СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ С ТРОМБИНОМ ОТ ОДНОГО ДОНОРА Российский патент 2016 года по МПК A61M1/36 A61M37/00 A61K35/16 A61K35/14 A61K38/36 A61P7/04 

Описание патента на изобретение RU2589648C2

Родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США №61/705,535, поданной 25 сентября 2012 года. Указанная заявка на выдачу патента в полном объеме включена в настоящий документ в виде ссылки.

Область техники

Изобретение относится к превращению протромбина, присутствующего в жидкой части крови, в тромбин, и более конкретно к устройству и способу увеличения концентрации активированных белков системы свертывания в крови.

Уровень техники

Свертывание плазмы крови, как думают, происходит посредством серий взаимосвязанных самоусиливающихся превращений зимоген-фермент (фиг. 1), которые на предпоследней стадии приводят к образованию тромбина (FIIa), высокоэффективной сериновой протеазы. Называемый «системой свертывания», на последней стадии, протромбин превращается в тромбин при помощи мультибелкового комплекса с кальцием, называемым протромбиназным ферментным комплексом. Тромбин представляет собой фермент, который гидролизует фибриноген в фибриновые единицы, которые полимеризуются в мелкую сетку, которая, в свою очередь, является причиной образования плазмой геля или сгустка. Тромбин представляет собой сериновую протеазу семейства трипсина с молекулярной массой приблизительно 34 кДа. Он состоит из двух полипептидных цепей.

Систему свертывания обычно подразделяют на две ветви для удобства обсуждения и тестирования коагулопатии. Внутренняя и внешняя ветви могут усиливаться отдельно, но объединяться в общий путь, приводящий к образованию тромбина. Внешний путь ответственен за контроль над гемостазом и ответом на сосудистое повреждение. Внутренний путь включается, когда кровь вступает в контакт с прокоагулирующими веществами, вызывающими активацию фактора XII. Внутренний путь активации свертывания плазмы крови прокоагулирующими веществами был хорошо изучен, как в J Biomed Mater Res. 1995 Aug; 29(8): 1005-16 и J Biomed Mater Res. 1995 Aug; 29(8): 1017-28, полное содержание которых включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Прокоагулянт относится к любому элементу или активности, которая является причиной образования жидкой частью крови опосредованного тромбином фибринового сгустка. Прокоагулирующие средства включают в себя множество отрицательно заряженных поверхностей, включая органические и неорганические вещества, включая каолин, хлопок, керамику, стекло, эллаговую кислоту и тому подобное. Прокоагулирующие средства, как известно, применяются по отдельности или в комбинации.

Связывание данных отрицательно заряженных поверхностей вызывает конформационное изменение в факторе XII (FXII), что позволяет ему протеолитическим образом активировать прекалликреин (PK). PK протеолитически активирует FXII, образуя положительную обратную связь, которая усиливает систему и приводит к активации FXI и расщепляет высокомолекулярный кининоген (HK) калликреином.

Последующим результатом активации фактора XIIa прокоагулирующими веществами является образование протромбиназного ферментного комплекса, который состоит из сериновой протеазы, фактора Xa и белка-кофактора, фактора Va. Комплекс собирается на отрицательно заряженных фосфолипидных мембранах в присутствии ионов кальция. Добавление кальциевой соли к цитратным антикоагулированным жидким частям крови, чтобы позволить продолжить работу системе свертывания, часто конкретно обозначают как рекальцификация. Протромбиназный ферментный комплекс катализирует превращение протромбина (фактора II), неактивного зимогена, в тромбин (фактор IIa), активную сериновую протеазу. Хотя было показано, что фактор Xa может активировать протромбин, когда он не связан с протромбиназным ферментным комплексом, скорость образования тромбина сильно уменьшалась в таких обстоятельствах.

Важные факторы крови, вовлеченные в свертывание, которые циркулируют в нормальное крови, присутствуют в гораздо более низкой концентрации, чем множество других белков крови (приблизительно 490 из них в концентрации, изменяющейся на шесть порядков). Среди множества нерешенных проблем, одна представляет собой механизм, при котором присутствующие в высокой концентрация белки крови, такие как альбумин, фибриноген или IgG, не в состоянии препятствовать сборке белков активирующего комплекса на поверхностях прокоагулянта, которые составлены из белков, присутствующих в крови при значительно более низких концентрациях (обозначаемый эффект «адсорбции-растворения»). Zhuo et al., Biomaterials. 2007 October; 28(30): 4355-4369, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки, описывает, что скорость накопления FXIIa в цельной плазме, как обнаружили, уменьшается со временем при постоянном присутствии активирующих поверхностей, приводя к равновесному образованию FXIIa, зависимому от исходной концентрации раствора FXII для прокоагулирующих частиц, суспендированных в плазме. Авторы объясняют, что результаты позволяют убедительно предположить, что активация конкурирует с реакцией самоингибирования, при которой сам FXIIa запрещает превращение FXII→FXIIa. Erwin A. Vogler и Christopher A. Siedlecki, Biomaterials. 2009 April; 30(10): 1857-1869, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки, всесторонне рассмотрели дополнительные сомнения, которые существуют в химии внутреннего пути активации свертывания, включая реакции самоактивации, самогидролиза и самоингибирования. Смотри, в общем, фиг. 1.

Сборка протромбиназного ферментного комплекса начинается со связывания фактора Xa и фактора Va с отрицательно заряженными фосфолипидами на плазматических мембранах. После связывания с плазматической мембраной фактор Xa и фактор Va быстро связываются в стехиометрическом соотношение 1:1 для образования протромбиназного ферментного комплекса. Сборка протромбиназного ферментного комплекса является кальций-зависимой. Полностью собранный протромбиназный ферментный комплекс катализирует превращение зимогена протромбина в сериновую протеазу тромбин. При связывании с протромбиназным ферментным комплексом каталитическая эффективность фактора Xa увеличивается в 300000 раз.

Система свертывания находится под чрезвычайно строгим регулированием как стехиометрических, так и динамических систем ингибирования. Концентрации прокоагулянтов в плазме, стехиометрических ингибиторов и компонентов динамических процессов ингибирования в основном регулируют конечное количество образующегося тромбина. Например, фактор Va протромбиназного ферментного комплекса инактивируется после расщепления активированным белком C, который уменьшает способность фактора V связываться с фактором Xa. Фактор Xa протромбиназного ферментного комплекса ингибируется антитромбином III, который также действует для того, чтобы ингибировать тромбин. Тромбин в плазме является только временно стабильным, обладая временем полужизни приблизительно 10-15 секунд в основном посредством ингибирующих свойств белка плазмы крови антитромбина III (Advanced Engineering Materials Volume 11, Issue 12, pages B251-B260, December, 2009, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки).

Точная химия реакций самоактивации, самогидролиза и самоингибирования системы свертывания остается неизвестной. Анализ улучшенной схемы реакции для внутреннего пути активации может потребовать решения мучительных проблем адсорбции белка и конкуренции при адсорбции белка, а также в значительной степени улучшенного понимание биохимии, вовлеченной в поверхностную активацию зимогенов.

Роль тромбина в системе свертывания и его использование для биоинженерных применений в фибриновых гелей была рассмотрена, например, Janmey et al., J.R. Soc. Interface (2009) 10, 1-10, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки. Тромбин применяют клинически для контроля над кровотечением во время хирургического вмешательства, для ожогов и при определенных травматических ситуациях. Бычий тромбин также является компонентом некоторых коммерческих тканевых клеев.

Общепринятые коммерческие тромбиновые терапевтические средства очищают из смешанных препаратов крови нескольких людей и животных, и в связи с этим они подвержены риску контаминации вирусами, такими как HIV и вирусы гепатита. При сравнении трех коммерческих препаратов тромбина, Suzuki и Sakuragawa обнаружили, что препараты содержали контаминирующие белки, и человеческий препарат содержал иммуноглобулин G, антитела к поверхностному антигену гепатита В и антитела к вирусу иммунодефицита человека. О ксеногенной иммунизации с использованием бычьего тромбина сообщалось у пациентов, у которых появлялись аутореактивные антитела и к тромбину человека, и к фактору V человека (фактор V является загрязнителем в препаратах бычьего тромбина). Кроме того, недавно были поставлены вопросы относительно возможной контаминации бычьих препаратов патогенами, такими как средство от губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота, которое не определяется или не инактивируется общепринятыми способами. Терапевтические препараты крови человека также подвержены контаминации вирусными частицами, такими как вирус гепатита и вирус иммунодефицита человека. Существуют также культурные и религиозные причины того, что, как обнаружено, бычий тромбин неприемлем для клинического применения.

Недавно рекомбинантный тромбин был одобрен FDA и он коммерчески продвигается в качестве альтернативы тромбину, основанному на бычьей плазме, который потенциально может вызывать образование ингибирующих антител к бычьему тромбину, и другие проблемы безопасности, связанные с полученным от животного препаратом крови. Однако, рекомбинантный тромбин, как также было показано, обладает проблемами иммуногенности у некоторых пациентов, которые получали препарат.

Долгое время подразумевалось, однако, что наиболее безопасный режим для хирургического пациента, нуждающегося в фибриновом герметике, являлся бы следствием использования препарата биологического герметика из двух компонентов, в котором компонент тромбина был бы получен от того же донора, от которого был получен компонент белка фибриногена, образующих полностью аутологический биологический герметик или клей, чтобы избежать любого риска передачи гемоконтактного заболевания.

Идея использовать тромбин и/или фибриноген, происходящий от пациента, в медицинской процедуре, проводимой на пациенте, датируется 1974 и не является новой. В патенте PCT Cederholm-Williams (WO 94/00566-10 января 1994) описан улучшенный фибриновый клей, в котором компонент тромбина, для получения которого потребовалось тринадцать стадий, включая центрифугирование, и разделение осадков промежуточных продуктов и подбор ионной силы крови и величины pH плазмы, был объединен с компонентом фибриногена, также происходящим из плазмы того же самого донора. Однако такое множество подготовительных стадий до такой степени являются трудоемкими, что они становятся непригодными для применения в периоперационном пространстве, где продолжительность подготовки должна составлять менее чем один час.

Три года спустя в 1997, Hirsh, et al. (патент США №5643192) последовали Cederholm-Williams, сообщая о другом способе получения фибринового клея, в котором компоненты фибриногена и тромбина в фибриновом клее происходили из одной и той же плазмы крови донора. В патенте Hirsh описан способ получения тромбина, в котором большая часть фибриногена в плазме крови сперва осаждается и удаляется для получения надосадочной жидкости и затем образующего тромб остаточного фибриногена в надосадочной жидкости, который является другим и более простым, чем способ, сообщенный Cederholm-Williams, но не приводит к получению коммерчески применимому тромбину, в котором тромбин обеспечивает скорости образования тромба пять секунд или менее в течение только 4 минут и менее чем 10 секунд в течение только 47 минут.

Такие скорости образования тромба не отвечают потребностям хирургов, которые не могли бы запланировать все свои операции по ограничениям для фибринового клея Hirsh, et al.

Для хирургов преимущественно необходимо быстродействие в отношении времени свертывания (<5 секунд) для остановки кровотечения и закрытия или сращивания ткани. Медленные биологические клеи для свертывания крови (>5 секунд) часто будут транспортироваться далеко от места раны, медленно сочась и кровоточа, прежде чем они смогут выполнить свою функцию. Хирург, использующий фибриновый клей Hirsh, был бы обязан устраивать свою хирургию так, чтобы остановка кровотечения и закрытие ткани, подвергаемое лечению с использованием фибринового клея Hirsh, происходили бы в 4-минутном окне, где время свертывания составляло менее чем 5 секунд, делая изобретение Hirsh полностью непригодным для большинства операций, которые преимущественно требуют быстрой остановки кровотечения и сращивания ткани на всем протяжении хирургической операции, продолжительность которой может увеличиваться до шести часов.

