества метгемоглобина. В различных композициях количество метгемоглобина составляет менее 10%, менее 9%, менее 8%, менее 7%, менее 6%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2% или менее 1%.

В иллюстративном варианте осуществления гемоглобин до комбинации со стабилизирующим компонентом является выделенным.

Изобретение относится к ковалентным конъюгатам гемоглобина с водорастворимыми полимерами. Специалистам в данной области известно и пригодно в практическом осуществлении настоящего изобретения множество водорастворимых полимеров. Термин водорастворимый полимер включает такие соединения, как сахариды (например, декстран, амилоза, гиалуроновая кислота, поли(сиаловая кислота), гепараны, гепарины и т.д.); поли(аминокислоты), например, поли(аспарагиновая кислота) и поли(глутаминовая кислота); нуклеиновые кислоты; синтетические полимеры (например, поли(акриловая кислота), поли(простые эфиры), например, полиэтиленгликоль)); пептиды, белки и т.п. Настоящее изобретение можно осуществлять с любым водорастворимым полимером с единственным ограничением, что полимер должен содержать участок, с которым может связываться оставшаяся часть конъюгата.

Таким образом, в иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к композиции гемоглобина с инактивированными вирусами, содержащей ковалентный конъюгат между молекулой функционального восстановленного природного гемоглобина и по меньшей мере одной группой водорастворимого полимера. Композиция содержит водорастворимый компонент гемоглобина, содержащий группу молекул гемоглобина. Каждый представитель группы молекул гемоглобина является восстановленным. В иллюстративных вариантах осуществления с гемоглобином посредством аминогруппы аминокислотного остатка ковалентно конъюгирован водорастворимый полимер. Гемоглобин по существу не содержит введенных химических сшивающих средств. В различных вариантах осуществления P₅₀ гемоглобина составляет от приблизительно 22 мм рт.ст. до приблизительно 26 мм рт.ст. В различных вариантах осуществления P₅₀ составляет от приблизительно 9 мм рт.ст. до приблизительно 12 мм рт.ст. Композиция также содержит водорастворимый стабилизирующий компонент, обеспечивающий устойчивость группы молекул гемоглобина к окислению. Стабилизирующий компонент содержит стабилизатор. Иллюстративные стабилизаторы содержат по меньшей мере один структурный элемент, который более реакционноспособен в отношении кислорода, чем группа молекул гемоглобина. Различные составы также содержат компонент разбавителя, содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель, в котором растворим компонент гемоглобина. Иллюстративные составы по существу лишены вирусной активности и содержат менее чем приблизительно 10% метгемоглобина.

Способы активации полимеров также можно найти в WO 94/17039, патенте США № 5324844, WO 94/18247, WO 94/04193, патенте США № 5219564, патенте США № 5122614, WO 90/13540, патенте США № 5281698 и дополнительно WO 93/15189, и для конъюгации между активированными полимерами и пептидами, например, фактором свертывания VIII (WO 94/15625), гемоглобином (WO 94/09027), молекулой-переносчиком кислорода (патент США № 4412989), рибонуклеазой и супероксиддисмутазой (Veronese at al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)).

Молекулярную массу в случае водорастворимого полимера, применяемого в композициях по изобретению, такого как PEG, можно выражать или как среднечисловую молекулярную массу, или как средневзвешенную молекулярную массу. Если не указано иначе, все указания на молекулярную массу в настоящем документе относятся к средневзвешенной молекулярной массе. Оба определения молекулярной массы, среднечисловое и средневзвешенное, можно проводить с использованием гель-хроматографии, или других способов жидкостной хроматографии. Также можно использовать другие способы определения величин молекулярной массы, такие как использование анализа концевых групп или измерения коллигативных свойств (например, снижение температуры замерзания, повышение температуры кипения или осмотическое давление) для определения среднечисловой молекулярной массы, или использование способов светорассеяния, ультрацентрифугирования или вискозиметрии для определения средневзвешенной молекулярной массы. Полимерные реагенты по изобретению, как правило, являются полидисперсными (т.е., среднечисловая молекулярная масса и средневзвешенная молекулярная масса полимеров не равны), обладая низкими значениями полидисперсности предпочтительно менее чем приблизительно 1,2, более предпочтительно менее чем приблизительно 1,15, еще более предпочтительно менее чем приблизительно 1,10, еще более предпочтительно менее чем приблизительно 1,05, и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 1,03. Иллюстративные водорастворимые полимеры представляют собой полимеры, в которых молекулярная масса значительной части молекул полимера в образце полимера приблизительно одинакова; такие полимеры являются "гомодисперсными".

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано на основе конъюгата с поли(этиленгликолем). Доступно несколько обзоров и монографий о функционализации и конъюгации PEG. См., например, Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); и Bhadra, et al., Pharmazie, 57: 5-29 (2002). Способы получения реакционноспособных молекул PEG и получения конъюгатов с применением реакционноспособных молекул известны в данной области. Например, в патенте США № 5672662 описан водорастворимый и выделяемый конъюгат активного сложного эфира полимерной кислоты, выбранный из линейных или разветвленных поли(алкиленоксидов), поли(оксиэтилированных полиолов), поли(олефиновых спиртов) и поли(акриломорфолина).

В патенте США № 6376604 приведен способ получения водорастворимого сложного 1-бензотриазолилкарбонатного эфира водорастворимого и непептидного полимера посредством реакции концевого гидроксила полимера с ди(1-бензотриазолил)карбонатом в органическом растворителе. Активный сложный эфир применяют для получения конъюгатов с биологически активным средством, таким как белок или пептид.

В WO 99/45964 описан конъюгат, содержащий биологически активное средство и активированный водорастворимый полимер, содержащий каркас полимера по меньшей мере с одним концом, связанным с каркасом полимера посредством стабильной связи, где по меньшей мере один конец содержит разветвленную группу с проксимальными реакционноспособными группами, связанными с разветвленной группой, в котором биологически активное средство связано по меньшей мере с одной из проксимальных реакционноспособных групп. Другие разветвленные поли(этиленгликоли) описаны в WO 96/21469, в патенте США № 5932462 описан конъюгат, образуемый с разветвленной молекулой PEG, содержащей разветвленный конец, содержащий реакционноспособные функциональные группы. Свободные реакционноспособные группы доступны для реакции с биологически активными соединениями, такими как белок или пептид, образуя конъюгаты между поли(этиленгликолем) и биологически активными молекулами. В патенте США № 5446090 описан бифункциональный PEG линкер и его применение в получении конъюгатов с пептидом на каждом из концов PEG линкера.

В WO 99/34833 и WO 99/14259, а также в патенте США № 6348558 описаны конъюгаты, содержащие разрушаемые связи с PEG. Такие разрушаемые связи пригодны по настоящему изобретению.

По настоящему изобретению для получения разветвленных полимеров указанных в настоящем документе, а также для конъюгации этих разветвленных полимеров с другими соединениями, например, сахарами, нуклеотидами сахара и т.п. пригодны известные в данной области способы активации полимеров, указанные выше.

Иллюстративным водорастворимым полимером является поли(этиленгликоль), например, метоксиполи(этиленгликоль). Поли(этиленгликоль) используемый по настоящему изобретению не ограничен какой-либо конкретной формой или диапазоном молекулярных масс. Для молекул поли(этиленгликоля) с линейной цепью молекулярная масса предпочтительно составляет от 500 до 100000. Предпочтительно используют молекулярную массу 2000-60000, а предпочтительно - от приблизительно 5000 до приблизительно 40000. В иллюстративном варианте осуществления применяемый PEG представляет собой метокси-PEG со средней молекулярной массой приблизительно 5000.

В другом варианте осуществления поли(этиленгликоль) представляет собой разветвленный PEG с более чем одной присоединенной группой PEG. Примеры разветвленных PEG описаны в патенте США № 5932462; патенте США № 5342940; патенте США № 5643575; патенте США № 5919455; патенте США № 6113906; патенте США № 5183660; WO 02/09766; Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994); и Yamasaki et al., Agric. Biol. Chem., 52: 2125-2127, 1998. В предпочтительном варианте осуществления молекулярная масса каждого поли(этиленгликоля) разветвленного PEG меньше или равна 40000 дальтон.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к конъюгату гемоглобина с присоединенными к нему одной или несколькими группами PEG. PEG-гемоглобин находится в форме с CO. В иллюстративном варианте осуществления этот конъюгат формулируют в фосфатно-солевом буфере.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к конъюгату гемоглобина с присоединенными к нему одной или несколькими группами PEG. В различных вариантах осуществления PEG-гемоглобин является восстановленным и не находится в форме с CO. В других вариантах осуществления PEG-гемоглобин находится в форме с CO. В иллюстративном варианте осуществления этот конъюгат PEG-Hb, находящийся в любой из оксигенированной, CO или несвязанной форме, формулируют в гипертоническом солевом растворе (высокая концентрация соли). Иллюстративные концентрации соли (например, NaCl), используемые в этих гипертонических составах, составляют от приблизительно 4% до приблизительно 8%, от приблизительно 4,5% до приблизительно 7,5% или от приблизительно 5% до приблизительно 7%. Иллюстративные составы содержат приблизительно 4%, приблизительно 5%, приблизительно 6%, приблизительно 7% или приблизительно 8% соли. В одном из составов концентрация соли составляет 7,5%. В различных вариантах осуществления соль представляет собой NaCl. В иллюстративных вариантах осуществления осмоляльность состава составляет приблизительно 300-400, или приблизительно 325-375, или от приблизительно 340-360 мосмоль. В иллюстративном варианте осуществления соль представляет собой NaCl.

В иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к жидкости для реанимации на основе PEG-Hb для корректировки коагулопатии по меньшей мере с 75%, по меньшей мере с 80%, по меньшей мере с 85%, по меньшей мере с 90% по меньшей мере 95% или приблизительно со 100% эффективностью, эквивалентной свежезамороженной плазме. Иллюстративные составы по данному варианту осуществления дополнительно включают факторы свертывания, тромбоциты или другие вещества, для которых известно, что они помогают уменьшению коагулопатии.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к жидкости для реанимации с PEG-Hb с общим объемом жидкости приблизительно 450 мл и со способностью к переносу кислорода и/или диффузии кислорода, эквивалентной одной единице эритроцитарной массы, предпочтительно из эритроцитов человека.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к составу с PEG-Hb (например, жидкости для реанимации), способному к переносу CO и его диффузии в тканях. Иллюстративный состав обладает общим объемом жидкости приблизительно 450 мл и способностью к переносу CO и/или диффузии CO, достаточной для переноса в ткань терапевтически значимого количества CO.

В иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к жидкости для реанимации с PEG-Hb, с находящимися в ней факторами свертывания. В различных вариантах осуществления факторы свертывания присутствуют в количестве не менее 60%, не менее 70%, не менее 80% или не менее 90% от свежей замороженной плазмы.

В иллюстративном варианте осуществления жидкость для реанимации содержит тромбоциты. В основном предпочтительно, чтобы жидкости для реанимации по изобретению содержали тромбоциты с количеством и активностью клеток, которое составляет не менее 60%, не менее 70%, не менее 80%, не менее 90% или было приблизительно равным количеству и активности одной единицы при аферезе.

Важной задачей настоящего изобретения является стабильность при хранении. В различных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к жидкости для реанимации с PEG-Hb, которая стабильна при температуре окружающей среды (≈25°C) в течение по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере шести месяцев, по меньшей мере 9 месяцев или по меньшей мере 12 месяцев.

Настоящее изобретение в различных вариантах осуществления также относится к жидкости для реанимации с PEG-Hb, которая является не более иммуногенной, чем современные консервированные препараты крови в банках. Также предоставлена жидкость для реанимации с PEG-Hb, которая не более тромбогенна, чем современные консервированные препараты крови.

Иллюстративные составы по изобретению обладают одной или несколькими из этих характеристик в любой комбинации: приблизительно 4,0-4,6% масс. Hb, приблизительно 1,0-5,0% масс. Met, приблизительно 0,0-5,0% HbO₂, приблизительно 95,0-100,0% HbCO, pH приблизительно 8,10-8,20, осмоляльность приблизительно 325-370 мосмоль, P₅₀ (мм рт.ст.) приблизительно 10,00-14,00 и оптический спектр с основными пиками при 538 нм и 568 нм с оптической плотностью приблизительно 1,4 и 1,9, соответственно, отношением пиков при 568 нм/500 нм 2,5-3,0. В других иллюстративных составах состав обладает оптическим спектром с основными пиками при 541 и 576 нм.

Даже более конкретно иллюстративные составы по изобретению обладают одной или несколькими из этих характеристик в любой комбинации: приблизительно 4,5% масс. Hb, приблизительно 1,1% масс. Met, приблизительно 1,2% HbO₂, приблизительно 99,4% HbCO, pH приблизительно 8,14, осмоляльность приблизительно 356 мосмоль, P₅₀ (мм рт.ст.) приблизительно 12,2 и оптический спектр с основными пиками при 538 нм и 568 нм с оптической плотностью приблизительно 1,493 и приблизительно 1,465, соответственно, и отношением пиков при 568 нм/500 нм приблизительно 2,6.

Получение конъюгатов

Получение гемоглобина с инактивированными вирусами

Исходный гемоглобин, применяемый при получении конъюгатов по изобретению, можно выделять из эритроцитов (RBC). Подходящие источники RBC включают кровь человека, кровь быка, кровь овцы, кровь свиньи, кровь других видов и трансгенно полученный гемоглобин, такой как трансгенный Hb, описанный в BIO/TECHNOLOGY, 12: 55-59 (1994).

Кровь можно получать у живых или только что забитых доноров. Один из способов сбора цельной крови быка описан в патентах США №№ 5084558 и 5296465, выданных Rausch et al. Предпочтительно, чтобы кровь собирали в санитарных условиях.

В данной области известно множество способов выделения и очистки гемоглобина; эти способы в основном применимы для композиций по настоящему изобретению. Следующее далее в настоящем документе описание является иллюстративным и неограничивающим.

В различных вариантах осуществления при получении или вскоре после него кровь необязательно смешивают по меньшей мере с одним антикоагулянтом для предотвращения значительного свертывания крови. Подходящие антикоагулянты для крови являются такими, какие обычно известны в данной области, и они включают, например, цитрат натрия, этилендиаминтетрауксусную кислоту и гепарин. При смешивании с кровью антикоагулянт может находиться в твердой форме, такой как порошок, или в водном растворе.

Раствор крови до или в течение этапа антикоагуляции можно фильтровать, например, проводя фильтрование для удаления больших агрегатов и частиц. Примером подходящего фильтра является сетчатый фильтр с 600 меш.

Затем RBC в растворе крови для отделения RBC от внеклеточных белков плазмы, таких как сывороточные альбумины или антитела (например, иммуноглобулины (IgG)) необязательно отмывают подходящими способами, такими как посредством диафильтрации или посредством комбинации раздельных этапов разбавления и концентрации по меньшей мере в одном растворе, таком как изотонический раствор. Следует понимать, что RBC можно отмывать порционно или в режиме с непрерывной подачей.

Подходящие изотонические растворы также известны в данной области и приносят большую пользу при получении составов по изобретению. Иллюстративный изотонический раствор обладает нейтральным pH, и осмолярностью приблизительно 285-315 мосмоль. Неограничивающие примеры изотонических растворов включают такие растворы, как цитратный/солевой раствор с pH и осмолярностью, не разрушающими клеточные мембраны RBC, и вытесняющие плазматическую часть цельной крови. Иллюстративный изотонический раствор состоит из водного раствора дигидрата цитрата натрия (6,0 г/л) и хлорида натрия (8,0 г/л).

Вода, пригодная в способе по изобретению, включает дистиллированную воду, деионизированную воду, воду для инъекций (WFI) и/или воду с низким содержанием пирогенов (LPW). WFI, которая является предпочтительной, представляет собой деионизированную, дистиллированную воду, удовлетворяющую спецификациям U.S. Pharmacological Specifications для воды для инъекций. Кроме того, WFI описана в Pharmaceutical Engineering, 11, 15-23 (1991). LPW, которая является предпочтительной, представляет собой деионизированную воду, содержащую менее 0,002 Эе/мл.

RBC в растворе крови можно отмывать посредством диафильтрации. Подходящие диафильтры включают микропористые мембраны с размером пор, хорошо отделяющим RBC по существу от всех более мелких компонентов раствора крови, такие как фильтр от 0,1 мкм до 0,5 мкм (например, фильтр 0,2 мкм). Одновременно в качестве компенсации непрерывно (или порционно) добавляют профильтрованный изотонический раствор при скорости, равной скорости (или объему) фильтрата, убывающему через диафильтр. При отмывке RBC компоненты раствора крови, которые в диаметре значительно меньше RBC, или являются жидкими, такими как плазма, проходят через стенки диафильтра в фильтрат. RBC, тромбоциты и более крупные тельца разбавленного раствора крови, такие как лейкоциты, сохраняются и смешиваются с изотоническим раствором, который постоянно или порционно добавляют, с получением диализированного раствора крови.

