ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПОЛИПЕПТИДЫ ФАКТОРА VII И ПОЛИПЕПТИДЫ ФАКТОРА XI Российский патент 2007 года по МПК A61K38/36 A61P7/04 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид. Изобретение также относится к применению комбинации фактора VII или полипептида, родственного фактору VII, и фактора XI или полипептида, родственного фактору XI, для производства лекарственного средства с целью лечения субъектов, страдающих кровотечениями, или профилактики кровотечений. Изобретение также относится к способу лечения кровотечений у субъектов и к способу ускорения образования сгустка у субъекта. Настоящее изобретение также относится к наборам, содержащим указанные соединения.

Предпосылки к созданию изобретения

Гемостаз инициируется посредством образования комплекса между тканевым фактором (TF), который экспонируется в кровотоке после повреждения стенки сосуда, и фактором FVIIa, который находится в кровотоке в количестве, соответствующем приблизительно 1% от общей массы белка FVII. Указанный комплекс прочно прикрепляется к TF-несущей клетке и активирует FX (фактор X) в FXa (фактор Xa) и активирует FIX (фактор IX) в FIXa (фактор IXa) на поверхности клетки. FXa активирует протромбин и превращает его в тромбин, который в свою очередь активирует FVIII, FV, FXI FXIII. Кроме того, ограниченное количество тромбина, образованного на этой первоначальной стадии гемостаза, также активирует тромбоциты. После воздействия тромбина на тромбоциты, последние изменяют форму и «выставляют» на поверхность заряженные фосфолипиды. Активированная поверхность тромбоцита образует матрицу для дальнейшей активации FX и полного образования тромбина. Дальнейшая активация FX на активированной поверхности тромбоцита происходит посредством комплекса FIXa-FVIIIa, образованного на поверхности активированного тромбоцита, и FXa затем превращает протромбин в тромбин, все еще оставаясь на поверхности. Затем тромбин превращает фибриноген в фибрин, который является нерастворимым и который стабилизирует первоначальную «пробку» из тромбоцитов. Этот процесс является обособленным, т.е. локализуется на участке экспрессии или местоположения TF, тем самым снижается риск системной активации свертывающей системы крови. Нерастворимый фибрин, образующий «пробку», кроме того, стабилизируется посредством поперечного связывания фибриновых волокон, катализируемого фактором FXIII.

Фактор FVII существует в плазме, главным образом, в виде одноцепочечного зимогена, который расщепляется посредством фактора FXa на двухцепочечную, активированную форму, FVIIa. Рекомбинантный активированный фактор VIIa (rFVIIa) был разработан в качестве прогемостатического агента. Введение rFVIIa приводит к быстрому и высокоэффективному прогемостатическому ответу у больных гемофилией с кровотечениями, которых нельзя лечить факторами свертывания вследствие образования антител. Кроме того, субъектов, которые страдают от кровотечений, с недостаточностью фактора VII или субъектов, у которых свертывающая система крови находится в норме, страдающих чрезмерным кровотечением, можно успешно лечить с помощью фактора FVIIa. При изучении данной проблемы исследователи не сталкивались с неблагоприятными побочными эффектами, обусловленными введением rFVIIa (в частности, возможность развития тромбоэмболии).

Дополнительно введенный фактор FVIIa улучшает образование тромбина на активированной поверхности тромбоцита. Такое явление имеет место у больных гемофилией, у которых отсутствует фактор FIX или FVIII и поэтому не осуществляется самый эффективный путь полного образования тромбина. Также в присутствии пониженного количества тромбоцитов или тромбоцитов с нарушением функции добавочный фактор FVIIa увеличивает образование тромбина.

Коммерческие препараты рекомбинантного человеческого фактора FVIIa продаются как NovoSeven^®(Novo Nordisk A/S, Denmark). Novoseven^® показан для лечения случаев кровотечений у больных гемофилией А и В. Novoseven^® является единственным рекомбинантным фактором FVIIa, доступным на рынке, для эффективного и надежного лечения кровотечений.

Фактор FXI является одним из компонентов пути свертывания крови. Недостаточность FXI связана с кровотечениями, от слабых до умеренных, особенно из тканей с высокой локальной фибринолитической активностью. Исследователи полагают, что в сравнении с недостаточностью FXI, высокое содержание FXI являются фактором риска венозного тромбоза. Фактор FXI является зимогеном трипсиноподобной сериновой протеазы, который активируется посредством фактора FXIIa, тромбина и фактора FXIa. Активированный фактор FXI (FXIa) участвует в активации FIX, который в свою очередь (в комбинации с FVIII) также активирует FX и, таким образом, приводит к образованию тромбина.

Хорошо известно, что у субъектов, у которых наблюдается чрезмерное кровотечение в связи с операцией или обширной травмой и которые нуждаются в переливании крови, развивается больше осложнений, чем у субъектов, не страдающих кровотечениями. Однако, умеренные кровотечения у субъектов, нуждающихся во введении крови человека или элементов крови (тромбоциты, лейкоциты, произведенные из плазмы концентраты для лечения нарушений свертывания крови и т.д.), могут привести к осложнениям, связанным с риском передачи с кровью вирусов человека (вируса гепатита, ВИЧ, парвовируса и других, до сих пор неизвестных вирусов). Массивные кровотечения у субъектов, нуждающихся в значительных переливаниях крови, могут привести к развитию полиорганной недостаточности, включая нарушение функции легких и почек. Как только у субъекта начинают развиваться указанные серьезные осложнения, то запускается каскад реакций, в которые вовлекается ряд цитокинов, а также воспалительные реакции, делая любое лечение крайне затруднительным и, к сожалению, часто неэффективным. Поэтому основной задачей в хирургии, а также в лечении обширных повреждений ткани является предупреждение кровотечений или сведение их к минимуму. Для того, чтобы избежать кровотечений или свести их к минимуму, важно добиться образования стабильных и плотных гемостатических «пробок», которые плохо растворяются под действием фибринолитических ферментов. Кроме того, важно достичь быстрого и эффективного образования таких «пробок» или сгустков.

На сегодняшний день, в случаях кровотечений у субъектов, включая жертв различных травм и тех, у кого кровотечения связаны с хирургической операцией, лечение часто осуществляют посредством нескольких инъекций или инфузий фактора FVIIa, поскольку из-за короткого полупериода существования FVIIa (2,5 часа) может потребоваться более одного введения для поддержания определенного уровня гемостатической способности. Более быстрая остановка кровотечений принесет больше пользы таким субъектам. Поэтому в таких случаях следует снизить количество введений, чтобы остановить кровотечение и поддержать гемостаз.

Заявка на выдачу патента Японии No. 59-116213A касается аэрозольной композиции для использования ее как тканевого клея, содержащей в качестве активного компонента реагент, способствующий коагуляции крови. Реагент, способствующий коагуляции крови, может быть выбран из факторов свертывания крови I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII и XIII, прекалликреина, высокополимерного кининогена и тромбина. Предпочтительной является комбинация фактора FXIII и тромбина.

Европейский патент No. 225160 (Novo Nordisk) касается композиций FVIIa и способов лечения нарушений, сопровождающихся кровотечением, которые не вызваны дефектами факторов свертывания крови или ингибиторами факторов свертывания крови.

Европейский патент No. 82182 (Baxter Travenol Lab.) касается композиции фактора VIIa, которую используют для восполнения недостаточности факторов свертывания крови или противодействия ингибиторам факторов свертывания крови у субъекта.

Международная патентная публикация No. WO 93/06855 (Novo Nordisk) касается местного применения FVIIa.

Патент США No. 5252217 касается способа получения концентрата фактора XI человека для терапевтических целей.

До сих пор в данной области существует потребность в усовершенствованном лечении субъектов, страдающих кровотечением, включая субъектов, у которых случаи кровотечения вызваны операцией, травмой или другими видами повреждений ткани; коагулопатией, включая коагулопатию у субъектов, претерпевших многократные переливания крови; обусловлены врожденными или приобретенными нарушениями в системе свертывания крови или нарушениями, сопровождающимися кровотечением, включая гипофункцию печени («заболевание печени»); обусловлены нарушением функции тромбоцитов или снижением количества тромбоцитов; отсутствием существенных «соединений» свертывания крови или наличием аномальных «соединений» свертывания крови (например, тромбоциты или белковый фактор Виллебранда); связаны с повышенным фибринолизом; обусловлены терапией антикоагулянтными средствами или терапией тромболитическими средствами; или трансплантацией стволовой клетки.

В данной области также сохраняется потребность в улучшенном, надежном и широко применяемом способе, повышающем свертывающую способность крови, улучшающем или обеспечивающем образование стабильных гемостатических «пробок», или увеличивающем возможности для благотворного лечения субъекта, или приводящем к достижению полного гемостаза у субъектов, в частности, у субъектов со сниженным образованием тромбина. Также имеется потребность в способах, в которых количество FVIIa, необходимое для достижения полного гемостаза, снижается, и способах, где время остановки кровотечения сокращается.

Краткое описание сущности изобретения

Одной целью настоящего изобретения является создание композиций, которые могут быть эффективно использованы для лечения или профилактики кровотечений и нарушений свертывания крови.

Второй целью настоящего изобретения является создание композиций в виде разовой дозированной формы, которая может быть эффективно использована для лечения или профилактики кровотечений или в качестве прокоагулянта. Другой целью настоящего изобретения является создание композиций, обладающих синергическим действием, создание способов лечения или комплектов, применение которых способствует проявлению синергического эффекта.

Другой целью настоящего изобретения является создание композиций, способов лечения и комплектов, не имеющих существенных побочных эффектов, таких как высокий уровень системной активации системы свертывания крови.

Другие цели настоящего изобретения будут очевидны при прочтении настоящего описания.

В первом аспекте, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фактор VII или родственный фактору VII полипептид, и фактор XI или родственный фактору XI полипептид.

Во втором аспекте, изобретение относится к набору компонентов, предназначенному для лечения кровотечений, содержащему

a) эффективное количество препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и фармацевтически приемлемый носитель в первой разовой дозированной форме;

b) эффективное количество препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида и фармацевтически приемлемый носитель во второй разовой дозированной форме; и

с) контейнер, вмещающий указанные первую и вторую лекарственную формы.

В различных аспектах изобретения, набор также содержит эффективное количество TFPI-ингибитора и/или фактора VIII; TFPI-ингибитор или фактор VIII (или комбинация из них) могут находиться в отдельных стандартных лекарственных формах или могут находиться в одной из стандартных лекарственных форм, содержащей либо фактор VII или родственный фактору VII полипептид, либо фактор XI или родственный фактору XI полипептид.

В третьем аспекте, изобретение относится к применению фактора VII или родственного фактору VII полипептида в комбинации с фактором XI или родственным фактору XI полипептидом для производства лекарственного средства с целью лечения кровотечений у субъекта. В другом аспекте, изобретение относится к применению композиции, как описано в любом из пунктов формулы изобретения 1-18, для производства лекарственного средства с целью лечения кровотечений у субъекта.

В разных аспектах изобретения, лекарственные средства предназначены для снижения времени свертывания крови, увеличения времени фибринолиза и повышения прочности сгустка.

В другом аспекте, лекарственное средство получают для внутривенного введения, предпочтительно в виде инъекции или инфузии, в частности, в виде инъекции.

В одном аспекте, лекарственное средство получают в виде разовой дозированной формы; в другом аспекте, лекарственное средство получают в виде первой разовой дозированной формы, содержащей препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида, и в виде второй разовой дозированной формы, содержащей препарат фактора XI или родственного фактору XI полипептида.

В различных аспектах, лекарственные средства предназначены для лечения субъектов в случаях кровотечений вследствие операции, травмы или других типов повреждения ткани; коагулопатии, включающей коагулопатию у субъектов, претерпевших многократные переливания крови; врожденных или приобретенных нарушений в системе свертывания крови или нарушений, сопровождающихся кровотечением, включающих гипофункцию печени («заболевание печени»); нарушения функции тромбоцитов или снижения количества тромбоцитов; отсутствия существенных «соединений» системы свертывания крови или наличия аномальных «соединений» системы свертывания крови (например, тромбоциты или белковый фактор Виллебранда); повышенного фибринолиза; терапии антикоагулянтными средствами и терапии тромболитическими средствами; трансплантации стволовой клетки. В одной серии аспектов, кровотечения происходят в органах, таких как головной мозг, область внутреннего уха, глаз, печень, легкое, опухолевая ткань, желудочно-кишечный тракт; в другой серии аспектов, кровотечение является диффузным кровотечением, таким как при геморрагическом гастрите и профузное маточное кровотечение. В другой серии аспектов, случаи кровотечения связаны с операцией или травмой у субъектов, у которых наблюдаются острые гемартрозы (кровоизлияния в суставы), хроническая гемофилическая артропатия, гематомы (например, мышечные, забрюшинные, подъязычные и заглоточные), кровотечения в другой ткани, гематурия (кровотечение из мочевыводящих путей), кровоизлияние в мозг, которые подверглись хирургической операции (например, гепатэктомии), удаление зуба и желудочно-кишечные кровоизлияния (например, кровотечения при UGI). В одном аспекте, лекарственное средство предназначено для лечения кровотечений вследствие травмы, операции или пониженного числа тромбоцитов или сниженной активности тромбоцитов у субъекта.

В другом аспекте, изобретение относится к способу лечения кровотечений у субъекта, предусматривающему введение субъекту при необходимости количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и количества второго препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида, где количества первого и второго препарата вместе взятые являются эффективными при лечении кровотечений.

В другом аспекте, изобретение относится к способу снижения времени свертывания крови у субъекта, предусматривающему введение субъекту при необходимости количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и количества второго препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, являются эффективными для снижения времени свертывания крови.

В другом аспекте, изобретение относится к способу, способствующему повышению гемостаза, предусматривающему введение субъекту при необходимости количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и количества второго препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, являются эффективными для повышения гемостаза.

В другом аспекте, изобретение относится к способу, позволяющему увеличить период времени фибринолиза у субъекта, предусматривающему введение субъекту при необходимости количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и количества второго препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, являются эффективными для увеличения времени фибринолиза.

В другом аспекте, изобретение относится к способу повышения прочности сгустка у субъекта, предусматривающему введение субъекту при необходимости количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и количества второго препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, являются эффективными для повышения прочности сгустка.

В одной серии аспектов способов, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид вводят в виде разовой дозированной формы.

В другой серии аспектов, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид вводят в виде первой разовой дозированной формы, содержащей препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида, и второй разовой дозированной формы, содержащей препарат фактора XI или родственного фактору XI полипептида. В серии аспектов изобретения, первую стандартную лекарственную форму и вторую стандартную лекарственную форму вводят раздельно с интервалом времени не более чем 15 минут.

В другом аспекте, изобретение относится к набору, предназначенному для лечения кровотечений, включающему в себя

d) эффективное количество фактора VII или родственного фактору VII полипептида и эффективное количество фактора XI или родственного фактору XI полипептида и фармацевтически приемлемый носитель в одной, разовой дозированной форме; и

е) контейнер, вмещающий указанную одну, стандартную лекарственную форму.

В одной серии аспектов изобретения, фактором VII или родственным фактору VII полипептидом является родственный фактору VII полипептид. В одной серии аспектов изобретения, родственный фактору VII полипептид представляет собой вариант аминокислотной последовательности фактора VII. В одном аспекте, отношение активности родственного фактору VII полипептида к активности нативного фактора VIIa человека (FVIIa дикого типа) составляет, по крайней мере, приблизительно 1,25, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью «анализа посредством гидролиза in vitro», как описано в настоящем описании.