Sternberger описывает в Br J Exp Pathol. 1947 June; 28(3): 168-177, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки, что этанол можно использовать для стабилизации активности тромбина в плазме. Coelho et al. в патенте США №7056722, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки, описывает изобретение для простого, практичного и быстрого способа получения стабильного тромбина человека из донорской крови, используя этанол в качестве стабилизирующего тромбин средства. Способ обеспечивает быстрое образование тромба (менее чем 5 секунд), который стабилен на всем протяжении длительной хирургической операции (например, шесть часов), при добавлении этанола в концентрации от 8% до 18%. Coelho et al. дополнительно сообщает, что устройство для промышленного получения препарата тромбина из крови, который не стабилизирован этанолом, совершенно неприменимо для широкого диапазона хирургических операций, в которых применяют тромбин. Авторы изобретения должны определить очень узкий диапазон концентрации этанола, которая была достаточно низкой, чтобы избежать ингибирования системы свертывания, которое могло бы препятствовать образованию тромбина, но достаточно высокой, чтобы в достаточной мере стабилизировать тромбин.

Kumar et al. описывают в JECT 2005; 37:390-395 и в JECT. 2007; 39:18-23, полные содержания которых включены в настоящий документ в качестве ссылки, идеи, что самый простой способ инициировать продукцию тромбина заключается в добавлении ионов кальция к цитратной плазме крови. Здесь, излишек кальция позволяет инициировать каскад свертывания и образование тромбина. Kumar дополнительно сообщает, что недостатком данного способа является то, что стабильность активности тромбина в образующемся тромбине коротка, и в результате ингибирования системы свертывания белком S, белком C и антитромбином III, активность обычно снижается до нефункционального состояния через 20 минут после образования. Kumar et al. дополнительно описывают способ и устройство для обхода данных ограничений, в которых стабильный препарат тромбина можно получить, когда ингибирующие ферменты частично инактивированы, используя этанол. Для того чтобы концентрировать и активировать тромбин, смесь хлорида кальция и этанола добавляют к цитратной антикоагулированной плазме крови в присутствие отрицательно заряженной поверхности. Отрицательно заряженная поверхность инициирует образование комплекса протромбин-FV-FXa, где смесь хлорида кальция и этанола (тромбинового реагента) обеспечивает химический состав для инактивации ингибиторов тромбина и для частичной стабилизации тромбина, так что его можно использовать часы после образования. Kumar и Chapman в JECT. 2007; 39: 18-23, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки, также описывают способ получения аутологичного тромбина человека из цельной крови вместо плазмы в качестве биологической жидкости первоначального источника в 30-минутный период времени, однако, как и большая часть другого уровня техники, он все еще использует этанол как добавку для стабилизации препарата тромбина, однако с активностью тромбина, непрерывно распадающейся в течение долгого времени даже при хранении при 4°C.

Препараты сыворотка с тромбином/этанол, такие как препараты, описанные у Coelho et al. в патенте США №7056722 и Kumar, не являются биосовместимыми растворами, как описано Semple et al. в J Oral Maxillofacial Surg 66: 632-638, 2008, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки. Препараты являются цитотоксичными, если по сути дела не растворены до введения до конечной концентрации этанола менее чем 4%.

Применение этанола в качестве стабилизатора для тромбина также описано у McGinnis et al. в патентной публикации США 2004/0120942, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки. McGinnis et al. также описывают применение «средства активации свертывания крови», которое, как подразумевают, представляют собой средства, вовлеченные во внутренний путь свертывания, и включают в качестве неограничивающих примеров стекло, стеклянные шарики, диатомовую землю, керамику, каолин и любое их сочетание.

Kanayinkal et al. в патентной публикации США 2009/0044852, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки, описывают взаимодействие композиции тромбина со стабилизирующим средством для получения композиции тромбина, обладающей стабильным временем жизни более чем приблизительно 10 часов, где стабилизирующее средство содержит этанол в диапазоне от 8% до 25%, полиол, PEG, аммония сульфат, неполярный растворитель, полярный растворитель, метилизобутилкетоновый спирт, гликоль, трихлоруксусную кислоту, ацетатную соль или любое их сочетание. В то время как данная система действительно обеспечивает получение композиции тромбина с увеличенным временем жизни, трудности с биосовместимостью могут привноситься из-за присутствия стабилизирующегося средства.

Nowakowski в патенте США №6159232, выданном 12 декабря 2000 года; в патенте США №6478808, выданном 12 ноября 2002 года; в патенте США №6482223, выданном 19 ноября 2002 года и патенте США №6989022, выданном 4 января 2006 года и в патентной публикации США №2006/0178610, опубликованной 10 августа 2006, полные содержания которых включены в настоящий документ в качестве ссылки, описывает способ и устройство для ушивания раны, где каскад свертывания жидкой части крови впервые инициализируется, в то время как жидкость находится вне организма и внутри по существу закрытого стерильного контейнера. Устройство для инициации каскада свертывания может включать в себя прокоагулирующее средство (компонент, способный вызывать образование тромба жидкой частью крови), механизмы для существенной нейтрализации антикоагулянта (такой как добавление жидкого протаминсульфата к жидкой части крови с тем, чтобы ингибировать антикоагулянт гепарин), или механизмы для существенной нейтрализации противосвертывающих средств (примеры противосвертывающих ингибиторов описаны как транексамовая кислота и связывающее плазминоген вещество). Активированная тромбом жидкая часть крови затем скапливается около раны, где продолжается образование тромба.

Недавно, была исследована важность тромбина помимо его ключевой роли в процессе образования тромба. Bae et al. в J Cell Physiol. 2009; 219(3): 744-751, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки, обсуждает, что тромбин, в дополнение к тому, что он играет центральную роль при образовании тромбов, расщепляя фибриноген до фибрина, обладает различными биологическими активностями, связанными с воспалением, аллергией, ростом опухоли, метастазированием, апоптозом и перестройкой ткани. Способность тромбина модулировать множество клеточных функций осуществляется в большинстве случаев посредством взаимодействия со специфическими рецепторами на поверхности клетки. Все из известных рецепторов к тромбину принадлежат к семейству активируемых протеазой рецепторов (PAR) и характеризуются особенным протеолитическим механизмом активации. Активация рецептора имеет место, когда тромбин расщепляет внеклеточный домен рецептора, подвергающийся связыванию с лигандом. Среди рецепторов семейства PAR, тромбин может специфически взаимодействовать с PAR-1, -3 и -4. Дополнительно тромбин является высокоэффективным митогенным средством для некоторых клеток.

Несмотря на данный прогресс, идеального способа производства сыворотки с тромбином от одного донора на месте оказания медицинской помощи продолжает недоставать. Идеальное устройство и способ получения тромбина должен быть безопасен для использования внутри организма и, должен, поэтому, происходить из собственной крови пациента и, не должен нуждаться в цитотоксических добавках, таких как этанол, чтобы преодолеть проблемы со стабильностью тромбина.

Упомянутый выше предшествующий уровень техники отражает состояние в данной области, которое осознается автором заявки и, включен настоящим, чтобы исполнить общепризнанную обязанность автора заявки описывать соответствующий предшествующий уровень техники. Оговаривается тем не менее, что ни в одной из данных ссылок отдельно не сообщается, ни обладает очевидностью, при рассмотрении в любой мыслимой комбинации, связующее звено с настоящим изобретением, как более подробно описано в дальнейшем и, как особенно заявлено.

Сущность изобретения

Цель настоящего изобретения заключается в предоставлении нового и улучшенного способа и устройства для получения сыворотки с тромбином. Другие цели и преимущества станут очевидны специалисту в данной области после прочтения описания и формулы изобретения настоящего документа. Настоящее изобретение лучшим образом направлено на неудовлетворенную потребность в простом, практичном, быстром способе получения безопасной и эффективной сыворотки с тромбином для медицинского применения из жидкой части крови одного донора на месте оказания медицинской помощи. Описывается способ и устройство для получения сыворотки с тромбином, где сыворотку с тромбином можно изготовить из жидкой части крови быстрым и повторяющимся образом по требованию лечащего врача. В настоящем изобретении предлагается способ из двух стадий для получения сыворотки с тромбином из жидкой части крови. На первой стадии, прокоагулирующее средство превращается в активированное прокоагулирующее средство посредством получения протромбиназного ферментного комплекса на поверхности прокоагулирующего средства. Протромбиназный ферментный комплекс происходит из коагулирующих белков в жидкой части крови. На второй стадии, которую можно временно проводить по требованию оператора, тромбин получают из протромбина при взаимодействии активированного прокоагулирующего средства с биологической жидкостью, содержащей коагулирующие белки, включающие в себя протромбин. Поскольку данные реакции пути свертывания крови являются кальций-зависимыми, необходимо обеспечить подходящую концентрацию ионов кальция для реакционных смесей. В изобретении дополнительно предлагается устройство для содержания реакционных смесей, а также способы добавления и извлечения для переноса жидкости.

В целях настоящего изобретения прокоагулирующее средство представляет собой материал, который обладает способностью активировать систему свертывания кровеносной системы, по меньшей мере, с момента получения продукции тромбина и предпочтительно до момента получения фибрина (фигура 1). Предпочтительный прокоагулянт будет присутствовать в крови с тем, чтобы обладать большой площадью поверхности, которая лучше всего достигается при помощи прокоагулирующих частиц, имеющих диаметр менее чем 5 мм или являющихся пористыми частицами. Стадия активации осуществляется при взаимодействии прокоагулирующего средства с первой аликвотой жидкой части крови в присутствие свободных ионов кальция. Хотя и не желая быть связанными теорией, полагают, что на молекулярном уровне активация на первой стадии происходит вследствие протромбиназного ферментного комплекса, образующегося на поверхности прокоагулирующего средства в метастабильной форме. Для активации устройства требуется только приблизительно от пяти до десяти минут с использованием жидкой части крови. Состояние активации сохраняется на высоком уровне в течение, по меньшей мере, десяти часов до постепенного разрушения до неактивных уровней за двадцать четыре часа. Такую продолжительность поддерживаемого состояния активации приписывают протромбиназному ферментному комплексу, обладающему такой продолжительностью функциональной стабильности, которая является одновременно удивляющей и непредсказуемо учитывающей, как короткое время полужизни других элементов системы свертывания сохраняется, чтобы избежать чрезмерного свертывания крови. Десять часов поддерживаемой активации прокоагулянта является счастливой случайностью, поскольку это является периодом времени большим, чем большинство операций. После активации устройство можно использовать для быстрого (например, приблизительно за 1 минуту) приготовления медицински применимых количеств тромбина из второй аликвоты жидкой части крови, добавляемой в устройство. Быстрое образование тромбина приписывают большим количествам протромбиназных ферментных комплексов, образующихся на большой площади поверхности прокоагулирующего средства, катализирующего превращение протромбина в тромбин. Скорость, с которой образуется тромбин, намного превышает скорость, с которой нейтрализующие тромбин средства, такие как антитромбин III, могут нейтрализовать тромбин вследствие различия в кинетике реакций протромбиназного ферментного комплекса в отношении кинетики реакции тромбина и антитромбина III, образующих неактивный комплекс. Такое различие в кинетике между образованием тромбина и нейтрализации тромбина создает временное окно в отношении способности обладать клинически применимыми количествами доступного тромбина. Чем более быстро образование тромбина, которое можно достичь (например, больше образующихся протромбиназных ферментных комплексов), тем большую продолжительность времени клинически применимые количества тромбина будут существовать в сыворотке с тромбином. Дополнительно, было изучено посредством экспериментирования, что кинетика реакции тромбина и антитромбина III является намного более чувствительной к температуре (ингибируется при температуре <10°C), чем образование тромбина, поэтому даже применимые количества тромбин можно хранить, используя охлажденные препараты крови, и что приемлемый срок годности полученной сыворотки с тромбином можно значительно увеличен при хранении в холодильнике. Следовательно, настоящее изобретение позволяет быстро получить биосовместимую сыворотку с тромбином из собственной крови пациента по требованию хирургической бригады. В изобретении также предлагаются способы для устройств, которые будут использоваться повторно, означая, что можно добавлять вторую, третью, четвертую и так далее аликвоту крови в то же самое устройство тем же самым образом, чтобы получить дополнительные независимые аликвоты сыворотки с тромбином. Дополнительно, в настоящем изобретении сообщается, что каждое использование устройства для получения сыворотки с тромбином является причиной активированного состояния прокоагулирующего средства, которое будет возобновляться в течение дополнительных десяти часов, позволяя оператору продолжать владеть непрерывным быстрым получением тромбина из одного устройства. Экономическая выгода и возможность для снижения произведенных расходов при обеспечении получения тромбина в большом объеме, используя собственную жидкую часть крови пациента при лечении, является другим благоприятным аспектом настоящего изобретения.