RBC также можно отмывать посредством серии последовательных (или с обращенной последовательностью) этапов разведения и концентрации, где раствор крови разбавляют посредством добавления по меньшей мере одного изотонического раствора, и концентрируют, пропуская через фильтр, таким образом, формируя диализированный раствор крови.

Отмывка RBC завершается, когда уровень белков плазмы, загрязняющих RBC значительно снижается (как правило, по меньшей мере приблизительно на 90%). Дополнительная отмывка RBC может дополнительно отделять внеклеточные белки плазмы от RBC. Например, диафильтрация 6 объемами изотонического раствора может удалять из раствора крови по меньшей мере приблизительно 99% IgG.

Затем к диализированному раствору крови необязательно применяют способы отделения RBC в диализированном растворе крови от лейкоцитов и тромбоцитов, таким как посредством центрифугирования.

Следует понимать, что для отделения RBC от других компонентов крови можно применять другие способы, в основном известные в данной области. Например, седиментацию до отделения RBC от других компонентов крови, где способ отделения не разрушает клеточные мембраны с выделением значительного количества RBC, например, менее чем приблизительно 30% RBC.

После отделения RBC из RBC выделяют гемоглобин с получением содержащего гемоглобин раствора. Выделение можно проводить различными способами, включающими лизис и гипоосмотическое набухание RBC. В способах лизиса можно использовать различные способы лизиса, такие как механический лизис, химический лизис, гипотонический лизис или другие известные способы лизиса, в которых гемоглобин высвобождается без значительного нарушения способности Hb к транспорту и высвобождению кислорода.

Альтернативно, вместо RBC в способе по изобретению можно обрабатывать рекомбинантно полученный гемоглобин, такой как рекомбинантно полученный гемоглобин, описанный в Nature, 356: 258-260 (1992). Бактериальные клетки, содержащие гемоглобин отмывают, и отделяют от примесей, как описано выше. Затем эти бактериальные клетки механически разрушают известными в данной области способами, такими как шаровая мельница, с высвобождением из клеток гемоглобина и с формированием фазы лизированных клеток. Затем эту фазу лизированных клеток обрабатывают так, как будто она является фазой лизированных RBC.

После лизиса фазу лизированных RBC необязательно подвергают ультрафильтрации для удаления более крупного клеточного дебриса, такого как белки с молекулярной массой выше приблизительно 100000 дальтон. В основном клеточный дебрис содержит все целые и фрагментированные клеточные компоненты за исключением Hb, более мелких клеточных белков, электролитов, коферментов и органических промежуточных продуктов метаболизма. Подходящие ультрафильтры включают, например, фильтры на 100000 дальтон.

Можно применять другие способы отделения Hb из фазы лизированных RBC, включая седиментацию, центрифугирование или микрофильтрацию. Затем фильтрат Hb можно подвергать ультрафильтрации с удалением из ультрафильтрата Hb более мелкого клеточного дебриса, электролитов, коферментов, промежуточных продуктов метаболизма и белков с молекулярной массой менее чем приблизительно 30000 дальтон и воды. Подходящие ультрафильтры включают ультрафильтр на 30000 дальтон.

Затем концентрированный раствор Hb можно помещать на одну или несколько параллельных хроматографических колонок для дополнительного отделения гемоглобина от других примесей, таких как антитела, эндотоксины, фосфолипиды и ферменты и вирусы, посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии. Примеры подходящих сред включают анионообменные среды, катионообменные среды, среды с гидрофобными взаимодействиями и аффинные среды. В одном из вариантов осуществления хроматографические колонки содержат анионообменную среду, подходящую для отделения Hb от не являющихся гемоглобином белков. Подходящие анионообменные среды включают, например, диоксид кремния, оксид алюминия, гель диоксида титана, сшитый декстран, агарозу или дериватизированную молекулу, такую как полиакриламид, полигидроксиэтилметакрилат или стиролдивинилбензол, который дериватизирован катионной химической, функциональной группой, такой как диэтиламиноэтильная или четвертичная аминоэтильная группа. Подходящую анионообменную среду и соответствующие элюенты для селективной абсорбции и десорбции Hb по сравнению с другими белками и примесями, которые, возможно, находятся в фазе лизированных RBC, может легко определить специалист в данной области.

Раствор Hb необязательно является дезоксигенированным с получением раствора восстановленного Hb (далее в настоящем документе дезокси-Hb) средствами, которые по существу восстанавливают Hb без значительного снижения способности Hb в элюате Hb к транспорту и высвобождению кислорода, так как это может происходить вследствие денатурации при образовании окисленного гемоглобина (metHb).

Элюат Hb можно дезоксигенировать посредством транспорта инертного газа через фазовую мембрану. Такие инертные газы включают, например, азот, аргон и гелий. Следует понимать, что для дезоксигенирования элюата Hb можно использовать другие способы дезоксигенирования раствора гемоглобина, известные в данной области. Такие другие средства могут включать, например, барботированием элюата Hb азотом, химическую очистку восстановителями, такими как N-ацетил-L-цистеин (NAC), цистеин, дитионит или аскорбат натрия или фотолиз светом. Восстановленный гемоглобин можно преобразовывать в форму с CO.

Дезоксигенирование продолжают до тех пор, пока pO₂ раствора Hb не снизится до желаемого уровня, например, где содержание окисленного Hb (оксигемоглобина или HbO₂) в растворе Hb приблизительно составляет 20% или менее, 10% или менее, 5% или менее 3% или менее или 1% или менее.

При дезоксигенировании температуру раствора Hb, как правило, поддерживают на уровне, который уравновешивает скорость дезоксигенирования относительно скорости образования метгемоглобина. Температуру поддерживают так, чтобы ограничить содержание метгемоглобина до менее 20%. Оптимальная температура приводит к содержанию метгемоглобина менее чем приблизительно 5%, а предпочтительно - к содержанию метгемоглобина менее чем приблизительно 2,5%, при продолжающемся дезоксигенировании раствора Hb. Как правило, при дезоксигенировании температуру раствора Hb поддерживают от приблизительно 15°C до приблизительно 35°C. При дезоксигенировании, а затем на всем протяжении оставшихся этапов способа по изобретению, Hb поддерживают в среде с низким содержанием кислорода для минимизации поглощения кислорода Hb.

Восстановленный Hb необязательно уравновешивают буфером для хранения с низким содержанием кислорода, содержащим стабилизатор, например, сульфгидрильное соединение, для формирования стабилизированного в отношении окисления дезокси-Hb. Подходящие сульфгидрильные соединения включают нетоксические средства, такие как N-ацетил-L-цистеин (NAC), D,L-цистеин, γ-глутамилцистеин, глутатион, 2,3-димеркапто-1-пропанол, 1,4-бутандитиол и другие биологически совместимые сульфгидрильные соединения. Добавляют определенное количество сульфгидрильного соединения для получения концентрации сульфгидрильного соединения, которая удаляет кислород с поддержанием содержания метгемоглобина на протяжении периода хранения, на уровне менее чем приблизительно 15%, менее чем приблизительно 10% или менее чем приблизительно 5%. Как правило, добавляемое количество сульфгидрильного соединения представляет собой количество, достаточное для получения концентрации сульфгидрильного соединения от приблизительно 0,05% и приблизительно 0,2% по массе.

Изобретение в различных вариантах осуществления относится к композиции гемоглобина с инактивированными вирусами, содержащей водорастворимый функциональный восстановленный природный гемоглобин. Композицию получают способом, включающим подвергание раствора восстановленного гемоглобина и стабилизатора способу термической инактивации вирусов. В иллюстративном варианте осуществления способ термической инактивации вирусов включает воздействия на раствор температуры, в достаточной степени высокой для инактивации по существу все вирусной активности в указанном растворе; повышенную температуру поддерживают в течение периода времени, достаточного для обеспечения инактивации по существу всей вирусной активности в растворе. Иллюстративный стабилизатор содержит структурный элемент, более реакционноспособный в отношении кислорода, чем восстановленный гемоглобин в растворе, таким образом, минимизируя связывание кислорода восстановленным гемоглобином. Раствор содержит количество стабилизатора, достаточное для предотвращения образования в процессе тепловой инактивации вирусов более чем приблизительно 10%, 8%, 6%, 4% или 2% метгемоглобина. В различных вариантах осуществления стабилизатор выбран и присутствует в количестве, достаточном для поддержания концентрации метгемоглобина на уровне приблизительно 5% или ниже.

В различных вариантах осуществления композиция содержит ковалентный конъюгат гемоглобина и по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере приблизительно 10 групп водорастворимого полимера, связанных с гемоглобином. Водорастворимые полимеры связаны с любым подходящим остатком в гемоглобине. В иллюстративном конъюгате по изобретению одна или несколько групп водорастворимого полимера связаны с боковыми цепями аминокислот, например, ε-аминогруппы остатка лизина. В иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к конъюгату PEG-Hb, как указано выше, в котором каждая молекула Hb конъюгирована с 7, 8, 9 или 10 группами PEG. В различных вариантах осуществления изобретение относится к группе конъюгатов PEG-Hb, в которой среднее количество групп PEG на молекулу Hb составляет от приблизительно 7 до приблизительно 10, или приблизительно 8 и приблизительно 9. В иллюстративном варианте осуществления группа PEG представляет собой группу PEG 5000.

Синтез конъюгатов

В различных вариантах осуществления изобретение относится к конъюгатам одной или нескольких молекул водорастворимого полимера и полипептида гемоглобина. В иллюстративном варианте осуществления исходный гемоглобин представляет собой композицию гемоглобина с инактивированными вирусами, содержащую водорастворимый функциональный восстановленный природный гемоглобин. Композицию получают способом, включающим подвергание раствора восстановленного гемоглобина и стабилизатор способу термической инактивации вирусов. В иллюстративном варианте осуществления способ термической инактивации вирусов включает воздействие на раствор температуры, в достаточной степени высокой для инактивации в указанном растворе по существу всей вирусной активности; повышенную температуру поддерживают в течение периода времени, достаточного для обеспечения инактивации по существу всей вирусной активности в растворе. Иллюстративный стабилизатор содержит структурный элемент, более реакционноспособный в отношении кислорода, чем восстановленный гемоглобин в растворе, таким образом, минимизируя связывание кислорода восстановленным гемоглобином. Раствор содержит количество стабилизатора, достаточное для предотвращения образования в процессе тепловой инактивации вирусов более чем приблизительно 10%, 8%, 6%, 4% или 2% метгемоглобина. В различных вариантах осуществления стабилизатор выбран и присутствует в количестве, достаточном для поддержания концентрации метгемоглобина на уровне приблизительно 5% или ниже.

В различных вариантах осуществления исходный полипептид гемоглобина представляет собой композицию гемоглобина с инактивированными вирусами, содержащую водорастворимый функциональный восстановленный природный гемоглобин. Композиция содержит менее чем приблизительно 10% метгемоглобина, и ее получают способом, включающим нагревание раствора исходного гемоглобина до приблизительно 60°C в течение срока до приблизительно 12 часов, например, от приблизительно 1 часа до приблизительно 4 часов. Исходный раствор необязательно содержит стабилизатор. Стабилизатор содержит структуру, которая более легко реагирует с кислородом или активными формами кислорода, чем это делают молекулы гемоглобина в растворе, таким образом, минимизируя связывание кислорода восстановленным гемоглобином и, таким образом, формируя указанную композицию.

Конъюгаты водорастворимых полимеров и пептида гемоглобина с инактивированными вирусами можно формировать реакцией активированного производного водорастворимого полимера и гемоглобина в подходящих условиях. В различных вариантах осуществления водорастворимый полимер конъюгирован с гемоглобином посредством боковой цепи аминокислотного остатка, например, ε-аминогруппы остатка лизина. Иллюстративные конъюгаты по изобретению содержат по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 молекул водорастворимого полимера, связанных с гемоглобином.

В иллюстративном способе получения конъюгата по изобретению композиция исходного гемоглобина с инактивированными вирусами является оксигенированной, и окисленный гемоглобин находится в контакте с молекулой активированного водорастворимого полимера с реакционноспособностью в отношении аминокислотного остатка гемоглобина, таким образом, образуя ковалентный конъюгат водорастворимого полимера и молекулами окисленного гемоглобина в растворе окисленного гемоглобина. В иллюстративном варианте осуществления гемоглобин ковалентного конъюгата является восстановленным или связанным с CO. Дезоксигенация может являться механической или химической, позволяющей получать молекулу гемоглобина, в которой железо является или несвязанным или связанным с CO.

Как правило, молекулу водорастворимого полимера (например, PEG) и полипептид связывают вместе с использованием реакционноспособных групп, которые, как правило, преобразуются в процессе связывания в новую органическую, функциональную группу или соединение, которые являются нереакционноспособными в физиологически значимых условиях. Реакционноспособная функциональная группа(ы) расположена в любых положениях пептида и водорастворимого полимера. Реакционноспособные группы и классы реакций, пригодных при практическом осуществлении настоящего изобретения в основном являются такими, которые хорошо известны в области химии биоконъюгатов. Предпочитаемыми в настоящее время классами реакций, пригодными для реакционноспособных групп аминокислот являются классы реакций, которые проходят в относительно мягких условиях. В качестве неограничивающих примеров они включают нуклеофильное замещение (например, реакции аминов и спиртов с ацилгалогенидами, активным сложными эфирами), электрофильное замещение (например, реакции с енаминами) и присоединение по множественным связям углерод-углерод и углерод-гетероатом (например, реакция Михаэля, присоединение Дильса-Альдера). Эти и другие пригодные реакции описаны, например, в March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; и Feeney et al., Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982.

Пригодные реакционноспособные функциональные группы, находящиеся на полипептиде гемоглобина или водорастворимом полимере, в качестве неограничивающих примеров включают:

(a) карбоксильные группы и различные их производные, включая в качестве неограничивающих примеров сложные N-гидроксисукцинимидные эфиры, сложные N-гидроксибензтриазольные эфиры, галогенангидриды, ацилимидазолы, сложные тиоэфиры, сложные п-нитрофенильные эфиры, алкильные, алкенильные, алкинильные и ароматические сложные эфиры;

(b) гидроксильные группы, которые можно преобразовывать, например, в сложные эфиры, простые эфиры, альдегиды и т.д.

(c) галогеналкильные группы, где галоген позже можно замещать нуклеофильной группой, например, такой как амин, карбоксилатный анион, тиольный анион, карбанион или алкоксидный ион, таким образом, получая ковалентное связывание новой группы по функциональной группе атома галогена;

(d) диенофильные группы, способные к участию в реакциях Дильса-Альдера, например, такие как малеимидные группы;

(e) альдегидные или кетоновые группы, так, что возможна последующая дериватизация посредством получения карбонильных производных, например, таких как имины, гидразоны, семикарбазоны или оксимы, или посредством таких механизмов, как присоединение Гриньяра или присоединение алкиллития;

(f) сульфонилгалогенидные группы для последующей реакции с аминами, например, с образованием сульфонамидов;

(g) тиольные группы, которые можно преобразовывать, например, в дисульфиды, или проводить их реакцию с ацилгалогенидами, или преобразовывать в тиоэфиры, например, реакцией с малеимидами;

(h) аминовые или сульфгидрильные группы, которые могут быть, например, ацилированными, алкилированными или окисленными;

(i) алкены, которые можно подвергать, например, циклоприсоединению, ацилированию, реакции Майкла и т.д.

(j) эпоксиды, которые могут реагировать, например, с аминами и гидроксильными соединениями, и

(k) малеимиды, которые могут реагировать, например, с аминами и сульфгидрилами.

Реакционноспособные функциональные группы можно выбирать так, чтобы они не участвовали в реакциях, необходимых для сборки реакционноспособной полимерной модифицирующей группы (например, PEG), или не препятствовали им. Альтернативно, реакционноспособную функциональную группу можно защищать от участия в реакции наличием защитной группы. Специалисты в данной области понимают, как защитить конкретную функциональную группу так, чтобы она не препятствовала выбранному набору условий реакции. Для примеров, пригодных защитных групп, см., например, Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.

Подходящие условия конъюгации представляют собой условия продолжительности по времени, температуры, pH, концентрации реагентов, функциональных групп(ы) реагентов, доступных функциональных групп на активном средстве, растворителя и т.п., достаточные для проведения конъюгации между полимерным реагентом и активным средством. Как известно в данной области, конкретные условия среди прочего зависят от активного средства, типа желательной конъюгации, наличия в реакционной смеси других веществ и т.д. Специалист в данной области сможет определить условия, достаточные для проведения конъюгации любом конкретном случае, после прочтения описания в настоящем документе, ссылок на соответствующую литературу и/или посредством общепринятого экспериментирования.