В одной серии аспектов изобретения, фактором VII или родственным фактору VII полипептидом является фактор VII. В одном аспекте, указанным фактором VII является фактор VII человека. В одном аспекте, фактор VII является фактором VII крупного рогатого скота, свиньи, собаки, лошади, мыши или лосося. В другом аспекте, фактор VII является рекомбинантным фактором. В другом аспекте, фактор VII получен из плазмы. В предпочтительном аспекте, фактор VII является рекомбинантным фактором VII человека. В одной серии аспектов изобретения, фактор VII или родственный фактору VII полипептид находится в его активированной форме. В одном предпочтительном аспекте изобретения, фактор VII является рекомбинантным фактором VIIa человека.

В одной серии аспектов изобретения, фактором XI или родственным фактору XI полипептидом является родственный фактору XI полипептид. В одной серии аспектов изобретения, родственный фактору XI полипептид представляет собой вариант аминокислотной последовательности фактора XI. В одном аспекте, отношение активности указанного родственного фактору XI полипептида к активности нативного фактора XI плазмы человека (FXI дикого типа) составляет, по крайней мере, приблизительно 1,25, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью «FXI хромогенного анализа», как описано в настоящем описании. В одном аспекте, фактором XI или родственным фактору XI полипептидом является родственный фактору XI полипептид. В одном аспекте, фактором XI является фактор XI человека. В одном аспекте, фактор XI является фактором XI крупного рогатого скота, свиньи, собаки, лошади, мыши или лосося. В предпочтительном аспекте, фактор XI является рекомбинантным фактором. В другом аспекте, фактор XI получен из плазмы. В другом аспекте, фактор XI является полученным из тромбоцитов фактором XI. В предпочтительном аспекте, фактор XI является рекомбинантным фактором XI плазмы человека. В одной серии аспектов изобретения, фактор XI или родственный фактору XI полипептид находится в его активированной форме. В одном аспекте, родственный фактору XI полипептид является фрагментом фактора XI. В одном аспекте, родственный фактору XI полипептид является гибридным полипептидом фактора XI, например, гибридный полипептид свиньи/человека. В одном аспекте, фактор XI является активированным фактором XI плазмы человека (FXIa).

В одном аспекте, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид присутствуют в соотношении по массе приблизительно между 100:1 и 1:100 (мас./мас. фактор VII:фактор XI).

В одном аспекте, родственные фактору VII полипептиды представляют собой варианты аминокислотной последовательности, в которой не более чем 20 аминокислот замещены, удалены или вставлены по сравнению с фактором VII дикого типа (т.е., полипептид с аминокислотной последовательностью, описанной в патенте США No. 4784950). В другом аспекте, варианты фактора VII имеют не более чем 15 аминокислот, которые замещены, удалены или вставлены; в других аспектах, варианты фактора VII имеют не более чем 10 аминокислот, таких как 8, 6, 5 или 3 аминокислоты, которые замещены, удалены или вставлены по сравнению с фактором VII дикого типа. В одном аспекте, варианты фактора VII выбирают из перечня L305V-FVIIa, L305V/M306D/D309S-FVIIa, L305I-FVIIa, L305T-FVIIa, F374P-FVIIa, V158T/M298Q-FVIIa, V158D/E296V/M298Q-FVIIa, K337A-FVIIa, M298Q-FVIIa, V158D/M298Q-FVIIa, L305V/K337A-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVIIa, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVIIa, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII и S336G-FVII.

В другом аспекте, родственные фактору VII полипептиды обладают повышенной активностью, независимой от тканевого фактора, по сравнению с активностью нативного фактора VIIa свертывания крови человека. В другом аспекте, повышенная активность не сопровождается изменениями в субстратной специфичности. В другом аспекте изобретения, связывание родственных фактору VII полипептидов с тканевым фактором не ухудшается, и родственные фактору VII полипептиды проявляют, по крайней мере, активность фактора VIIa дикого типа при связывании с тканевым фактором.

В предпочтительном аспекте, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид представляют собой рекомбинантный фактор VIIa человека и рекомбинантный фактор XI плазмы человека или рекомбинантный фактор VIIa человека и рекомбинантный фактор XIa плазмы человека.

В одном аспекте, время свертывания крови млекопитающих снижается. В другом аспекте, гемостаз в крови млекопитающих усиливается. В другом аспекте, время фибринолиза в крови млекопитающих увеличивается. В другом аспекте, прочность сгустка в крови млекопитающих повышается. В одном аспекте, кровью млекопитающих является кровь человека. В другом аспекте, кровью млекопитающих является кровь человека в норме; в одном аспекте, кровь представляет собой кровь субъекта, у которого образование тромбина снижено. В одном аспекте, кровь представляет собой кровь субъекта с недостаточностью одного или более факторов свертывающей системы; в другом аспекте, кровь представляет собой кровь субъекта, содержащую ингибиторы одного или более факторов свертывающей системы; в одном аспекте, кровь представляет собой кровь субъекта, содержащую сниженную концентрацию фибриногена; в одном аспекте, кровь представляет собой кровь человека с недостаточностью фактора XI. В одной серии аспектов, кровью является плазма.

В одном аспекте, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид способствуют увеличению времени фибринолиза в плазме человека в норме. В другом аспекте, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид повышают до максимального уровня прочность сгустка и время фибринолиза в нормальной плазме человека in vitro. В другом аспекте, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид способствуют уменьшению времени свертывания в нормальной плазме человека in vitro.

В одном аспекте изобретения, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид являются единственными гемостатическими агентами в композиции. В другом аспекте, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид являются единственными, активными гемостатическими агентами в композиции. В другом аспекте, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид являются единственными факторами свертывания, вводимыми субъекту. В одном аспекте изобретения, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид являются единственными, активными агентами, вводимыми больному. В одном аспекте, композиция, по существу, не содержит протромбина; в другом аспекте, композиция, по существу, не содержит FX; в другом аспекте, композиция, по существу, не содержит FXa.

В другом аспекте, фармацевтическую композицию получают для внутривенного введения, предпочтительно в виде инъекции или инфузии, в частности, инъекции. В одном аспекте, композиция содержит, по крайней мере, один фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель.

В одном аспекте изобретения, композиция находится в виде разовой дозированной формы, где однократная, стандартная лекарственная форма содержит оба фактора свертывания. В одном аспекте изобретения, композиция находится в виде набора компонентов, содержащего препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида как первую стандартную лекарственную форму и препарат фактора XI или родственного фактору XI полипептида как вторую стандартную лекарственную форму, и содержащего контейнер, вмещающий указанную первую и вторую стандартную лекарственную форму. В одном аспекте композиция или набор, по необходимости, также содержит инструкции для введения композиции или отдельных компонентов, соответственно.

В одном аспекте изобретения, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид вводят в виде разовой дозированной формы. В одном аспекте изобретения, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид вводят в виде первой разовой дозированной формы, содержащей препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида, и второй разовой дозированной формы, содержащей препарат фактора XI или родственного фактору XI полипептида.

В одном аспекте изобретения, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид вводят одновременно. В другом аспекте, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид вводят последовательно. В одном аспекте, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид вводят раздельно с интервалом времени не более чем 15 минут, предпочтительно 10, более предпочтительно 5, наиболее предпочтительно 2 минуты. В одном аспекте, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид вводят раздельно с интервалом времени вплоть до 2 часов, предпочтительно от 1 до 2 часов, более предпочтительно вплоть до 1 часа, более предпочтительно от 30 минут до 1 часа, более предпочтительно вплоть до 30 минут, наиболее предпочтительно от 15 до 30 минут.

В одном аспекте, эффективное количество фактора VII или родственного фактору VII полипептида составляет количество от приблизительно 0,05 мг/сутки до приблизительно 500 мг/сутки (субъект весом 70 кг). В одном аспекте, эффективное количество препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида составляет приблизительно от 0,01 мг/сутки до 500 мг/сутки (субъект весом 70 кг).

В одном аспекте, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид присутствуют в соотношении по массе приблизительно между 100:1 и 1:100 (мас./мас. фактор VII: фактор XI).

В одном аспекте настоящего изобретения, фармацевтическая композиция представлена в виде однократной лекарственной формы и состоит, в основном, из препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида и одного или более компонентов, выбранных из перечня фармацевтически приемлемых наполнителей или носителей, стабилизаторов, детергентов, нейтральных солей, антиоксидантов, консервантов и протеазных ингибиторов. В следующем аспекте, субъектом является человек; в другом аспекте, у субъекта отмечается снижение образования тромбина; в одном аспекте, у субъекта наблюдается пониженная концентрация фибриногена в плазме (например, у субъекта, претерпевшего многократные переливания крови); в одном аспекте, у субъекта наблюдается пониженная концентрация фактора VIII в плазме.

В другом аспекте, изобретение касается способа, разработанного для повышения гемостаза у субъекта, страдающего синдромом, связанным с фактором VII, способа, сравненного со способом лечения субъекта посредством фактора VII как единственного свертывающего белка, способа, включающего в себя введение субъекту при необходимости количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и количества второго препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, способствуют эффективному повышению гемостаза.

В другом аспекте, изобретение касается способа, разработанного для повышения образования тромбина у субъекта, способа, включающего в себя введение субъекту при необходимости количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII препарата и количества второго препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, способствуют эффективному повышению образования тромбина.

В другом аспекте, изобретение касается способа, разработанного для повышения образования тромбина у субъекта, страдающего синдромом, связанным с фактором VII, способа, сравненного со способом лечения субъекта посредством фактора VII как единственного свертывающего белка, способа, включающего в себя введение субъекту при необходимости количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и количества второго препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, способствуют эффективному повышению образования тромбина.

В другом аспекте, изобретение касается способа, разработанного с целью уменьшения числа введений белкового фактора свертывания, требуемого для достижения гемостаза у субъекта, страдающего синдромом, связанным с фактором VII, по сравнению с количеством введений, требуемых в тех случаях, когда фактор VII вводят субъекту в качестве единственного белкового фактора свертывания, способа, включающего в себя введение субъекту при необходимости первого количества препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и второго количества препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида, где первое и второе количество вместе способствуют эффективному снижению числа введений белкового фактора свертывания.

В другом аспекте, изобретение касается способа лечения кровотечений у субъекта, стадающего синдромом, связанным с фактором VII, способа, включающего в себя введение субъекту при необходимости количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и количества второго препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, проявляют эффективность в лечении кровотечений.

В одном аспекте, фактор VII является рекомбинантным фактором VIIa человека (rFVIIa). В другом аспекте, rFVIIa является NovoSeven^® (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark).

В одном аспекте, фармацевтическую композицию получают для внутривенного введения. В одном аспекте, композиция также содержит ингибитор фибринолитической системы, включая, без ограничения, апротинин, ε-аминокапроновую кислоту или транексамовую кислоту. В одном аспекте, композиция также содержит TFPI ингибитор и/или FVIII.

В одном аспекте, композиция также содержит фактор VIII. В одном аспекте, фактор VIII является активированным фактором VIII (фактор VIIIa). В следующем аспекте фактором VIII является рекомбинантный фактор VIIIa. В следующем аспекте фактором VIII является рекомбинантный фактор VIIIa человека.

В другом аспекте, изобретение относится к применению фактора VIIa в комбинации с фактором XI для производства лекарственного средства, способствующего повышению образования фибринового сгустка в плазме млекопитающих.

В другом аспекте, изобретение относится к способу, направленному на повышение образования фибринового сгустка у субъекта, способу, который включает в себя введение субъекту при необходимости количества первого препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и количества второго препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида, где количества первого и второго препарата, вместе взятые, проявляют эффективность в лечении кровотечений.

В одном аспекте настоящего изобретения, фармацевтическая композиция (в виде однократной формы) состоит, в основном, из фактора VIIa и фактора XI и, возможно, фармацевтически приемлемого наполнителя или носителя и, возможно, стабилизатора и, возможно, детергента и, возможно, нейтральной соли и, возможно, антиоксиданта и, возможно, консерванта и, возможно, протеазного ингибитора.

В другом аспекте настоящего изобретения, фармацевтическая композиция (в виде однократной формы) состоит, в основном, из фактора VIIa и фактора XI и, возможно, фармацевтически приемлемого наполнителя или носителя и, возможно, стабилизатора и, возможно, детергента и, возможно, нейтральной соли и, возможно, антиоксиданта и, возможно, консерванта и, возможно, протеазного ингибитора и TFPI-ингибитора.

В другом аспекте настоящего изобретения, фармацевтическая композиция (в виде однократной формы) состоит, в основном, из фактора VIIa и фактора XI и, возможно, фармацевтически приемлемого наполнителя или носителя, и, возможно, стабилизатора и, возможно, детергента и, возможно, нейтральной соли и, возможно, антиоксиданта, и, возможно, консерванта, и, возможно, протеазного ингибитора и фактора VIII и, возможно, TFPI-ингибитора.

В другом аспекте, фармацевтическая композиция (в виде набора) состоит из первой разовой дозированной формы, содержащей, в основном, фактор VIIa и, возможно, фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель и, возможно, стабилизатор и, возможно, детергент и, возможно, нейтральную соль и, возможно, антиоксидант и, возможно, консервант и, возможно, протеазный ингибитор; и второй разовой дозированной формы, содержащей, в основном, фактор XI и, возможно, фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель и, возможно, стабилизатор и, возможно, детергент и, возможно, нейтральную соль и, возможно, антиоксидант и, возможно, консервант и, возможно, протеазный ингибитор.

В другом аспекте, фармацевтическая композиция (в виде набора) состоит из первой разовой дозированной формы, содержащей, в основном, фактор VIIa и, возможно, фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель и, возможно, стабилизатор и, возможно, детергент и, возможно, нейтральную соль и, возможно, антиоксидант и, возможно, консервант и, возможно, протеазный ингибитор; и второй разовой дозированной формы, содержащей, в основном, фактор XI и, возможно, фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель и, возможно, стабилизатор и, возможно, детергент и, возможно, нейтральную соль и, возможно, антиоксидант и, возможно, консервант и, возможно, протеазный ингибитор; где либо первая стандартная лекарственная форма, либо вторая стандартная лекарственная форма, или обе лекарственные формы также содержат фактор VIII и/или TFPI-ингибитор.

Перечень фигур

Фигура 1: Добавление FVIIa привело к дозо-зависимому увеличению времени фибринолиза. Указанный эффект был оптимальным при 10 нМ FVIIa.

Фигура 2: В присутствии 10 нМ FVIIa, добавление FXI привело к дальнейшему увеличению времени фибринолиза. Эффект был дозо-зависимым и оптимальным при 30 нМ FXI.

Фигура 3: Тромбоэластографию (roTEG) применяли для анализа действия FVIIa и XI на максимальную плотность сгустка (MCF), а также анализа устойчивости сгустков к растворению, опосредованному t-PA.

Фигура 4: Полученные результаты показывают, что добавление FVII и FXI к плазме синергическим образом уменьшает время свертывания в NHP (нормальной плазме человека).