Плазма представляет собой бесклеточную фракцию крови и она включает в себя множество белков, включая белки системы свертывания и фибриноген. Когда фибриноген превращается в фибрин при активации тромбином, в плазме остается значительно меньшая концентрация фибриногена, и ее определяют как сыворотку вместо плазмы. Для целей по настоящему изобретению сыворотку с тромбином используют в качестве термина, чтобы описать любую биологическую жидкость, которая содержит определяемую активность фермента свертывания тромбина по превращению фибриногена в фибрин независимо от его клеточного содержания. Для целей по настоящему изобретению жидкая часть крови представляет собой термин, применяемый в настоящем документе для описания биологической жидкости, получаемой от донора, обладающей функциональной способностью образовывать протромбиназный ферментный комплекс при активации системы свертывания и она выбрана из списка, включающего в себя цельную кровь, цитратную антикоагулированную цельную кровь или плазму, или любого другого подходящего материала фракции крови, содержащего протромбин в качестве компонента, плазмы, включая обогащенную тромбоцитами плазму, плазму с высоким содержанием лейкоцитного слоя, обедненную тромбоцитами плазму, целый костный мозг, цитратный антикоагулированный костный мозг, цельную пуповинную кровь, цитратный антикоагулированный костный мозг и любые другие препараты жидкой части крови, отвечающие требованиям системы свертывания. Дополнительно в настоящем изобретении сообщается, что можно использовать различные жидкие части крови в одном и том же устройстве. В виде неограничивающего примера, первую стадию активации прокоагулирующего средства можно осуществить, добавляя цельную кровь в устройство, и для второй стадии получения сыворотки с тромбином, применяемая жидкая часть крови могла бы быть другой жидкой частью крови, такой как обогащенная тромбоцитами плазма.

Настоящее изобретение, как более подробно описано в дальнейшем и как особенно заявлено, было сделано по большому количеству неожиданных, непредсказуемых и удивительных экспериментальных наблюдений, включая: 1) что протромбиназный ферментный комплекс, образующийся на большой площади поверхности предпочтительного прокоагулирующего средства, во время первых минут смешивания жидкой части крови, кальция с прокоагулирующим средством в устройстве, остается в постоянном функциональном состоянии поддерживаемой ферментативной активности, чтобы обладать способностью усилить быстрое превращение протромбина в тромбин в течение клинически приемлемого промежутка времени, по меньшей мере, шести часов, но мене чем двадцати четырех часов, таким образом, позволяя «по требованию» получать препарат тромбина из подвергавшегося хранению активированного устройства; 2) находку, что тромбин можно получать в большом количестве и очень быстро, через секунды вместо минут, при взаимодействии источника протромбина жидкой части крови с активированным прокоагулирующим средством и тем самым обеспечивать клинически приемлемые концентрации тромбина, которые будут достигаться более быстро, чем было возможно до этого (например, 1 минута инкубации), дополнительно позволяя «по требованию» получать препарат тромбина из подвергавшегося хранению активированного устройства; 3) находку, что хранение собранной сыворотки с тромбином при температуре <10°C значительно увеличивает стабильность тромбина без этанола, присутствующего в качестве стабилизатора, как описано у Kumar et al. 2007, дополнительно поддерживания применимость подхода «по требованию» для получения биосовместимой сыворотки с тромбином; 4) находку, что одно устройство можно использовать повторно для получения множества партий тромбина и что каждая продукция тромбина дополнительно служит для поддержания прокоагулирующего средства внутри устройства в активированном состоянии в течение, по меньшей мере, дополнительного периода 10 часов, дополнительно поддерживая рентабельность устройства, поскольку одно устройство можно использовать для получения большого количества свежеприготовленной сыворотки с тромбином от одного донора; 5) находку, что удаление этанола из жидкой части крови, как сообщалось в предшествующем уровне техники для получения тромбина от одного донора, позволяет осуществлять более быструю активацию прокоагулянта, таким образом, что требуется только 10 минут времени, чтобы обладать способностью продуцировать клинически приемлемый тромбин вместо от 30 до 60 минут, необходимых в случаях, когда этанол добавляют к жидкой части крови, как сообщалось в предшествующем уровне техники, позволяя получить более быструю доступность для пациента тромбина от одного донора, 10) находку, что добавление этанола в концентрации от 18% до 25% об./об. к жидкой части крови можно все-таки применять для стабилизации тромбина, если этого хочется, добавляя этанол после того, как осуществили первую активацию прокоагулянта, чтобы улучшить предшествующий уровень техники, который страдает от являющегося медленным и ненадежным получения тромбина вследствие этанола, который должен присутствовать в точных концентрациях, чтобы избежать деградации системы свертывания (чрезмерная концентрация этанола) или избежать потери способности стабилизировать тромбин (недостаточная концентрация этанола).

Настоящее изобретение относится к способам повторного применения и хранения одного устройства, которое было активировано взаимодействием первой аликвоты жидкой части крови в присутствии ионов кальция, для того чтобы значительно повысить доступность и количество тромбина, содержащегося в одном или нескольких препаратах тромбина, полученных по требованию в течение периода времени 10 часов посредством взаимодействия с одной или несколькими дополнительными аликвотами жидкой части крови. Временно стабильный тромбин, образующийся по настоящему изобретению, получают, таким образом, без использования стабилизирующих тромбин добавок. Таким образом, предпочтительный вариант осуществления изобретения усовершенствует или преодолевает один или несколько из значительных недостатков предшествующего уровня техники, описывая приемлемый способ получения клинически применимых препаратов тромбина по требованию из жидкой части крови, которая выбрана из списка, включающего в себя кровь, цельную кровь одного донора, плазму, объединенную плазму, обогащенную тромбоцитами плазму, обедненную тромбоцитами плазму или фракцию цельной крови, содержащую интактную систему свертывания (в настоящем документе обозначаемая как жидкая часть крови). Значительные улучшения можно осуществить, практикуя изобретение для получения тромбина, в отношении контроля, эффективности, in regard to control, efficacy, надежности, безопасности и эффективности затрат. Особенно, описываемые способ и устройство позволяют с помощью одного устройства осуществить быстрое, восстанавливаемое, повторяемое и запланированное получение большого количества клинически приемлемых препаратов тромбина из легко доступных биологических жидкостей для достижения остановки кровотечения, стимулирования заживления ран или доставки клеточных композиций способом, который легко выполнит специалист на всем протяжении длительных хирургических операций. Изобретение дополнительно относится к способу использования препаратов сыворотки с тромбина для удобной практики способа, предлагая устройство для выполнения способа.

Прокоагулирующее средство предпочтительно выбрано из списка, включающего в себя, но не ограниченного этим, стекло, стеклянные шарики, стекловолокно, керамику, эллаговую кислоту и диатомовую землю или тому подобное, которое связывается с функциональным протромбиназным ферментным комплексом и определяется как активированный прокоагулянт. Предпочтительное прокоагулирующее средство представляет собой боросиликатные стеклянные шарики, имеющие диаметр в диапазоне от 50 микрон до 2 мм, такие, что они легко удерживаются в реакционной камере, позволяя проходить клеткам крови (диаметром приблизительно 6-10 микрон), способами, хорошо известными специалистам в данной области такими, как сетчатый фильтр, фильтр глубинного типа и тому подобное. Полезно обеспечивать большую площадь поверхности для прокоагулирующего средства, которое будет находиться на дне реакционной камеры. Особенно полезно включать в реакционную камеру другие незакрепленные предметы, обладающие большим диаметром и большей массой, которые буду использоваться для растирания в порошок образующихся фибриновых гелей механическим перемешиванием, таким как ручное перемешивание устройства. Иллюстративные подходящие незакрепленные предметы представляют собой шарики размером от 6 до 8 мм из медицински приемлемых для взаимодействия с кровью материалов, таких как стекло, полистирол, поликарбонат и полиэтилен, хотя следует с готовностью подразумевать, что могут быть использованы другие средства для растирания в порошок образующихся фибриновых гелей. Предпочтительно, все части устройства являются биосовместимыми для использования на человеке и могут противостоять стерилизации посредством одного или нескольких известных способов стерилизации, включая гамма-облучение, электронный луч или, менее предпочтительно, газ этиленоксид.

Было неожиданно и удивительно, что, несмотря на присутствие ингибиторов протромбиназного ферментного комплекса (антитромбин III и активированный белок C и белок S) и большого количества других сорбирующих белков, таких как альбумин и иммуноглобулин в реакционной смеси, достаточная стабильность протромбиназного ферментного комплекса сохранялась в течение продолжительного периода времени. Тем не менее такая химия получения увеличенного количества тромбина не была постоянной и заканчивалась в течение 24 часов после хранения при комнатной температуре. Отмечая, что причины продолжительной стабильности неизвестны и удивительны с учетом, как быстро наиболее активированные белки коагуляции исчезают из-за контроля и уравновешивания системы свертывания, не существует никакого научного доказательства, чтобы позволить специалисту в данной области предсказать без экспериментирования, что такие периоды предоставления стабильности были бы обнаружены. Специалист в данной области не был бы в состоянии предсказать, что стабильность будет иметь место, по меньшей мере, 10 часов, но менее чем 24 часа.

Настоящее изобретение относится к устройству, которое представляет собой легкое в использовании, переносное, недорогое и надежное устройство для применения на месте оказания медицинской помощи предпочтительно с использованием одного донора или предпочтительно аутологичного источника жидкой части крови (Смотри фиг. 4-6).

Настоящее изобретение относится к препарату тромбина для врача, который является безопасным для пациента, получающего препарат тромбина по сравнению с существующими препаратами тромбина. Первый способ улучшенной безопасности заключается в том, что настоящее изобретение снижает риск, связанный с существующими препаратами тромбина, избегая добавления химических примесей, таких как цитотоксические концентрации этанола, в качестве стабилизирующих средств. Отсутствие таких химических добавок особенно ценно, поскольку это устраняет риск возникновения химического токсичного ответа, когда препарат тромбина применяются пациентом-получателем. В качестве второго способа улучшенной безопасности препарат тромбина, описываемый в настоящем изобретении, не происходит из других видов, как в случае с бычьим тромбином или генетически модифицированными клеточными линиями хомячка, таким образом, избегая риска возникновения патогенной передачи и иммуногенных реакций. В качестве третьего способа улучшенной безопасности настоящее изобретение делает возможным получение препарата тромбина от одного донора, а не от смешивания плазмы от потенциально сотен или даже тысяч доноров, как практикуется в настоящее время, тем самым снижая риск передачи инфекционных заболеваний, остающихся в смешанном препарате. В качестве четвертого способа улучшенной безопасности получение тромбина является простым и быстрым, что его можно получать при использовании, тем самым предоставляя возможность использовать собственную жидкую часть крови пациента для получения тромбина. Аутологичные препараты крови повсеместно признаны самыми безопасными биологическими препаратами. В качестве пятого способа улучшенной безопасности настоящий способ и устройство достаточно просты, чтобы их можно было использовать в стерильное поле операционной комнаты, таким образом, избегая необходимости передавать материалы из и затем обратно в стерильное поле и, таким образом, избегая повышенного риска микробного загрязнения стерильного поля, и в конечном счете повышенного риска, что пациент заразится внутрибольничной инфекцией.