Например, когда полимерный реагент содержит активный сложный N-гидроксисукцинимидный эфир (например, сукцинимидилсукцинат, сукцинимидилкарбонат, сукцинимидилпропионат и сукцинимидилбутаноат), а активное средство содержит аминогруппу (например, концевую аминогруппу на полипептиде и/или эпсилон-амин содержащего лизин полипептида), конъюгацию можно проводить при pH от приблизительно 7,5 до приблизительно 9,5 при комнатной температуре. Кроме того, когда полимерный реагент содержит винилсульфоновую реакционноспособную группу или малеинимидную группу, а фармакологически активное средство содержит сульфгидрильную группу (например, сульфгидрильную группу содержащего цистеин или содержащего метионин полипептида), конъюгацию можно проводить при pH от приблизительно 7 до приблизительно 8,5 при комнатной температуре. Кроме того, когда реакционноспособная группа, связанная с полимерным реагентом, представляет собой альдегид или кетон, а фармакологически активное средство содержит первичный амин, конъюгацию можно проводить посредством восстановительного аминирования, где первичный амин фармакологически активного средства реагирует с альдегидом или кетоном полимера. Проводимое при pH от приблизительно 6 до приблизительно 9,5, восстановительное аминирование сначала приводит к конъюгату, где фармакологически активное средство и полимер связаны иминной связью. Последующая обработка иминсодержащего конъюгата подходящим восстановителем, таким как NaCNBH₃ восстанавливает имин до вторичного амина.

Иллюстративные условия конъюгации включают проведение реакции конъюгации при pH от приблизительно 4 до приблизительно 10, и, например, при pH приблизительно 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 или 10,0. Реакции позволяют протекать от приблизительно 5 минут до приблизительно 72 часов, например, от приблизительно 30 минут до приблизительно 48 часов, например, от приблизительно 4 часов до приблизительно 24 часов. Температура, при которой можно проводить реакцию, как правило, хотя и не обязательно, находится в диапазоне от приблизительно 0°C до приблизительно 40°C, и часто представляет собой комнатную температуру или ниже. Реакции конъюгации часто проводят и с использованием раствора фосфатного буфера, ацетата натрия или сходной системы.

В отношении концентрации реагентов, как правило, с гемоглобином комбинируют избыток полимерного реагента. Иллюстративные отношения полимерного реагента и гемоглобина включают молярные соотношения приблизительно 1:1 (полимерный реагент:гемоглобин), 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1 или 30:1. В различных вариантах осуществления реакции конъюгации позволяют проходить по существу до тех пор, пока конъюгация больше не будет происходить, что, как правило, можно определять, контролируя прохождение реакции с течением времени.

Прохождение реакции можно контролировать, отбирая аликвоты из реакционной смеси в различные моменты времени и анализируя реакционную смесь посредством SDS-PAGE или масс-спектрометрии MALDI-TOF или любым другим подходящим аналитическим способом. После достижения плато относительно количества образующегося конъюгата или количества оставшегося неконъюгированного полимерного реагента реакцию считают завершенной. Как правило, реакция конъюгации занимает от приблизительно нескольких минут до нескольких часов (например, от 5 минут до 24 часов или более). Полученную смесь продуктов предпочтительно, но не обязательно, очищают для отделения избытка полимерного реагента, неконъюгированных реагентов (например, активного средства) и нежелательных конъюгированных несколько раз соединений. Затем полученные конъюгаты можно дополнительно характеризовать аналитическими способами, такими как MALDI, капиллярный электрофорез, электрофорез в геле и/или хроматография.

Конъюгаты полимер-гемоглобин можно очищать с получением/выделением различных конъюгированных соединений. Альтернативно и более предпочтительно для полимерных реагентов с более низкой молекулярной массой (например, менее чем приблизительно 20000 дальтон, более предпочтительно, менее чем приблизительно 10000 дальтон), используемых для получения конъюгатов, смесь продуктов можно очищать с получением распределения количества участков водорастворимого полимера на активное средство. Например, смесь продуктов можно очищать с получением среднего желаемого количества присоединений полимерного реагента на молекулу Hb, как правило, среднего приблизительно 7, 8, 9 или 10 присоединений на молекулу Hb. Стратегия очистки конечной реакционной смеси конъюгатов зависит от ряда факторов, включая, например, молекулярную массу используемого полимерного реагента, конкретный состав Hb, желаемую схему дозирования и остаточную активность и свойства in vivo конкретного конъюгата(ов).

При желании, можно выделять конъюгаты с различными молекулярными массами с применением гель-фильтрационной хроматографии. Таким образом, гель-фильтрационную хроматографию применяют для фракционирования различных числовых отношений полимерный реагент-к-активному средству (например, 1-меров, 2-меров, 3-меров и т.д., где "1-мер" означает 1 полимерный реагент на активное средство, "2-мер" означает два полимерных реагента на активное средство и т.д.) на основании их различных молекулярных масс (где различие по существу соответствует средней молекулярной массе участков водорастворимого полимера). Например, в иллюстративной реакции, где белок массой 100000 дальтон случайным образом конъюгируют с разветвленным PEG с общей молекулярной массой приблизительно 20000 дальтон (где молекулярная масса каждой "ветви" разветвленного полимера PEG составляет приблизительно 10000 дальтон), получаемая реакционная смесь может содержать немодифицированный белок (с молекулярной массой приблизительно 100000 дальтон), монопегилированный белок (с молекулярной массой приблизительно 120000 дальтон), дипегилированный белок (с молекулярной массой приблизительно 140000 дальтон) и т.д.

Хотя этот подход можно использовать для разделения PEG и других конъюгатов полимер-активное средство с различными молекулярными массами, этот подход, как правило, неэффективен для разделения позиционных изомеров с различными участками присоединения в белке. Например, гель-фильтрационную хроматографию можно использовать для разделения друг от друга смесей 1-меров, 2-меров, 3-меров и т.д. PEG, хотя каждая из выделенных композиций PEG-меров может содержать PEG, присоединенные к различным реакционноспособным аминогруппам (например, остаткам лизина) в активном средстве.

Колонка для гель-фильтрации, подходящая для проведения разделения такого типа включает колонки Superdex™ и Sephadex™, доступные в Amersham Biosciences (Piscataway, N.J.). Выбор конкретной колонки зависит от желаемого диапазона фракционирования. Как правило, элюирование проводят с использованием подходящего буфера, такого как фосфат, ацетат или т.п. Собранные фракции можно анализировать рядом различных способов, например, (i) посредством оптической плотности (OD) при 280 нм на содержание белка, (ii) посредством белкового анализа бычьего сывороточного альбумина (BSA), (iii) анализа содержания PEG с использованием йода (Sims et al. (1980) Anal. Biochem., 107: 60-63), и (iv) электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS PAGE) с последующим окрашиванием иодидом бария.

В различных вариантах осуществления водорастворимый полимер представляет собой PEG, и его молекулярная масса составляет приблизительно 1 кДа, 5 кДа, 10 кДа, 15 кДа, 20 кДа, 30 кДа или 40 кДа. Группы PEG являются линейными или разветвленными соединениями PEG. Концы группы PEG, которые не соединены с полипептидом (или с линкером, присоединенным к полипептиду), могут представлять собой OH или другую группу, например, замещенную или незамещенную алкильную группу O-(C₁-C₄). По настоящему изобретению предпочтителен OMe (где Me представляет собой метильную группу).

В иллюстративном варианте осуществления водорастворимый полимер является линейным или разветвленным PEG. В различных вариантах осуществления конъюгаты содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 групп PEG на пептид. В иллюстративном варианте осуществления водорастворимый полимер представляет собой линейный PEG, и конъюгат содержит приблизительно 6, 7, 8, 9 или 10 групп PEG на пептидную молекулу. В другом иллюстративном варианте осуществления, водорастворимый полимер представляет собой разветвленный PEG, и конъюгат содержит приблизительно 1, 2, 3, 4 или 5 групп PEG на пептидную молекулу.

В иллюстративных вариантах осуществления, в которых PEG представляет собой линейные соединения, молекулярная масса группы PEG составляет от приблизительно 200 Да до приблизительно 20 кДа. В различных вариантах осуществления в которых группа PEG представляет собой линейную группу PEG, молекулярная масса линейного PEG составляет по меньшей мере приблизительно 200 Да, по меньшей мере приблизительно 500 Да, по меньшей мере приблизительно 1 кДа, по меньшей мере приблизительно 2 кДа, по меньшей мере приблизительно 5 кДа, по меньшей мере приблизительно 10 кДа, по меньшей мере приблизительно 20 кДа, по меньшей мере приблизительно 30 кДа или по меньшей мере приблизительно 40 кДа.

Иллюстративные соединения PEG, используемые в изобретении, являются разветвленными PEG с двумя или более ветвями PEG. Пример данного варианта осуществления основан на аминокислоте с боковой цепью, например, серине, цистеине или лизине, и ди-, три- и тетрапептидах, получаемых из этих аминокислот индивидуально или в комбинации.

В других иллюстративных вариантах осуществления, в которых соединения PEG являются разветвленными, разветвленный PEG содержит от 2 до 6 линейных ветвей PEG. Молекулярная масса иллюстративных ветвей PEG составляет от приблизительно 200 Да до приблизительно 30 кДа. В различных вариантах осуществления каждая ветвь обладает отдельно выбранной молекулярной массой, которая составляет по меньшей мере приблизительно 2 кДа, по меньшей мере приблизительно 5 кДа, по меньшей мере приблизительно 10 кДа, по меньшей мере приблизительно 15 кДа, по меньшей мере приблизительно 20 кДа, по меньшей мере приблизительно 30 кДа или по меньшей мере приблизительно 40 кДа.

В различных вариантах осуществления посредством аминогруппы аминокислотного остатка молекул гемоглобина ковалентно конъюгирована по меньшей мере одна группа поли(этиленгликоля). В иллюстративном варианте осуществления аминокислотный остаток представляет собой остаток лизина и по меньшей мере одна группа поли(этиленгликоля) ковалентно конъюгирована с ε-аминогруппой остатка лизина. Иллюстративные мотивы при конъюгации образованы посредством связи, которая является представителем, выбранным из амида и уретана.

Стабильность конъюгатов

В различных вариантах осуществления изобретение относится к конъюгатам PEG-гемоглобин, являющимися высокостабильными, как определяют по их устойчивости к образованию метгемоглобина. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к конъюгату, содержащему менее чем приблизительно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% или 3% метгемоглобина после хранения при 45°C в течение по меньшей мере приблизительно 4 суток, по меньшей мере приблизительно 5 суток, по меньшей мере приблизительно 6 суток, по меньшей мере приблизительно 7 суток, по меньшей мере приблизительно 8 суток, по меньшей мере приблизительно 9 суток, по меньшей мере приблизительно 10 суток, по меньшей мере приблизительно 11 суток, по меньшей мере приблизительно 12 суток, по меньшей мере приблизительно 13 суток, по меньшей мере приблизительно 14 суток или по меньшей мере приблизительно 15 суток.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к конъюгатам PEG-гемоглобин, являющимся высокостабильными, как определяют по их устойчивости к образованию метгемоглобина. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к конъюгату, содержащему менее чем приблизительно 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% или 3% метгемоглобина после хранения при 4°C в течение по меньшей мере приблизительно 5 недель, по меньшей мере приблизительно 6 недель, по меньшей мере приблизительно 7 недель, по меньшей мере приблизительно 8 недель, по меньшей мере приблизительно 9 недель, по меньшей мере приблизительно 10 недель, по меньшей мере приблизительно 11 недель, по меньшей мере приблизительно 12 недель, по меньшей мере приблизительно 13 недель, по меньшей мере приблизительно 14 недель, по меньшей мере приблизительно 15 недель или по меньшей мере приблизительно 16 недель.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к монооксиду углерода (CO), образующему конъюгат PEG-гемоглобин. Полагают, что эта форма является особенно стабильной в отношении сохранения низкого образования %MET-Hb, как показано в таблице 3. Например, форма CO демонстрировала только 4,0% %MET-Hb после хранения при 37°C в течение 16 недель. Она является более стабильной, чем механически дезоксигенированная форма.

Иллюстративный конъюгат по изобретению полностью эффективен в модели гиповолемического шока на животных после хранения при 45°C в течение по меньшей мере приблизительно 3 недель, по меньшей мере приблизительно 4 недель или по меньшей мере приблизительно 5 недель.

В иллюстративном составе по каждому из приведенных выше описаний гемоглобин конъюгата находится в форме с CO. В различных вариантах осуществления изобретение относится к конъюгату PEG-Hb-CO, стабильному при 4°C в течение по меньшей мере приблизительно 3 месяцев, по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, по меньшей мере приблизительно 9 месяцев или по меньшей мере приблизительно 12 месяцев.

Комбинированные составы

В различных иллюстративных вариантах осуществления изобретение относится к комбинированным составам, содержащим один или несколько конъюгатов или составов с PEG-Hb по изобретению в комбинации с другим терапевтическим средством или средством, усиливающим, дополняющим или увеличивающим активность конъюгата PEG-Hb в составе. Иллюстративные средства в качестве неограничивающих примеров включают коагулянты или предшественники коагулянтов, ферменты-антиоксиданты и средства, обеспечивающие профилактику или лечение ишемии/реперфузионного повреждения. Ниже указаны иллюстративные соединения по этим примерам.

В иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к составу, содержащему одну или несколько композиций PEG-Hb по изобретению в комбинации с тромбоцитами.

Тромбоциты представляют собой безъядерные костные клетки крови, происходящие из костного мозга, которые защищают млекопитающие с повреждениями от кровопотери, прикрепляясь к участкам повреждения сосудов и стимулируя образование сгустков плазматического фибрина. Люди со снижением количества циркулирующих тромбоцитов, вследствие недостаточности костного мозга, страдают опасными для жизни спонтанными кровотечениями, а менее тяжелая недостаточность тромбоцитов способствует осложнениям при кровотечении после травмы или хирургического вмешательства.

О тромбоцитах человека известно многое. Основные публикации, в которых описаны способы, материалы и способы хранения тромбоцитов, включают Murphy et al., Blood 60(1): 194-200 (1982); Murphy in "The Preparation and Storage of Platelets for Transfusion", Mammon, Barnhart, Lusher, and Walsh, PJD Publications, Ltd., Westbury, N.Y. (1980); Murphy in "Platelet Transfusion", Progress in Hemostasis and Thrombosis, Vol. Ill, Ed. by T. Spaet, Grune and Stratton, Inc. (1976); Murphy et al., Blood 46(2): 209-218 (1975); Kilkson et al., Blood 64(2): 406-414 (1984); Murphy in "Platelet Storage for Transfusion", Seminars in Hematology 22(3): 165-177 (1985); Simon et al., Transfusion 23: 207-212 (1983); Cesar et al., Transfusion 27(5): 434-437 (1987).

По имеющимся данным, уменьшение количества циркулирующих тромбоцитов менее чем ≈70000 на мкл приводит к удлинению теста времени стандартизированного кожного кровотечения, а интервал кровотечения увеличивается с экстраполяцией почти до бесконечности по мере падения количества тромбоцитов до нуля. Полагают, что пациенты с количеством тромбоцитов менее 20000 на мкл являются сильно подверженными спонтанным кровотечениям из слизистых поверхностей.

Составы с PEG-Hb с тромбоцитами по изобретению пригодны для лечения индивидуумов, страдающих недостаточностью костного мозга, например, апластической анемией, острыми и хроническими лейкозами, метастазирующей злокачественной опухолью, но особенно вследствие лечения злокачественных опухолей ионизирующей радиацией и химиотерапией. Кроме того, составы пригодны для лечения и улучшения состояния при тромбоцитопении, ассоциированной с обширным оперативным вмешательством, повреждением (например, травмой) и сепсисом.

Тромбоциты и состав с PEG-Hb можно комбинировать любым практическим и эффективным способом. Таким образом, в иллюстративном варианте осуществления тромбоциты и PEG-Hb комбинируют незадолго перед введением получаемой композиции индивидууму. В других иллюстративных вариантах осуществления состав с тромбоцитами-PEG-Hb получают и хранят в течение соответствующего времени.

В различных вариантах осуществления тромбоциты, отдельно или в комбинации с составом с PEG-Hb стабилизированы стабилизатором. Иллюстративные стабилизаторы, применяемые по настоящему изобретению, известны в данной области. См., например, патент США №s 7241282 и 5466573. Также источником тромбоцитов необязательно является состав крови, обогащенный тромбоцитами и фибриногеном, такой как описано в патенте США № 6649072.

В иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к набору, в котором присутствуют два (или более) компонента и до их комбинирования хранятся раздельно. Например, в различных вариантах осуществления изобретение относится к устройству для комбинирования тромбоцитов и состава с PEG-Hb. Устройство содержит первый контейнер для сбора или хранения фактора(ов); и по меньшей мере один вспомогательный контейнер с гидравлическим соединением с первым контейнером, в котором хранят состав с PEG-Hb. При применении между первым и вспомогательным контейнером помещают барьер в виде разрушаемой перегородки так, что при разрушении перегородки два компонента состава можно смешивать, а затем вводить нуждающемуся в этом индивидууму. Как понятно специалисту, доступны и попадают в сущность и объем настоящего изобретения эквиваленты описанного устройства. Например, набор может содержать две или более ампулы, где каждая содержит элемент комбинированного состава по изобретению в жидкой или сухой форме. Содержимое ампул можно смешивать в подходящее время и подходящим образом до введения комбинированного состава нуждающемуся в этом индивидууму.