Подробное описание изобретения

У субъектов, которые претерпевают обильные кровотечения в связи с хирургической операцией или обширной травмой и которым вследствие кровопотери требуются переливания крови, развиваются осложнения в большей степени, чем у субъектов, не испытывающих какого-либо кровотечения. Однако и умеренные кровотечения могут привести к осложнениям, если в случаях таких кровотечений требуется введение крови человека или элементов крови (тромбоцитов, лейкоцитов, концентратов, полученных из плазмы крови, для лечения нарушений в системе свертывания крови), поскольку переливания крови связаны с риском передачи с кровью вирусов человека (например, вируса гепатита, ВИЧ, парвовируса или других, неизвестных в настоящее время вирусов), а также невирусных патогенов. Массивные кровотечения, требующие больших переливаний крови, могут привести к развитию полиорганной недостаточности, включая нарушение функции легких и почек. Как только у субъекта развиваются эти серьезные осложнения, запускается каскад реакций, вовлекающих ряд цитокинов и воспалительных реакций, крайне затрудняющих любое лечение и делающих его, к сожалению, часто неэффективным. Больной, претерпевший большую потерю крови, становится клинически неустойчивым. У таких больных имеется риск развития мерцательной аритмии, которая может привести к фатальной остановке сердечной деятельности; нарушению функции почек; или выпотеванию жидкости в легкие (так называемый «отек легких» или ARDS (шоковое легкое)). Поэтому, основной задачей в хирургии, а также в лечении значительных повреждений ткани является предотвращение сильного кровотечения или свидение его к минимуму. Для того, чтобы избежать нежелательных кровотечений или свести их к минимуму, необходимо добиться образования стабильных и твердых гемостатических «пробок», которые плохо растворяются под действием фибринолитических ферментов. Кроме того, важно достичь быстрого и эффективного образования таких «пробок» или сгустков.

У субъектов с тромбоцитопенией (пониженное число тромбоцитов или сниженная активность тромбоцитов) снижена способность к образованию тромбина, а также наблюдается недостаточная стабилизация фибриновых «пробок», что приводит к образованию гемостатических «пробок», подвергаемых преждевременному растворению. Кроме того, субъекты, получившие обширную травму или повреждение органа, и которые, в результате, претерпевают многократные переливания крови, часто имеют пониженное число тромбоцитов, а также пониженные уровни фибриногена, фактора VIII и других белков свертывающей системы. У таких субъектов наблюдается нарушение (снижение) в образовании тромбина. Такие субъекты имеют несовершенный, или менее эффективный, гемостаз, приводящий к образованию фибриновых «пробок», которые легко и преждевременно растворяются под действием протеолитических ферментов, которые, кроме того, интенсивно высвобождаются при обширной травме и повреждении органа.

Кровотечения в тканях также могут привести к образованию гематом. Размеры (в частности, внутричерепных и спиномозговых) гематом тесно коррелируют со степенью потери неврологической функции, с возникающими при реабилитации трудностями и/или с тяжестью и степенью постоянных ухудшений неврологической функции после реабилитации. Самые тяжелые последствия гематом наблюдаются в случаях их расположения в головном мозге, когда они могут привести даже к смерти больного.

Таким образом, главные задачи в лечении кровотечений заключаются в достижении гемостаза за минимальное время, что приводит к минимальной потере крови.

Таким образом, настоящее изобретение относится к эффективным композициям, применению этих композиций и способам обработки с целью лечения кровотечений у субъектов, нуждающихся в таком лечении. Композиции, их применение и способы могут быть связаны с такими благотворными эффектами, как меньшая потеря крови до достижения гемостаза, меньшая потребность в крови в течение операции, поддержание кровяного давления на приемлемом уровне до достижения гемостаза, более быстрая стабилизация кровяного давления, более короткое время восстановления больного, подвергаемого лечению, более короткое время реабилитации больного, подвергаемого лечению, снижение случаев образования гематом или образование меньших по размеру гематом, включая гематомы в мозге, более быстрая остановка кровотечений, снижение количества введений, требуемых для остановки кровотечения и поддержания гемостаза.

Введение препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида, например, фактора VIIa, в комбинации с препаратом фактора XI или родственного фактору XI полипептида способствует сокращению времени свертывания крови, образованию более плотного сгустка и повышению устойчивости к фибринолизу по сравнению со временем свертывания, плотностью сгустка и устойчивостью в случаях, когда субъектам вводят только фактор VIIa или фактор XI.

Введение препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида, например, фактора VIIa, в комбинации с препаратом фактора XI или родственного фактору XI полипептида также способствует снижению времени достижения остановки кровотечения и снижению количества введений для поддержания гемостаза по сравнению со случаем, когда вводят только либо фактор VIIa, либо фактор XI. Настоящее изобретение относится к благотворному действию одновременного или последовательного дозирования препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида и препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может быть в виде однократной композиции или может быть в виде многокомпонентного набора (набора компонентов). Композицию согласно настоящему изобретению используют в качестве терапевтического и профилактического прокоагулянта у млекопитающих, включая приматов, таких как человек. Настоящее изобретение также относится к способу лечения (включая профилактическое лечение или профилактику) кровотечений у субъекта, включая человека.

Всякий раз, когда в описании упоминают о первой или второй или третьей и т.д. стандартной дозе, то это упоминание не указывает на предпочтительный порядок введения, а только приводится для удобства.

Комбинация препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида представляет собой благотворно действующий продукт, способствующий сокращению времени свертывания крови, быстрому образованию гемостатических "пробок" и образованию стабильных гемостатических "пробок". Настоящим изобретателем было обнаружено, что комбинация препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида представляет собой благотворно действующий продукт, способствующий образованию твердых, стабильных и быстро формирующихся «пробок».

Авторы настоящего изобретения показали, что комбинация фактора VIIa и фактора XI может снизить время свертывания плазмы человека в норме с большей эффективностью, чем только либо фактор VIIa, либо фактор XI. Было показано, что комбинация фактора VIIa и фактора XI может повысить плотность сгустка с большей эффективностью, чем только либо фактор VIIa, либо фактор XI. Комбинируя фактор VIIa при концентрации, которая не приводит к дальнейшему увеличению плотности сгустка, с фактором XI также при концентрации, которая не приводит к дальнейшему увеличению плотности сгустка, неожиданно было выявлено, что происходит дальнейшее увеличение прочности сгустка. Также было показано, что комбинация фактора VIIa и фактора XI может увеличить in vitro время фибринолиза в плазме человека в норме с большей эффективностью, чем только либо фактор VIIa, либо фактор XI. Также было показано, что комбинация фактора VIIa и фактора XI может продлить полупериод фибринолиза в нормальной плазме человека с большей эффективностью, чем только либо фактор VIIa, либо фактор XI. Также было показано, что комбинация фактора VIIa и фактора XI может защитить сгусток от фибринолиза, в частности, от tPA-опосредованного фибринолиза, в нормальной плазме человека с большей эффективностью, чем только либо фактор VIIa, либо фактор XI.

Таким образом, повышение уровня свертывания способствует более эффективному лечению кровотечения у субъекта.

Не ограничиваясь какой-либо теорией, изобретатели полагают, что полное образование тромбина является необходимым для формирования твердой, стабильной гемостатической «пробки» и, тем самым, для поддержания гемостаза. Фибриновая структура такой «пробки» зависит как от количества образованного тромбина, так и от скорости первоначального образования тромбина. В случае снижения образования тромбина образуется рыхлая фибриновая «пробка», которая является высоко проницаемой. Фибринолитические ферменты, которые в норме находятся на поверхности фибрина, легко растворяют такую фибриновую «пробку». Образование стабильной фибриновой «пробки» также зависит от присутствия фактора XIIIa, который образуется в результате действия тромбина, и поэтому также зависит от завершенного образования тромбина. Кроме того, недавно описан активируемый тромбином ингибитор фибринолиза, TAFI, для активации которого требуются высокие количества тромбина. В случае не полностью произошедшего образования тромбина, TAFI не активируется, что приводит к образованию гемостатической «пробки», которая легче, чем обычно, растворяется под действием фибринолитической активности в норме. В случае нарушения, характеризующегося сниженным числом тромбоцитов, тромбоцитопении, введение экзогенного добавочного фактора VIIa инициирует более скорое образование тромбина. Однако полное образование тромбина не нормализуется посредством фактора VIIa даже при его высоких концентрациях.

У субъектов с пониженными концентрациями фибриногена в плазме (субъекты с многократными переливаниями крови вследствие сложной травмы или обширной операции) полной активации тромбином не происходит. Более эффективный гемостаз достигается путем введения комбинации фактора VII и фактора XI.

У субъектов с тромбоцитопенией наблюдается ослабление образования тромбина, а также недостаточная стабилизация фибриновых «пробок», что приводит к образованию гемостатических «пробок», подверженных преждевременному растворению. Кроме того, субъекты, которые получают травму или повреждение органа и которые вследствие этого претерпевают многократные переливания крови, часто имеют пониженное число тромбоцитов, а также пониженные уровни фибриногена, фактора VIII и других белков системы свертывания крови. У таких субъектов наблюдается ослабление (или снижение) образования тромбина. Кроме того, пониженный уровень фибриногена у таких субъектов отрицательно влияет на активацию фактора XIII. Такие субъекты, поэтому, имеют несовершенный или менее эффективный гемостаз, что приводит к образованию фибриновых «пробок», которые легко и преждевременно растворяются под действием протеолитических ферментов, причем такие ферменты интенсивно высвобождаются при обширной травме и повреждении органа.

Для того чтобы облегчить образование полностью стабилизированных «пробок» с полноценной способностью поддержать гемостаз у субъекта, субъекту вводят композицию согласно изобретению. Указанная композиция является особенно благотворной для субъектов с пониженным числом тромбоцитов и для субъектов с пониженными уровнями фибриногена в плазме крови и/или других белков свертывающей системы.

Полагают, что в присутствии фактора XI для достижения достаточного гемостаза могут потребоваться более низкие концентрации фактора VIIa.

Полипептиды фактора VII

Для осуществления настоящего изобретения любой полипептид фактора VII может быть использован, то есть полипептид, являющийся эффективным средством в профилактике или лечении кровотечения. Такие полипептиды включают в себя полипептиды фактора VII, полученные из крови или плазмы или полученные рекомбинантными способами.

Настоящее изобретение включает в себя полипептиды фактора VII, такие, например, полипептиды, аминокислотная последовательность которых описана в патенте США No. 4784950 (человеческий фактор VII дикого типа). В некоторых аспектах, полипептид фактора VII представляет собой фактор VIIa человека, описанный, например, в патенте США No. 4784950 (фактор VII дикого типа). В одной серии аспектов, полипептиды фактора VII включают в себя полипептиды, которые проявляют, по крайней мере, приблизительно 10%, предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 30%, более предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 50% и самое предпочтительное, по крайней мере, приблизительно 70% удельной биологической активности фактора VIIa человека. В одной серии аспектов, полипептиды фактора VII включают в себя полипептиды, которые проявляют, по крайней мере, приблизительно 90%, предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 100%, предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 120%, более предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 140% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 160% удельной активности фактора VIIa человека. В одной серии аспектов, полипептиды фактора VII включают в себя полипептиды, аминокислотная последовательность которых идентична, по крайней мере, приблизительно на 70%, предпочтительно, по крайней мере, приблизительно на 80%, более предпочтительно, по крайней мере, приблизительно на 90%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, приблизительно на 95%, последовательности фактора VII дикого типа, описанной в патенте США No. 4784950.

Употребляемый в тексте термин «полипептид фактора VII» охватывает, без ограничения, фактор VII, а также родственные фактору VII полипептиды. Подразумевается, что термин «фактор VII» охватывает, без ограничения, полипептиды с последовательностью аминокислот 1-406 человеческого фактора VII дикого типа (как описано в патенте США No. 4784950), а также фактора VII дикого типа, произведенного из других видов, таких как, например, крупный рогатый скот, свинья, собака, мышь и лосось, причем указанный фактор произведен из крови или плазмы или получен рекомбинантными способами. Указанный термин также охватывает природные аллельные варианты фактора VII, которые могут существовать и встречаться у разных представителей. Кроме того, степень и место гликозилирования или других посттрансляционных модификаций может различаться в зависимости от выбранных хозяйских клеток и природы окружающей хозяйские клетки среды. Термин «фактор VII» также подразумевает охватить полипептиды фактора VII в их нерасщепленной форме (зимоген), а также полипептиды, которые подверглись протеолитическому процессингу с образованием соответствующих биоактивных форм, обозначенных как фактор VIIa. Обычно молекула фактора VII расщепляется между 152 и 153 аминокислотными остатками с получением фактора VIIa.

Термин «родственные фактору VII полипептиды» включает в себя, без ограничения, полипептиды фактора VII, которые представляют собой химические модификации фактора VII человека, и/или включают одно или более изменения аминокислотной последовательности по сравнению с фактором VII человека (т.е., варианты фактора VII), и/или полипептиды с укороченными аминокислотными последовательностями по сравнению с фактором VII человека (т.е., фрагменты фактора VII). Такие родственные фактору VII полипептиды могут проявлять свойства, отличные от свойств фактора VII человека, включая стабильность, связывание с фосфолипидами, удельную активность и тому подобное. Термин «родственные фактору VII полипептиды» подразумевает охватить полипептиды в их нерасщепленной форме (зимоген), а также полипептиды, которые подверглись протеолитическому процессингу с образованием соответствующих биоактивных форм, которые обозначают как «родственные фактору VIIa полипептиды» или «активированные, родственные фактору VII полипептиды».

Употребляемый в тексте термин «родственные фактору VII полипептиды» охватывает, без ограничения, полипептиды, проявляющие, главным образом, равную или улучшенную биологическую активность относительно человеческого фактора VII дикого типа, а также полипептиды, у которых биологическая активность фактора VIIa была существенно модифицирована или снижена относительно активности человеческого фактора VIIa дикого типа. Такие полипептиды включают, без ограничения, фактор VII или фактор VIIa, модифицированный химическим путем, и варианты фактора VII, в которые были внесены специфические изменения аминокислотной последовательности, которые привели к модификации или нарушению биоактивности полипептида.

Кроме того, термин охватывает полипептиды с незначительно модифицированной аминокислотной последовательностью, например, полипептиды с модифицированной N-концевой частью, включая делеции или добавления аминокислот в N-концевой части полипептидов, и/или полипептиды, которые были модифицированы химическим путем относительно фактора VIIa человека.

Родственные фактору VII полипептиды, которые включают варианты фактора VII, проявляющие, в основном, либо равную или улучшенную биологическую активность, по сравнению с фактором VII дикого типа, либо, в качестве альтернативы, проявляющие, в основном, модифицированную или сниженную биоактивность относительно фактора VII дикого типа, включают в себя, без ограничения, полипептиды с аминокислотной последовательностью, которая отличается от последовательности фактора VII дикого типа включением, делецией или замещением одной или более аминокислот.

Родственные фактору VII полипептиды, включающие варианты, охватывают такие полипептиды, которые проявляют, по крайней мере, приблизительно 10%, по крайней мере, приблизительно 20%, по крайней мере, приблизительно 25%, по крайней мере, приблизительно 30%, по крайней мере, приблизительно 40%, по крайней мере, приблизительно 50%, по крайней мере, приблизительно 60%, по крайней мере, приблизительно 70%, по крайней мере, приблизительно 75%, по крайней мере, приблизительно 80%, по крайней мере, приблизительно 90%, по крайней мере, приблизительно 100%, по крайней мере, приблизительно 110%, по крайней мере, приблизительно 120% или по крайней мере, приблизительно 130% удельной активности фактора VIIa дикого типа, который продуцируется в клетках такого же типа, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью одного или более из таких анализов, как анализ свертывания крови, анализ посредством протеолиза или анализ связывания TF, как описано выше.Родственные фактору VII полипептиды, включающие варианты, обладающие, в основном, сниженной биологической активностью по сравнению с фактором VIIa дикого типа, представляют собой полипептиды, которые проявляют менее чем приблизительно 25%, предпочтительно менее чем приблизительно 50%, более предпочтительно менее чем приблизительно 75%, более предпочтительно менее чем приблизительно 100%, более предпочтительно менее чем приблизительно 110%, более предпочтительно менее чем приблизительно 120%, более предпочтительно менее чем приблизительно 130% удельной активности фактор VIIa дикого типа, продуцированного в клетках того же типа, причем приведенные данные получены в ходе исследований с помощью одного или нескольких анализов, таких как анализ свертывания крови, протеолитический анализ или анилиз связывания TF, как описаго выше.