Тромбин, получаемый согласно способу по настоящему изобретению, применим для таких же общепринятых терапевтических применений тромбина, как известно и было недавно рассмотрено у Ham et al., Journal of Blood Medicine 2010:1 135-142, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки. Настоящее изобретение относится к способам получения препарата тромбина, который обладает достаточной концентрацией тромбина во время использования, которое будет эффективно для предусмотренного назначения получения фибрина из фибриногена. Настоящее изобретение особенно хорошо подходит для получения фибриновых гелей для доставки клеток, таких как тромбоциты и стволовые клетки. Добавление препаратов тромбина к обогащенной тромбоцитами плазме для образования гелей с высоким содержанием тромбоцитов широко применяется в практике медицины, как недавно рассмотрено Akingboye et al., AA, J Extra Corpor Technol. 2010 Mar; 42(1): 20-9, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Способ и материалы для получения описываемого препарата тромбина приемлемы, поскольку они быстры, надежны и просты в использовании, так что их можно использовать при множестве различных обстоятельств, проходящих во время и на поле действия операции, на месте оказания медицинской помощи или в лабораторных условиях или пользователями, которые обладают различными возможностями квалификации и владеют специальностью операционной медсестры, чтобы проводить их. Дополнительно, настоящее устройство и способ уменьшают до минимума количество времени непосредственного использования и общего времени от начала до конца до приблизительно 10 минут, которое является меньшим временем, чем для других способов, используемых в настоящее время. Для настоящего способа не требуется использования электромеханических устройств, таких как центрифуги или нагреватели, для приготовления сыворотки с тромбином.

Nowakowski, Coelho, Kumar и остальной предшествующий уровень техники ни по отдельности, или в комбинации действительно не сообщают, предлагают или мотивируют: 1) описание способа из двух стадий для приготовления сыворотки с тромбином; 2) приемлемые способы преодоления нестабильности сыворотки с тромбином при хранении активированного прокоагулирующего средства; 3). Способ для повторного использования активированного прокоагулирующего средства для получения множества партий сыворотки с тромбином из одного устройства или 4) внесение средства для растирания фибринового геля, образующегося в реакционной камере, для высвобождения сыворотки с тромбином из фибринового геля, используя незакрепленные предметы.

В свете недостатков предшествующего уровня техники основная цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предоставить биосовместимую сыворотку с тромбином из жидкая часть крови одного донора по требованию без необходимости использования цитотоксических стабилизирующих тромбин химических веществ в способе, достаточно простом, чтобы выполняться медицинским штатом, таким как хирургические медсестры на месте оказания медицинской помощи.

Дополнительная цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предоставить приемлемый способ получения сыворотки с тромбином, который обладает минимальным временем процесса приблизительно 10 минут.

Еще одна дополнительная цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предоставить биосовместимую сыворотку с тромбином, которая обеспечивает образование тромба через менее чем 10 секунд.

Еще одна дополнительная цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предоставить тромбин, который можно распылять через небольшое отверстие или выжимать через тонкие тюбики отдельно или в сочетании с источником фибриногена.

Еще одна дополнительная цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предоставить способ получения биосовместимого тромбина, способ включающий: получение первой аликвоты жидкой части крови; добавление достаточного количества CaCl2 к первой аликвоте жидкой части крови, чтобы рекальцинировать жидкую часть крови, добавление прокоагулирующего средства, получение первой смеси из этого, причем получающие стадии, включают в себя: быстрое перемешивание первой композиции для получения смеси; хранения первой композиции в течение, по меньшей мере, приблизительно 10 минут и менее чем 6 часов; хранение указанной первой смеси в течение периода времени пока необходимо, чтобы сыворотка с тромбином была доступна; получение второй аликвоты жидкой части крови; добавление достаточного количества CaCl2 ко второй аликвоте жидкой части крови, чтобы рекальцинировать жидкую часть крови, добавление второй аликвоты, содержащей CaCl2 к хранящейся первой смеси для получения второй композиции смеси; быстрое перемешивание второй композиции смеси для смешивания; инкубирование второй композиции до тех пор, пока не образуется фибриновый гель, растирание фибринового геля для высвобождения сыворотки с тромбином; и фильтрация сыворотки с тромбином для удаления частиц, таким образом, пропуская тромбин через мембрану фильтра, имеющего размер пор, чтобы позволить протекать жидкости к сыворотке с тромбином, но достаточно большим, чтобы предотвратить прохождение прокоагулирующего средства (например, размер пор 20 микрон); ранение полученной сыворотки с тромбином при комнатной температуре и, более предпочтительно, на водном льду (<10°C) и, наконец, взаимодействие сыворотки с тромбином с источником фибриногена для образования фибрина.

Еще одна дополнительная цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предоставить способ приготовления сыворотки с тромбином, который подходит для получения эффективной клеточной суспензии, встроенной в фибриновый гель с целью получения тканевого лоскута, для ведения клеточной культуры, для проведения диагностического теста или других целей, известных в данной области, объединения клеток и тканей с фибриновыми герметиками. Значение использования биосовместимого тромбин особенно важно для получения сложных трансплантатов жизнеспособных клеток, чтобы поддержать жизнеспособность клеток, содержащихся в фибриновом трансплантате.

Еще одна дополнительная цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предоставить устройства, которое можно повторно использовать для извлечения сыворотки с тромбином множество раз без необходимости в активации.

Добавляя 3-ю, 4-ю или 5-ю или более аликвот жидкой части крови в устройство, можно быстро достичь этого через 10 часов после последнего добавления предшествующей жидкой части крови в устройство. Каждую аликвоту жидкой части крови следует обрабатывать раствором CaCl2, чтобы рекальцинировать жидкую часть крови, если хелатирующее кальций средство, такое как цитрат натрия, был использован в качестве антикоагулянта. Настоящее изобретение не пригодно для использования с жидкой частью крови, которая была антикоагулирована гепарином, за исключением случаев, когда применяются меры, как описано Nowakowski для удаления гепарина из жидкости крови.

Настоящее изобретение относится к улучшенному способу получения тромбина для медицинского применения, преодолевающему ограничения, иллюстрируемые при усилии других работ в данной области. Настоящее изобретение относится к тромбину в концентрации, которая обеспечит быстрое образование тромба при объединении и источником фибриногена (<5-10 секунд) по мере необходимости на всем протяжении длительной хирургической операции (например, десять часов). Предыдущие работы в данной области (Hirsch, et al.) проиллюстрировали проблему, что тромбин обладал только минимальной стабильностью, при которой тромбин достигает быстрого свертывания фибриногена (то есть, менее чем 5 секунд), существующей только в очень узком временном интервале от четырех до пяти минут, или требовал такого количества стадий и затраченного времени, что он не подходил для периоперационной подготовки, и то, и другое полностью неприемлемо для широкого диапазона хирургических операций. В предшествующих работах в данной области (например, Coelho et al.) пытались преодолеть данное ограничение кратковременной стабильности сыворотки с тромбином добавлением этанола в качестве химического стабилизатора для тромбина, но при этом ввели новую проблему биосовместимости из-за цитотоксической концентрации этанола, требуемой для достижения улучшенной стабильности тромбина.

Таким образом, проблема нестабильности тромбина в настоящем изобретении решается более совершенно. Посредством создания двухстадийного способа активированное прокоагулирующее средство можно изготовить и хранить до времени пока не понадобится непосредственно сыворотка с тромбином и, тем самым, откладывая приготовление сыворотки с тромбином, так чтобы преодолеть хорошо известную проблему временной стабильности тромбина. Полученный препарат тромбина из активированного устройства сохраняет свою способность быстрого свертывания в течение, по меньшей мере, 15 минут, когда хранится при комнатной температуре и в течение, по меньшей мере, одного часа, когда хранится при температуре <10°C, не требуя химической добавки. Сохраняя активированное устройство вместо хранения сыворотки с тромбином, стабилизированной этанолом, как сообщалось в предшествующим уровне техники Coelho и Kumar и других, настоящее изобретение относится к способу, чтобы более быстро обеспечить получение клинически применимых препаратов сыворотки с тромбином одновременно с быстрым временем свертывания (например, менее чем 10 секунд), которая является биосовместимой, от одного донора на месте оказания медицинской помощи.

Краткое описание чертежей

Упомянутые выше аспекты и множество из сопутствующих преимуществ по изобретению станут более легко оценены, как то же самое станет более понятым в соответствии со следующим ниже подробном описанием, когда оно взято в сочетании с приложенными графиками и фигурами, где:

Фиг. 1 представляет собой краткое описание системы свертывания, как известно на предшествующем уровне техники;

Фиг. 2 представляет собой схему последовательности операций, подробно описывающую способ в предпочтительном варианте осуществления изобретения;

Фиг. 3 представляет собой схему последовательности операций, подробно описывающую способ в предпочтительном варианте осуществления изобретения;

Фиг. 4a представляет собой один из вариантов осуществления корпуса реакционной камеры согласно варианту осуществления изобретения;

Фиг. 4b представляет собой вид сверху корпуса реакционной камеры и реакционной камеры согласно варианту осуществления изобретения;

Фиг. 4c представляет собой вид сбоку корпуса реакционной камеры и реакционной камеры согласно варианту осуществления изобретения;

Фиг. 4d представляет собой развернутый вид в перспективе корпуса реакционной камеры и реакционной камеры согласно варианту осуществления изобретения;

Fig 5 представляет собой рисунок иллюстративной собранной реакционной камеры совместно с устройством для сбора сыворотки с тромбином;

Фиг. 6 представляет собой рисунок иллюстративной реакционной камеры совместно со шприцами для применения в сочетании с иллюстративной реакционной камерой для сбора сыворотки с тромбином;

Фиг. 6A представляет собой рисунок предшествующего уровня техники насадки наконечника распылителя, применяемого для доставки полученного тромбина для образования фибрина в необходимом месте;

Фиг. 7 представляет собой рисунок, иллюстрирующий получение сыворотки с тромбином из иллюстративной реакционной камеры согласно варианту осуществления изобретения; и

на Фиг. 8 показано, что образовавшийся фибриновый гель достаточно прочен, чтобы поддерживать свой собственный вес.

Подробное описание изобретения

Следующее ниже описание представлено, чтобы дать возможность специалисту в данной области получить и применить различные аспекты и примеры по настоящему изобретению. Описание конкретных материалов, методик и применений предлагается только в качестве примеров. Различные модификации примеров, описываемые в настоящем документе, будут с легкостью очевидны специалистам в данной области, и общие принципы, определяемые в настоящем документе, можно применять к другим примерам и применениям не отступая от сущности и объема изобретения. Таким образом, настоящее изобретение не предназначено для ограничения описанными и показанными примерами, а должно соответствовать объему, как предусмотрено прилагаемой формулой изобретения.

Начиная сперва с фиг. 2, способ настоящего изобретения в предпочтительном варианте осуществления включает четыре стадии, которые предпочтительно происходят последовательно: 1) получают активированную поверхность прокоагулирующего средства посредством объединения и затем инкубации в течение приблизительно 10 минут первой аликвоты биологической жидкости, которая отвечает требованиям системы свертывания в присутствие свободных ионов кальция; 2) активированное прокоагулирующее средство может затем храниться в течение периода времени вплоть до приблизительно 10 часов; 3) в диапазоне приблизительно от 1 минуты до 10 часов от добавления первой жидкой часть крови и во время, когда, как ожидается, понадобится тромбин (планируемое использование тромбина), дополнительную аликвоту биологической жидкости и свободных ионов Ca++ добавляют к активированному прокоагулирующему средству; и 4) фибриновый гель, который впоследствии образуется, растирают в порошок, чтобы высвободить сыворотку с тромбином, которую можно затем собирать. Тромбин можно наносить на источник фибриногена для образования фибрина. Тромбин можно наносить местно в качестве жидкости, распылять в аэрозоле или применять с другим носителем, таким как рассасывающееся кровоостанавливающее средство, включая желатиновую губку, окисленную регенерированную целлюлозу и микрофибриллированный коллаген по отдельности или в сочетании с фибриногеном, чтобы получить «клей» или «гель».