В дополнительном иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к составу, в котором состав с PEG-Hb по изобретению комбинирован с одним или несколькими факторами свертывания. Такие составы среди других применений пригодны при лечении определенных нарушений свертывания (например, старческая или приобретенная недостаточность свертывания крови), острого кровотечения и для профилактики кровотечения перед хирургическим вмешательством.

В иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к комбинированному составу, содержащему состав с PEG-Hb по изобретению и фактор свертывания, являющийся представителем, выбранным из факторов II, V, VII, VIII, IX, X, XI и XII и их сочетания. В различных иллюстративных вариантах осуществления фактор выбран из фактора VII, фактора VIII и фактора IX или их сочетания.

Свертывание крови представляет собой сложный процесс, требующий последовательного взаимодействия большого количества компонентов, почти все из которых являются белками. Эти компоненты включают фибриноген и факторы II, V, VII, VIII, IX, X, XI и XII. Отсутствие любого из этих компонентов или нефункциональный компонент могут приводить к неспособности крови свертываться при необходимости, с получаемой в результате избыточной и опасной для жизни кровопотери у пациента.

В данной области существует множество общепринятых способов получения различных концентратов факторов свертывания, очисткой. Например, очистка комплекса фактора VIII приводит к получению препаратов фактора VIII, с уровнем чистоты приблизительно 90% или выше и с достаточной стабильностью для хранения в течение длительных периодов времени в лиофилизированной форме. См., например, патент США № 4650858 и патент США № 5399670. Также доступны составы с фактором VIII. Они включают фактор VIII человека (подобно активным компонентам гумата (Humate™), моноклата (Monoclate™), иммуната (Immunate™) и гемофила (Hemofil™)), рекомбинантный фактор VIII человека (подобно r-VIII SQ, который описан в патентной заявке PCT WO 91/09122 (активный компонент рефакто (ReFacto™)) или активные компоненты когената (Kogenate™) или рекомбината (Recombinate™)), фактор VIII свиньи (являющийся активным компонентом продукта гиата:C (Hyate:C™)), продаваемого Ipsen, Inc., USA) или рекомбинантный фактор VIII свиньи (например, модифицированная форма без B-домена фактора VIII свиньи, подобно форме, описанной в патентной заявке WO 01/68109 и идентифициремой как "POL1212").

Дополнительные составы с фактором VIII, применяемые в настоящем изобретении, включают составы, описанные в патенте США № 5565427, патенте США № 5605884, патенте США № 5763401 патенте США № 5874408, патенте США № 5962650, патенте США № 5972885, WO 89/09784 и WO 94/07510.

Также доступны другие факторы, и их применяют по настоящему изобретению. В иллюстративном варианте осуществления в состав с PEG-Hb по изобретению вводят фактор VII. Фактор VII представляет собой одноцепочечный гликопротеин (молярная масса 50000) из 406 аминокислот, который секретируется в кровь, где циркулирует в форме профермента. In vitro, FVII под действием активированных факторов свертывания фактора X (FXa), фактора IX (FIXa), фактора XII (FXIIa) или фактора II (FIIa) может протеолитически активироваться до активированного фактора FVII или FVIIa. FVIIa самостоятельно не стимулирует свертывания, но может образовывать комплекс с тканевым фактором (TF), находящимся в участке повреждения. Комплекс FVIIa/TF может преобразовывать FX в FXa, таким образом, индуцируя локальный гемостаз в участке повреждения. Активация FVII до FVIIa включает протеолитическое расщепление по одной пептидной связи между Arg-152 и Ile-153, что приводит к двухцепочечной молекуле, состоящей из легкой цепи из 152 аминокислотных остатков и тяжелой цепи из 254 аминокислотных остатков, удерживаемых вместе одной дисульфидной связью.

Способы получения и очистки фактора VII известны в данной области. См., например, патент США № 6329176. Сообщалось о некоторых инженерно сконструированных вариантах FVII. См., например, Dickinson et al., J. Bio. Chem. 272: 19875-19879 (1997), Kemball-Cook et al., J. Biol. Chem. 273: 8516-8521 (1998), Bharadwaj et al., J. Biol Chem. 271: 30685-30691 (1996), Ruf et al., Biochemistry, 38: 1957-1966 (1999); WO 99/20767; WO 00/11416; WO 02/22776; WO 02/38162; WO 01/83725; WO 01/58935 и патент США № 5580560. FVII экспрессирован в BHK и других клетках млекопитающих (WO 92/15686, WO 91/11514 и WO 88/10295), и проведена коэкспрессия FVII и эндопротеазы kex2 в эукариотических клетках (WO 00/28065). Коммерческие препараты рекомбинантного FVIIa человека продаются как новосэвен (NovoSeven™). Новосэвен (NovoSeven™) показан для лечения случаев кровотечения у пациентов с гемофилией A или B.

Гемофилия B вызвана дефицитом белка плазмы крови, называемого фактором IX, который влияет на свойство свертывания крови. Нарушение вызвано наследственным X-сцепленным рецессивным признаком с дефектным геном, расположенным на X хромосоме. Таким образом, нарушение возникает преимущественно у мужчин. Фактор IX человека представляет собой зависимый от витамина K профермент, играющий важную роль в свертывании крови. Фактор IX циркулирует в виде одноцепочечного профермента длиной 415 аминокислот с молекулярной массой 55000 дальтон и находится в нормальной плазме в концентрации приблизительно 5 мкг/мл.

Доступно несколько коммерческих форм концентрата фактора IX для обеспечения заместительной терапии пациентам, страдающим гемофилией B. Например, получаемые из крови комплексные продукты фактора IX (содержащие другие факторы) продаются под марками бебулин (Bebulin) VH™ (Baxter Healthcare, Vienna, Austria), конин (konyne) 80™ (Bayer Corporation, Elkhart Ind.), профилнин (Profilnine) SD™ (Alpha Therapeutic Corporation, Los Angeles Calif.) и проплекс (Proplex™) (Baxter Healthcare, Glendale Calif.). Продукты до некоторой степени, более очищенных форм фактора IX продаются под марками альфанин (Alphanine) SD™ (Alpha Therapeutic Corporation, Los Angeles Calif.) и мононин (Mononine™) (Aventis Behring, Kankakee 111). В отношении рекомбинантно полученных концентратов фактора IX, одним доступным в настоящее время продуктом является бенефикс (Benefix™) (Wyeth/Genetics Institute, Cambridge Mass.).

Рекомбинантный синтез и очистка других факторов свертывания и введение этих факторов в состав по изобретению находится в компетенции специалистов в данной области.

Фактор(ы) и состав с PEG-Hb можно комбинировать любым практическим и эффективным способом. Таким образом, в иллюстративном варианте осуществления фактор(ы) и PEG-Hb комбинируют незадолго перед введением получаемой композиции индивидууму. В других иллюстративных вариантах осуществления состав с фактором(ами)-PEG-Hb получают и хранят в течение подходящего периода времени.

В иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к набору, в котором присутствуют два (или более) компонента и до их комбинирования хранятся раздельно. Например, в различных вариантах осуществления изобретение относится к устройству для комбинирования фактора(ов) и состава с PEG-Hb. Устройство содержит первый контейнер для сбора или хранения фактора(ов); и по меньшей мере один вспомогательный контейнер с гидравлическим соединением с первым контейнером, в котором хранят состав с PEG-Hb. При применении между первым и вспомогательным контейнером помещают барьер в виде разрушаемой перегородки так, что при разрушении перегородки два компонента состава можно смешивать, а затем вводить нуждающемуся в этом индивидууму. Как понятно специалисту, доступны и попадают в сущность и объем настоящего изобретения эквиваленты описанного устройства. Например, набор может содержать две или более ампулы, где каждая содержит элемент комбинированного состава по изобретению в жидкой или сухой форме. Содержимое ампул можно смешивать в подходящее время и подходящим образом до введения комбинированного состава нуждающемуся в этом индивидууму.

В другом иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к комбинированному составу между источником NO и составом с PEG-Hb по изобретению. Этот вариант осуществления изобретения проиллюстрирован с указанием различных молекул-доноров NO, однако специалист легко поймет, что источник NO не ограничен этими иллюстративными примерами и в комбинированный состав по изобретению можно вводить другие источники NO.

Оксид азота (NO) представляет собой важную внутриклеточную и межклеточную молекулу-мессенджер, играющую важную физиологическую роль в противодействии агрегации тромбоцитов и в противодействии активации тромбоцитов, в расслаблении сосудов, передаче нервных импульсов и иммунном ответе. NO (оксид азота) представляет собой биологическую "молекулу-мессенджер", среди других функций снижающую артериальное давление и ингибирующую функцию тромбоцитов. NO свободно диффундирует из эндотелия в гладкую мускулатуру сосудов и тромбоцитов и через нервные, синапсы вызывая биологический ответ.

Ткани, лишенные крови и кислорода претерпевают ишемический некроз и инфаркт с возможным необратимым повреждением органов. После восстановления тока крови и кислорода в органе или ткани (реперфузия), орган не сразу возвращается в нормальное предишемическое состояние. Постишемическая дисфункция может являться следствием ряда факторов. Роль могут играть свободные радикалы кислорода, так как в ишемизированном миокарде показано образование свободных радикалов, и показано, что акцепторы свободных радикалов уменьшают сократительную дисфункцию. В постишемическую дисфункцию могут вносить вклад нарушенный транспорт внутриклеточного кальция и избыток кальция при ранней реперфузии.

Хорошо доказано, что избыточный окислительный стресс, вследствие наличия свободных радикалов может повреждать биологические ткани. Природная защита клеток и тканей сосредоточена на антиоксидантных механизмах, которые эволюционировали для защиты клеток и тканей от высоких уровней окислительного стресса. В богатой кислородом атмосфере Земли присутствие кислорода в определенные периоды стресса может являться разрушительным; это называют кислородным парадоксом, и это относится к роли кислорода в формировании процессов со свободными радикалами и участия в них. В определенных состояниях болезни, связанных с периодами ограниченного кровотока в тканях, таких как инфаркт миокарда, инсульт и ограниченный приток к конечностям, перемежающиеся эпизоды отсутствия кровотока с последующим обратным притоком крови формируют окислительный стресс при ишемии/реперфузии (I/R).

Как применяют в настоящем документе термин донор NO включает любые высвобождающие, доставляющие или переносящие монооксид азота соединения, включая, например, S-нитрозотиолы, нитрилы, нитраты, S-нитротиолы, сиднонимины, 2-гидрокси-2-нитрозогидразины, (NONOаты), (E)-алкил-2-((E)-гидроксиимино)-5-нитро-3-гексенамид (FK-409), (E)-аллил-2-((E)-гидроксиимино)-5-нитро-3-гексенамины, N-((2Z, 3E)-4-этил-2-(гидроксиимино)-6-метил-5-нитро-3-гептенил)-3-пиридинкарбоксамид (FR 146801), N-нитрозоамины, N-гидроксилнитрозамины, нитрозимины, диазетиновые диоксиды, оксатриазол-5-имины, оксимы, гидроксиламины, N-гидроксигуанидины, гидроксикарбамиды, бензофуроксаны, фуроксаны, а также субстраты эндогенных ферментов, синтезирующих оксид азота.

Подходящие NONOаты в качестве неограничивающих примеров включают, (Z)-1-(N-метил-N-(6-(N-метил-аммониогексил)амино))диазен-1-ий-1,2-диолеат ("MAHMA/NO"), (Z)-1-(N-(3-аммониопропил)-N-(н-пропил)амино)диазен-1-ий-1,2-диолеат ("PAPA/NO"), (Z)-1-(N-(3-аминопропил)-N-(4-(3-аминопропиламмонио)бутил)-амино)диазен-1-ий-1,2-диолеат (спермин-NONOат или "SPER/NO") и (Z)-1-(N,N-диэтиламино)диазений-1,2-диолеат натрия (диэтиламин-NONOат или "DEA/NO") и их производные. NONOаты также описаны в патентах США №№ 6232336, 5910316 и 5650447, описания которых в полном объеме включены в настоящий документ в качестве ссылки. "Продукты присоединения NO" могут являться мононитрозилированными, полинитрозилированными, мононитрозированными и/или полинитрозированными по различным природным или искусственно полученным участкам связывания биологически активных форм монооксида азота.

Подходящие фуроксаны в качестве неограничивающих примеров включают CAS 1609, C93-4759, C92-4678, S35b, CHF 2206, CHF 2363 и т.п.

Подходящие сиднонимины в качестве неограничивающих примеров включают молсидомин (N-этоксикарбонил-3-морфолиносиднонимин), SIN-1 (3-морфолиносиднонимин) CAS 936 (3-(цис-2,6-диметилпиперидино)-N-(4-метоксибензоил)сиднонимин, пирсидомин), C87-3754 (3-(цис-2,6-диметилпиперидино)сиднонимин, линсидомин, C4144 (гидрохлорид 3-(3,3-диметил-1,4-тиазан-4-ил)сиднонимина), C89-4095 (гидрохлорид 3-(3,3-диметил-1,1-диоксо-1,4-тиазан-4-ил)сиднонимина и т.п.

Подходящие оксимы в качестве неограничивающих примеров включают NOR-1, NOR-3, NOR-4 и т.п.

Одной из групп продуктов присоединения NO являются S-нитрозотиолы, представляющие собой соединения, содержащие по меньшей мере одну группу SNO. Эти соединения включают S-нитрозополипептиды (термин "полипептид" включает белки и полиаминокислоты, не обладающие определенной биологической функцией, и их производные); S-нитрозилированные аминокислоты (включая природные и синтетические аминокислоты и их стереоизомеры и рацемические смеси и их производные); S-нитрозилированные сахара; S-нитрозилированные модифицированные и немодифицированные олигонуклеотиды (предпочтительно, по меньшей мере из 5, а более предпочтительно их 5-200 нуклеотидов); линейные или разветвленные насыщенные или ненасыщенные алифатические или ароматические замещенные или незамещенные S-нитрозилированные углеводороды; и S-нитрозогетероциклические соединения. S-нитрозотиолы и способы их получения описаны в патентах США №№ 5380758 и 5703073; WO 97/27749; WO 98/19672 и Oae et al, Org. Prep. Proc. Int., 15(3): 165-198 (1983), описания каждого из которых в полном объеме включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Другим подходящим классом доноров NO являются S-нитрозоаминокислоты, где нитрозогруппа связана с серной группой серосодержащей аминокислоты или ее производного. Такие соединения включают, например, S-нитрозо-N-ацетилцистеин, S-нитрозокаптоприл, S-нитрозо-N-ацетилпеницилламин, S-нитрозогомоцистеин, S-нитрозоцистеин, S-нитрозоглутатион, S-нитрозоцистеинилглицин и т.п.

Подходящие S-нитрозилированные белки включают тиолсодержащие белки (где группа NO присоединена к одной или нескольким серным группам на аминокислоте или производном аминокислоты) из различных функциональных классов, включая ферменты, такие как тканевый активатор плазминогена (TPA) и катепсин B; транспортные белки, такие как липопротеины; гемовые белки, такие как гемоглобин и сывороточный альбумин; и биологическиие протективные белки, такие как иммуноглобулины, антитела и цитокины. Такие нитрозилированные белки описаны в WO 93/09806, описание которой полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки. Примеры включают полинитрозилированный альбумин, где модифицированы один или несколько тиольных или других нуклеофильных центров в белке.

Другая группа продуктов присоединения NO для применения по изобретению, где продукт присоединения NO представляет собой соединение, являющееся донором, переносящее или высвобождающее оксид азота, включает соединения, содержащие по меньшей мере одну группу ONO- или ONN. Соединения, содержащие по меньшей мере одну группу ONO- или ONN предпочтительно представляют собой ONO- или ONN-полипептиды (термин "полипептид" включает белки и полиаминокислоты, не обладающие определенной биологической функцией, и их производные); ONO- или ONN-аминокислоты (включая природные и синтетические аминокислоты и их стереоизомеры и рацемические смеси); ONO- или ONN-сахара; модифицированные или немодифицированные ONO- или ONN-олигонуклеотиды (содержащие по меньшей мере 5 нуклеотидов, предпочтительно 5-200 нуклеотидов); линейные или разветвленные насыщенные или ненасыщенные алифатические или ароматические замещенные или незамещенные ONO- или ONN-углеводороды; и ONO-, ONN- или ONC-гетероциклические соединения. Предпочтительные примеры соединений, содержащих по меньшей мере одну группу ONO- или ONN включают бутилнитрит, изобутилнитрит, трет-бутилнитрит, амилонитрит, изоамилонитрит, N-нитрозамины, N-нитрозамиды, N-нитрозомочевину, N-нитрозогуанидины, N-нитрозокарбаматы, N-ацил-N-нитрозосоединения (такие как, N-метил-N-нитрозомочевина); N-гидрокси-N-нитрозамины, купферрон, аланозин, допастин, 1,3-дизамещенные нитрозиминобензимидазолы, 1,3,4-тиадиазол-2-нитрозимины, бензотиазол-2(3H)-нитрозимины, тиазол-2-нитрозимины, олигонитрозосиднонимины, 3-алкил-N-нитрозосиднонимины, 2H-1,3,4-тиадиазиннитрозимины.