Родственные фактору VII полипептиды, включая варианты, проявляющие существенно сниженную биологическую активность по сравнению с фактором VIIa дикого типа, представляют собой полипептиды, проявляющие менее 25%, предпочтительно менее чем приблизительно 10%, более предпочтительно менее чем приблизительно и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 1% удельной активности фактора VIIa дикого типа, который продуцируется в клетках такого же типа, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью одного или более из анализов, таких как анализ свертывания крови, анализ протеолиза или анализа связывания TF, как описано выше. Варианты фактора VII, проявляющие, главным образом, модифицированную биологическую активность относительно фактора VII дикого типа, включают в себя, без ограничения, варианты фактора VII, которые проявляют независимую от TF протеолитическую активность по отношению к фактору Х, и такие варианты, которые связываются с TF, но не расщепляют фактор Х.

В некоторых аспектах, полипептиды фактора VII представляют собой родственные фактору VII полипептиды, в частности, варианты, у которых отношение между активностью указанного полипептида фактора VII и активностью нативного человеческого фактора VIIa (FVIIa дикого типа) составляет, по крайней мере, приблизительно 1,25, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью «анализа гидролизом in vitro» (смотри «анализы», ниже); в других аспектах, отношение составляет, по крайней мере, приблизительно 2,0; в следующих аспектах, отношение составляет, по крайней мере, приблизительно 4,0. В некоторых аспектах изобретения, полипептиды фактора VII являются родственными фактору VII полипептидами, в частности, вариантами, у которых отношение между активностью указанного полипептида фактора VII и активностью нативного человеческого фактора VIIa (FVIIa дикого типа) составляет, по крайней мере, приблизительно 1,25, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью «анализа посредством гидролиза in vitro» (смотри «анализы», ниже); в других аспектах, отношение составляет, по крайней мере, приблизительно 2,0; в следующих аспектах, отношение составляет, по крайней мере, приблизительно 4,0; в следующих аспектах, отношение составляет, по крайней мере, приблизительно 8,0.В некоторых аспектах, полипептид фактора VII представляет собой фактор VII человека, как описано, например, в патенте США No. 4784950 (фактор VII дикого типа). В некоторых аспектах, полипептид фактора VII представляет собой фактор VIIa человека. В одной серии аспектов, полипептиды фактора VII представляют собой родственные фактору VII полипептиды, которые проявляют, по крайней мере, приблизительно 10%, предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 30%, более предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 50% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 70% удельной ферментативной активности фактора VIIa человека. В некоторых аспектах, полипептиды фактора VII имеют аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности фактора VII дикого типа введением, делецией или замещением одной или более аминокислот.

Неограничивающие примеры вариантов фактора VII, проявляющих равную или большую биологическую активность по сравнению с фактором VIIa дикого типа, включают в себя, но не ограничиваются, варианты, описанные в датских патентных заявках Nos. PA 2000 00734 и РА 2000 01360 (соответствующая международной публикации WO 01/83725), и РА 2000 01361 (соответствующая международной патентной заявке WO 02/22776). Неограничивающие примеры вариантов фактора VII, проявляющих, главным образом, равную или улучшенную биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа, включают в себя S52A-FVII, S60A-FVII (lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVIIa, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII и S336G-FVII; варианты FVIIa, проявляющие повышенную устойчивость к протеолизу, как описано в патенте США No. 5580560; фактор VIIa, который протеолитическим путем расщеплялся между остатками 290 и 291 или между остатками 315 и 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); и окисленные формы фактора VIIa (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999). Неограничивающие примеры вариантов фактора VII, проявляющих, в основном, сниженную или модифицированную биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа, включают в себя R125E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem. 29:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998) и фактор VIIa с отсутствующим Gla доменом (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317:245-249, 1993). Неограничивающие примеры химически модифицированных полипептидов фактора VII и вариантов последовательностей описаны, например, в патенте США No. 5997864.

Биологическая активность фактора VIIa в системе свертывания крови проявляется в его способности (i) связываться с тканевым фактором (TF) и (ii) катализировать протеолитическое расщепление фактора IX или фактора X с образованием активированного фактора IX или X (фактора IXa или Ха, соответственно).

Для целей изобретения, биологическую активность полипептидов фактора VII («биологическая активность фактора VII») можно оценить количественно путем измерения способности препарата стимулировать свертывание крови, используя плазму с недостаточным количеством фактора VII и тромбопластин, как описано, например, в патенте США No. 5997864. В данном анализе биологическую активность выражают как снижение времени свертывания по сравнению с контрольным образцом и превращают в «единицы фактора VII» при сравнении со стандартом, представляющим объединенную сыворотку человека, который проявляет активность фактора VII, равную 1 единице/мл. В качестве альтернативы, биологическая активность фактора VIIa может быть количественно оценена путем

(i) измерения способности фактора VIIa или родственного фактору VIIa полипептида производить активированный фактор Х (фактор Ха) в системе, содержащей TF, встроенный в липидный слой мембраны, и фактор Х. (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997);

(ii) измерения гидролиза фактора Х в водной системе («анализ посредством протеолиза in vitro», смотри ниже);

(iii) измерения физического связывания фактора VIIa или родственного фактору VIIa полипептида с TF, используя прибор, основанный на резонансе поверхности плазмона (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997); и

(iv) измерения гидролиза синтетического субстрата посредством фактора VIIa и/или родственного фактору VIIa полипептида («анализ посредством гидролиза in vitro», смотри ниже); и(v) измерения образования тромбина в TF-независимой системе in vitro.

Термин «биологическая активность фактора VII» или «активность фактора VII» подразумевает включить способность образовывать тромбин; термин также включает способность образовывать тромбин на поверхности активированных тромбоцитов в отсутствие тканевого фактора.

Препарат фактора VIIa, который может быть использован согласно изобретению, представляет собой, без ограничения, NovoSeven^® (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark).

Полипептиды фактора XI

При осуществлении настоящего изобретения любой полипептид фактора XI может быть использован, то есть, полипептид, являющийся эффективным в предупреждении или лечении кровотечения. Такие полипептиды включают в себя полипептиды фактора XI, полученные из крови или плазмы или полученные рекомбинантными способами. Кроме того, тромбоциты могут содержать отличную по структуре форму FXI (возможно, вследствие альтернативного сплайсинга гена FXI). Фактор XI тромбоцитов описан в публикации Lipscomb, M.S. & Walsh, P.N. (1979), Journal of Clinical Investigation, 63, 1006-1014.

Употребляемый в тексте термин «полипептид фактора XI» охватывает, без ограничения, фактор XI, а также родственные фактору XI полипептиды. Термин «фактор XI» подразумевает охватить, без ограничения, полипептиды с аминокислотной последовательностью, описанной в публикации Sun, Y. & Gailani, D. (1996), J. Biol. Chem. 271:29023-29028 (фактор XI дикого типа из плазмы человека), а также фактор XI дикого типа, произведенный из других видов, таких как, например, крупный рогатый скот, свинья, собака, мышь и лосось. В некоторых аспектах, полипептид фактора XI является человеческим фактором XI дикого типа, как описано, например, в публикации Sun, Y. & Gailani, D. (1996), J. Biol. Chem. 271:29023-29028.

Указанный термин также охватывает аллельные варианты фактора XI, которые могут существовать и встречаться у разных представителей. Кроме того, степень и место гликозилирования или других посттрансляционных модификаций может различаться в зависимости от выбранных хозяйских клеток и природы окружающей хозяйские клетки среды. Термин «фактор XI» также подразумевает охватить полипептиды фактора XI в их нерасщепленной форме (зимоген), а также полипептиды, которые подверглись протеолитическому процессингу с образованием соответствующих биоактивных форм, обозначенных как фактор XIa.

Термин «родственные фактору XI полипептиды» включает в себя, без ограничения, химически модифицированные полипептиды фактора XI и/или полипептиды, в аминокислотную последовательность которых внесено одно или более изменений аминокислотной последовательности по сравнению с фактором XI человека (т.е., варианты фактора XI), и/или полипептиды с укороченными аминокислотными последовательностями относительно фактора XI человека (т.е., фрагменты фактора XI). Такие родственные фактору XI полипептиды могут проявлять свойства, отличные от свойств фактора XI человека, включая стабильность, связывание с фосфолипидами, удельную активность и тому подобное. Термин «родственные фактору XI полипептиды» подразумевает охватить такие полипептиды в их нерасщепленной форме (зимоген), а также полипептиды, которые подверглись протеолитическому процессингу с образованием соответствующих биоактивных форм, которые могут быть обозначены как «родственные фактору XIa полипептиды» или «активированные, родственные фактору XI полипептиды».

Употребляемый в тексте термин «родственные фактору XI полипептиды» охватывает, без ограничения, полипептиды, проявляющие, главным образом, равную или улучшенную биологическую активность по сравнению с человеческим фактором XI дикого типа, а также полипептиды, биологическая активность которых была существенно модифицирована или снижена относительно активности человеческого фактора XI дикого типа. Такие полипептиды включают, без ограничения, фактор XI или фактор XIa, который был модифицирован химическим путем, и варианты фактора XI, в которые были внесены специфические изменения аминокислотной последовательности, что привело к модификации или нарушению биоактивности полипептида.

Кроме того, термин охватывает полипептиды с незначительно модифицированной аминокислотной последовательностью, например, полипептиды с модифицированной N-концевой частью, включая делеции или добавления аминокислот в N-концевой части полипептидов, и/или полипептиды, которые представляют собой химические модификации фактора XI человека.

Родственные фактору XI полипептиды, включающие варианты фактора XI, которые проявляют биологическую активность, в основном, равную активности фактора XI дикого типа, или лучшую биологическую активность по сравнению с фактором XI дикого типа, или которые, в качестве альтернативы, имеют, в основном, модифицированную или сниженную биоактивность по сравнению с активностью фактора XI дикого типа, включают в себя, без ограничения, полипептиды с аминокислотной последовательностью, которая отличается от последовательности фактора XI дикого типа включением, делецией или замещением одной или более аминокислот.

Родственные фактору XI полипептиды, включающие варианты, охватывают такие полипептиды, которые проявляют, по крайней мере, приблизительно 10%, по крайней мере, приблизительно 20%, по крайней мере, приблизительно 30%, по крайней мере, приблизительно 40%, по крайней мере, приблизительно 50%, по крайней мере, приблизительно 60%, по крайней мере, приблизительно 70%, по крайней мере, приблизительно 80%, по крайней мере, приблизительно 90%, по крайней мере, приблизительно 100%, по крайней мере, приблизительно 110%, по крайней мере, приблизительно 120% и, по крайней мере, приблизительно 130% удельной активности фактора XI дикого типа, который продуцируется в клетках такого же типа, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью анализа активности фактора XI, приведенного в настоящем описании.

Родственные фактору XI полипептиды, включающие варианты, которые обладают равной с фактором XI дикого типа биологической активностью или улучшенной активностью по сравнению с фактором XI дикого типа, охватывают полипептиды, которые проявляют, по крайней мере, приблизительно 25%, предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 50%, более предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 75%, более предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 100%, более предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 110%, более предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 120% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 130% удельной биологической активности человеческого фактора XI дикого типа, который продуцируется в клетках такого же типа, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью одного или более из анализов удельной активности фактора XI, как описано. С целью изобретения, биологическая активность фактора XI может быть оценена количественно, как будет описано позже в настоящем тексте (часть «анализы»).

Родственные фактору XI полипептиды, включающие варианты, которые обладают, в основном, сниженной биологической активностью по сравнению с активностью фактора XI дикого типа, представляют собой полипептиды, которые проявляют приблизительно менее 25%, предпочтительно менее 10%, более предпочтительно менее 5% и наиболее предпочтительно менее 1% удельной активности фактора XI дикого типа, который продуцируется в клетках такого же типа, причем приведенные данные получены в результате исследований с помощью одного или более из анализов удельной активности фактора XI, как описано выше.

Неограничивающие примеры полипептидов фактора XI включают в себя фактор XI из плазмы человека, описанный, например, в публикации Gailani & Broze (1993), Blood Coagul. Fibrinolysis, 4:15-20, или Kerbiriou & Griffin (1979), J. Biol. Chem. 254:12020-12207.

В некоторых аспектах, фактор XI представляет собой родственные фактору XI полипептиды, у которых отношение между активностью указанного полипептида фактора XI и активностью нативного человеческого фактора XI (фактор XI дикого типа) составляет, по крайней мере, приблизительно 1,25, когда исследования проводят с помощью «хромогенного анализа FXI» (смотри ниже); в других аспектах, отношение составляет, по крайней мере, приблизительно 2,0; в следующих аспектах, отношение составляет, по крайней мере, приблизительно 4,0.

Термин «родственные фактору XI полипептиды» также включает в себя фрагменты фактора XI или полипептидов, родственных фактору XI, сохраняющие характерную, связанную с гемостазом активность. Связанная с гемостазом активность полипептида фактора XI может быть измерена, например, с помощью анализа активности фактора XI, описанного в данном тексте.

В предпочтительных аспектах, фактор XI представляет собой фактор XI плазмы человека или активированный фактор XIa плазмы человека. В одном аспекте, FXI является фактором XI тромбоцитов. В другом аспекте, FXI является фактором, полученным рекомбинантным способом.

Определения

В настоящем тексте использовали трехбуквенные или однобуквенные обозначения аминокислот в их обычном значении, как указано в таблице 1. Если не указано особо, то упоминаемые в тексте аминокислоты являются L-аминокислотами. Следует понимать, что первая буква, например, в обозначении К337 представляет аминокислоту, которая по природе находится в указанном положении молекулы фактора VII дикого типа и что, например, [К337А]-FVIIa означает FVII-вариант, где аминокислота, представленная однобуквенным кодом К в нативной молекуле, находящаяся в указанном положении, заменена на аминокислоту, представленную однобуквенным кодом А.

Таблица 1
Сокращения аминокислотАминокислотаТрехбуквенный кодОднобуквенный кодГлицинGly GПролинPro PАланинAla AВалинVal VЛейцинLeu LИзолейцинIle IМетионинMet MЦистеинCys CФенилаланинPhe FТирозинTyr YТриптофанTrp WГистидинHis HЛизинLys KАргининArg RГлутаминGln QАспарагинAsn NГлутаминовая кислотаGlu EАспарагиновая кислотаAsp D

Термин «фактор VIIa» или «FVIIa» может быть взаимозаменяемым. Термин фактор VIIa включает в себя зимоген фактора VII (одноцепочечный фактор VII). Термин «фактор XI» или «FXI» может быть взаимозаменяемым. Термин «фактор VIII» или «FVIII» может быть взаимозаменяемым. Термин «фактор VIII» или «FVIII» включает в себя активированный фактор VIII (FVIIIa), варианты и усеченные формы, сохраняющие характерную связанную с фактором VIII гемостатическую активность; термин включает в себя полученный рекомбинантным способом фактор FVIII и фактор VIII из плазмы. Фактор VIII человека и рекомбинантный фактор VIII человека являются предпочтительными.

В данном тексте, термин «субъекты с нарушением образования тромбина» означает субъектов, у которых не образуется полностью тромбин на активированной поверхности тромбоцитов, и также включает в себя субъектов, у которых тромбин образуется в меньшей степени, чем у субъектов с полностью функционирующей нормальной системой гемостаза, включая нормальное количество факторов свертывания, тромбоцитов и фибриногена и их функцию в норме (например, как в объединенной, плазме человека в норме), и включает, без ограничения, субъектов, у которых отсутствует фактор VIII (например, тромбоцитопения или тромбастения Гланцмана или субъекты с обширными кровотечениями); субъектов с пониженными уровнями протромбина, FX или FVII; субъектов с пониженным уровнем некоторых факторов свертывающей системы (например, вследствие чрезмерного кровотечения в результате травмы или обширной операции), и субъектов с пониженными концентрациями фибриногена в плазме (например, у субъектов, претерпевших многократные переливания крови).