Применительно к данной заявке, следует отметить, что «активированное» прокоагулирующее средство и прокоагулирующее средство - это не одно и то же. Активированное прокоагулирующее средство вызовет загустение плазмы с гораздо большей скоростью, чем прокоагулирующее средство, которое не было активировано. По схеме идентификации, активированное прокоагулирующее средство можно определить, сравнивая для двух образцов время, которое прокоагулирующее средство займет в каждом образце для того, чтобы вызвать загустение свежезамороженной плазмы, содержащей цитрат в качестве антикоагулянта, где плазма размораживалась в течение двух часов до ее предполагаемого использования. Более конкретно, в первую полистироловую пробирку для тестирования 12 мм × 75 мм, добавляют 0,5 грамм прокоагулирующего средства, которое ранее взаимодействовало с жидкой частью крови. Во вторую такую же пробирку для тестирования добавляют в качестве контроля то же самое прокоагулирующее средство, которое не взаимодействовало ранее с жидкой частью крови. В каждую пробирку добавляют 2 мл размороженной свежезамороженной плазмы, содержащей цитрат в качестве антикоагулянта, где плазма размораживалась в течение 2 часов от ее предполагаемого использования, и регистрировали время добавления как время ноль. Продолжительность времени, которая требуется для жидкой плазмы в каждой пробирке, чтобы превратиться в гель, регистрировали, и, если для тестируемого прокоагулянта затраченное время, чтобы вызвать загустение плазмы, является более быстрым вдвое или более чем время, чтобы вызвать загустение плазмы, для контрольного прокоагулянта, то тестируемый прокоагулянт, как определяют, является активированным прокоагулирующим средством. Если для тестируемого прокоагулянта затраченное время для того, чтобы вызвать загустение плазмы является менее чем вдвое быстрее, чем время для контрольного прокоагулянта, чтобы вызвать загустение плазмы, то тестируемый прокоагулянт, как определяют, не является активированным прокоагулирующим средством.

Возвращаясь к настоящему изобретению в его предпочтительном варианте осуществления, также отмечено, что полученный тромбин, хранимый при комнатной температуре, кратковременно стабилен, и его можно добавлять к источнику фибриногена для образования фибрина в 30-минутный период времени. Если требуется быстрое образование фибрина (быстрое время свертывания), предпочтительно осуществить взаимодействие фибриногена с полученным тромбином в течение 15-минутного периода времени и, даже более предпочтительно, немедленно (в течение 5 минут) после получения тромбина. Если планируемое использование тромбина откладывается, тромбин можно хранить на льду (<10°C), что будет значительно увеличивать стабильность тромбин, так что его можно использовать через 3 часа и более предпочтительно, через 60 минут.

Пропускание раствора тромбина через фильтр, содержащий пористую мембрану (например, размер пор от 20 до 80 микрон) будет сохранять прокоагулирующее средство и удалять твердые частицы фибрина, которые иначе будут препятствовать распылению тромбина через небольшое отверстие или выдавливанию тромбина через тонкий тюбик в участок раны, используя устройство, показанное на фиг. 6A. Фиг. 6A представляет собой рисунок предшествующего уровня техники насадки наконечника распылителя, в котором один шприц заполнен источником фибриногена и второй шприц заполнен сывороткой с тромбином, и где содержимое двух шприцев смешивается, когда они выдавливаются через элемент распылителя для получения спрей-аэрозоля, который будет доставлять смесь в виде жидкости, которая быстро станет твердой из-за образования фибрина и будет действовать в качестве герметика.

Переходя теперь к фиг. 4A - фиг. 4D, показан один аспект по изобретению. На фиг. 4A - фиг. 4C показаны различные виды устройства, используемого для практики способа. Устройство включает в себя кожух 1 окружающий реакционную камеру 2. Реакционная камера 2 представляет собой предпочтительно цилиндрическую камеру, имеющую широкое окончание конец 2a и узкое окончание 2b. Широкое окончание 2a содержит структуру крышки 3, которая выполнена с возможностью прессовой посадки в отверстие на широкое окончание 2a. Узкое окончание 2b выполнено с возможностью помещать переходник 4. Обращаясь теперь к фиг. 4D, на фигуре показано изображение структуры крышки 3 и переходника 4 в разобранном виде, согласно варианту осуществления изобретения. Узкое окончание 2b выполнено с возможностью образовать подобную горлышку структуру 2c, подобная горлышку структура 2c соединена с переходником 4 (смотри от фиг. 4A до фиг. 4C). Переходник 4 содержит двойной переходник с люэровской насадкой с внутренней резьбой 5. Двойной переходник с люэровской насадкой с внутренней резьбой 5 имеет первый 2 конец 5a и второй конец 5b. 5a адаптирован, чтобы входить в подобную горлышку структуру 2c. 5b адаптирован, чтобы помещать первый конец 6a безыгольного входного отверстия 6. Второй конец 6b безыгольного входного отверстия 6 выполнен с возможностью образовать структуру с резьбой 6b. Структура с резьбой 6b безыгольного входного отверстия 6 соединена с крышкой 7. Крышка 7 предотвращает загрязнение безыгольного входного отверстия 6. Структура крышки 3 включает в себя герметичную крышку 8. Герметичная крышка 8 представляет собой кольцевую структуру, внутреннее кольцо 8a выполнено с возможностью вмещать крышку 9 и внешнее кольцо 8b выполнено для плотной подгонки широкого окончания 2a контейнера 2. Крышка 9 содержит выемку 9a, выполненную для размещения и поддержания фильтрующей мембраны 10. Фильтрующая мембрана 10 остается в углублении 9a крышки 9 при помощи держателя 11.

Устройство, как описано в настоящем документе, содержит стерильный непирогенный контейнер для система циркуляции жидкости, имеющий средства для внесения, содержания и удаления жидкости без протекания и, предпочтительно, без непосредственного контакта жидкости с воздухом открытого помещения, чтобы таким образом снизить риск возникновения загрязнение микроорганизмами, причем контейнер также действует в качестве реакционной камеры для активации системы свертывания, причем реакционная камера содержит прокоагулирующее средство в достаточном количестве и площадь поверхности для эффективной активации системы свертывания в объеме биологической жидкости, предназначенной для применения, причем реакционная камера дополнительно имеет форму, которая делает возможным тесное взаимодействие прокоагулирующего средства с биологической жидкостью во время каждой стадии инкубации, и содержащая средства для растирания полученных в ней фибриновых гелей, предпочтительно за счет содержания более крупных незакрепленных предметов с большей массой, чем прокоагулирующее средство, и реакционный сосуд, сконструированный, чтобы иметь достаточную внутреннюю площадь поверхности внутри камеры, так чтобы механическое перемешивание реакционной камеры (например, встряхивание) оператором, заставляло более крупные незакрепленные предметы сдвигать и разрушать фибриновый гель, окружающий более мелкое прокоагулирующее средство. Предпочтительным является отношение объема, по меньшей мере, в два раза больше объединенного объема биологической жидкости, прокоагулирующего средства и незакрепленных более крупных предметов. При растирании в порошок геля движение крупных незакрепленных предметов внутри реакционной камеры создает слышимый звук, оповещающий оператора, что растирание завершено. Более крупные незакрепленные предметы изготовлены из пластиковых сфер или стеклянных сфер для медицинского использования. Предпочтительная форма и диаметр таких крупных незакрепленных предметов представляет собой сферу, обладающую диаметром от 5 до 15 мм, состоящую из пластмассы и стекла для медицинского использования. В реакционной камере предпочтительно предлагаются средства для введения ионов кальция в раствор, предпочтительно, в количестве раствора, который составляет менее чем 10% от объема заданной аликвоты жидкой части крови и, дополнительно, где ионы кальция происходят из хлорида кальция. Количество ионов кальция, которое необходимо добавить, может с легкостью определить экспериментированием специалист в данной области, но оно должно быть достаточным для рекальцинирования аликвоты крови, которое, как правило, имеет место, когда конечная концентрация добавляемого хлорид кальция составляет от 5 до 30 мМ и, более предпочтительно, от 10 до 20 мМ. Кальций можно добавлять где угодно в системе циркуляции жидкости после автоматического клапана, поскольку плазма, впрыснутая в систему, будет переносить ее в реакционную камеру. В качестве одного менее предпочтительного, но полезного примера, описанного более подробно ниже, предлагается, что сухой кальций можно помещать между задвижкой и односторонним одноходовым клапаном.

Ниже следует подробное описание иллюстративного способа для приготовления сыворотки с тромбином из плазмы крови человека согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения.

Изображение иллюстративного устройства, применяемого для практики способа, показано на фиг. 5. В данном иллюстративном варианте осуществления устройство включает в себя реакционную камеру 2, содержащую прокоагулирующее средство 12. Реакционная камера 2 также содержит незакрепленные сферы 13 для растирания в порошок фибринового геля. Четырехсторонний запорный кран 14, содержащий ручку регулировки потока 14a, предлагается для контроля потока жидкости из и в реакционную камеру 2. Односторонний одноходовый клапан 15 соединен с реакционной камерой 2 и препятствует выходу жидкости из реакционной камеры 2. Корпус фильтра 16, содержащий мембрану с размером пор приблизительно 20 микрон, соединен с одним из концов четырехстороннего запорного крана 14 для удерживания твердых частиц, включая прокоагулирующее средство и частицы фибрина. Устройство дополнительно содержит автоматическое одностороннее безыгольное входное отверстие 17, чтобы улучшить микробную безопасность устройства, избегая контакта с открытым воздухом при переносе жидкости в и из реакционной камеры 2.

Изготовление реакционной камеры. Хотя можно применять различные подходящие сосуды, в данном иллюстративном варианте осуществления шприц объемом 60 мл предложен как удобный прототип реакционной камеры 2. Реакционную камеру 2 можно получить, удаляя поршень шприца и добавляя стеклянные сферы в качестве прокоагулянта 12. В данном иллюстративном способе и в виде одного примера, 20 грамм стеклянных шариков, имеющих диаметр в диапазоне от 0,5 до 5 мм, можно использовать в качестве прокоагулирующего средства 12. Кроме того, 7 грамм крупных полистироловых шариков (диаметр 10 мм) или других подходящих материалов можно добавлять в реакционную камеру в качестве твердых незакрепленных предметов 13 для растирания в порошок фибриновых гелей. Поршень можно затем возвращать до отметки на шприце 50 мл, чтобы создать достаточное пространство для крупных незакрепленных шариков 13 для движения при перемешивании, так чтобы разрушать (растирать) образующийся фибриновый гель. Поршень не нужно двигать и он может оставаться в фиксированном положении во время получения сыворотки с тромбином. Коммерческие варианты осуществления настоящего изобретения могут альтернативно использовать изготовленный литьем под давлением сосуд вместо шприца в качестве реакционного сосуда. 4-сторонний запорный кран 14 с ручкой затвора 14a включены в предпочтительный вариант осуществления, чтобы обеспечить средства для направленного контроля передвижения жидкости в и из реакционной камеры. Ручка затвора 14 повернута в первое положение A, при котором циркуляция жидкости происходит из первого безыгольного входного отверстия 17, через односторонний одноходовый клапан 15 и затем в реакционную камеру 2 (цилиндр шприца в настоящем примере). Фиг. 6 представляет собой рисунок иллюстративной реакционной камеры совместно с шприцами для применения в сочетании с иллюстративной реакционной камерой для сбора сыворотки с тромбином. Иллюстративная реакционная камера, как описано в настоящем документе, применяется в сочетании с другими шприцами 19, 20 и 21 для доставки жидкостей, таких как биологическая жидкость и жидкость, содержащая ион кальция. Жидкости можно вводить в устройство, когда ручка затвора находится в положении A. Ручку затвора 14a можно поворачивать во второе положение B, при котором жидкость проходит из второго безыгольного входного отверстия 18, через фильтр 16 и затем в реакционную камеру 2 (цилиндр шприца в настоящем примере). В таком положении B ручки затвора, шприц можно присоединить ко второму входному отверстию с автоматическим клапаном и поршень шприца можно выдвигать обратно так, чтобы создать объем низкого давления или вакуум, что приведет к тому, что сыворотка с тромбином будет проходить из реакционной камеры 2 через фильтр 16 и в шприц. В предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения включен фильтр, содержащий пористую мембрану с величиной отверстия поры достаточно малым, чтобы она удерживала прокоагулирующее средство (слишком мало, чтобы показать на данной фигуре) и частицы фибрина, но дающую возможность протекать сыворотке с тромбином. Микробную безопасность устройства можно увеличить, предлагая закрытую систему, которую получают, включая непроницаемое асептическое входное отверстие с автоматическим клапаном для шприцев для доступа в устройство.