Другая группа продуктов присоединения NO для применения по изобретению включает нитраты, которые являются донорами, переносят или высвобождают оксид азота, такие как соединения, содержащие по меньшей мере одну группу O₂NO, O₂NN или O₂NS. Среди этих соединений предпочтительными являются O₂NO-, O₂NN- или O₂NS-полипептиды (термин "полипептид" включает белки, а также полиаминокислоты, не обладающие определенной биологической функцией, и их производные); O₂NO-, O₂NN- или O₂NS-аминокислоты (включая природные и синтетические аминокислоты и их стереоизомеры и рацемические смеси); ONO-, O₂NN- или O₂NS-сахара; модифицированные и немодифицированные O₂NO-, O₂NN- или O₂NS-олигонуклеотиды (содержащие по меньшей мере 5 нуклеотидов, предпочтительно 5-200 нуклеотидов); линейные или разветвленные насыщенные или ненасыщенные алифатические или ароматические замещенные или незамещенные O₂NO-, O₂NN- или O₂NS-углеводороды; и O₂NO-, O₂NN- или O₂NS-гетероциклические соединения. Предпочтительные примеры соединений, содержащих по меньшей мере одну группу O₂NO, O₂NN или O₂NS, включают динитрат изосорбида, мононитрат изосорбида, клонитрат, тетранитрат эритритила, гексанитрат маннита, нитроглицерин, пентаэритролтетранитрат, пентринитрол, пропатилнитрат и органические нитраты с содержащими сульфгидрильные группы аминокислотами, такими как, например, SPM 3672, SPM 5185, SPM 5186 и соединения, описанные в патентах США №№ 5284872, 5428061, 5661129, 5807847 и 5883122 и в WO 97/46521, WO 00/54756 и in WO 03/013432, описания каждого из которых, в полном объеме включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Другой группой продуктов присоединения NO являются N-оксо-N-нитрозоамины, которые являются донорами, переносят или высвобождают оксид азота и представлены формулой: R^1"R^2"NN(OM⁺)NO, где каждый из R^1" и R^2" независимо представляет собой полипептид, аминокислоту, сахар, модифицированный или немодифицированный олигонуклеотид, линейный или разветвленный насыщенный или ненасыщенный алифатический или ароматический замещенный или незамещенный углеводород или гетероциклическую группу и где M⁺ представляет собой органический или неорганический катион, такой как, например, замещенный алкилами катион аммония или катион металла I группы.

В комбинации с донором NO индивидууму можно вводить терапевтически эффективное количество второго соединения, которое потенциирует терапевтический эффект NO. Второе соединение может представлять собой, например, ингибитор фосфодиэстеразы (например, 2-о-пропоксифенил-8-азапурин-6-он [запринаст (Zaprinast™)], дипиридамол, теофиллин, силденафил [виагра (Viagra™)] или 1,3-диметил-6-[2-пропокси-5-метансульфониламидофенил]пиразоло[3,4-D]пиримидин-4-[5H]-он) или супероксиддисмутазы. Альтернативно второе соединение может представлять собой антитромботическое средство, такое как тиклопидин, стрептокиназу, урокиназу, t-PA или его аналог (например, met-t-PA, ретевазу (Retevase™) или FE1X), гепарин, гирудин или его аналог (например, хурулог (Hurulog™)), нестероидное противовоспалительное средство (например, индометацин или аспирин), глюкокортикоид (например, преднизон) или цитотоксическое средство (например, метотрексат) или антилейкоцитарное средство, такое как антитело к лейкоцитам.

Введение оксида азота используют в качестве профилактики и лечения ишемии/реперфузионного повреждения. См., например, патент США № 6656452 и цитируемые в нем ссылки. Таким образом, дополнительной целью настоящего изобретения является предоставление составов заменителей крови на основе гемоглобина, содержащих источник NO для лечения ишемии/реперфузионного повреждения. В иллюстративном варианте осуществления заменитель крови по изобретению комбинирован с молекулой-донором NO. Комбинацию можно получать в момент получения производства крови или в любой момент после исходного производства. Например, изобретение относится к устройству с двумя отделениями или двумя раздельными контейнерами. В одном отделении или контейнере хранится заменитель крови, а во втором отделении или контейнере находится молекула-донор NO. До введения нуждающемуся в этом индивидууму содержимое двух отделений или контейнеров смешивают, и полученный состав вводят индивидууму.

В различных вариантах осуществления состав по изобретению дополнительно содержит супероксиддисмутазу или каталазу. Эти белки сами необязательно конъюгированы с водорастворимым полимером, например, PEG.

В иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к составу, применяемому при лечении, улучшении, предотвращении или уменьшении ишемии/реперфузионного повреждения и/или окислительного стресса в одной или нескольких тканях индивидуума, которому вводят состав.

В иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к набору, в котором присутствуют два (или более) компонента и до их комбинирования хранятся раздельно. Например, в различных вариантах осуществления изобретение относится к устройству для комбинирования донора NO и состава с PEG-Hb. Устройство содержит первый контейнер для сбора или хранения донора NO; и по меньшей мере один вспомогательный контейнер с гидравлическим соединением с первым контейнером, в котором хранят состав с PEG-Hb. При применении между первым и вспомогательным контейнером помещают барьер в виде разрушаемой перегородки так, что при разрушении перегородки два компонента состава можно смешивать, а затем вводить нуждающемуся в этом индивидууму. Как понятно специалисту, доступны и попадают в сущность и объем настоящего изобретения эквиваленты этого устройства. Например, набор может содержать две или более ампулы, где каждая содержит элемент комбинированного состава по изобретению в жидкой или сухой форме. Содержимое ампул можно смешивать в подходящее время и подходящим образом до введения комбинированного состава нуждающемуся в этом индивидууму.

В каждом из комбинированных составов, указанных выше, PEG-Hb может быть связан с кислородом, монооксидом углерода или ни с одним из них. Сам PEG-Hb или весь состав можно формулировать так, чтобы они являлись гипотоническими, изотоническими или гипертоническими относительно тоничности крови индивидуума.

Способы применения

Существует необходимость в средстве для переноса кислорода для лечения или предотвращения гипоксии, являющейся результатом кровопотери (например, вследствие острого кровотечения или при хирургических операциях), являющейся результатом анемии (например, пернициозной анемии или серповидно-клеточной анемии) или являющейся результатом шока (например, гиповолемического шока, анафилактического шока, септического шока или аллергического шока), инфаркта миокарда, инсульта или травматического повреждения головного мозга. Дополнительно существует необходимость в гипероксигенировании опухолей для улучшения терапевтического эффекта лучевой терапии или химиотерапии. Настоящее изобретение относится к соединениям и способам, как проиллюстрировано выше в настоящем документе, пригодным для лечения и предотвращения этих и других состояний, ассоциированных, например, с кровопотерей, ишемией или гипоксией.

Каждый из составов, указанных в настоящем документе, пригоден в различных способах лечения и профилактики состояний, ассоциированных с шоком, кровотечением, анемией или другими нарушениями функции крови по переносу кислорода. Способы по изобретению пригодны для лечения или предотвращения ишемии-реперфузионного повреждения, включая повреждения, вызываемые хирургическим вмешательством (например, трансплантационная хирургия (особенно хирургическая операция для трансплантации почки или сердца) или хирургическая операция для коронарного шунтирования), тромболизисом, инсультом, индуцированной травмой временной гипотензией или хирургической операцией на сосудах, такой как атерэктомия или ангиопластика, включая использование лазера, баллона или стента. Способы можно применять для лечения или предотвращения ишемии-реперфузионного повреждения после чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики. Повреждение, подвергаемое лечению или предотвращению, может происходить в любой нелегочной ткани, включая почку, сердце или головной мозг.

Гиповолемический шок является конкретной формой шока, в которой сердце неспособно поддерживать достаточный для организма объем крови вследствие кровопотери или недостаточного объема крови. К гиповолемическому шоку приводит потеря приблизительно одной пятой или более от нормального объема крови. Потеря может происходить вследствие любой причины, включая наружное кровотечение (вследствие порезов или повреждений), кровотечения в желудочно-кишечном тракте, другого внутреннего кровотечения, или вследствие уменьшенного объема крови, являющегося следствием избыточной потери других жидкостей организма (так, как может происходить при диарее, рвоте, ожогах и т.п.). Как правило, более крупная и более быстрая потеря крови приводит к более тяжелым симптомам шока. Как правило, пациенты с более умеренной степенью шока имеют более хорошую тенденцию, чем пациенты с более тяжелым шоком. При этом в случаях тяжелого гиповолемического шока гибель возможна даже при незамедлительной медицинской помощи. У индивидуумов преклонного возраста существует увеличенный риск неблагоприятного исхода вследствие шока.

Во время войны пули и проникающие фрагменты взрывчатых боеприпасов часто вызывают опасное для жизни кровотечение. По оценкам Life Science Research Office обескровливающее кровотечение является механизмом гибели до 50% раненых солдат, погибших в последних конфликтах, и полагают, что оно является основной причиной гибели в потенциально восстановимых боевых потерях. Только кровотечение из раненых конечностей насчитывает приблизительно одну десятую от всех боевых смертей, часть из которых рассматривают как предотвратимые при предоставлении соответствующей до госпитальной медицинской помощи.

Анемия представляет собой основной термин для любого патологического состояния, которое развивается, когда в крови существует недостаток здоровых эритроцитов. Альтернативно, может существовать достаточное количество эритроцитов, но в них существует недостаток гемоглобина. Анемия является наиболее общим патологическим состоянием в США, поражающим приблизительно 3,5 миллиона американцев. Женщины и люди с хроническим заболеванием подвержены повышенному риску этого патологического состояния. Существует более 400 типов анемии, которые ориентировочно можно классифицировать на три категории: 1) анемия, вызываемая кровопотерей, 2) анемия, вызываемая сниженной или нарушенной продукцией эритроцитов, или 3) анемия, вызываемая разрушением эритроцитов.

Вне зависимости от причины существует большое количество индивидуумов страдающих какой-либо формой клинической кислородной недостаточности, которую можно улучшить посредством применения состава с PEG-Hb. Необходимость в таком продукте и коммерческие возможности почти безграничны. Например, серповидно-клеточная анемия является наиболее общим наследственным нарушением крови в Соединенных Штатах Америки, поражающим приблизительно 72000 американцев. Она является особенно болезненной, и ослабляющий при кризисах. Можно представить себе лечение этих пациентов на месячной основе одной единицей PEG-Hb для предотвращения кризиса и оксигенирования тканей. Это может потребовать 864000 единиц PEG-Hb только для этого показания.

При окклюзии капилляров и более крупных артерий, такой как вследствие сужения сосудов или твердых эмболов, блокирующих или частично блокирующих кровеносные сосуды, снижается доставка кислорода в ткани, зависимые в отношении кислорода от этих сосудов. Результатом недостаточности транспорта достаточного количества кислорода, часто вследствие недостаточного кровотока, т.е. ишемии, является тканевая гипоксия. Гипоксия может возникать вследствие внутреннего кровотечения (например, внутримозгового кровотечения, порождающего мозговую гипоксию), анемии или травмы. Ишемия представляет собой недостаток доставки кислорода в ткань вследствие функционального сужения или фактической обструкции кровеносного сосуда. Например, ишемия миокарда представляет собой недостаток доставки кислорода в сердечную мышцу вследствие обструкции или сужения коронарных артерий. Если ишемия продолжается более нескольких секунд, повреждение тканей может стать следствием сложной последовательности биохимических процессов, ассоциированных с индуцированной ишемией тканевой гипоксией.

Гипоксические или ишемические состояния, создаваемые эмболами, могут приводить к повреждению тканей, которое является особенно ослабляющим, если поврежденная ткань представляет собой ткань сердца или нервную ткань центральной нервной системы (ЦНС). Два наиболее серьезных следствия эмболии являются инфаркт миокарда (острый инфаркт миокарда или AMI), являющийся результатом ишемии сердечной мышцы, и инсульт, являющийся результатом ишемии ткани головного мозга. Тем не менее, ишемия, не приводящая к AMI или инсульту, может приводить к серьезным симптомам у индивидуума, таким как боль в груди (стенокардия), частичный паралич, помрачение сознания, дезориентацию и/или потерю памяти.

Индивидуумы с сосудистым заболеванием, особенно атеросклерозом, особенно подвержены риску развития эмболии, которая может приводить к AMI или инсульту. Ишемическая болезнь сердца поражает миллионы людей по всему миру, часто приводит к внезапной смерти вследствие AMI. Ишемия может возникать, когда твердые эмболы, образующиеся из частей бляшки, которые отделяются от своего положения, и перемещаются по системе кровообращения, застревают в капиллярах или прикрепляются к другому отложению в бляшке в кровеносном сосуде, таким образом, полностью или частично закупоривая сосуд или капилляр. Частицы атеросклеротической бляшки также могут образовываться при хирургических операциях на сердце и сосудах (например, катетеризация, пережимание), при которых манипулируют или беспокоят любые кровеносные сосуды с атеросклеротическим поражением (например, сонные артерии, коронарные артерии, аорту, бедренные или подколенные артерии).

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу доставки кислорода представителю, выбранному из тканей и органов индивидуума, нуждающегося в такой доставке. В иллюстративном варианте осуществления способ включает введение индивидууму количества композиции любого средства по изобретению, достаточного для осуществления доставки кислорода в одну или несколько тканей и/или в один или несколько органов. В иллюстративных вариантах осуществления способ применяют для лечения таких патологических состояний, как гипоксия, ишемия, анемия и серповидно-клеточная анемия.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к способу устранения дефицита кислорода в представителе, выбранном из тканей и органов индивидуума, страдающего от геморрагического шока. В иллюстративном варианте осуществления способ включает введение индивидууму количества композиции любого средства по изобретению, достаточного для устранения дефицита кислорода.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к способу индукции ангиогенеза в тканях индивидуума посредством введения индивидууму количества композиции по изобретению, эффективного для индукции ангиогенеза. В иллюстративных вариантах осуществления ангиогенез индуцируют в тканях, страдающих от недостатка кислорода. В дополнительных иллюстративных вариантах осуществления, ткани или органы, в которых индуцируют ангиогенез, представляют собой ткани или органы индивидуума, страдающего от недостатка кислорода. В иллюстративном варианте осуществления способ включает введение индивидууму количества композиции любого средства по изобретению, достаточного для устранения недостатка кислорода.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к способу увеличения кровотока в ткани, страдающей от недостатка кислорода. Способ состоит из введения индивидууму количества композиции по изобретению, эффективного для увеличения кровотока в ткани, страдающей от недостатка кислорода. В иллюстративном варианте осуществления ткань или орган представляют собой ткань или орган индивидуума, страдающего от плохого кровотока. В иллюстративном варианте осуществления способ включает введение индивидууму количества композиции любого средства по изобретению, достаточного для устранения плохого кровотока.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к способу уменьшения неврологического повреждения и/или ткани с инфарктом в тканях, страдающих от недостатка кислорода. В иллюстративном варианте осуществления способ включает введение индивидууму количества композиции по изобретению, достаточного для уменьшения неврологического повреждения и/или инфаркта в ткани, страдающей от недостатка кислорода. В иллюстративном варианте осуществления способ включает введение индивидууму количества композиции любого средства по изобретению, достаточного для уменьшения количества ткани с инфарктом и/или неврологически поврежденной ткани.

Индивидуумы, получающие средство для переноса кислорода, получаемое способами по изобретению, включают млекопитающих, таких как человек, не являющийся человеком примат, собака, кошка, крыса, лошадь или овца. Кроме того, индивидуумы, которые могут получать средство для переноса кислорода, включают эмбрионы (индивидуумов до рождения), индивидуумов после рождения или индивидуумов в момент рождения.

Композицию по настоящему изобретению можно вводить в систему кровообращения посредством прямой и/или непрямой инъекции композиции в систему кровообращения индивидуума, посредством одного или нескольких способов инъекции. Примеры способов прямой инъекции включают внутрисосудистые инъекции, такие как внутривенные и внутриартериальные инъекции, и внутрисердечные инъекции. Примеры способов непрямой инъекции включают интраперитонеальные инъекции, подкожные инъекции, такие, что средство для переноса кислорода транспортирует в систему кровообращения лимфатическая система, или инъекции в костный мозг посредством трокара или катетера. Предпочтительно средство для переноса кислорода вводят внутривенно.