Под «уровнем образования тромбина» или «нормальным образованием тромбина» подразумевают уровень образования тромбина у больного, сравненный с уровнем образования тромбина у здоровых субъектов. Уровень обозначают как процент от нормального уровня. Термины могут, где уместно, быть взаимозаменяемы.

Термин «улучшение гемостатической системы» означает повышение способности к образованию тромбина. Термин «улучшенный гемостаз» подразумевает охватить случаи, когда определенное образование тромбина для тестируемого образца, содержащего препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат фактора XI или родственного фактору XI полипептида, продолжено по времени по сравнению с образованием тромбина контрольного образца, содержащего только фактор VII или родственный фактору VII полипептид или фактор XI или родственный фактору XI полипептид, соответственно, когда исследования проводят с помощью такого же анализа образования тромбина. Образование тромбина может быть проанализировано, как описано в анализе образования тромбина настоящего изобретения (смотри часть "анализы").

"Единственные" агенты или факторы, применяемые в данном изобретении, имеют отношение к тем случаям, когда фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид, взятые вместе, являются единственными гемостатическими агентами или факторами свертывающей системы, содержащимися в фармацевтической композиции или наборе, или являются единственными гемостатическими агентами или активными гемостатическими агентами или факторами свертывающей системы, которые вводят больному в ходе индивидуального лечения, такого как, например, индивидуальное лечение кровотечения. Следует понимать, что такие случаи охватывают такие ситуации, когда другие гемостатические агенты или факторы свертывающей системы, которые обычно применяют, не присутствуют в достаточном количестве или не имеют достаточной активности, чтобы в значительной степени влиять на один или более параметров свертывания крови.

Время фибринолиза, прочность сгустка, образование фибринового сгустка и время свертывания крови являются клиническими параметрами, применяемыми для характеристики состояния гемостатической системы больного. Образцы крови берут у больного при подходящих интервалах времени и проводят исследования одного или более параметров способами, например, тромбоэластографией, как описано в публикациях Meh et al., Blood Coagulation & Fibrinolysis 2001, 12:627-637; Vig et al., Hematology, Vol. 6 (3) pp. 205-213 (2001); Vig et al., Blood coagulation & fibrinolysis, Vol. 12 (7) pp. 555-561 (2001) Oct; Glidden et al., Clinical and applied thrombosis/hemostasis, Vol. 6 (4) pp. 226-233 (2000) Oct; McKenzie et al., Cardiology, Vol. 92 (4) pp. 240-247 (1999) Apr; или Davis et al., Journal of the American Society of Nephrology, Vol. 6 (4) pp. 1250-1255 (1995).

Термин «увеличение времени фибринолиза» подразумевает охватить случаи, когда измеряемое время растворения сгустка для тестируемого образца, содержащего препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат фактора XI или родственного фактору XI полипептида, увеличивается по сравнению с характерным временем растворения сгустка контрольного образца, содержащего только фактор VII или родственный фактору VII полипептид или фактор XI или родственный фактору XI полипептид, соответственно, когда исследования проводят с помощью такого же анализа растворения сгустка. Время растворения сгустка может быть определено, как описано выше.

Термин "возрастающая прочность сгустка" подразумевает охватить случаи, когда измеряемая прочность сгустка, например, механическая прочность, для тестируемого образца, содержащего препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат фактора XI или родственного фактору XI полипептида, повышается относительно характерной прочности сгустка контрольного образца, содержащего только фактор VII или родственный фактору VII полипептид или фактор XI или родственный фактору XI полипептид, соответственно, когда исследования проводят с помощью такого же анализа прочности сгустка. Прочность сгустка может быть определена, как описано, например, в публикации Carr et al., 1991. (Carr ME, Zekert SL. Measurement of platelet-mediated force development during plasma clot formation. AM. J. MED. SCI. 1991, 302:13-8), или как описано выше, то есть, с помощью тромбоэластографии.

Термин «усиление образования фибринового сгустка» подразумевает охватить случаи, когда измеряемая скорость или степень образования сгустка для тестируемого образца, содержащего препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат фактора XI или родственного фактору XI полипептида, повышается по сравнению с характерной скоростью или степенью образования фибринового сгустка контрольного образца, содержащего только фактор VII или родственный фактору VII полипептид или фактор XI или родственный фактору XI полипептид, соответственно, когда исследования проводят с помощью такого же анализа свертывания крови. Образование фибринового сгустка может быть измерено, как описано выше.

Термин "сокращенное время свертывания крови" подразумевает охватить случаи, когда измеряемое время образования сгустка (время свертывания) для тестируемого образца, содержащего препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат фактора XI или родственного фактору XI полипептида, сокращается относительно характерного времени свертывания контрольного образца, содержащего только фактор VII или родственный фактору VII полипептид или фактор XI или родственный фактору XI полипептид, соответственно, когда исследования проводят с помощью такого же анализа свертывания крови. Время свертывания крови может быть измерено с помощью стандартных PT-или aPTT-анализов, которые широко известны специалистам в данной области.

Термин «пониженное число тромбоцитов или уменьшенная активность тромбоцитов» относится к количеству тромбоцитов (тромбоциты), имеющихся в плазме субъекта и к биологической, связанной со свертыванием активности таких тромбоцитов. Уменьшение числа тромбоцитов может быть вследствие, например, усиления разрушения тромбоцитов, уменьшения образования тромбоцитов и объединения фракции тромбоцитов больше, чем нормальная фракция тромбоцитов в селезенке. Тромбоцитопению, например, определяют как число тромбоцитов менее чем 150000 тромбоцитов на микролитр; верхний предел нормального числа тромбоцитов находится, обычно, между 350000 и 450000 тромбоцитов на микролитр. Число тромбоцитов можно измерить с помощью автоматических счетчиков тромбоцитов, то есть, хорошо известным для специалистов способом. Синдромы, как следствие снижения числа тромбоцитов, включают в себя, без ограничения, тромбоцитопению, коагулопатию. «Активность» включает в себя, без ограничения, агрегационную, адгезивную и свертывающую активность тромбоцитов. Снижение активности может быть обусловлено, например, изменениями гликопротеинов, аномальным взаимодействием мембраны и цитоскелета, изменениями гранул тромбоцитов, изменениями свертывающей активности тромбоцитов, изменениями сигнала трансдукции и секреции. Активность тромбоцитов, включающая агрегационную, адгезивную и свертывающую активность, измеряют стандартными способами, известными квалифицированному специалисту, смотри, например, публикацию Platelets. A Practical Approach, Ed. S.P. Watson & K.S.Authi: Clinical Aspects of Platelet Disorders (K.J.Clemetson) 15:299-318, 1996, Oxford University Press; Williams Hematology, Sixth Edition, Eds. Beutler, Lichtman, Coller, Kipps & Seligsohn, 2001, McGraw-Hill. Синдромы, обусловленные снижением активности тромбоцитов, включают в себя, без ограничения, тромбастению Гланцмана, синдром Bernard-Soulier, лечение противосвертывающим средством и лечение тромболитическим средством. «Пониженный» относится к числу тромбоцитов или активности тромбоцитов образца тестируемой плазмы по сравнению с числом тромбоцитов и активностью тромбоцитов в образце объединенной плазмы в норме, когда исследования проводят с помощью такого же анализа.

Употребляемый в тексте термин «нарушение, сопровождающееся кровотечением» отражает любой дефект, врожденный, приобретенный или индуцированный, клеточного или молекулярного происхождения, проявляющийся кровотечением. Примеры нарушений, сопровождающихся кровотечением, включают в себя, но не ограничиваются, недостаточность факторов свертывания (например, недостаточность факторов свертывания VIII, IX, XI или VII), ингибирование факторов свертывания, нарушение функции тромбоцитов (например, тромбастению Гланцмана и синдром Bernard-Soulier), тромбоцитопению, болезнь Виллебранда и коагулопатию, такую, которая вызвана разбавлением белков свертывающей системы, повышенным фибринолизом и пониженным числом тромбоцитов вследствие кровотечений и/или переливаний крови (например, у субъектов, подвергаемых многократным переливаниям крови вследствие перенесенной операции или травмы).

Кровотечение относится к экстравазации крови из любого компонента системы циркуляции крови. Подразумевается, что термин " кровотечения" включает нежелательное, неконтролируемое и часто чрезмерное кровотечение в связи с операцией, травмой или другими видами повреждения ткани, а также нежелательные кровотечения у субъектов с нарушениями, сопровождающимися кровотечением. Случаи кровотечения могут иметь место у субъектов, у которых свертывающая система находится, в основном, в норме, но которые испытывают (временную) коагулопатию, а также у субъектов с врожденными или приобретенными нарушениями свертывания или нарушениями, сопровождающимися кровотечением. У субъектов с нарушением функции тромбоцитов кровотечения можно сравнить с кровотечениями, вызванными гемофилией, поскольку гемостатическая система, как при гемофилии, отсутствует или имеет аномальные существенные "вещества" свертывания крови (например, тромбоциты или белковый фактор Виллебранда). У субъектов, имеющих значительное повреждение ткани, например, в связи с операцией или существенной травмой, при потребности в незамедлительной остановки кровотечения может быть ослаблен нормальный механизм гемостаза, и у таких субъектов может возникнуть чрезмерное кровотечение несмотря на то, что, в основном (до операции и до травмы), гемостаз у них осуществлялся по нормальному механизму. У таких субъектов, которые также часто претерпевают многократные переливания крови, возникает (временная) коагулопатия в результате кровотечения и/или переливаний крови (т.е., разбавление белков свертывающей системы, повышенный фибринолиз и пониженное количество тромбоцитов вследствие кровотечения и/или переливаний крови). Кровотечения также могут возникать в органах, таких как головной мозг, область внутреннего уха и глаза; указанные органы являются областями с ограниченными возможностями для гемостаза хирургическим путем, и поэтому достижение удовлетворительного гемостаза является проблематичным. Подобные проблемы могут возникать в процессе биопсии различных органов (печени, легких, опухолевой ткани, желудочно-кишечного тракта), а также при лапароскопической операции и радикальной залобковой простатэктомии. Общим фактором для всех указанных случаев является трудность достижения гемостаза с помощью хирургической техники (хирургические швы, зажимы и т.д.), а также в случае диффузного кровотечения (например, геморрагический гастрит и массивное маточное кровотечение) сталкиваются с такой же трудностью. Кровотечения также могут возникать у субъектов при антикоагулянтной терапии, у которых нарушение гемостаза вызвано данным лечением; указанные кровотечения часто являются резкими и обильными. Антикоагулянтную терапию часто назначают для предотвращения тромбоэмболической болезни. Такая терапия может предусматривать введение гепарина, других видов протеогликанов, варфарина или других видов антагонистов витамина К, а также аспирина и других ингибиторов агрегации тромбоцитов, таких как, например, антитела или другие ингибиторы активности GP IIb/IIIa. Кровотечение также может быть обусловлено так называемой тромболитической терапией, которая включает в себя комбинированное лечение антитромбоцитарным средством (например, ацетилсалициловая кислота), антикоагулянтом (например, гепарин) и фибринолитическим средством (например, тканевой активатор плазминогена, tPA). Случаи кровотечений также подразумевают включить в себя, без ограничения, неконтролируемое и обильное кровотечение в связи с операцией или травмой у субъектов, которые страдают острыми гемартрозами (кровоизлияния в суставы), хронической гемофилической артропатией, гематомами (например, мышечные, забрюшинные, подъязычные и заглоточные), кровотечениями в других тканях, гематурией (кровотечение из мочевыводящих путей), кровоизлиянием в мозг, которые подвергаются операции (например, гепатэктомия), удалению зуба и которые страдают желудочно-кишечными кровотечениями (например, кровопотери при UGI). Случаи кровотечения могут быть связаны с ингибиторами фактора VIII; гемофилией А; гемофилией А с ингибиторами; гемофилией В; недостаточностью фактора VII; недостаточностью фактора XI; тромбоцитопенией; недостаточностью фактора Виллебранда (болезнь Виллебранда); тяжелым повреждением ткани; тяжелой травмой; хирургической операцией; лапароскопической операцией; геморрагическим гастритом; биопсией; антикоагулянтной терапией; кровотечениями в верхнем отделе желудочно-кишечного тракта (UGI); или трансплантацией стволовой клетки. Случаями кровотечений могут быть профузное маточное кровотечение; кровотечение, возникающее в органах с ограниченной возможностью для достижения гемостаза механическим путем; возникающее в головном мозге; возникающее в области внутреннего уха или возникающее в глазах. Термины «случаи кровотечений» и «кровотечения» могут, когда уместно, быть взаимозаменяемыми.

В данном контексте подразумевается, что термин «лечение» включает в себя как предотвращение вероятного кровотечения, такого как, например, при операции, так и регулирование уже имеющегося кровотечения, такого как, например, при травме, с целью остановки или снижения до минимума кровотечения. Приведенный выше термин «вероятное кровотечение» может означать кровотечение, которое, вероятно, возникает в отдельной ткани или органе, или оно может быть неопределенным кровотечением. Таким образом, в термин «лечение» включено профилактическое введение препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат фактора XI или родственного фактору XI полипептида.

Употребляемый в тексте термин "субъект" означает любое животное, в частности, млекопитающих, таких как человек, и может быть, когда уместно, взаимозаменен на термин "больной".

Фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид, как определено в настоящем описании, могут быть введены одновременно или последовательно. Факторы могут быть использованы в виде однократной лекарственной формы, где однократная лекарственная форма содержит оба фактора свертывания, или в виде набора компонентов, содержащего препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида в качестве первой разовой дозированной формы, и препарат фактора XI или родственного фактору XI полипептида в качестве второй разовой дозированной формы. Всякий раз, когда в описании речь идет о первой или второй или третьей и т.д. стандартной дозе, при этом не указан предпочтительный порядок введения, то данные обозначения сделаны, главным образом, для удобства.

Под "одновременным" дозированием препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида подразумевают введение белковых факторов свертывания в однократной лекарственнной форме, или введение первого белкового фактора свертывания с последующим введением второго белкового фактора свертывания с интервалом времени введения не более чем 15 минут, предпочтительно 10, более предпочтительно 5, более предпочтительно 2 минуты. Любой фактор может быть введен первым.

Под "последовательным" дозированием подразумевают введение первого белкового фактора свертывания с последующим введением второго белкового фактора свертывания с интервалом времени введения вплоть до 2 часов, предпочтительно от 1 до 2 часов, более предпочтительно вплоть до 1 часа, более предпочтительно от 30 минут до 1 часа, более предпочтительно вплоть до 30 минут, более предпочтительно от 15 до 30 минут. Любая из двух стандартных лекарственных форм, или белковых факторов свертывания, может быть введена первой. Предпочтительно, оба продукта вводят одним и тем же внутривенным путем.

Под "содержанием фактора XI" подразумевают уровень активности фактора XI свертывающей системы, сравненный с уровнем активности у здоровых субъектов. Уровень обозначают как процент от нормального уровня. Термины могут, когда уместно, быть взаимозаменяемыми.

Под «снижением уровня фактора XI» или «сниженным содержанием фактора XI» подразумевают уменьшение количества или активности фактора XI в кровотоке по сравнению со средним содержанием фактора XI в популяции субъектов, не обладающих недостаточностью фактора XI свертывающей системы или ингибиторов фактора XI свертывающей системы. Уровень циркулирующего фактора XI может быть измерен с помощью либо анализа свертывания крови, либо иммунологического анализа. Прокоагулянтную активность фактора XI определяют по способности плазмы больного корректировать время свертывания плазмы с недостаточностью фактора XI (например, анализ АРТТ, смотри ниже; смотри также раздел «Анализы» настоящего описания).