Приготовление раствора CaCl2. 354 мМ раствор гексагидрата хлорида кальция (Sigma, St. Louis, Mo, Product No. 21110-1KG-F, Lot #BCBC3343, MW 219,08) можно получить, растворяя 15,5 грамм в 200 мл воды. Для каждых 5 мл цитратной антикоагулированной жидкой части крови, можно добавлять 0,2 мл раствора CaCl2, для рекальцинирования раствора жидкой части крови при конечной концентрации приблизительно 14 мМ. Можно использовать шприц объемом 1 мл для доставки to CaCl2 в реакционную камеру через отверстие с автоматическим клапаном. Альтернативно, сухой кальций может присутствовать в камере до начала процедуры и присутствие сухого кальция исключает необходимость в применении жидкого кальция на последних стадиях способа.

Жидкая часть крови. В виде неограничивающего примера, цитратную антикоагулированную цельную кровь или цитратную антикоагулированную свежую плазму человека можно использовать в качестве приемлемых жидких частей крови для экспериментальных целей.

Нанесение спрея сыворотки с тромбином. После сбора сыворотки с тромбином, насадку наконечника распылителя, такую как насадка, производимая Micromedics Corp., St. Paul, Minnesota (смотри соединительное устройство Fibrijet Blending с наконечником распылителя SA-3674, как показано в предшествующем уровне на фиг. 6A) можно использовать для нанесения сыворотки с тромбином в сочетании с другой аликвотой размороженной плазмы в качестве источника фибриногена.

Один из вариантов осуществления предпочтительного способа для получения сыворотки с тромбином по настоящему изобретению подробно изложено ниже:

Стадия 1: в реакционную камеру, изготовленную, как описано выше, загружают реагирующие вещества для первой инкубации:

a. Шприц объемом 1 мл, содержащий раствор CaCl2, подсоединяют к реакционной камере через безыгольное входное отверстие и вводят 0,2 мл, затем шприц отсоединяют.

b. Шприц объемом 5 мл, содержащий 5 мл плазмы, подсоединяют к реакционной камере через безыгольное входное отверстие и вводят всю плазму в реакционную камеру и затем шприц отсоединяют.

c. При удерживании реакционной камеры в горизонтальном положении содержимое перемешивают до полного смачивания прокоагулирующего средства, аккуратно встряхивая реакционную камеру в достаточной степени, чтобы вызвать движение прокоагулирующего средства и незакрепленных больших пластиковых шариков.

Стадия 2. Первая инкубация

a. Шприц с равномерно распределенным прокоагулирующим средством укладывают на плоскую поверхность и начинают первый цикл инкубации, который может длиться приблизительно от 10 минут до приблизительно 10 часов.

b. Приблизительно через 10 минут образуется достаточное количество тромбина для начала превращения растворимого фибриногена в биологической жидкости в нерастворимый фибрин, приводя к формированию первого фибринового геля. Фибриновый гель легко обнаруживается при визуальном осмотре из-за потери текучести смеси и при наблюдении, что прокоагулянт и пластмассовые шарики, начинают прилипать к стенке реакционной камеры, даже когда реакционную камеру переводят в вертикальное положение.

Стадия 3. Когда необходимо применение сыворотки с тромбином, в реакционную камеру загружают реагирующие вещества для второй инкубации.

a. Шприц объемом 1 мл, содержащий раствор CaCl2, подсоединяют к реакционной камере через безыгольное входное отверстие и вводят 0,2 мл до того, как шприц отсоединяют.

b. Шприц объемом 5 мл, содержащий 5 мл плазмы, подсоединяют к реакционной камере через безыгольное входное отверстие.

c. При удерживании реакционной камеры в вертикальном положении, первый полученный фибриновый гель растирают и содержимое камеры смешивают, сильно встряхивая реакционную камеру вверх и вниз, пока все шарики не будут свободно передвигаться внутри реакционной камеры (приблизительно от 3 до 10 секунд).

Стадия 4. Вторая инкубация

a. Шприц с равномерно распределенными стеклянными шариками укладывают на плоскую поверхность и начинают второй цикл инкубации, который может длиться приблизительно от 1 минуты до приблизительно 60 минут. Сыворотка с тромбином готова для сбора как только образуется второй фибриновый гель. Фибриновый гель становится очевидным, поскольку плазма больше не находится в жидком состоянии и содержимое с шариками устойчиво прикреплены к стенке реакционного сосуд. Данный способ приводит к получению препарата тромбина, который кратковременно стабилен и свертывающая фибриноген активность тромбина снижается со временем хранения в фибриновом геле. Поэтому для наибольшей реакционноспособности тромбина, которая должно присутствовать в сыворотке с тромбином, предпочтительно растирать фибриновый гель и собирать сыворотку с тромбином, как описано ниже, как только образуется фибриновый гель (например, приблизительно или менее чем через 15 минут после дополнительного образования второго фибринового геля, более предпочтительно, приблизительно или менее чем через 5 минут после образования второго фибринового геля и, наиболее предпочтительно, приблизительно или менее чем через 1 минуту после образования второго фибринового геля).

Стадия 5. Сбор сыворотки с тромбином при использовании шприца объемом 10 мл

b. После образования второго фибринового геля, реакционную камеру перемешивают с достаточной силой для перемещения шариков в камере, чтобы разрушить присутствующий фибриновый гель.

c. Фильтр с пористой мембраной присоединяют к отверстию с автоматическим клапаном, подсоединенным к реакционной камере так, чтобы предотвратить прохождение твердых частиц в шприц для сбора объемом 10 мл.

d. Реакционную камеру размещают в вертикальном положении так, чтобы шприц объемом 10 мл находился ниже реакционной камеры и сыворотку с тромбином собирают, оттягивая назад поршень шприца объемом 10 мл, чтобы создать область низкого давления или вакуум внутри реакционной камеры, пока необходимое количество сыворотки с тромбином (вплоть до приблизительно 5 мл) собирают, как показано на фиг. 7, которая представляет собой иллюстрацию, показывающую сбор сыворотки с тромбином из иллюстративной реакционной камеры 2, осуществляемый посредством оттягивания назад поршня шприца 21 для создания вакуума и затем, ожидая, пока необходимое количество сыворотки с тромбином не покинет реакционную камеру, чтобы пройти в шприц 21.

e. Собранную плазму можно хранить при комнатной температуре и использовать для взаимодействия с фибриногеном для образования фибрина через 15 минут после добавления второй аликвоты жидкой части крови или ее можно хранить на водном льду (<10°C) и использовать для взаимодействия с фибриногеном для образования фибрина через 1 час добавления второй аликвоты жидкой части крови.

Стадия 6. (Необязательная) Если требуется получить дополнительные препараты сыворотки с тромбином, стадии 3, 4 и 5 можно повторять, использую свежие аликвоты жидкой части крови, по меньшей мере, до шести раз.

Находка, что протромбиназный ферментный комплекс после образования на поверхности прокоагулирующего средства во время первого контакта смеси жидкой часть крови, кальция и прокоагулирующего средства в устройстве, остается в постоянном функциональном состоянии устойчивой ферментативной активности, который будет способен быстро превращать протромбин в тромбин в течение клинически приемлемого периода времени, по меньшей мере, десять часов, но менее чем двадцать четыре часа, проиллюстрирована в эксперименте, кратко изложенном ниже.

В данном исследовании, шесть реакционных камер подготавливали, как описано выше. Типичная жидкая часть крови, применяемая для данного эксперимента, представляла собой свежую плазму. Добавление плазмы и кальция в реакционную камеру (стадия 1) проводили, как описано выше, для всех шести шприцев во время, обозначаемое как время ноль. Продолжительность первой инкубации (стадия 2) менялась для каждого из шести шприцев, чтобы получить тестируемые условия инкубации 0 час, 1 час, 3 часа, 10 часов, 12 часов и 24 часа. Добавление вторых аликвот плазмы и кальция в реакционную камеру (стадия 3) проводили в конце времени первой инкубации, как описано выше. Вторую инкубацию (стадия 4) фиксировали по времени, необходимом для образования второго геля, которое регистрировали. Сбор сыворотки с тромбином проводили, как описано выше (стадия 5) и активность тромбина измеряли через 5 минут после сбора сыворотки с тромбином. Активность тромбина в данном эксперименте измеряли, регистрируя время образования сгустка фибриногеном, используя анализатор STart Hemostasis Analyzer, производимый Diagnostica Stago Inc., Troy Hills, New Jersey. Данные, представленные ниже в таблице, демонстрируют, что время хранения 12 часов или более приводит к потере активации прокоагулянта, поскольку время для образования тромба фибриногеном начинает возрастать из-за меньшей активности тромбина, однако даже в 12, она не была полностью потеряна, как было в случае после 24 часов хранения. Интересно, что у каждой получаемой партия тромбина увеличивалась активность прокоагулянта в течение дополнительных activity 10 часов или более. Данные в таблице ниже демонстрируют стабильность активированного прокоагулирующего средства в течение, по меньшей мере, 10 часов хранения при комнатной температуре.

Эксперимент, демонстрирующий доказательство концепции, что множество препаратов сыворотки с тромбином можно получить из одного устройства, проводился согласно способу, предложенному выше. Здесь, препараты сыворотки с тромбином получали из размороженной свежезамороженной плазмы пять раз в 30-минутных интервалах, используя одно устройство. Данные в таблице ниже демонстрируют, что одно устройство можно использовать повторно для получения тромбина с высокой реакционноспособностью по требованию. Прокоагулирующее средство активировали, добавляя 0,2 мл раствора CaCl2 и 5 мл свежеразмороженной плазмы в реакционную камеру, и инкубировали, пока не происходило первое загустение, для которого требовалось приблизительно 5 минут. В данный момент поверхность прокоагулянта активируется и может производить сыворотку с тромбином по требованию. Для того чтобы получить сыворотку с тромбином, дополнительные 0,2 мл раствора CaCl2 и 5 мл плазмы добавляли в реакционную камеру и инкубировали, пока не происходило второе загустение, для которого требовалось приблизительно 30 секунд. Приблизительно через 1-минутную задержку после того, как образовался гель, устройство взбалтывали, чтобы разрушить гель и собирали приблизительно 5 мл сыворотки с тромбином. Реакционноспособность тромбина в выделенной сыворотке определяли, проводя тест на свертывание. В иллюстративном тесте на свертывание, 0,5 мл сыворотки с тромбином добавляют к 0,5 мл источника фибриногена, такого как плазма, в пробирки Eppendorf объемом 1,5 мл. Образец смешивают переворачиванием и время, необходимое для того, чтобы жидкий раствор стал твердым или гелем, определяют наблюдением. Данные демонстрируют, одно устройство могло бы производить, по меньшей мере, 4 партии по 5 мл сыворотки с тромбином/партию.

Также был проведен эксперимент для измерения стабильности сыворотки с тромбином, полученной с использованием идеи настоящего изобретения. Здесь, препараты сыворотки с тромбином получали из размороженной свежезамороженной плазмы, используя одно устройство. Прокоагулирующее средство активировали, добавляя 0,2 мл раствора CaCl2 и 5 мл свежеразмороженной плазмы в реакционную камеру, и инкубировали, пока не происходило первое загустение, для которого требовалось приблизительно 5 минут. Для того чтобы получить сыворотку с тромбином, дополнительные 0,2 мл раствора CaCl2 и 5 мл плазмы добавляли в реакционную камеру и инкубировали, пока не происходило второе загустение, для которого требовалось приблизительно 30 секунд. Приблизительно через 1-минутную задержку после того, как образовался гель, устройство взбалтывали, чтобы разрушить гель и собирали приблизительно 5 мл сыворотки с тромбином. Препараты сыворотки с тромбином хранили при комнатной температуре или при <10°C и в дальнейшем периодически определяли реакционноспособность тромбина. Реакционноспособность тромбина в выделенной плазме определяли, проводя тест на свертывание. Время свертывания для сыворотки с тромбином измеряли в течение периода времени 30 мин, чтобы определить его стабильность как при комнатной температуре, так и при хранении при температуре <10°C. Время свертывания постепенно увеличивалось в течение 3-часового периода. Наиболее быстрое время свертывания (например, наибольшая концентрация тромбина) достигалось сразу же после сбора сыворотки с тромбином. Высокая свертывающая активность сохранялась в течение первых 15 минут после получения препарата и поддерживалась в течение более чем 30 минут со временем свертывания менее чем 90 секунд. Когда сыворотку с тромбином хранили на льду, быстрая свертывающая активность хорошо сохранялась в течение 60-минутного периода времени и держалась в течение, по меньшей мере, трех часов.