Индивидуум, подвергаемый лечению, до, во время и/или после введения композиции по изобретению может являться нормоволемическим, гиперволемическим или гиповолемическим. Композицию в систему кровообращения можно вводить такими способами, как избыточное введение, и способами обмена.

Композицию по изобретению можно вводить терапевтически, для лечения гипоксической ткани у индивидуума, являющейся результатом множества различных причин, включая снижение потока RBC в части или на всем протяжении системы кровообращения, анемию и шок. Кроме того, средство для переноса кислорода можно вводить профилактически для предотвращения снижения тканевого кислорода у индивидуума, которое может являться результатом возможного или ожидаемого снижения потока RBC в ткани или на всем протяжении системы кровообращения индивидуума. Композиции по изобретению пригодны для терапевтического или профилактического лечения гипоксии.

В иллюстративном варианте осуществления изобретение относится к лечению заболевания, повреждения или кровоизлияния посредством введения индивидууму количества состава по изобретению, достаточного для обеспечения лечения. Гемоглобин находится в форме с CO. В иллюстративном варианте осуществления этот конъюгат формулируют в фосфатно-солевом буфере.

В различных вариантах осуществления состав с PEG-Hb-CO по изобретению применяют для лечения ишемии. Иллюстративный тип ишемии, поддающийся лечению составом, представляет собой периферическую ишемию, такую как периферическая диабетическая ишемия, и нисходящие эффекты ишемии. Как понятно специалистам, композиции по изобретению также пригодны для лечения других форм ишемии.

В различных вариантах осуществления изобретение относится к лечению заболевания, повреждения или кровоизлияния посредством введения индивидууму количества состава по изобретению, достаточного для обеспечения лечения. Гемоглобин является восстановленным или может находиться в форме с CO, и его формулируют в гипертоническом солевом растворе. Иллюстративные концентрации солей, применяемые в этих составах, составляют от приблизительно 4% до приблизительно 8%, от приблизительно 4,5% до приблизительно 7,5%, или от приблизительно 5% до приблизительно 7%. Иллюстративные составы содержат приблизительно 4%, приблизительно 5%, приблизительно 6%, приблизительно 7% или приблизительно 8% соли. В одном из составов концентрация соли составляет 7,5%. В различных вариантах осуществления соль представляет собой NaCl. В различных вариантах осуществления этот состав применяют для лечения серповидно-клеточной анемии, инсульта, инфаркта миокарда или травматического повреждения головного мозга.

В иллюстративных вариантах осуществления PEG-Hb-CO по изобретению пригодны для увеличения ангиогенеза, увеличения расширения сосудов, защиты сердца и почек от ишемии, активации митохондриальных KATP каналов, уменьшения адгезии лейкоцитов к эндотелию и их инфильтрации, уменьшения активации макрофагов и микроглии и/или защиты цереброваскулярной сосудистой реакционноспособности от индуцированной судорогами дисфункции. Таким образом, изобретение относится к способам применения композиции по изобретению для достижения таких результатов.

Как правило, подходящей дозой или комбинацией доз средства для переноса кислорода по изобретению является количество, которое при нахождении в плазме крови приводит к общей концентрации гемоглобина в плазме крови индивидуума от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 грамм Hb/дл или от приблизительно 1 до приблизительно 4 грамм Hb/дл или более, если необходимо для восполнения кровопотери большого объема.

Композицию по изобретению можно вводить индивидууму любым удобным способом. Например, в одном из вариантов осуществления композицию вводят в виде непрерывного вливания при предопределенной скорости в течение предопределенного периода времени. В иллюстративном варианте осуществления вводят ударную дозу композиции по изобретению в течение короткого периода, как является целесообразным. За этим начальным "пиком" следует введение второго количества состава в течение по меньшей мере приблизительно 6 часов, по меньшей мере приблизительно 12 часов, по меньшей мере приблизительно 18 часов или по меньшей мере приблизительно 24 часов. В различных вариантах осуществления второе количество составляет по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 100% или по меньшей мере приблизительно 120% от дозы начального "пика".

Иллюстративные композиции по изобретению содержат конъюгат PEG-Hb в количестве от приблизительно 3% до приблизительно 6%. Иллюстративная композиция содержит конъюгат PEG-Hb в количестве приблизительно 4%.

В широком смысле настоящее изобретение также относится к применению средства для переноса кислорода на основе конъюгата синтетический гемоглобин-водорастворимый полимер для получения лекарственного средства для реоксигенации гипоксической ткани. Гипоксия может являться результатом любого кровоизлияния, повреждения или заболевания, включая в качестве неограничивающих примеров хирургическое вмешательство, травму, ишемию, анемию, инфаркт миокарда, инсульт, шок, диабет и травматическое повреждение головного мозга, где переносящее кислород лекарственное средство системно вводят индивидууму с наличием или с предполагаемым наличием одной или нескольких тканей с дефицитом кислорода.

В каждом из способов, указанных выше, PEG-Hb может быть связан с кислородом, монооксидом углерода или ни с одним из них. Сам PEG-Hb или весь состав можно формулировать так, чтобы они являлись гипотоническими, изотоническими или гипертоническими относительно тоничности крови индивидуума.

Приведенные ниже примеры предоставлены для иллюстрации выбранных вариантов осуществления изобретения, и их не следует рассматривать, как ограничивающих его объем.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Очистка гемоглобина

Этот первый этап включает отмывку клеток крови от плазмы. В лабораторных условиях это проводили посредством повторных отмывки, центрифугирования и декантации. Этот процесс представляется более эффективным, чем вертикальная проточная центрифуга непрерывного действия.

Эритроциты 4x отмывают буфером (1,2% NaCl с 10 мМ фосфатом, pH 7,8). Затем эритроциты лизируют (гемоглобин выделяют без настоящего лизиса клеток) посредством медленного добавления 1,5 объемов WFI в течение периода 2 часов. Состояние лизиса (снова, выделения гемоглобина) контролируют посредством выборочной проводимости до тех пор, пока она не попадает в диапазон 5,50 - 7,00 мкС. %Hb определяют с использованием радиометрического гемоксиметра OSM3. Также тестируют осмоляльность, и она находится в диапазоне 130-150 мосмоль. После завершения выделения гемоглобина содержимое фильтруют под давлением через 1 мкм пористый фильтр на основе целлюлозы, с последующим 0,45/0,2 мкм стерильным фильтром на основе полисульфона во втором резервуаре, который служит в качестве резервуара для следующего этапа. Затем раствор гемоглобина пропускают через ультрафильр 300 кДа в резервуар с двойными стенками при 10°C, что служит начальным этапом удаления вирусов, и удаляет высокомолекулярные белки.

Гемоглобин концентрируют с использованием системы 10KD MWCO, а затем восстановливают посредством рециркуляции через контактор с мембраной из пористого волокна до тех пор, пока раствор гемоглобина не будет содержать менее 10% HbO₂. Почти перед окончанием этапа удаления кислорода добавляют стабилизатор, цистеин, до конечной концентрации 5 мМ. Стабилизатор помогает поддерживать уровень кислорода менее 10%, а также действует, защищая гемоглобин во время этапа тепловой инактивации.

Проведение этапа инактивации/удаления вирусов при получении гемоглобина

Перед тем, как бычий гемоглобин можно будет использовать в продукте для людей, необходимы процедуры для инактивации любых потенциальных вирусных загрязнителей при сохранении функционально активного белкового биопрепарата. FDA требует инактивации вирусов в белках, полученных из животных продуктов. Это проводят воздействием 60°C до достижения инактивации вирусов, в этом случае в течение 4 часов. Затем раствор охлаждают, и фильтруют через 0,45/0,2 мкм в накопительный резервуар. Это представляет собой очищенный гемоглобин. Продукт подвергают анализу QC посредством FPLC (один пик), видимому спектральному анализу (пики при 540 нм и 577 нм), электрофорезу в геле с SDS, %Hb, %HbO₂, %MetHb, pH, осмоляльности, эндотоксина, липидов и свободного железа.

Как описано на ФИГ. 1, в механически дезоксигенированном гемоглобине вирусы инактивировали нагреванием, и этот инактивированный нагреванием бычий гемоглобин являлся чистым. Процесс тепловой инактивации механически дезоксигенированного гемоглобина с добавляемым восстановителем поддерживал низкий уровень MET-Hb (менее 10%), сохраняя его целостность, как очевидно из схемы ниже (таблица 1). Воздействие 60°C в течение 10 часов не оказывало никакого действия на продукт в восстановленной (дезокси) форме (с добавлением 5 мМ цистеина), в отношении %tHb и %METHb. Этого не наблюдали для бычьего гемоглобина в восстановленной форме без цистеина, где терялось приблизительно 40% белка.

Таблица 1
Дезоксигенация гемоглобина стабилизирует продукт при тепловой инактивации Дезокси-Hb + 5 мМ цистеин Дезокси-Hb без цистеина¹ Hb в форме с CO + 5 мМ цистеин Hb в форме с CO, без цистеина До 60°C После 10 часов при 60°C До 60°C После 10 часов при 60°C До 60°C После 10 часов при 60°C До 60°C После 10 часов при 60°C tHb=8,3% tHb=8,7% tHb=8,8% tHb=5,2% tHb=9,1% tHb=9,1% tHb=9,1% tHb=8,7% METHb= 0,9% METHb= 1,6% METHb= 5,9% METHb= 2,1% METHb= 0,8% METHb= 0,7% METHb= 6,2% METHb= 4,2% HbO₂= 5,4% HbO₂= 4,4% HbO₂= 6,0% HbO₂= 6,6% HbO₂= <0% HbO₂= <0% HbO₂= 4,3% HbO₂= 3,4% HbCO= 3,0% HbCO= 2,1% HbCO= 6,0% HbCO= 6,6% HbCO= 99,4% HbCO= 100,8% HbCO= 89,5% HbCO= 90,2%

Пегилирование гемоглобина

Добавляют буфер для разбавления (25 мМ фосфат натрия, 120 мМ бикарбонат натрия и 4,5% NaCl, pH 8,0) для приведения раствора гемоглобина к концентрации 4-5%. Гемоглобин пегилируют с использованием молярного отношения PEG к гемоглобину 17:1. Реакционную смесь поддерживают при pH 7,6-7,8, и реакции позволяют протекать в течение одного часа. В этот момент можно использовать один из двух способов.

Способ A

Добавляют 15 мМ цистеина для остановки реакции. После хранения раствора в течение ночи при 4°C, раствор диализируют против 20 объемов буфера (5,0 мМ бикарбонат натрия, 1,0 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, 4,7 мМ хлорид калия, 2,5 мМ сульфат магния, 0,5 мМ хлорид кальция, pH 8,1) с использованием мембраны с отсечением 50 кДа. Затем PEG-Hb разводят до 4% Hb, добавляют декстрозу (5 мг/мл) и цистеин (5 мМ), и раствор подвергают циркуляции через контактор с мембраной из пористого волокна до тех пор, пока %HbO₂ не станет ниже 10%. Затем раствор асептически фильтруют в пакты для крови. Продукт подвергают анализу QC посредством FPLC (один пик), видимому спектральному анализу (пики при 540 нм и 577 нм), электрофорезу в геле с SDS, %Hb, %HbO₂, %MetHb, pH, осмоляльности, эндотоксина, липидов и свободного железа.

Способ B

Добавляют 15 мМ цистеина для остановки реакции. После хранения раствора в течение ночи при 4°C, раствор диализируют против 20 объемов буфера (5,0 мМ бикарбонат натрия, 1,0 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, 4,7 мМ хлорид калия, 2,5 мМ сульфат магния, 0,5 мМ хлорид кальция, pH 8,1) с использованием мембраны с отсечением 50 кДа. Затем PEG-Hb разводят до 4% Hb, добавляют декстрозу (5 мг/мл) и L-цистеин (5 мМ), и раствор преобразуют в форму с монооксидом углерода, посредством медленного барботирования монооксида углерода через раствор с постоянным перемешиванием до тех пор, пока % кислорода не станет меньше "0", а монооксид углерода (CO) не составит 95% или более. Затем раствор асептически фильтруют в пакты для крови. Продукт подвергают анализу QC посредством FPLC (один пик), видимому спектральному анализу (пики при 540 нм и 577 нм), электрофорезу в геле с SDS, %Hb, %HbO₂, %MetHb, pH, осмоляльности, эндотоксина, липидов и свободного железа.

Кроме того, инактивированный нагреванием гемоглобин пегилировали, и полученный PEG-Hb являлся чистым и активным.

Фигура 1: Стабильность PEG-Hb при 37°C

В течение периода 120 суток в образце, хранимом при 37°C, не наблюдалось изменений % общего Hb, %MET-Hb, %HbCO, и %HbO₂ (фигура 1).

Получение формы PEG-Hb с монооксидом углерода

Целью этих исследований являлось получение формы PEG-гемоглобина с монооксидом углерода (CO). Эта форма представляется особенно стабильной в отношении сохранения образования %MET-Hb на низком уровне, как показано на фигуре 1. Она является более стабильной, чем механически дезоксигенированная форма.

Кроме того, форму PEG-Hb с CO хранили при 4°C, и после 8 недель хранения только 1,0% преобразовывался в MET-Hb. Эта же партия PEG-Hb в форме с CO после 12 недель при 4°C содержала 1,3% MET-Hb. Кроме того выявлено, что в форме PEG-Hb с CO, хранимой при 18°C в течение 6 недель содержится 7,9% MET-Hb, который увеличивался до 16,7% MET-Hb в конце 10 недели при 18°C.

Эффективность PEG-Hb/HS для устранения дефицита кислорода

В предварительных исследованиях по тестированию активности PEG-Hb/HS авторов изобретения в оксигенации тканей, тестировали его способность увеличивать доставку кислорода в ткани и устранять дефицит кислорода в модели тяжелого травматического шока на свиньях.

Дефицит кислорода является мерой величины потребления кислорода всем организмом, находящейся ниже уровня, необходимого для поддержания аэробного метаболизма. Он представляет собой одну из физиологических переменных, для которой показано, что она коррелирует с выживанием и осложнениями в виде недостаточности органов после индуцированного травмой геморрагического шока и позволяет прогнозировать их. В модели животным проводили кровотечение до предопределенного дефицита кислорода для уменьшения вариабельности между животными так, что эффекты не зависят от количества кровопотери или эндогенного гемоглобина. Модель позволяет проводить непрерывное измерение потребления кислорода (VO₂), образования диоксида углерода (VCO₂), смешанного венозного насыщения гемоглобина кислородом (SVO₂), артериального насыщения гемоглобина кислородом (SaO₂), коэффициента извлечения кислорода (OER), дефицита кислорода, частоты сердечных сокращений, артериального давления, насыщения гемоглобина кислородом в ткани головного мозга (StO₂ головного мозга), насыщения гемоглобина кислородом в ткани скелетных мышц плеча (StO₂ плеча), сердечного выброса (CO), а также измерения PO₂ в скелетных мышцах, печени, слизистой оболочки кишечника, слизистой рта и почке.

Кровотечение в модели сопровождается двусторонним повреждением скелетных мышц задних конечностей и переломом бедренной кости для получения соответствующего боевому повреждению ткани. Показано, что этот тип повреждения ткани независимо влияет на доставку кислорода в ткань, и приводит к более сильному снижению висцерального кровотока по сравнению с одним кровотечением. После повреждения скелетной мышцы и повреждения бедра с использованием выдвигающегося стержня, у животного проводили кровотечение до предопределенного дефицита кислорода 80 мл/кг. Кровотечение до одинакового дефицита кислорода обеспечивает то, что у всех животных существовала ограниченная вариабельность их конечного повреждения до лечения и, это значительно снижает вариабельность удаляемого объема в противоположность контролируемых давлением кровотечений. У этих животных, непрерывно и накопительно контролировали дефицит кислорода. Дефицит кислорода основан на отклонении VO₂ ниже фоновых значений, полученных до повреждения скелетных мышц, и его измеряли каждые 10 секунд.

После повреждения дефицит кислорода у животных при кровотечении медленно возрастал. В момент, когда у травмированных животных достигалось 100% заданного дефицита кислорода (80 мл/кг), животному проводили инфузии 500 см³ PEG-Hb (концентрация PEG-Hb 4% и гипертонический солевой раствор 5-7,5%) в течение периода времени 15 мин (период реанимации). После введения PEG-Hb, дефицит кислорода быстро устранялся (средние результаты у 4 травмированных животных). Увеличение оксигенации тканей в период реанимации параллельно сопровождало изменение дефицита кислорода, а затем стабилизировалось в течение периода трех часов.