За одну единицу фактора XI принимают количество фактора XI, находящегося в одном миллилитре нормальной (объединенной) плазмы человека (соответствующей 100% уровню фактора XI).

За одну единицу фактора VII принимают количество фактора VII, находящегося в 1 мл нормальной плазмы, соответствующей содержанию белка приблизительно 0,5 мкг белка. После активации 50 единиц соответствуют приблизительно 1 мкг белка.

Под «недостаточностью» подразумевают снижение количества или активности, например, фактора XI в плазме по сравнению с количеством или активностью данного фактора в плазме нормальных здоровых индивидуумов. Термин может, когда уместно, быть заменим термином «сниженный уровень фактора XI».

Под "АРТТ" или "аРТТ" подразумевают частичное активированное тромбопластиновое время (описанное, например, в публикации, Proctor RR, Rapaport SI: The partial thromboplastin time with kaolin; a simple screening test for first-stage plasma clotting factor deficiencies. Am. J. Clin. Pathol. 36:212, 1961).

Под «синдромом, связанным с фактором XI» подразумевают синдром, когда введенный субъекту, по необходимости, экзогенный фактор XI может предотвратить, излечить или улучшить любые симптомы, состояния или заболевания, возможные или уже имеющиеся, вызванные синдромом. Синдромы включают в себя, без ограничения, синдромы, вызванные снижением уровня фактора XI, например, связанные с кровотечением нарушения, вызванные ингибиторами фактора XI. Синдром, связанный с фактором XI, можно также лечить композицией согласно настоящему изобретению.

Под «синдромом, связанным с фактором VII» подразумевают синдром, когда введенный субъекту, по необходимости, экзогенный фактор VII, предпочтительно VIIa, может предотвратить, излечить или улучшить любые симптомы, состояния или заболевания, возможные или уже имеющиеся, вызванные синдромом. Синдромы включают в себя, без ограничения, синдромы, вызванные снижением уровня факторов свертывания VIII, IX, XI или VII, ингибиторов факторов свертывания, нарушением функции тромбоцитов (например, тромбастения Гланцмана и синдром Bernard-Soulier), тромбоцитопенией, болезнью Виллебранда и коагулопатией, которая вызвана разбавлением белков свертывающей системы, повышенным фибринолизом и снижением количества тромбоцитов вследствие кровотечений и/или переливаний крови (например, у субъектов, претерпевших многократные переливания крови после операции или травмы).

Термин "время полужизни" относится ко времени, которое требуется для того, чтобы концентрация фактора VII или родственного фактору VII полипептида или фактора XI или родственного фактору XI полипептида снизилась от данной величины до половины указанной величины.

Под "первичным гемостазом" подразумевают первоначальное образование тромбина под действием FXa и комплекса TF:фактора VIIa, последующую активацию тромбоцитов и образование первоначальной рыхлой "пробки" из активированных, плотно соединенных тромбоцитов, которая пока что не стабилизирована фибрином и, наконец, стабилизацию поперечно-связанным фибрином. Если "пробка" не стабилизируется фибрином, образованным на второй стадии гемостатического процесса (поддерживаемый гемостаз), она легко растворяется под действием фибринолитической системы.

Под «вторичным гемостазом» или «поддерживаемым гемостазом» подразумевают вторичное, полное и значительное, образование тромбина в виде «вспышки», имеющее место на поверхности активированных тромбоцитов и катализируемое фактором VIIa и фактором VIIIa, последующее образование фибрина и стабилизацию первоначальной "пробки" из тромбоцитов. Стабилизация "пробки" фибрином приводит к полному гемостазу.

Под "полным гемостазом" подразумевают образование стабильного и твердого фибринового сгустка или "пробки" на участке повреждения, который эффективно останавливает кровотечение и который не легко растворяется под действием фибринолитической системы. В данном контексте, термин гемостаз будет употребляться, чтобы представить полный гемостаз, как описано выше.

Общее количество белка в препарате можно измерить общеизвестными способами, например, путем измерения оптической плотности. Количества фактора XI свертывающей системы или белкового фактора VII («антиген») можно измерить общеизвестными способами, такими как стандартные иммуноанализы Elisa. В общих чертах, такой анализ осуществляют путем взаимодействия, например, раствора препарата, содержащего белковый фактор XI, с антителом против FXI, иммобилизованным на пластине Elisa, последующего взаимодействия комплекса иммобилизованное антитело-фактор XI со вторым антителом против FXI, несущим маркер, количества которого, на третьей стадии, измеряют. Количества каждого фактора свертывающей системы можно измерить подобным способом, используя соответствующие антитела. Общее количество белкового фактора свертывающей системы, присутствующего в препарате, определяют путем суммирования количеств индивидуальных белковых факторов свертывающей системы. В одном аспекте, препарат содержит выделенный фактор свертывания. В другом аспекте, препарат не содержит фактор II и фактор IIa свертывания (протромбин и тромбин) и/или фактор Х или Ха.

Употребляемый в тексте термин "выделенный" относится к факторам свертывающей системы крови, например, фактору XI или родственным фактору XI полипептидам, которые выделены из клетки, в которой они синтезируются, или из среды, в которой они обнаруживаются в природе (например, плазма или кровь). Отделение полипептидов от клетки, в которой они синтезируются, может быть достигнуто любым способом, известным в данной области, включая, без ограничения, отделение среды культуры клеток, содержащей желаемый продукт, от прикрепленной культуры клеток; центрифугирование или фильтрацию для удаления неприкрепленных клеток и тому подобное. Отделение полипептидов от среды, в которой они по природе находятся, достигается любым способом, известным в данной области, включая, без ограничения, аффинную хроматографию, такую как, например, на колонке с антителом против фактора VII или фактора XI, соответственно; гидрофобную хроматографию; ионообменную хроматографию; гель-хроматографию; электрофоретические процедуры (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование (IEF)), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония) или экстракцию и тому подобное.Термин "TFPI ингибитор" означает соединения, ингибирующие противосвертывающую активность TFPI (ингибитор пути обмена тканевого фактора). Термин включает в себя соединения, такие как описанные в европейском патенте No. 558529, международной публикации WO 96/28153 и патенте США 5622988. "TFPI" и "EPI" (ингибитор внешнего пути) могут быть взаимозаменяемыми.

В настоящем изобретении "эффективное количество" полипептида фактора VII и полипептида фактора XI определяют как количество полипептида фактора VII, например, FVIIa, и количество полипептида фактора XI, которых вместе достаточно, чтобы предотвратить или снизить кровотечение или потерю крови с целью лечения, облегчения или частичного угнетения заболевания и его осложнений.

Термин «активность фактора VIIa» или «фактор VIIa-активность» включает в себя способность образовывать тромбин; термин также включает в себя способность образовывать тромбин на поверхности активированных тромбоцитов в отсутствие тканевого фактора.

Композиция согласно изобретению также может содержать TFPI-ингибитор. Композиция согласно изобретению также может содержать фактор VIII. Такую композицию предпочтительно вводить субъектам, у которых отсутствуют ингибиторы фактора VIII.

Сокращения

TF тканевой фактор

FVII фактор VII в виде одноцепочечной, активированной формы

FVIIa фактор VII в его активированной форме

rFVIIa рекомбинантный фактор VII в его активированной формеFXI фактор XI в его зимогенной, неактивированной форме

FXIa фактор XI в его активированной форме

rFXI рекомбинантный FXI

rFXIa рекомбинантный FXIa

FVIII фактор VIII в его зимогенной, неактивированной форме

rFVIII рекомбинантный FVIII

FVIIIa фактор VIII в его активированной форме

rFVIIIa рекомбинантный FVIIIa

TFPI ингибитор пути обмена тканевого фактора

Получение соединений:

Очищенный фактор VIIa человека, пригодный для использования в настоящем изобретении, предпочтительно получают методом рекомбинантных ДНК, например, описанным в публикации Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2412-2416, 1986, или описанным в европейском патенте No. 200421 (ZymoGenetics, Inc.).

Фактор VII также может быть получен способами, описанными в публикациях Broze and Majerus, J. Biol. Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980 и Hedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71:1836-1841, 1983. Указанные способы позволяют получить препарат фактора VII без определяемых количеств других факторов свертывания крови. Кроме того, препарат очищенного фактора VII может быть получен путем включения дополнительной гель-фильтрации в качестве конечной стадии очистки. Затем фактор VII превращают в активированный фактор VIIa известными способами, например, с помощью нескольких различных белков плазмы, таких как фактор XIIa, IX или Xa. В качестве альтернативы, как описано в публикации Bjoern et al. (Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565), фактор VII может быть активирован путем пропускания его через ионообменную хроматографическую колонку, такую как Mono Q^® (Pharmacia fine Chemicals) или тому подобное.

Родственные фактору VII полипептиды можно получить путем модификации фактора VII дикого типа или рекомбинантной технологией. Родственные фактору VII полипептиды с измененной аминокислотной последовательностью по отношению к последовательности фактора VII дикого типа могут быть получены путем модификации последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор VII дикого типа, либо путем изменения кодонов, детерминирующих аминокислоты, или удаления некоторых из кодонов для аминокислот в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей природный фактор VII, известными способами, например, сайт-специфическим мутагенезом.

Специалистам в данной области будет очевидно, что замещения можно сделать вне участков, важных для функции фактора VIIa или молекулы фактора XI, и указанные замещения приведут к образованию активного полипептида. Аминокислотные остатки, существенные для активности фактора VII или родственного фактору VII полипептида или фактора XI или родственного фактору XI полипептида и поэтому, предпочтительно, не подвергаемые замещению, могут быть идентифицированы согласно процедурам, известным в данной области, таким как сайт - направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (смотри, например, публикацию Cunningham and Wells, 1989, Science 244:1081-1085). В последнем способе мутации вносят у каждого положительно заряженного остатка в молекуле, и полученные мутантные молекулы исследуют в отношении свертывающей, соответственно поперечно-связывающей активности, чтобы идентифицировать аминокислотные остатки, существенные для активности молекулы. Участки фермент-субстратного взаимодействия также можно определить путем анализа трехмерной структуры такими способами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография или фотоаффинное мечение (смотри, например, публикации de Vos et al., 1992, Science 255:306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224:899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309:59-64).

Введение мутации в последовательность нуклеиновой кислоты с целью обмена одного нуклеотида на другой нуклеотид может быть осуществлено посредством сайт-направленного мутагенеза с помощью любого из известных в данной области способов. Наиболее применяемым является способ, в котором используют суперспиральный, двухцепочечный ДНК вектор с вставленными представляющими интерес праймерами и двумя синтетическими праймерами, включающими желаемую мутацию. Олигонуклеотидные праймеры, каждый из которых комплементарен противоположным цепям вектора, удлиняются в течение прохождения температурного цикла с помощью Pfu ДНК-полимеразы. При введении праймеров образуется мутированная плазмида, включающая в себя лишающие устойчивости одноцепочечные разрывы. После прохождения температурного цикла продукт обрабатывают посредством фермента DpnI, который является специфичным для метилированной и полу-метилированной ДНК, чтобы переварить материнскую форму ДНК и выбрать синтезированную ДНК, включающую в себя мутации. Другие способы, известные в данной области для создания, идентификации и выделения вариантов, могут быть использованы, такие как, например, способы перестановки генов или воспроизведения фага.

Отделение полипептидов от клетки, в которой они синтезированы, может быть достигнуто любым способом, известным в данной области, включая, без ограничения, отделение среды культуры клеток, содержащей желаемый продукт, от прикрепленной культуры клеток; центрифугирование или фильтрацию для удаления неприкрепленных клеток и тому подобное.

Возможно, фактор VII или родственные фактору VII полипептиды могут быть в дальнейшем очищены. Очистку осуществляют любым, известным в данной области способом, включая, без ограничения, аффинную хроматографию, такую как, например, колоночная хроматография с антителом против фактора VII (смотри, например, публикации Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986 и Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988); гидрофобную хроматографию; ионообменную хроматографию; гель-хроматографию; электрофоретические процедуры (например, препаративное электрофокусирование (IEF)), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония) или экстракцию и тому подобное. Смотри, в целом, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; и Protein Purification, J.C.Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989. После очистки препарат предпочтительно содержит менее 10 мас.%, более предпочтительно менее 5% и наиболее предпочтительно менее 1% продуктов, отличных от фактора VII или родственных фактору VII полипептидов, произведенных из клетки хозяина.

Фактор VII или родственные фактору VII полипептиды могут быть активированы посредством протеолитического расщепления, используя фактор XIIa или другие протеазы, имеющие трипсиноподобную специфичность, такие как, например, фактор IXa, калликреин, фактор Xa и тромбин. Смотри, например, публикации Osterud et al., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, патент США No. 4456591 и Hender et al., J. Clin. Invest. 71:1836 (1983). В качестве альтернативы, фактор VII или родственные фактору VII полипептиды могут быть активированы путем пропускания их через ионообменную хроматографическую колонку, такую как Mono Q^® (Pharmacia) или тому подобное. Таким образом, активированный фактор VII или родственные фактору VII полипептиды могут быть получены и введены, как описано ниже.

Для использования в настоящем изобретении фактор XI может быть получен из плазмы согласно известным способам, таким, которые описаны в публикациях Koide et al. (Biochemistry 16:2279-2286, 1977) и Bouma et al. (J. Biol. Chem. 252:6432-6437, 1977), включенных в данный текст в виде ссылки. Предпочтительно, однако, использовать рекомбинантный фактор XI с тем, чтобы избежать использования произведенных из крови и ткани продуктов, которые несут в себе риск передачи заболевания. Способы получения рекомбинантного фактора XI известны в данной области. Смотри, например, публикации Kemball-Cook et al. (Gene 139 (2):275-279, 1994), Fujikawa et al. (Biochemistry 25:2417-2424, 1986), Meijers et al. (Blood 79 (6):1435-1440, 1992), которые включены в данный текст в виде ссылки во всей полноте.

Родственные фактору XI полипептиды могут быть получены посредством модификации фактора XI дикого типа или рекомбинантной технологии. Родственные фактору XI полипептиды, аминокислотная последовательность которых изменена относительно аминокислотной последовательности фактора XI дикого типа, могут быть получены путем модификации последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор XI дикого типа, либо путем изменения кодонов, детерминирующих аминокислоты, либо путем удаления некоторых из кодонов для аминокислот в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей природный фактор XI, известными способами, например, сайт-специфическим мутагенезом, как описано более подробно выше. Отделение полипептидов от клетки, в которой они синтезируются, может быть достигнуто любым способом, известным в данной области, включая, без ограничения, отделение среды культуры клеток, содержащей желаемый продукт, от прикрепленной культуры клеток; центрифугирование или фильтрацию для удаления неприкрепленных клеток и тому подобное. Возможно, фактор XI или полипептиды, родственные фактору XI, могут быть в дальнейшем очищены. Очистку осуществляют любым, известным в данной области способом, включая, без ограничения, аффинную хроматографию, такую как, например, колоночная хроматография с антителом против фактора XI; гидрофобную хроматографию; ионообменную хроматографию; гель-хроматографию; электрофоретические процедуры (например, препаративное изоэлектрофокусирование (IEF)), дифференциальную растворимость (например, осаждение сульфатом аммония) или экстракцию и тому подобное, как описано более подробно выше. После очистки препарат предпочтительно содержит менее 10 мас.%, более предпочтительно менее 5% и наиболее предпочтительно менее 1% продуктов, отличных от фактора XI или родственных фактору XI полипептидов, произведенных из клетки хозяина. Активированный фактор XI или родственный фактору XI полипептид затем может быть получен и введен, как описано ниже.