Возвращаясь в кратком изложении к альтернативному варианту осуществления, где применяли сухой хлорид кальция (в противоположность жидкому кальцию), в еще одном варианте осуществления данный сухой хлорид кальция можно было бы вносить в реакционную камеру во время изготовления устройства. При использовании существующего кальция, он обязательно связался бы с каждой введенной аликвотой жидкой части крови. В данном варианте осуществления предлагается преимущество в том, что количество шагов, требуемых от оператора, сокращено, таким образом снижая риска ошибки.

В качестве одного иллюстративного случая такого альтернативного варианта осуществления с сухим кальцием в одном эксперименте использовали препараты сыворотки с тромбином, полученные из размороженной свежезамороженной плазмы, используя одно устройство. Устройство подготавливали, добавляя 0,4 мл раствора CaCl2 (354 мМ гексагидрата хлорида кальция, полученного растворением 15,5 грамм в 200 мл абсолютного этанола) в реакционную камеру, содержащую прокоагулирующее средство. Этанолу позволяли испариться, оставляя сухую кальциевую соль в реакционной камере. Сыворотку с тромбином приготавливали в данном устройстве, содержащем сухую кальциевую соль, активируя прокоагулянтный реагент с использованием 5 мл цитратной антикоагулированной плазмы крови без добавления раствора жидкого хлорида кальция. Активированный прокоагулянт затем использовали для получения сыворотки с тромбином, добавляя дополнительные 5 мл цитратной антикоагулированной плазмы. Было удивительно узнать, что исходная концентрация кальция, присутствующая в первой аликвоте плазмы, которая в два раза больше, чем та, которая обычно используется, не ингибировала успешное образование прокоагулирующего средства. Такое ингибирование в образовании активированного прокоагулирующего средства наблюдали, когда количество высушенного кальция в реакционной камере увеличивали до 0,8 мл раствора CaCl2 (354 мМ хлорида кальция).

Хотя, как правило, менее целесообразно для множества применений, возможно объединение идей предшествующего уровня техники применения этанола для стабилизации тромбина с настоящим изобретением двухстадийного получения сыворотки с тромбином. На фиг. 3 показан способ настоящего изобретения в таком варианте осуществления, где двухстадийный способ включает в себя четыре стадии, которые предпочтительно осуществляют последовательно: 1) активированное прокоагулирующее средство (протромбиназный ферментный комплекс на поверхности материала) получают, объединяя первую аликвоту биологической жидкости, которая отвечает требованиям системы свертывания, в присутствие свободных ионов кальция и затем инкубируя смесь в течение, по меньшей мере, приблизительно 10 минут; 2) активированное прокоагулирующее средство может затем храниться в течение периода времени вплоть до приблизительно 10 часов; 3) во время, когда планируется применять тромбин, дополнительная аликвота биологической жидкости, дополненной от 15 до 25% этанола (об./об.) и свободными ионами Ca++, можно добавлять к активированному прокоагулирующему средству; и 4) фибриновый гель, который впоследствии образуется, растирают. Затем можно собирать сыворотку с тромбином, дополненную этанолом. Собранный тромбин, дополненный этанолом, обладает повышенной стабильностью, особенно при хранении при температуре <10°C, и его можно использовать для взаимодействия с фибриногеном для образования фибрина через 10 часов добавления второй аликвоты жидкой части крови. Менее предпочтительно, это происходит через 6 часов добавления второй аликвоты жидкой части крови. Способ для получения сыворотки с тромбином согласно данному варианту осуществления настоящего изобретения подробно описан ниже:

Стадия 1: в реакционную камеру, изготовленную, как описано выше, загружают реагенты для первой инкубации:

a. Шприц объемом 1 мл, содержащий раствор CaCl2, подсоединяют к реакционной камере через безыгольное входное отверстие и вводят 0,2 мл, затем шприц отсоединяют.

b. Шприц объемом 5 мл, содержащий 5 мл плазмы, подсоединяют к реакционной камере через безыгольное входное отверстие и вводят всю плазму в реакционную камеру и затем шприц отсоединяют.

c. При удерживании реакционной камеры в горизонтальном положении содержимое перемешивают до полного смачивания прокоагулирующего средства, аккуратно встряхивая реакционную камеру в достаточной степени, чтобы вызвать движение прокоагулирующего средства и незакрепленных больших пластиковых шариков.

Стадия 2. Первая инкубация

a. Шприц с равномерно распределенным прокоагулирующим средством укладывают на плоскую поверхность и начинают первый цикл инкубации, который может длиться приблизительно от 10 минут до приблизительно 10 часов.

b. Приблизительно через 10 минут образуется достаточное количество тромбина для начала превращения растворимого фибриногена в биологической жидкости в нерастворимый фибрин, приводя к образованию первого фибринового геля. Фибриновый гель легко обнаруживается при визуальном осмотре из-за потери текучести смеси и при наблюдении, что прокоагулянт и пластмассовые шарики, начинают прилипать к стенке реакционной камеры, даже когда реакционную камеру удерживают в вертикальном положении.

Стадия 3. Когда необходимо применение сыворотки с тромбином, в реакционную камеру загружают реагирующие вещества для второй инкубации.

a. Шприц объемом 1 мл, содержащий раствор CaCl2, подсоединяют к реакционной камере через безыгольное входное отверстие и вводят 0,2 мл до того, как шприц отсоединяют.

b. Шприц объемом 5 мл, содержащий 4 мл 72% этанола в вода (об./об.), подсоединяют к реакционной камере через безыгольное входное отверстие и содержимое шприца вводят в реакционную камеру.

c. Шприц объемом 5 мл, содержащий 5 мл плазмы, подсоединяют к реакционной камере через безыгольное входное отверстие и все содержимое шприца вводят до того, как шприц отсоединяют.

d. При удерживании реакционной камеры в вертикальном положении, первый полученный фибриновый гель растирают и содержимое камеры смешивают, сильно встряхивая реакционную камеру вверх и вниз, пока все шарики не будут свободно передвигаться внутри реакционной камеры (приблизительно от 3 до 10 секунд), так чтобы достичь конечной концентрации приблизительно 20% этанол (об./об.) в жидком содержимом реакционной камеры.

Стадия 4. Вторая инкубация

a. Шприц укладывают на плоскую поверхность с равномерно распределенным стеклянными шариками и начинают второй цикл инкубации, который может длиться приблизительно от 1 минуты до приблизительно 6 часов. Сыворотка с тромбином готова для сбора, как только образуется второй фибриновый гель. Фибриновый гель становится очевидным, поскольку плазма больше не находится в жидком состоянии и содержимое с шариками устойчиво прикреплены к стенке реакционного сосуда. Данный способ приводит к получению препарата тромбина, который кратковременно стабилен и свертывающая активность тромбина в отношении фибриногена снижается со временем хранения в фибриновом геле. Поэтому для наибольшей реакционноспособности тромбина, которая должна присутствовать в сыворотке с тромбином, предпочтительно растирать фибриновый гель и собирать сыворотку с тромбином, как описано ниже, как только образуется фибриновый гель (например, приблизительно или менее чем через 15 минут после дополнительного образования второго фибринового геля, более предпочтительно, приблизительно или менее чем через 5 минут после образования второго фибринового геля и, наиболее предпочтительно, приблизительно или менее чем через 1 минуту после образования второго фибринового геля).

Стадия 5. Сбор сыворотки с тромбином

a. После образования второго фибринового геля, реакционную камеру перемешивают с достаточной силой, чтобы перемещать шарики в камере, разрушая присутствующий фибриновый гель.

b. Фильтр с пористой мембраной присоединяют к отверстию с автоматическим клапаном, подсоединенным к реакционной камере так, чтобы предотвратить прохождение твердых частиц в шприц для сбора объемом 10 мл.

c. Реакционную камеру размещают в вертикальном положении так, чтобы шприц объемом 10 мл находился ниже реакционной камеры и сыворотку с тромбином собирают, оттягивая назад поршень шприца объемом 10 мл, чтобы создать область низкого давления или вакуум внутри реакционной камеры, пока необходимое количество сыворотки с тромбином (вплоть до приблизительно 5 мл) собирают, как показано на фиг. 7. Фиг. 7 иллюстрирует сбор сыворотки с тромбином из иллюстративной реакционной камеры 2, осуществляемый посредством оттягивания назад поршня шприца 21 для создания вакуума и затем ожидая, пока необходимое количество сыворотки с тромбином не покинет реакционную камеру, чтобы пройти в шприц 21.

d. Собранную плазму можно хранить при комнатной температуре и использовать для взаимодействия с фибриногеном для образования фибрина через 4 часа после добавления второй аликвоты жидкой части крови или ее можно хранить на водном льду (<10°C) и использовать для взаимодействия с фибриногеном для образования фибрина через 6 часов после добавления второй аликвоты жидкой части крови.

Стадия 6. (Необязательная) Если требуется получить дополнительные препараты сыворотки с тромбином, стадии 3, 4 и 5 можно повторять, использую свежие аликвоты жидкой части крови, по меньшей мере, до шести раз.

Хотя изобретение показано и описано в отношении определенных вариантов осуществления, очевидно, что равноценные изменения и модификации будут проводиться другими специалистами в данной области при прочтении и понимании описания. В частности, относительно различных функций, выполняемых описанными выше компонентами, термины (включая любую ссылку на «средство»), используемый для описания таких компонентов, предназначены соответствовать, если не указано иначе, любому компоненту, который выполняет указанную функцию описанного компонента (например, который функционально эквивалентен) даже при том, что он структурно не эквивалентен описываемому компоненту, который выполняет функции в настоящем документе в иллюстративных вариантах осуществления изобретения. Кроме того, в то время как определенный признак по изобретению, возможно, был описан в отношении только одного из вариантов осуществления, такой признак может сочетаться с одним или несколькими другими признаками из других вариантов осуществления, как может быть желательно или выгодно для любого данного или особого применения.