В отличие PEG-Hb, лечение 2 животных 500 мл гидроксиэтилкрахмалом (геспаном (Hespan)), стандартный способ лечения пациентов с травмой, не приводило к устранению дефицита кислорода, также как и лечение оксиглобином (Oxyglobin), продуктом HBOC, разрабатываемым Biopure в качестве заменителя крови. Эти изыскания являются важными, так как, во-первых они демонстрируют, что применяемое в настоящее время лечение для травм является неэффективным в отношении оксигенации ткани и, таким образом, вероятно, оказывает ограниченное действие у пациентов, подвергающихся геморрагическому шоку. Во-вторых, показано, что один из продуктов, который интенсивно тестировали у людей, и который не прошел клинические испытания, оксиглобин (Oxyglobin), не мог оксигенировать ткань. Тот факт, что композиция по изобретению устраняла дефицит кислорода, отчетливо указывает на то, что композиция по изобретению и продукт Biopure очень отличаются, и что потенциал PEG-Hb/HS при лечении травмы не следует оценивать на основе неудачи с другими HBOC.

Кроме того, у двух травмированных животных, которых лечили 500 см³ эритроцитарной массы, наблюдали уменьшение дефицита кислорода, которое ожидали. Однако величина устранения не являлась такой же большой, как величина устранения, вызываемая PEG-Hb. Важно, что даже если лечение эритроцитарной массой давало такой же эффект, что и PEG-Hb, эти результаты могут поддерживать применение PEG-Hb в качестве заменителя крови, так как целью HBOC является такая же эффективность, как и переливание крови.

Кроме тестирования изменений дефицита кислорода и доставки кислорода в тканях, авторы также определяли сублингвальную микроциркуляцию у животных с кровотечением как меру реперфузии ткани после кровотечения. Также в качестве меры реперфузии ткани количественно определяли плотность функциональных капилляров, как общую длину всех сосудов в рассматриваемой области. Наблюдали, что при кровотечении плотность капилляров значительно снижалась. В отличие от этого лечение PEG-Hb под конец исследования приводило плотность обратно почти к нормальным фоновым уровням. Это происходило вопреки падению конечного уровня гемоглобина от исходных 12,3 г/дл до 7,1 г/дл. Как отмечено вливание PEG-Hb увеличивало плотность функциональных капилляров в большей степени, чем гидроксиэтилкрахмал или эритроцитарная масса.

ПРИМЕР 2

Основание : В модели ишемии задних конечностей на мышах, вызванной лигированием бедренной артерии, мыши с диабетом демонстрировали значительно более медленное ответное восстановление кровотока и ангиогенеза по сравнению с животными без диабета. В этом исследовании авторы тестировали гипотезу, что введение сангвината может способствовать восстановлению кровотока и ангиогенеза.

Способ и результаты : У мышей C57BL/6 в возрасте 6 недель стрептозотоцином (stz) вызывали диабет, и в возрасте 12 недель их подвергали лигированию FA с последующим введением сангвината (20 мл/кг/сутки) посредством интраперитонеальной (и./п.) ежедневной инъекции в течение 4 недель. Обрабатываемым носителем мышам с диабетом проводили и./п. ежедневную инъекцию равных объемов 1×PBS. Мыши с диабетом, получавшие лечение сангвинатом, на сутки 28 после лигирования FA демонстрировали значительно улучшенные соотношения кровотока (ишемия/ложная операция) при лазерном допплеровском анализе по сравнению с обработанной носителем группой (63,36±5,83 по сравнению с 44,39±4,13 BFR (%), n≥9, p=0,019). Иммуногистохимическое окрашивание CD31 в мышечной ткани на сутки 28 после лигирования FA демонстрировало значительно увеличенную плотность микрососудистого русла у мышей с диабетом, подвергаемых лечению сангвинатом™, по сравнению с обработанной носителем группой (663,86±57,78 по сравнению с 461,44±36,19 капилляров/мм², p<0,0001). Взятые вместе, эти данные демонстрируют значимые терапевтические эффекты сангвината при диабетической ишемии задних конечностей в модели на мышах и могут обеспечить основание для использования этого средства в качестве дополнительной сохраняющей сосуды терапии при продолжительном диабете.

Протокол : У мышей стрептозотоцином (несколько инъекций с низкой дозой) C57BL/6 вызывали диабет типа 1. Через месяц после индукции диабета мышей подвергали односторонней ишемии задней конечности. В этом исследовании контролировали кровоток и ангиогенез.

Процедура : В верхней части бедра мыши делали кожный надрез. На левой ноге проводили хирургическую операцию, правую ногу подвергали идентичной процедуре за исключением того, что не проводили лигирование бедренной артерии. Выводили наружу паховую связку и верхнюю половину бедренной артерии. Сосудистый пучок лигировали двумя стерильными невпитывающими шелковыми хирургическими нитями 8/0 ниже паховой связки, проксимально, и немного выше бифуркации на поверхностную и глубокую бедренные артерии, дистально. Все артериальные и венозные ответвления, связанные с выделенным участком бедренных сосудов перерезали невпитывающими нитями 8/0. Наконец, вену и артерию между проксимальными и дистальными лигатурами перерезали. Кожный надрез зашивали стерильной нейлоновой нитью 5/0.

Мыши и группы : На основе предварительных исследований, авторы начали с количества мышей >15 на группу, чтобы быть уверенными, в достаточном количестве мышей в конце исследования и иметь достаточное количество ткани для анализа.

Эксперименты регулировали для работы с дополнительными обработанными носителем мышами.

Группа #1 - Мыши WT с диабетом + 20 мл/кг/сутки сангвината (и./п.), начиная непосредственно после лигирования бедренной артерии

Группа #2 - Мыши WT с диабетом + PBS (20 мл/кг/сутки и./п.)

Конечные показатели

Лазерная доплеровская визуализация кровотока (сутки 28). Следует отметить, что кровоток анализировали в левой (с повреждением) и правой (ложная операция) конечностях, а затем регистрировали как отношение правое/левое. Регистрировали средние значения диабет/сангвинат и диабет/PBS.

-Количественный анализ ангиогенеза с использованием окрашивания CD31 и программы количественной визуализации (сутки 28) (левая конечность).

Данные

Конечный показатель № 1: Количественный анализ ангиогенеза

На сутки 28 мышей умерщвляли и выделяли скелетные мышцы задней конечности в зоне лигирования бедренной артерии и подвергали иммуногистохимии с использованием IgG к анти-CD31. Получали серийные изображения, и проводили анализ изображений для определения действия сангвината на ангиогенез:

Группа/Обработка Капилляры/мм ² Конечность с ложной операцией/Носитель 805,60±55,60

Конечность с ложной операцией/Лекарственное средство 763,40±9,39 Конечность с ишемией/Носитель 461,44±36,19* Конечность с ишемией/Лекарственное средство 663,86±57,78** ** означает p<0,001 Конечность с ишемией/Носитель
* означает p<0,001 относительно конечности с ложной операцией/носителя

Конечный показатель № 2: Восстановление кровотока

% восстановление кровотока, сравнивая конечность с лигированной бедренной артерией/противоположную (с ложной операцией) конечность, оценивали с использованием лазерной доплеровской визуализации. В этих исследованиях, регистрировали соотношение между поврежденной конечностью и ее противоположной конечностью с ложной операцией так, что в расчет принималась базовая сосудистая дисфункция. Данные являются следующими:

Группа/обработка % восстановления кровотока Конечность с ишемией/ложная операция НОСИТЕЛЬ 44,38±12,38 Конечность с ишемией/ложная операция ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО 63,36±18,43* * означает p=0,0187

Заключение

Введение сангвината мышам с диабетом, подвергаемым ишемии задних конечностей, индуцированной лигированием бедренной артерии, приводило к значимому улучшению количественной оценки ангиогенеза по сравнению с исследованиями с применением носителя. Введение сангвината мышам с диабетом, подвергаемым ишемии задних конечностей, индуцированной лигированием бедренной артерии, значимо улучшает восстановление кровотока по измерениям посредством лазерной доплеровской визуализации по сравнению с обработкой носителем (PBS).

ПРИМЕР 3

Действие трансфузии пегилированного CO-гемоглобина (PEG-COHb) оценивали у анестезированных крыс, подвергаемых 2 часам фокальной ишемии головного мозга и 1 суткам реперфузии. PEG-Hb хранили в состоянии карбокси (PEG-COHb) для обеспечения источника CO, и снижения самоокисления, и увеличения периода хранения. Трансфузия 10 мл/кг PEG-COHb на 20 минуте ишемии не приводила к изменению артериального давления крови или увеличению притока эритроцитов в ишемическом очаге. Плазматический гемоглобин увеличивался только до 0,6 г/дл, тогда как объем инфаркта значительно снижался, и происходило улучшение неврологических расстройств. Ранняя избыточная трансфузия PEG-COHb защищает головной мозг от ишемического инсульта.

Хирургическая подготовка

Все процедуры одобрены Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee. Анестезию вызывали у самцов крыс Wistar (250-350 г) 5% изофлураном и поддерживали приблизительно 2% изофлураном через носовой конус с произвольным дыханием в течение хирургической операции. После хирургической операции концентрацию изофлурана снижали приблизительно до 1,5%. Вдыхаемый O₂ составлял приблизительно 25-30%. Катетеры вводили в бедренную вену для трансфузии и в бедренную артерию для измерения артериального давления крови и получения образцов артериальной крови. Для поддержания ректальной температуры при ишемии и ранней реперфузии применяли нагревательную лампу. В коже черепа делали небольшой надрез, и в латеральной теменной кости делали небольшое трепанационное отверстие до тех пор, пока не оставался только тонкий слой кости. Напротив истонченной кости закрепляли волоконно-оптический зонд диаметром 1 мм. Зонд соединяли с лазерным доплеровским измерителем потока, испускающим и принимающим свет в ближней инфракрасной области спектра и вычисляющим относительные изменения потока эритроцитов. Сигнал лазерного доплеровского измерителя потока применяли для оценки достаточности окклюзии сосудов в течение периода ишемии.

Транзиторную фокальную ишемию головного мозга индуцировали способом интралюминальной нити с окклюзией кровотока в средней мозговой артерии. Выводили наружу правую общую сонную артерию через латеральный разрез, и подвергали окклюзии. Разрезали и лигировали правую наружную сонную артерию, а ветвь затылочной артерии наружной сонной артерии изолировали, и коагулировали. Проксимальную ветвь крылонебной артерии правой внутренней сонной артерии лигировали и во внутреннюю сонную артерию приблизительно на 2 см вводили одноволоконную нейлоновую нить 4-0 (с закругленным концом). Положение нити регулировали так, чтобы получить по меньшей мере 60% снижения сигнала лазерного доплеровского измерителя потока. Через два часа окклюзии начинали реперфузию, вынимая интралюминальную нить. После контроля в течение первых 30 мин реперфузии, удаляли катетеры, зашивали нитью разрезы, и прекращали анестезию.

Схема эксперимента

PEG-альбумин и PEG-COHb синтезировали в Prolong Pharmaceuticals (South Plainfield, New Jersey). Поверхностные остатки лизина очищенного бычьего Hb конъюгировали с PEG с молекулярной массой 5000. Раствор PEG-Hb барботировали CO с преобразованием перед хранением >80% PEG-Hb в PEG-COHb. Растворы, содержащие 4-6% белка, хранили при 2-10°C в стерильных пакетах для крови. Исследовали три группы по 10 крыс: 1) без трансфузии, 2) с трансфузией бычьего PEG-альбумина и 3) с трансфузией бычьего PEG-COHb. На сутки эксперимента нагревали аликвоту раствора, и проводили избыточную трансфузию, эквивалентную 10 мл/кг массы тела. Трансфузию начинали на 20 мин MCAO. Скорость внутривенной трансфузии составляла 0,5 мл/мин, и она продолжалась в течение приблизительно 5-7 мин. Среднее артериальное давление и процент изменения потока при лазерном допплеровском измерении регистрировали с 15-минутными интервалами в течение 2 часов MCAO и 30 мин реперфузии. Ректальную температуру контролировали в течение 1 часа реперфузии во время восстановления животных от анестезии в теплой среде. Образцы артериальной крови (≈0,7 мл) получали на исходном уровне, через 1 час MCAO и 30 мин реперфузии. Измеряли pH, PCO₂, PO₂ и электролиты артериальной крови на радиометрическом газовом анализаторе крови (ABL80). Артериальную концентрацию Hb, насыщение O₂, MetHb и COHb измеряли на радиометрическом гемоксиметре (OSM3). Плазму из образцов анализировали на концентрацию Hb. У крысы оценивали неврологические расстройства через 1 и 24 часа реперфузии по шкале 0-4 (0 = отсутствие расстройства, 1 = неспособность к вытягиванию передней конечности при размещении, 2 = вращения, 3= односторонняя слабость и 4 = отсутствие произвольной двигательной активности). Через 24 часа выделяли головной мозг для измерения объема инфаркта. Головной мозг разделяли на 7 коронарных срезов (толщиной 2 мм). Срезы окрашивали 1% раствором хлорида трифенилтетразолия, окрашивающим жизнеспособные области красным. Бледные, нежизнеспособные области коры головного мозга и полосатого тела измеряли на передней и задней поверхностях каждого среза. Объем инфаркта каждого среза рассчитывали на основе произведения толщины среза и средней области инфаркта на передней и задней поверхностях. Общий объем инфаркта коры и полосатого тела получали суммированием объема из каждого среза. Значения выражают в виде процента от всей структуры. Измерения сравнивали в 3 группах посредством ANOVA и критерия множественных сравнений Ньюмена-Кейлса с уровнем значимости 0,05. Данные представлены как средние ± SE.

Результаты

Артериальные pH, PCO₂, и PO₂ при MCAO и ранней реперфузии оставались стабильными и в физиологическом диапазоне во всех группах крыс (таблица 1). Значимых отличий в группах с трансфузией на 20 мин of MCAO не выявляли. Концентрации электролитов в группах после трансфузии оставались сходными (таблица 2). Как и ожидалось при избыточной трансфузии белков, наблюдали небольшое снижение гематокрита (таблица 3).

Таблица 1
Артериальный pH и газы крови в течение и после 2 часов окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) в группах без трансфузии или с трансфузией на 20 мин MCAO (среднее ± SE; n=10) Исходный уровень 60 мин MCAO 30 мин реперфузия PH Исходный уровень 60 мин MCAO 30 мин реперфузии Без трансфузии 7,40±0,01 7,41±0,01 7,41±0,01 PEG-альбумин 7,41±0,01 7,41±0,01 7,39±0,01 PEG-COHb 7,39±0,01 7,40±0,01 7,39±0,01 PCO ₂ (мм рт.ст.)   Без трансфузии 45,0±0,9 43,0±1,0 43,6±1,1 PEG-альбумин 42,0±1,1 42,5±0,7 45,4±0,5 PEG-COHb 43,7±0,8 44,3±1,4 44,3±2,0 PO ₂ (мм рт.ст.)   Без трансфузии 120±3 123±5 124±3 PEG-альбумин 124±2 123±3 119±4 PEG-COHb 128±4 122±6 125±7 Избыток оснований   Без трансфузии 1,6±0,5 1,5±0,6 1,7±0,4 PEG-альбумин 1,4±0,3 2,1±0,4 1,9±0,3 PEG-COHb 0,3±0,6 1,4±0,4 1,3±0,3

Таблица 2
Электролиты артериальной крови в течение и после 2 часов MCAO в группах без трансфузии или с трансфузией на 20 мин MCAO (среднее ± SE; n=10)   Исходный уровень 60 мин MCAO 30 мин реперфузии Na ⁺ (мМ)   Без трансфузии 138,4±0,6 140,2±1,1 141,0±0,8 PEG-альбумин 140,2±0,5 138,2±0,5 138,3±0,6 PEG-COHb 142,0±0,8 141,4±0,4 142,7±0,7 K ⁺ (мМ) Без трансфузии 4,1±0,1 4,5±0,2 4,0±0,1

PEG-альбумин 4,1±0,1 4,1±0,1 4,0±0,1 PEG-COHb 4,0±0,1 4,1±0,1 4,3±0,1 Ca ²⁺ (мМ) Без трансфузии 1,36±0,04 1,23±0,06 1,20±0,05 PEG-альбумин 1,53±0,26 1,34±0,02 1,30±0,05 PEG-COHb 1,28±0,04 1,24±0,02 1,21±0,03 Cl ^- (мМ) Без трансфузии 100,2±0,7 100,7±1,5 101,6±0,7 PEG-альбумин 102,8±1,0 101,7±0,5 101,1±0,5 PEG-COHb 104,0±1,0 102,0±0,6 102,5±0,7

Таблица 3
Анализ гемоглобина цельной крови в течение и после 2 часов MCAO в группах без трансфузии или с трансфузией на 20 мин MCAO (среднее ± SE; n=10)   Исходный уровень 60 мин MCAO 30 мин реперфузия Гематокрит (%) Без трансфузии 37±1 37±1   PEG-альбумин 38±1 34±1   PEG-COHb 36±1 33±1   Гемоглобин (г/дл) Без трансфузии 12,5±0,3 11,7±0,3 12,1±0,3 PEG-альбумин 12,5±0,2 11,2±0,4 11,2±0,3 PEG-COHb 11,7±0,3 11,1±0,3 11,1±0,6 Содержание артериального O ₂ (мл O ₂ /дл) Без трансфузии 16,0±0,3 15,3±0,3 16,3±0,4 PEG-альбумин 16,3±0,2 14,4±0,4 14,1±0,7 PEG-COHb 14,9±0,7 14,8±0,6 14,4±0,7 MetHb (%) Без трансфузии 1,0±0,1 0,9±0,1 0,7±0,1 PEG-альбумин 0,9±0,1 0,9±0,1 0,9±0,1 PEG-COHb 0,7±0,1 1,6±0,2* 1,5±0,1* COHb (%) Без трансфузии 0,6±0,1 0,5±0,1 0,3±0,3