Как будет оценено специалистами в данной области, предпочтительно использовать белковые фактор XI и фактор VIIa, сингенные с субъектом, чтобы снизить риск возникновения иммунного ответа. Получение и характеристика фактора XI, отличного от человеческого, описаны, например, в публикации Gailani (Blood 90 (3):1055-1064, 1997). Настоящее изобретение также охватывает применение таких белков, как фактор XI и фактор VIIa в ветеринарии.

Фармацевтические композиции и способы их применения

Препараты согласно настоящему изобретению могут быть использованы для лечения какого-либо синдрома, связанного с фактором VII, такого как, например, нарушения, сопровождающиеся кровотечением, включая, без ограничения, синдромы, вызванные снижением уровня факторов свертывания крови VII, IX, XI или VII, ингибиторов факторов свертывания крови, нарушением функции тромбоцитов (например, тромбастения Гланцмана и синдром Bernard-Soulier), тромбоцитопению, болезнь Виллебранда и коагулопатию, такую, которая вызвана разбавлением белков свертывающей системы, повышенным фибринолизом и пониженным количеством тромбоцитов вследствие кровотечений и/или переливаний крови (например, у субъектов, претерпевших многократные переливания крови после операции или травмы). Фармацевтические композиции, содержащие препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат фактора XI или родственного фактору XI полипептида согласно настоящему изобретению, предназначены, главным образом, для парентерального введения с целью профилактического и/или терапевтического лечения. Предпочтительно, фармацевтические композиции вводят парентерально, т.е., внутривенно, подкожно или внутримышечно; внутривенное введение является наиболее предпочтительным. Композиции также можно вводить с помощью непрерывной или прерывистой инфузии.

Фармацевтические композиции или препараты согласно изобретению содержат фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид, либо приготовленные в виде разовой дозированной формы или в виде набора компонентов, предпочтительно растворенные в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно в водном носителе или разбавителе. Кратко, фармацевтические композиции, пригодные для использования согласно настоящему изобретению, получают смешиванием фактора VIIa, или фактора XI, или фактора VIIa в комбинации с фактором XI, предпочтительно в очищенном виде, с подходящими адъювантами и подходящим носителем или разбавителем. Ряд водных носителей может быть использован, такой как вода, забуференная вода, 0,4% солевой раствор, 0,3% глицин и тому подобное. Препараты согласно изобретению также могут быть составлены с использованием неводных носителей, таких как, например, в виде геля или в качестве липосомных препаратов для доставки к участкам повреждения или таргетирования указанных участков. Липосомные препараты описаны, в основном, в патентах США Nos. 4837028, 4501728 и 4975282. Композиции могут быть стерилизованы подходящими, хорошо известными способами стерилизации. Полученные водные растворы могут быть упакованы для использования или отфильтрованы в асептических условиях и лиофилизированы, лиофилизированный препарат объединяют со стерильным водным раствором до введения.

Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества или адъюванты, включая, без ограничения, реагенты, регулирующие рН, и буферные реагенты и/или регулирующие тонус реагенты, такие как, например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и т.д.

Композиции могут также включать в себя один или более разбавителей, эмульгаторов, консервантов, буферов, наполнителей и т.д. и могут быть получены в виде жидкостей, порошков, эмульсий контролируемого высвобождения и т.д. Специалист в данной области может составить композиции согласно изобретению соответствующим образом и в соответствии с принятой практикой, как описано в публикации Remington^′s Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990. Таким образом, обычная фармацевтическая композиция для внутривенной инфузии должна быть составлена таким образом, чтобы она содержала 250 мл стерильного раствора Рингера и 10 мг препарата.

Композиции, содержащие препараты согласно настоящему изобретению, могут быть введены для профилактического и/или терапевтического лечения. В терапевтических целях, композиции вводят субъекту, который уже страдает от заболевания, как описано выше, в количестве, достаточном для лечения, облегчения или частичной остановки клинических проявлений заболевания и его осложнений. Количество, достаточное для достижения таких результатов, определяют как «терапевтически эффективное количество». Эффективные количества для достижения каждой цели будут зависеть от тяжести заболевания или повреждения, а также веса и общего состояния субъекта. Следует понимать, что определение соответствующей дозировки может быть осуществлено с помощью стандартного экспериментирования, создания матрицы величин и проверки разных точек в матрице.

Локальная доставка препаратов согласно настоящему изобретению, такая как, например, местное нанесение, может быть выполнена, например, посредством разбрызгивания, перфузии, двойных катетеров-баллонов или другими, хорошо отработанными способами. В любом случае фармацевтическая композиция должна содержать количество препарата, достаточное для эффективного лечения состояния.

Концентрация фактора VII или родственного фактору VII полипептида, фактора XI или родственного фактору XI полипептида, или фактора VII или родственного фактору VII полипептида в комбинации с фактором XI или родственным фактору XI полипептидом в данных композициях может значительно изменяться, т.е., от концентрации, составляющей приблизительно менее 0,5% мас., или, по крайней мере, приблизительно 1% мас., до концентрации, составляющей 15 или 20% мас., и будет выбрана, главным образом, исходя из объема жидкости, вязкости и т.д. в соответствии с отдельным, выбранным способом введения. Введение посредством инъекции или инфузии, в частности инъекции, является предпочтительным. Таким образом, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид получают в виде, подходящем для внутривенного введения, таком как препарат, который представляет собой либо растворенный лиофилизированный порошок или жидкую композицию, содержащую как фактор VII или родственный фактору VII полипептид, так и фактор XI или родственный фактору XI полипептид в одной дозированной форме, либо растворенный лиофилизированный порошок или жидкую композицию, содержащую фактор VII или родственный фактору VII полипептид в одной дозированной форме и растворенный лиофилизированный порошок или жидкую композицию, содержащую фактор XI или родственный фактору XI полипептид в другой дозированной форме.

Понятно, что количество фактора VII или родственного фактору VII полипептида и количество фактора XI или родственного фактору XI полипептида вместе представляют собой суммарное эффективное количество для лечения кровотечений.

Следует иметь в виду, что материалы настоящего изобретения могут, в основном, быть применены в случаях серьезного заболевания или повреждения, то есть, угрожающих жизни или, возможно, угрожающих жизни случаях. В таких случаях, ввиду сокращения до минимума посторонних веществ и общего отсутствия иммуногенности фактора VIIa и фактора XI у человека, желательно ввести субъекту существенный избыток указанных композиций лечащим врачом.

В целях профилактики, композиции, содержащие препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат фактора XI или родственного фактору XI полипептида, вводят субъекту, восприимчивому к заболеванию или повреждению или в других случаях при риске заболевания или повреждения, чтобы повысить собственную способность субъекта к свертыванию крови. Такое количество определяют как "профилактически эффективная доза". Понятно, что количество фактора VII или родственного фактору VII полипептида и количество фактора XI или родственного фактору XI полипептида вместе представляет собой суммарное эффективное количество для предотвращения кровотечений.

Однократные или многократные введения композиций могут быть выполнены при таких уровнях доз и режимах, которые выбраны лечащим врачом. Композиции могут быть введены один или более раз в день или неделю. Эффективным количеством такой фармацевтической композиции является количество, которое способствует клинически значительному действию против кровотечений. Такие количества будут зависеть, отчасти, от отдельного состояния, которое необходимо лечить, возраста, веса и общего здоровья субъекта и других факторов, очевидных специалистам в данной области.

Композицию согласно изобретению обычно вводят в виде однократной дозы до возможного кровотечения или в начале кровотечения. Однако композицию можно вводить повторно (в виде многократных доз), предпочтительно с интервалами 2-4-6-12 часов в зависимости от данной дозы и состояния субъекта.

С целью лечения, связанного с предупредительным вмешательством, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид обычно вводят в течение приблизительно 24 часов до осуществления вмешательства и до 7 дней или более после него. Введение препарата в качестве коагулянта может быть выполнено с помощью ряда способов, приведенных в данном тексте.

Композиция может быть представлена в виде однократного препарата (однократная лекарственная форма), содержащего оба препарата, а именно препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарат фактора XI или родственного фактору XI полипептида в подходящих концентрациях. Композиция также может быть представлена в виде набора компонентов, состоящего из первой разовой дозированной формы, содержащей препарат фактора VII или родственного фактору VII полипептида, и второй разовой дозированной формы, содержащей препарат фактора XI или родственного фактору XI полипептида. В данном случае, фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид должны вводиться один за другим, предпочтительно в пределах приблизительно 15 минут друг от друга, например, в пределах 10 минут друг от друга или, предпочтительно, в пределах 5 минут или, более предпочтительно, в пределах 2 минут друг от друга. Любая из двух стандартных лекарственных форм может быть введена первой.

Набор включает в себя, по крайней мере, две отдельные фармацевтические композиции. Набор включает в себя емкости для содержания отдельных композиций, такие как разделенный флакон или разделенный пакет из фольги. Обычно набор включает в себя инструкции относительно введения отдельных компонентов. Применение набора является особенно благоприятным в случаях, когда отдельные компоненты предпочтительно вводят в различных дозированных формах, вводят при различных интервалах между дозами лекарственного средства, или когда титрование индивидуальных компонентов комбинации предписано врачом.

Количество фактора VII или родственного фактору VII полипептида и количество фактора XI или родственного фактору XI полипептида, вводимое согласно настоящему изобретению, может изменяться от отношения приблизительно 1:100 до 100:1 (мас./мас.). Таким образом, отношение фактора VII к фактору XI может быть, например, приблизительно 1:100, или 1:90, или 1:80, или 1:70, или 1:60, или 1:50, или 1:40, или 1:30, или 1:20, или 1:10, или 1:5, или 1:2, или 1:1, или 2:1, или 5:1, или 10:1, или 20:1, или 30:1, или 40:1, или 50:1, или 60:1, или 70:1, или 80:1, или 90:1, или 100:1, или приблизительно от 1:90 до 1:1, или приблизительно от 1:80 до 1:2, или приблизительно от 1:70 до 1:5, или приблизительно от от 1:60 до 1:10, или приблизительно от 1:50 до 1:25, или приблизительно от 1:40 до 1:30, или приблизительно от 90:1 до 1:1, или приблизительно от 80:1 до 2:1, или приблизительно от 70:1 до 5:1, или приблизительно от 60:1 до 10:1 или приблизительно 50:1 до 25:1, или приблизительно от 40:1 до 30:1.

Доза фактора VII или родственного фактору VII полипептида колеблется от дозы, которая соответствует приблизительно 0,05 мг, до дозы, соответствующей 500 мг/сутки фактора VII дикого типа, например, приблизительно от 1 мг до 200 мг/сутки, или, например, приблизительно от 5 мг до 175 мг/сутки для субъекта весом 70 кг, причем доза может быть нагрузочной и поддерживающей дозой и зависеть от веса субъекта, состояния и серьезности заболевания.

Доза фактора XI или родственного фактору XI полипептида колеблется от дозы, которая соответствует приблизительно 0,05 мг, до дозы, соответствующей 500 мг/сутки фактора XI дикого типа, например, приблизительно от 1 мг до 200 мг/сутки, или, например, приблизительно от 5 мг до 175 мг/сутки для субъекта весом 70 кг, причем доза может быть нагрузочной и поддерживающей дозой и зависеть от веса субъекта, состояния и серьезности заболевания.

Комбинация фактора VIIa и фактора XI проявляет синергическое действие, когда исследования проводят in vitro с помощью анализа плотности сгустка и времени фибринолиза. Кроме того, комбинация фактора VIIa и фактора XI проявляет синергическое действие при образовании стабильных фибриновых сгустков, увеличении полупериода фибринолиза, увеличении прочности сгустка и повышении устойчивости к фибринолизу.

Композиция может быть представлена в виде однократного препарата, содержащего как фактор VIIa, так и фактор XI в подходящих концентрациях. Композиция может быть представлена в виде набора, состоящего из первой разовой дозированной формы, содержащей фактор VIIa, и второй разовой дозированной формы, содержащей фактор XI, и, возможно, одной или более стандартных лекарственных форм, содержащих фактор VIII и/или ингибитор TFPI. В данном случае, фактор VIIa и фактор XI должны вводиться последовательно, предпочтительно в пределах от 1 до 2 часов друг от друга, например, в пределах 30 минут друг от друга, или, предпочтительно, в пределах 10 минут, или, более предпочтительно, в пределах 5 минут друг от друга. Любая из двух стандартных лекарственных форм может быть введена первой.

Поскольку настоящее изобретение относится к предупреждению или лечению кровотечений или к лечению нарушений свертывающей системы крови путем обработки комбинацией активных ингредиентов, которые можно вводить раздельно, изобретение также относится к объединению отдельных фармацевтических композиций в виде набора. Набор включает в себя, по крайней мере, две отдельные фармацевтические композиции. Набор включает в себя емкости для содержания отдельных композиций, такие как разделенный флакон или разделенный пакет из фольги. Обычно набор включает в себя инструкции относительно введения отдельных компонентов. Применение набора является особенно благоприятным в случаях, когда отдельные компоненты предпочтительно вводят в различных дозированных формах, вводят при различных интервалах между дозами лекарственного средства, или когда титрование индивидуальных компонентов комбинации предписано врачом.

Анализы

Исследование активности фактора VIIa

Подходящий анализ для проверки активности фактора VIIa и, тем самым, выбора подходящих вариантов фактора VIIa можно провести в виде простого предварительного испытания in vitro:

Анализ посредством гидролиза in vitro

Нативный (дикий тип) фактор VIIa и вариант фактора VIIa (оба названы в тексте как "фактор VIIa") могут быть исследованы в отношении их удельной активности. Они могут быть исследованы параллельно для удобства сравнения их удельных активностей. Анализ проводят в титрационном микропланшете (MaxiSorp, Nunc, Denmark). Хромогенный субстрат D-Ile-Arg-p-нитроанилид (S-2288, Chromogenix, Sweden), конечная концентрация 1 мМ, добавляют к фактору VIIa (конечная концентрация 100 нМ) в 50 мМ буфере Hepes, рН 7,4, содержащем 0,1 М NaCl, 5 мМ CaCl₂ и 1мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Абсорбцию измеряют при 405 нм постоянно в SpectraMax^TM 340 аппарате для прочтения планшетов (Molecular Devices, USA). Величину абсорбции, развивающейся в течение 20-минутной инкубации, после вычитания абсорбции в контрольной лунке, не содержащей фермента, используют для расчета отношения между активностями варианта фактора VIIa и фактора VIIa дикого типа:

Отношение = (А_{405 нм} варианта фактора VIIa)/(А_{405 нм} фактора VIIa дикого типа)

На основании результатов данного расчета могут быть идентифицированы варианты фактора VIIa с активностью, сравнимой с активностью нативного фактора VIIa или выше указанной активности, такие как, например, варианты, где отношение между активностью варианта и активностью нативного фактора VII (FVII дикого типа) составляет примерно выше 1,0.

Активность фактора VIIa или вариантов фактора VIIa можно измерить с помощью физиологического субстрата, такого как фактор Х, соответствующим образом при концентрации 100-1000 нМ, где образованный фактор Ха измеряют после добавления соответствующего хромогенного субстрата (например, S-2765). Кроме того, анализ активности можно выполнять при физиологической температуре.