Похожие патенты RU2589648C2

название год авторы номер документа
ПОЛУЧЕНИЕ СЫВОРОТКИ 2011
  • Мэси, Пол
  • Де Джерси, Джон
  • Лавин, Мартин
  • Филлипс, Джули
  • Даймески, Гоук
RU2643957C2
СЫВОРОТОЧНАЯ ФРАКЦИЯ ОБОГАЩЕННОГО ТРОМБОЦИТАМИ ФИБРИНА 2014
  • Лаца Жомбор
  • Вац Габриелла
RU2711330C2
СПОСОБ ВВОДА ФИБРИНОВОГО СГУСТКА (ЕГО ВАРИАНТЫ) И КОМПЛЕКТ СРЕДСТВ ДЛЯ ВВОДА (ЕГО ВАРИАНТ) 1991
  • Бренда Морс Смит[Us]
  • А.Дениз Тернер[Us]
  • Роберт Т.Макнэлли[Us]
RU2104701C1
СРЕДСТВА, КОНТРОЛИРУЮЩИЕ КОАГУЛЯЦИЮ, И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ УСТРОЙСТВА 2012
  • Монро Дугальд
  • Новарра Шэбэзз
  • Хоук Рэндэл Алан
  • Холмс Пол Ф.
  • Дударонек Жюстина
RU2622760C9
СПОСОБ, ПРОБИРКА И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ РАН 2011
  • Турзи Антуан
RU2667964C1
СПОСОБ, ПРОБИРКА И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ РАН 2011
  • Турзи Антуан
RU2614722C2
СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ФИБРИНОВОГО ГЕРМЕТИКА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОСТАВА, СОСТАВЫ, НАБОРЫ 1993
  • Питер Эндрю Дэвид Эдвардсон
  • Джон Исэм Фэйрбразер
  • Рональд Стефен Гарднер
  • Дерек Эндрю Холлингсби
  • Стюарт Энтони Седерхольм-Уилльямс
RU2143924C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ ФИБРИНОГЕНА ПЛАЗМЫ КРОВИ ПО СОДЕРЖАНИЮ КАРБОНИЛЬНЫХ ГРУПП В ФИБРИНОВОМ СГУСТКЕ 2014
  • Швачко Андрей Григорьевич
  • Пирязев Алексей Павлович
  • Азизова Офелия Ахатовна
  • Сергиенко Валерий Иванович
  • Быкова Александра Александровна
RU2595806C2
Способ изготовления аутологичного фибрина с регулируемым содержанием фибриногена без использования экзогенного тромбина 2020
  • Антонова Лариса Валерьевна
  • Матвеева Вера Геннадьевна
  • Ханова Марьям Юрисовна
  • Барбараш Ольга Леонидовна
  • Барбараш Леонид Семенович
RU2758260C1
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПОЛИПЕПТИДЫ ФАКТОРА VII И ПОЛИПЕПТИДЫ ФАКТОРА XI 2002
  • Рейкер Расмус
RU2298416C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 589 648 C2

Реферат патента 2016 года СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ С ТРОМБИНОМ ОТ ОДНОГО ДОНОРА

Группа изобретений относится к медицине, а именно к трансфузиологии. Получают сыворотки с тромбином. Для чего получают образец жидкой части крови, содержащий первую аликвоту жидкой части крови с прокоагулирующим средством для образования протромбиназного ферментного комплекса, связанного с поверхностью прокоагулирующего средства, что позволяет получить активированное прокоагулирующее средство, которое можно хранить. Активированное прокоагулирующее средство затем можно подвергать взаимодействию со второй аликвотой жидкой части крови, содержащей протромбин, чтобы получить сыворотку с тромбином, которую можно извлечь и подвергнуть взаимодействию с фибриногеном для получения фибрина. Для получения сыворотки с тромбином используют специальное устройство, содержащее реакционную камеру с одним или несколькими отделениями, выполненную с возможностью удерживания прокоагулирующего средства и жидкой части крови без протекания. Прокоагулирующее средство выполнено с возможностью вступления в реакцию с указанной жидкой частью крови для образования фибринового геля, средства для введения жидкостей в и из реакционной камеры, средства для удерживания твердых частиц в реакционной камере; средства для отделения сыворотки с тромбином из фибринового геля. Кроме того, устройство содержит вентиляционное отверстие, выполненное с возможностью избегания длительного пребывания под избыточным давлением реакционной камеры. При этом один или несколько твердых незакрепленных предметов присутствуют в реакционной камере, причем твердые незакрепленные предметы, имеют диаметр в диапазоне от 50 мкм и 2 мм, а другие твердые незакрепленные предметы характеризуются размерами, выбранными для растирания фибринового геля, и в поперечном сечении имеют, по меньшей мере, 4 мм. Группа изобретений позволяет устранить риск возникновения токсической реакции у пациента в ответ на введение сыворотки с тромбином, риск возникновения иммуногенных реакций и риск передачи инфекционных заболеваний от доноров. 5 н. и 20 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл.

Формула изобретения RU 2 589 648 C2

1. Способ получения сыворотки с тромбином, включающий стадии:
получения активированного прокоагулирующего средства; и
взаимодействия указанного активированного прокоагулирующего средства с аликвотой жидкой части крови для образования смеси, содержащей сыворотку с тромбином; и
извлечения указанной сыворотки с тромбином из указанной смеси.

2. Способ получения сыворотки с тромбином, включающий стадии:
взаимодействия первой аликвоты жидкой части крови с прокоагулирующим средством для образования активированного прокоагулирующего средства;
хранения указанного активированного прокоагулирующего средства;
взаимодействия второй аликвоты жидкой части крови с указанным подвергавшимся хранению активированным прокоагулирующим средством для образования смеси, содержащей сыворотку с тромбином; и
извлечения указанной сыворотки с тромбином из указанной смеси.

3. Способ получения сыворотки с тромбином, включающий стадии:
взаимодействия первой аликвоты жидкой части крови с прокоагулирующим средством для образования активированного прокоагулирующего средства, содержащего протромбиназный ферментный комплекс, связанный с поверхностью прокоагулирующего средства;
хранения указанного активированного прокоагулирующего средства;
взаимодействия указанного подвергавшегося хранению активированного прокоагулирующего средства со второй аликвотой жидкой части крови для образования смеси, содержащей фибриновый гель;
растирание указанного фибринового геля;
после указанной стадии растирания, извлечения сыворотки с тромбином из указанной смеси; и
взаимодействия указанной извлеченной сыворотки с тромбином с фибриногеном для получения фибрина.

4. Способ получения стабилизированной этанолом сыворотки с тромбином, включающий стадии:
взаимодействия первой аликвоты жидкой части крови с прокоагулирующим средством для образования активированного прокоагулирующего средства, содержащего протромбиназный ферментный комплекс на поверхности прокоагулирующего средства;
хранения указанного активированного прокоагулирующего средства;
после указанной стадии хранения, взаимодействия указанного прокоагулянта со второй аликвотой жидкой части крови, где этанол присутствует в концентрации приблизительно от 15% до 25% по объему для получения сыворотки с тромбином, дополненной этанолом, и образования смеси, содержащей фибриновый гель;
растирание указанного фибринового геля;
после указанной стадии растирания, извлечения сыворотки с тромбином, дополненной этанолом, из указанной смеси; и
взаимодействия извлеченной сыворотки с тромбином, дополненной этанолом, с фибриногеном для получения фибрина.

5. Способ по любому из пп. 1, 2, 3 или 4, дополнительно включающий стадию получения жидкой части крови от одного донора, и в котором указанные аликвоты жидкой части крови извлекают из указанной жидкой части крови.

6. Способ по п. 5, в котором получаемая жидкая часть крови представляет собой аутологичную жидкую часть крови.

7. Способ по п. 5, в котором жидкая часть крови выбрана из группы, состоящей из цельной крови, цитратной антикоагулированной цельной крови или плазмы, плазмы, включая обогащенную тромбоцитами плазму, плазму с высоким содержанием лейкоцитного слоя, обедненную тромбоцитами плазму, цельного костного мозга, цитратного антикоагулированного костного мозга, цельной пуповинной крови, цитратного антикоагулированного костного мозга, вещества фракции крови, содержащего протромбин и их сочетания.

8. Способ по п. 1, 2, 3 или 4, в котором аликвоты жидкой части крови подергаются рекальцификации, чтобы они содержали свободные ионы кальция.

9. Способ по любому из пп. 1, 2, 3 или 4, в котором прокоагулирующее средство выбрано из группы, состоящей из стекла, стеклянных сфер, стекловаты, каолина, керамики, хлопка, эллаговой кислоты и их сочетания.

10. Способ по любому из пп. 1, 2 или 4, в котором извлечение сыворотки с тромбином проводят оттягиванием поршня шприца.

11. Способ по п. 3, в котором извлечение извлеченной сыворотки с тромбином, дополненной этанолом, осуществляют оттягиванием поршня шприца.

12. Способ по любому из пп. 2, 3 или 4, в котором указанное активированное прокоагулирующее средство хранят в течение периода времени в диапазоне приблизительно от 1 минуты до 10 часов.

13. Способ по любому из пп. 2, 3 или 4, в котором активированный прокоагулянт используют повторно с дополнительными аликвотами жидкой части крови, чтобы получить сыворотку с тромбином по требованию.

14. Способ по любому из пп. 3 или 4, в котором растирание в порошок указанного фибринового геля проводят один или несколько раз.

15. Способ по любому из пп. 3 или 4, в котором растирание в порошок указанного фибринового геля проводят посредством механического встряхивания.

16. Устройство для обработки жидкой части крови, включающее:
реакционную камеру, содержащую один или несколько отделений, выполненную с возможностью удерживания прокоагулирующего средства и жидкой части крови по существу без протекания, где указанное удерживаемое прокоагулирующее средство выполнено с возможностью вступать в реакцию с указанной жидкой частью крови для образования фибринового геля;
средства для введения жидкостей в и из реакционной камеры;
средства для удерживания твердых частиц в реакционной камере;
средства для отделения сыворотки с тромбином из фибринового геля; и
где один или несколько твердых незакрепленных предметов присутствуют в реакционной камере, причем размеры указанных твердых незакрепленных предметов выбраны для растирания фибринового геля.

17. Устройство по п. 16, в котором указанные незакрепленные предметы в поперечном сечении имеют, по меньшей мере, 4 мм.

18. Устройство по п. 16, в котором реакционная камера представляет собой цилиндрическую бутыль, содержащую узкое окончание, герметично закрытое крышкой, содержащей, по меньшей мере, один люэровский фиксатор.

19. Устройство по п. 16, в котором указанные средства введения жидкостей представляют собой переходник и где четырехсторонний запорный кран соединен с указанным переходником, причем четырехсторонний запорный кран содержит, по меньшей мере, два одноходовых клапана.
20 Устройство по п. 16, причем устройство дополнительно включает в себя фильтр для удерживания твердых частиц, фильтр, имеющий размер пор, меньший чем размер прокоагулирующего средства.
21 Устройство по п. 20, в котором размер фильтра выбран для удерживания твердых частиц, больших чем приблизительно 30 микрон в диаметре.

22. Устройство по п. 16, в котором указанные средства введения снабжены, по меньшей мере, одним отверстием с автоматическим клапаном для введения и удаления жидкостей.

23. Устройство по п. 16, причем устройство дополнительно включает в себя вентиляционное отверстие, выполненное с возможностью избежать длительного содержания под избыточным давлением реакционной камеры.

24. Устройство по п. 16, в котором реакционная камера изготовлена из пластмассы.

25. Устройство по п. 16, в котором реакционная камера изготовлена из стекла.

26. Устройство по п. 16, в котором твердые незакрепленные предметы выбраны из группы, состоящей из стеклянных изделий, металлических предметов, пластмассовых предметов и их сочетания.

27. Устройство по п. 16, в котором твердые незакрепленные предметы не являются прокоагулирующим средством.

28. Устройство по п. 16, в котором жидкая часть крови выбрана из группы, состоящей из цельной крови, цитратной антикоагулированной цельной крови или плазмы, плазмы, включая обогащенную тромбоцитами плазму, плазму с высоким содержанием лейкоцитного слоя, обедненную тромбоцитами плазму, цельного костного мозга, цитратного антикоагулированного костного мозга, цельной пуповинной крови, цитратного антикоагулированного костного мозга, вещества фракции крови, содержащего протромбин, и их сочетания.

29. Устройство по п. 16, в котором указанная реакционная камера дополнена сухой кальциевой солью.

30. Устройство по п. 16, в котором указанная реакционная камера дополнена раствором кальциевой соли.

31. Устройство по п. 29 и 30, в котором указанная кальциевая соль представляет собой хлорид кальция.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2016 года RU2589648C2

US 2004120942 A1, 24.06.2004
WO 00/07659 A1, 17.02.2000
Способ защиты анодных контуров передатчиков 1941
  • Модель М.И.
SU74713A1
СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБИНА 2010
  • Момот Андрей Павлович
  • Шахматов Игорь Ильич
  • Ломаев Иван Сергеевич
  • Кореновский Юрий Владимирович
  • Вдовин Вячеслав Михайлович
  • Терехов Сергей Сергеевич
RU2457248C2
Источник электропитания 1985
  • Красношапка Максим Митрофанович
  • Тихонов Виктор Васильевич
SU1327261A1

RU 2 589 648 C2

Авторы

Чапман Джон Р.

Даты

2016-07-10Публикация

2013-09-25Подача