PEG-альбумин 0,5±0,1 0,4±0,1 0,2±0,1 PEG-COHb 0,6±0,1 2,3±0,2* 2,3±0,1* *P<0,05 по сравнению с PEG-альбумином

Однако в группе с трансфузией PEG-COHb по сравнению с группой с трансфузией PEG-альбумина существовали значимые отличия гематокрита или концентрации Hb цельной крови. Проценты MetHb и COHb после трансфузии PEG-COHb в цельной крови незначительно увеличивались (таблица 3). Анализ плазматического Hb на 60 мин MCAO (приблизительно 35 мин после завершения трансфузии PEG-COHb) продемонстрировал концентрации 0,6±0,1 г/дл (±SE), и через 30 мин реперфузии уровень оставался относительно неизменным. Процент COHb в плазматическом Hb на 60 мин MCAO находился в диапазоне 11±4%, а на 30 мин реперфузии - 6±1%. Значения среднего артериального давления представлены на ФИГ. 3A. Хотя в группе PEG-COHb существовала тенденция к небольшому увеличению давления в течение длительной MCAO, значения в группах, ни в какой момент времени значимо не отличались. Поток при лазерном допплеровском измерении регистрировали в латеральной коре, где ишемия является наиболее глубокой. Значения представлены на ФИГ. 3B. Во всех группах поток сначала снижался приблизительно на 25% от исходного уровня, и со временем немного увеличивался приблизительно до 30% от исходного уровня. При реперфузии поток во всех группах восстанавливался приблизительно до 80% от исходного уровня. В группах, ни в какой момент времени значимых различий не наблюдали. Ректальную температуру при ишемии и через 1 час реперфузии после пробуждения крыс от анестезии поддерживали в диапазоне 36,5-37,0°C. Кроме того, крысы не демонстрировали лихорадки через 24 часа. После пробуждения от анестезии показатель неврологических расстройств в группах являлся сходным (ФИГ. 4). Однако при повторном тестировании через 24 часа показатели неврологических расстройств избирательно улучшались в группе PEG-COHb. Величины объема инфаркта на каждом коронарном уровне и общие объемы инфарктов представлены на ФИГ. 5. Объем инфаркта в группе без трансфузии и в группе с трансфузией PEG-альбумина являлся сходным. Объем инфаркта в группе с трансфузией PEG-COHb по сравнению с группами без трансфузии или с трансфузией PEG-альбумина значимо снижался. В группе PEG-COHb относительно группы PEG-альбумина объем инфаркта снижался на 82% в коре и на 56% в полосатом теле (ФИГ. 6). Уменьшение объема инфаркта выявляли в каждом из 5 наиболее передних срезах, что таким образом, означает, что защита ткани распространялась по всей зоне распределения средней артерии мозга.

Обсуждение

Степень защиты ткани посредством избыточной трансфузии PEG-COHb при транзиторной фокальной ишемии головного мозга является значимо большей, чем сообщалось для гиперволемической обменной трансфузии αα-сшитого Hb у крыс или полимерного Hb у мышей. Это открытие является значительным, так как концентрация плазматического Hb при избыточном введении 10 мл/кг достигала 0,6 г/дл, что в значительной степени меньше чем 2-2,5 г/дл, как правило, достигаемых при 30-40% обменной трансфузии жидкостей, содержащих 6 г/дл Hb. Кроме того, дополнительное увеличение плазматической концентрации αα-сшитого Hb посредством увеличения концентрации Hb в жидкости для трансфузии с 10 г/дл до 20 г/дл, приводило к дополнительному уменьшению объема инфаркта. Эти сравнения позволяют предположить, что PEG-COHb по сравнению с αα-сшитым Hb и полимерным Hb может являться лучшим в расчете на моль гема при защите головного мозга от инсульта. Результаты демонстрируют, что для защиты головного мозга большой плазматической концентрации пегилированного COHb не требуется. Теоретическим преимуществом обменной трансфузии является то, что можно снизить вязкость цельной крови посредством снижения гематокрита и, таким образом, стимулировать коллатеральный кровоток. Преимущество избыточного введения над обменной трансфузией состоит в том, что этот протокол может быть проще для применения при клиническом инсульте и объем 10 мл/кг легко переносится без возникновения заметной вызванной гиперволемией гипертензии. В настоящем исследовании значительной гипертензии не наблюдали. По-видимому, защита PEG-COHb по оценкам лазерного допплеровского измерения потока в одном участке не связана с увеличением кровотока в ишемическом очаге коры. Однако возможно, что в пограничной области ишемии улучался коллатеральный кровоток, достаточный для защиты ткани. Вязкость раствора пегилированного Hb по сравнению с растворами сшитого и полимерного Hb ближе к вязкости цельной крови и, таким образом, может лучше поддерживать механическое напряжение эндотелия и ассоциированную продукцию NO, что может помочь в поддержании дилатации коллатеральных артерий.

Избыточная трансфузия 10 мл/кг PEG-альбумина и PEG-COHb приводила приблизительно к 8-10% снижению гематокрита. Это относительно небольшое снижение гематокрита только незначительно влияет на вязкость крови, и маловероятно, что оно в достаточной степени улучшает перфузию для снижения повреждения головного мозга, посредством снижения вязкости крови. Отсутствие различия в объеме инфаркта между группой с трансфузией PEG-альбумина и группой без трансфузии в этом исследовании и в предыдущем исследовании с большим разбавлением крови поддерживает это предположение. Кроме того, увеличение плазматической [Hb] до 0,6 г/дл после избыточного введения PEG-COHb, являлось недостаточным для компенсации снижения гематокрита. Таким образом, [Hb] цельной крови и артериальное содержание O₂ при трансфузии PEG-COHb не возрастали. Однако даже в отсутствие увеличения артериального содержания O₂ или кровотока, носитель O₂ в плазме может быть способен увеличивать доставку O₂ в ишемическую ткань по многим причинам. Во-первых, растворимость кислорода в плазме является низкой, и представляет собой основной участок сопротивления диффузии O₂ между эритроцитом и митохондриями в ткани. При переносе большого количества O₂ в плазме, транспорт O₂ от мембраны эритроцита в эндотелий облегчается. В этом отношении эффективность трансфузии полимеров Hb при MCAO теряется, когда раствор преимущественно содержит полимеры молекулярной массы более 14 МДа. По-видимому, применяемый по настоящему документу бычий PEG-Hb приблизительно с 8-10 боковыми цепями PEG с молекулярной массой 5000, представляет собой хороший баланс, являясь достаточно небольшим для обладания высокой подвижностью для облегчения транспорта O₂ в плазме, но достаточно большим для ограничения экстравазации. Во-вторых, ток эритроцитов через отдельные микрососуды является гетерогенным, и эта гетерогенность в условиях низкого перфузионного давления при неполной ишемии увеличена. При доставке O₂ в капилляры, обедненные эритроцитами, посредством тока плазмы, доставка O₂ в капиллярах может стать более гомогенной. В-третьих, эритроциты являются частицами, и их площадь поверхности ни в какой конкретный момент не покрывает площадь поверхности эндотелия капилляров целиком. Носитель O₂ в плазме увеличивает эффективную площадь поверхности для диффузии O₂. Таким образом, избыточная инфузия бесклеточного Hb может активировать несколько механизмов доставки O₂, независимых от объемного артериального содержания O₂ и макроскопического кровотока.

Все публикации и патентные документы, цитируемые в настоящей заявке, в полном объеме в качестве ссылки включены для всех целей в той же степени, как если бы каждая конкретная публикация или патентный документ были также конкретно указаны. При цитировании в этом документе различных ссылок из них, заявители не признают, что какая либо конкретная ссылка является для их изобретения "известным уровнем техники".

Группа изобретений относится к медицине и касается композиции для терапевтической доставки в ткани кислорода или монооксида углерода, содержащей ковалентный конъюгат функциональной природной молекулы гемоглобина и по меньшей мере одной молекулы полиэтиленгликоля, водорастворимый стабилизирующий компонент, разбавитель. Группа изобретений также касается способа получения указанной композиции; применения указанной композиции для получения лекарственного средства для доставки кислорода или монооксида углерода в ткани. Группа изобретений обеспечивает доставку кислорода к тканям и улучшенную стабильность композиции при хранении. 6 н. и 21 з.п. ф-лы, 3 пр., 6 ил., 4 табл.

1. Высокостабильная композиция для терапевтической доставки в ткани кислорода или монооксида углерода, содержащая ковалентный конъюгат функциональной природной молекулы гемоглобина и по меньшей мере одной молекулы поли(этиленгликоля), где указанная композиция, содержит:
a. водорастворимый компонент гемоглобина, содержащий группу молекул гемоглобина, где каждый представитель указанной группы молекул гемоглобина:
i. ковалентно конъюгирован по меньшей мере с одной молекулой указанного поли(этиленгликоля) посредством аминогруппы аминокислотного остатка;
ii. не содержит химических сшивающих средств; и
iii. обладает P₅₀ от 10 мм рт.ст. до 14 мм рт.ст.;
b. водорастворимый стабилизирующий компонент, делающий указанную группу молекул гемоглобина устойчивой к окислению, где указанный компонент содержит стабилизатор, содержащий структурный элемент, более реакционноспособный в отношении кислорода, чем указанная группа молекул гемоглобина; и
c. компонент разбавителя, содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель, в котором растворим указанный компонент гемоглобина,
где указанная композиция лишена вирусной активности и стабильно содержит менее 5% метгемоглобина.

2. Композиция по п. 1, где каждый представитель указанной группы молекул гемоглобина ковалентно конъюгирован с пятью или более указанными группами поли(этиленгликоля) посредством указанной аминогруппы пяти или более из указанных аминокислотных остатков.

3. Композиция по п. 1, где указанная аминогруппа указанного аминокислотного остатка представляет собой ε-аминогруппу остатка лизина.

4. Композиция по п. 1, где указанная молекула гемоглобина связана с представителем, выбранным из кислорода и монооксида углерода.

5. Композиция по п. 1, где указанная молекула гемоглобина способна к переносу представителя, выбранного из указанного связанного кислорода и указанного связанного монооксида углерода, в ткань, с которой указанный гемоглобин находится в контакте.

6. Композиция по п. 1, где указанную композицию получают способом, включающим:
a. подвергание раствора восстановленного гемоглобина и стабилизатора способу термической инактивации вирусов, включающему воздействие на указанный раствор температуры, в достаточной степени высокой для инактивации всей вирусной активности в указанном растворе, где указанное воздействие продолжается в течение периода времени, достаточного для достижения указанной инактивации всей вирусной активности в указанном растворе,
где указанный стабилизатор, содержит структурный элемент, более реакционноспособный в отношении кислорода, чем указанный восстановленный гемоглобин в указанном растворе, таким образом, минимизируя связывание кислорода указанным восстановленным гемоглобином,
где указанный раствор содержит количество указанного стабилизатора, достаточное для предотвращения образования в указанном способе тепловой инактивации вирусов более чем 5% метгемоглобина; и последующей реоксигенации указанного восстановленного гемоглобина для получения раствора реоксигинированного гемоглобина с инактивированными вирусами;
и
b. приведение указанного реоксигиниованного раствора гемоглобина с инактивированными вирусами из этапа (а) в контакт с молекулой активированного поли(этиленгликоля) с реакционноспособностью, комплементарной аминокислотному остатку указанного гемоглобина, таким образом, образуя в указанном растворе ковалентный конъюгат поли(этиленгликоля) и молекул гемоглобина.

7. Композиция по п. 6, полученная указанным способом, дополнительно включающим (с) до этапа (а), дезоксигенацию раствора окисленного гемоглобина, таким образом, получая указанный раствор указанного восстановленного гемоглобина.

8. Композиция по п. 7, полученная указанным способом, дополнительно включающим (d) до этапа (а), с получением указанного раствора указанного восстановленного гемоглобина с указанным стабилизатором.

9. Композиция по п. 6, полученная указанным способом, в котором указанная температура представляет собой 60°C.

10. Композиция по п. 6, полученная указанным способом, в котором указанное время составляет 10 часов.

11. Композиция по п. 7, где посредством указанной дезоксигенации получают молекулу восстановленного гемоглобина, не связанного ни с кислородом, ни с монооксидом углерода.

12. Композиция по п. 7, где посредством указанной дезоксигенации получают молекулу восстановленного гемоглобина, связанную с монооксидом углерода.

13. Композиция по п. 6, где указанная молекула гемоглобина связана с представителем, выбранным из кислорода и монооксида углерода.

14. Композиция по п. 13, где указанная молекула гемоглобина способна к переносу представителя, выбранного из указанного связанного кислорода и указанного связанного монооксида углерода, в ткань.

15. Композиция по п. 1, содержащая ковалентный конъюгат функциональной природной молекулы гемоглобина и по меньшей мере одной молекулы поли(этиленгликоля), где указанная композиция стабильно содержит менее 5% метгемоглобина, где указанная композиция получена способом, включающим:
а. нагревание исходного раствора гемоглобина до 60°C в течение 10 часов, где указанный исходный раствор содержит стабилизатор, содержащий структуру, более реакционноспособную в отношении кислорода, чем указанные молекулы гемоглобина в указанном растворе, таким образом, инактивируя вирусы в указанном растворе при минимизации связывания кислорода указанным восстановленным гемоглобином; и
b. приведение указанного раствора гемоглобина с инактивированными вирусами из этапа (а) в контакт с молекулой активированного поли(этиленгликоля) с реакционноспособностью, комплементарной аминокислотному остатку указанного гемоглобина, таким образом, образуя в указанном растворе ковалентный конъюгат поли(этиленгликоля) и молекул гемоглобина.

16. Композиция по п. 15, где указанный стабилизатор представляет собой аминокислоту.

17. Композиция по п. 16, где указанный стабилизатор представляет собой цистеин.

18. Композиция по п. 17, полученная указанным способом, дополнительно включающим (с) до этапа (b), оксигенацию указанного раствора гемоглобина с инактивированными вирусами из этапа (а).

19. Способ получения композиции по п. 1, включающий:
i. подвергание раствора восстановленного гемоглобина и указанного стабилизатора способу термической инактивации вирусов, включающему воздействие на указанный раствор температуры, в достаточной степени высокой для инактивации всей вирусной активности в указанной смеси, где указанное воздействие продолжается в течение периода времени, достаточного для достижения указанной инактивации всей вирусной активности в указанной смеси; и
ii. приведение указанного раствора гемоглобина с инактивированными вирусами из этапа (i) в контакт с молекулой активированного поли(этиленгликоля) с реакционноспособностью, комплементарной аминокислотному остатку указанного гемоглобина, таким образом, образуя в указанном растворе ковалентный конъюгат поли(этиленгликоля) и молекул гемоглобина.

20. Способ по п. 19, где указанный способ дополнительно включает:
iii. перед этапом (ii), оксигенацию указанного раствора гемоглобина с инактивированными вирусами из этапа (i).

21. Композиция по п. 1, где восстановленные молекулы гемоглобина связаны с СО, и где компонент разбавителя содержит разбавитель в виде фосфатно-солевого буферного раствора.

22. Композиция по п. 1, где восстановленные молекулы гемоглобина не связаны с СО, и где компонент разбавителя содержит разбавитель в виде гипертонического солевого раствора.

23. Композиция по п. 22, где указанный разбавитель в виде гипертонического солевого раствора содержит NaCl в концентрации от 3% до 7%.

24. Применение композиции по любому из пп. 1-18 или 21-23 для получения лекарственного средства для трансфузии для доставки кислорода или монооксида углерода в ткани.

25. Применение композиции по любому из пп. 1-18 или 21-23 для получения лекарственного средства для трансфузии для лечения травмы, геморрагического шока, ишемии, реперфузионного повреждения или серповидно-клеточной анемии, в каждом случае сохраняя дилатацию коллатеральных артерий.

26. Применение композиции по любому из пп. 1-18 или 21-23 для получения лекарственного средства для трансфузии для индукции ангиогенеза или увеличения кровотока в тканях.

27. Применение композиции по любому из пп. 1-18 или 21-23 для получения лекарственного средства для трансфузии для лечения или предотвращения гипоксии, являющейся результатом кровопотери, анемии, шока, инфаркта миокарда, инсульта или травматического повреждения головного мозга, или для гипероксигенации опухолей для улучшения терапевтического эффекта лучевой терапии или химиотерапии.