Анализ посредством протеолиза in vitro

Нативный (дикий тип) фактор VIIa и вариант фактора VIIa (оба названы в тексте как "фактор VIIa") исследуют параллельно для удобства сравнения их удельных активностей. Анализ проводят в титрационном микропланшете (MaxiSorp, Nunc, Denmark). Фактор VIIa (10 нМ) и фактор Х (0,8 мкМ) в 100 микролитрах 50 мМ буфера Hepes, рН 7,4, содержащего 0,1 М NaCl, 5 мМ CaCl₂ и 1мг/мл бычьего сывороточного альбумина, инкубируют в течение 15 минут. Затем останавливают реакцию расщепления фактора Х путем добавления 50 микролитров 50 мМ буфера Hepes, рН 7,4, содержащего 0,1 М NaCl, 20 мМ ЭДТА_{и 1мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Количество образованного фактора Ха измеряют путем добавления хромогенного субстрата Z-D-Arg-Gly-Arg-p-нитроанилида (S-2765, Chromogenix, Sweden), конечная концентрация 0,5 мМ. Абсорбцию измеряют при 405 нм постоянно в SpectraMax^TM 340 аппарате для прочтения планшетов (Molecular Devices, USA). Величину абсорбции, развивающейся в течение 10 минут, после вычитания абсорбции в контрольной лунке, не содержащей FVIIa, используют для расчета отношения между протеолитическими активностями варианта фактора VIIa и фактора VIIa дикого типа:}

Отношение = (А_{405 нм} варианта фактора VIIa)/(А_{405 нм} фактора VIIa дикого типа)

На основании результатов данного расчета могут быть идентифицированы варианты фактора VIIa с активностью, сравнимой с активностью нативного фактора VIIa или выше указанной активности, такие как, например, варианты, где отношение между активностью варианта и активностью нативного фактора VII (FVII дикого типа) составляет примерно выше 1,0.

Анализ образования тромбина

Способность фактора VII или родственных фактору VII полипептидов или фактора XI или родственных фактору XI полипептидов (например, вариантов) образовывать тромбин можно измерить с помощью анализа, который осуществляют с применением всех значимых факторов и ингибиторов свертывающей системы крови при физиологических концентрациях и активированных тромбоцитов (как описано в публикации p. 543 in Monroe et al. (1997) Brit. J. Haemotol. 99, 542-547, которая включена в данный текст в виде ссылки).

Проверка активности фактора XI

Подходящий анализ для проверки амидолитической активности фактора XI и, тем самым, выбора соответствующих вариантов фактора XI может быть проведен в виде простого испытания in vitro с помощью хромогенного субстрата, как описано, например, в публикации Gailani et al. (Blood 97 (10):3117-3122, 2001)("хромогенный анализ FXI").

Биологическую активность фактора XI можно определить с помощью простого испытания in vitro путем измерения активации фактора IX до фактора IXa, как описано, например, в публикации Gailani et al. (Blood 97 (10):3117-3122, 2001).

Проверка активности фактора VIII

Подходящие анализы для проверки активности фактора VIII и, тем самым, создания возможностей выбора соответствующих вариантов фактора VIII для применения в настоящем изобретении могут быть проведены в виде простых проверок in vitro, как описано, например, в публикациях Kirkwood TBL, Rizza CR, Snape TJ, Rhymes IL, Austen DEG. Identification of sources of interlaboratory variation in factor VIII assay. B. J. Haemotol. 1981; 37; 559-68 или Kessels eta l., British Journal of Haemotology, Vol. 76 (Suppl. 1) pp. 16 (1990)). Активность фактора VIII также можно измерить с помощью двухступенчатого хромогенного анализа, основанного на амидолитической активности образованного FXa (Wagenvoord et al., 1989, Haemostasis, 19 (4):196-204).

Биологическую активность фактора VIII также можно оценить количественно путем измерения способности препарата корректировать время свертывания плазмы с недостаточностью фактора VIII, например, как описано в публикации Nilsson et al., 1959. (Nilsson IM, Blombaeck M, Thilen A, von Francken I., Carriers of haemophilia A - A laboratory study, Acta Med. Scan. 1959; 165:357). В данном анализе биологическую активность выражали в виде единиц/мл плазмы (1 единица соответствует количеству FVIII, присутствующего в нормальной объединенной плазме).

Аспекты изобретения:

Аспект 1: Фармацевтическая композиция, содержащая фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид.

Вариант 2: композиция, как в аспекте 1, где указанным фактором VII или родственным фактору VII полипептидом является родственный фактору VII полипептид.

Вариант 3: Композиция, как в аспекте 1, где фактором VIIa является фактор VIIa человека.

Вариант 4: Композиция, как в аспекте 1 или аспекте 3, где фактор VIIa и фактор XI представляет собой рекомбинантный фактор VIIa человека и рекомбинантный фактор XI человека, соответственно.

Вариант 5: Композиция, как в любом одном из аспектов 1-4, где фактором XI является фактор XI тромбоцитов.

Вариант 6: Композиция, как в любом одном из аспектов 1-5, где фактором XI является активированный фактор XI.

Вариант 7: Композиция, как в любом одном из аспектов 1-6, где композиция также содержит TFPI ингибитор.

Вариант 8: Композиция, как в любом одном из аспектов 1-7, где композиция также содержит фактор VIII.

Аспект 2: Набор, предназначенный для лечения кровотечений, содержащий

a) эффективное количество фактора VIIa и фармацевтически приемлемый носитель в первой разовой дозированной форме;

b) эффективное количество фактора XI и фармацевтически приемлемый носитель во второй разовой дозированной форме;

с) контейнер, вмещающий указанные первую и вторую лекарственные формы.

Вариант 10: Композиция, как в аспекте 2, содержащая

a) эффективное количество фактора VIIa и фармацевтически приемлемый носитель в первой разовой дозированной форме;

b) эффективное количество фактора XI и фармацевтически приемлемый носитель во второй разовой дозированной форме;

с) эффективное количество TFPI ингибитора и фармацевтически приемлемый носитель в третьей разовой дозированной форме; и

d) контейнер, вмещающий указанные первую, вторую и третью лекарственные формы.

Аспект 3: Набор, предназначенный для лечения кровотечений, содержащий

a) эффективное количество фактора VIIa и TFPI ингибитора и фармацевтически приемлемый носитель в первой разовой дозированной форме;

b) эффективное количество фактора XI и фармацевтически приемлемый носитель во второй разовой дозированной форме; и

с) контейнер, вмещающий указанные первую и вторую лекарственные формы.

Аспект 4: Набор, предназначенный для лечения кровотечений, содержащий

a) эффективное количество фактора VIIa и фармацевтически приемлемый носитель в первой разовой дозированной форме;

b) эффективное количество фактора XI и TFPI ингибитора и фармацевтически приемлемый носитель во второй разовой дозированной форме; и

с) контейнер, вмещающий указанные первую и вторую лекарственные формы.

Вариант 9: Набор, как в любом одном из вариантов 2-4, также содержащий фактор VIII, либо приготовленный в отдельной разовой дозированной форме, или находящийся в разовой дозированной форме, также содержащей одно или более соединений, выбранных из перечня фактора VIIa, фактора XI или ингибитора TFPI.

Аспект 6: Применение фактора VIIa в комбинации с фактором XI для производства лекарственного средства с целью лечения кровотечений у субъекта.

Аспект 7: Применение фактора VIIa в комбинации с фактором XI для производства лекарственного средства с целью уменьшения времени свертывания у субъекта.

Аспект 8: Применение фактора VIIa в комбинации с фактором XI для производства лекарственного средства с целью увеличения времени фибринолиза в плазме млекопитающего в норме.

Аспект 9: Применение фактора VIIa в комбинации с фактором XI для производства лекарственного средства с целью повышения стабильности сгустка в плазме млекопитающего в норме.

Аспект 10: Применение фактора VIIa в комбинации с фактором XI для производства лекарственного средства с целью повышения образования фибринового сгустка в плазме млекопитающего в норме.

Аспект 11: Способ повышения образования фибринового сгустка у субъекта, способ включает в себя введение субъекту эффективного количества фактора VIIa в комбинации с эффективным количеством фактора XI.

Аспект 12: Способ лечения кровотечений у субъектов, включающий в себя введение субъекту эффективного количества фактора VIIa в комбинации с эффективным количеством фактора XI.

Вариант 10: Способ, как в аспекте 19 или 20, где фактор VIIa и фактор XI вводят в одной лекарственной форме.

Вариант 11: Способ, как в аспекте 19 или 20, где фактор VIIa и фактор XI вводят последовательно.

Настоящее изобретение также иллюстрируют следующими примерами, которые, однако, не рассматриваются как ограничивающие объем защиты. Характерные особенности, представленные в вышеприведенном описании и в следующих примерах, могут как отдельно, так и в любой их комбинации могут быть привлечены для осуществления изобретения в его многообразных формах.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Улучшение стабильности гемостатического сгустка посредством комбинирования факторов свертывания крови VIIa и XI

МЕТОДЫ:

Анализ растворения сгустка: Нормальную плазму человека, разбавленную в 10 раз буфером (20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl₂, pH 7,4), содержащим инновин (Dade Behring, 2000-кратное разведение), rFVIIa (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark; различные концентрации) и t-PA (American Diagnostics, 8 нМ), добавляли к 96-луночным планшетам ELISA и измеряли мутность при 650 нм в течение времени при комнатной температуре. Где указано, добавляли очищенный фактор FXI человека (Haemotological Tachnologies, различные концентрации).

Ротационная тромбоэластография (roTEG): Измерения проводили с использованием цитратной, нормальной плазмы человека с добавленным 5 нМ t-PA, и действие добавления 1 нМ фактора FVIIa только или в комбинации с 30 нМ фактора FXI (Haemotological Tachnologies) анализировали. Свертывание инициировали путем добавления инновина (конечная концентрация 2000-кратное разведение, Dade Behring # 526945) и кальция (конечная концентрация 15 мМ) в 20 мМ буфере HEPES, 150 мМ NaCl, pH 7,4.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

Анализ растворения сгустка: Добавление фактора FVIIa приводило к дозозависимому увеличению времени растворения сгустка (Фиг.1). Данное действие было оптимальным при 10 нМ FVIIa. В присутствии 10 нМ FVIIa добавление фактора FXI приводило к дальнейшему увеличению времени растворения сгустка (Фиг.2). Действие было дозозависимым и оптимальным при 30 нМ FXI.

Тромбоэластография: roTEG измерения были применены для исследования влияния FVIIa и FXI на максимальную плотность сгустка (MCF), а также на устойчивость сгустков к растворению, опосредованному t-PA. До добавления FVIIa/FXI максимальная плотность сгустка (MCF) составляла 25 мм, и полупериод растворения сгустка был 12,3 минуты (Фиг.3). Добавление FXI (30 нМ) не изменило MCF, но увеличило полупериод растворения сгустка до 16, 1 минуты (Фиг.3). Аналогично, добавление FVIIa (1 нМ) приводило к защите сгустка от фибринолиза, опосредованного t-PA (полупериод растворения сгустка 16,7 мин), без какого-либо влияния на MCF (Фиг.3). Однако добавление FVIIa (1 нМ) вместе с FXI (30 нМ) увеличивает MCF (29 мм), а также полупериод растворения сгустка (24, 2 мин., Фиг.3).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты показывают, что добавление FVIIa и FXI к плазме улучшает синергическим образом механическую прочность и устойчивость к фибринолизу, опосредованному t-PA.

Пример 2

Сокращение времени свертывания в плазме человека в норме посредством комбинирования факторов свертывания крови VIIa и XI

МЕТОДЫ

Анализ сгустка: Аликвоты (55 мкл) rFVIIa (1мкг/мл) только, FXI (25 нМ) только, или rFVIIa и FXI в 50 мМ буфере Pipes, 100 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 1% БСА, рН 7,2 инкубировали в течение 5 мин с 55 мкл аликвоты, содержащей 100 мкМ PC/PS пузурьков и 50 мМ CaCl₂ в таком же буфере. Затем добавляли 55 мкл аликвоты нормальной плазмы человека (NHP) и за свертыванием наблюдали в течение 400 секунд в ACL аппарате для изучения свертывания, используя АРТТ программу.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ сгустка: До добавления rFVIIa или FXI, NHP не свертывалась в течение времени контролирования, составляющем 400 секунд. После добавления FXI (25 нМ) время свертывания было все еще больше чем 400 с. Добавление FVIIa (1 мкг/мл) снижало время свертывания до 159,4 ± 1,4 секунды (Фиг.4). Добавление как FVIIa (1 мкг/мл), так и FXI (25 нМ) снижало время свертывания до 95,0 ± 1,4 секунды (Фиг.4).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты показывают, что добавление FVIIa и FXI к плазме синергическим образом сокращает время свертывания в NHP.

Группа изобретений относится к композиции, содержащей фактор VII или родственный фактору VII полипептид и фактор XI или родственный фактор XI полипептид, к наборам, содержащим указанные соединения, и к применению композиции для лечения кровотечений. Фармацевтическая композиция содержит эффективное количество фактор VII или родственный фактор VII полипептид и фактор XI или родственный фактору XI полипептид. Изобретение обеспечивает: 1. создание композиций, которые могут эффективно использованы для лечения или профилактики кровотечений и нарушений свертывания крови, предпочтительно пероральных композиций; 2. создание композиций в виде разовой дозированной формы, которая может быть эффективно использована для лечения или профилактики кровотечений или в качестве прокоагулянта; 3. создание композиций, обладающих синергическим действием, создание способов лечения или комплектов, применение которых способствует проявлению синергического эффекта; 4. создание композиций, способов лечения и комплектов, не имеющих существенных побочных эффектов, таких как высокий уровень системной активации системы свертывания крови. 3 н. и 40 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.

1. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида.2. Композиция по п.1, где указанным фактором VII или родственным фактору VII полипептидом является родственный фактору VII полипептид.3. Композиция по п.2, где указанным родственным фактору VII полипептидом является вариант аминокислотной последовательности фактора VII.4. Композиция по п.2 или 3, где отношение между активностью указанного родственного фактору VII полипептида и активностью нативного фактора VIIa человека (FVIIa дикого типа) составляет, по крайней мере, приблизительно 1,25, когда исследования проводят с помощью анализа посредством гидролиза in vitro, как описано в настоящем описании.5. Композиция по п.1, где указанным фактором VII или родственным фактору VII полипептидом является фактор VII.6. Композиция по п.5, где указанным фактором VII является фактор VII человека.7. Композиция по п.6, где указанным фактором VII является рекомбинантный фактор VII человека.8. Композиция по п.1, где указанный фактор VII или родственный фактору VII полипептид находится в активированной форме.9. Композиция по п.8, где указанным фактором VII является рекомбинантный фактор VIIa человека.10. Композиция по п.1, где указанным фактором XI или родственным фактору XI полипептидом является полипептид, родственный фактору XI.11. Композиция по п.10, где указанным родственным фактору XI полипептидом является вариант аминокислотной последовательности фактора XI.12. Композиция по п.10 или 11, где отношение между активностью указанного родственного фактору XI полипептида и активностью нативного фактора XI плазмы человека (FXI дикого типа), составляет, по крайней мере, приблизительно 1,25, когда исследования проводят с помощью FXI-хромогенного анализа, как описано в настоящем описании.13. Композиция по п.1 или 9, где указанным фактором XI или родственным фактору XI полипептидом является полипептид фактора XI.14. Композиция по п.13, где указанным фактором XI является фактор XI человека.15. Композиция по п.14, где указанным фактором XI является рекомбинантный фактор XI плазмы человека.16. Композиция по п.14, где указанным фактором XI является рекомбинантный фактор XI тромбоцитов человека.17. Композиция по п.1, где указанный фактор VII или родственный фактору VII полипептид и указанный фактор XI или родственный фактору XI полипептид присутствуют в отношении по массе приблизительно между 100:1 и 1:100 (мас./мас. фактор VII: фактор XI).18. Композиция по п.1, где композиция также содержит фармацевтически приемлемые наполнители, подходящие для инъекции или инфузии, особенно для инъекции.19. Набор компонентов, предназначенный для лечения кровотечений, содержащий

а) эффективное количество препарата фактора VII или родственного фактору VII полипептида и фармацевтически приемлемый носитель в первой разовой дозированной форме;

в) эффективное количество препарата фактора XI или родственного фактору XI полипептида и фармацевтически приемлемый носитель во второй разовой дозированной форме; и

с) контейнер, вмещающий указанную первую и вторую лекарственные формы.