СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОВАРИАЛЬНОЙ И АДРЕНАЛОВОЙ ГИПЕРАНДРОГЕНИИ У ДЕВОЧЕК ПУБЕРТАТНОГО ВОЗРАСТА Российский патент 2016 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно гинекологии и эндокринологии, и найдет широкое применение для дифференциальной диагностики синдрома гиперандрогении, у девочек-подростков, страдающих нарушениями менструального цикла.

Одной из актуальных проблем гинекологии является синдром гиперандрогении (ГА), который наиболее часто является следствием таких заболеваний, как синдром поликистозных яичников (СПКЯ) и неклассическая форма врожденной гиперплазии коры надпочечников.

Другой проблемой оценки тяжести и разработки программы коррекции ГА является то, что в пубертате умеренная андрогензависимая дермопатия, кратковременная нерегулярность менструаций и эхографическая картина мультифолликулярных яичников являются у некоторых девочек-подростков вариантами физиологической нормы (Уварова Е.В., 2007). Хорошо известен также феномен существования как серьезных нарушений менструального цикла и репродуктивных проблем, так и полное их отсутствие при сходных клинико-биохимических проявлениях ГА (Чагай, Фадеев, 2009).

В диагностике гиперандрогенной патологии доминирует принцип уточнения источника избыточной продукции мужских половых гормонов. Несомненно, этот принцип оправдан при органической гиперандрогении вследствие неопластических и гиперпластических процессов в яичниках или коре надпочечников. Во всех иных случаях, на долю которых приходится до 98% в структуре синдрома ГА, патология обычно имеет комбинированный характер. Поэтому достоверно судить об основном и тем более единственном источнике функциональной гиперандрогении представляется затруднительным. В связи с этим необходима разработка новых критериев для уточнения источника избыточной продукции андрогенов с целью оптимизации подходов к терапии данного синдрома.

Метод диагностики овариальной дисфункции на основании только клинической симптоматики весьма неспецифичен, поскольку нарушения менструального цикла могут встречаться в пубертатном периоде достаточно часто и носить при этом функциональный транзиторный характер, будучи обусловлены несовершенством и незрелостью репродуктивной системы. Подобные нарушения в этом возрасте могут зависеть от длительности становления менархе, эмоционального состояния подростка, степени выраженности умственных и физических нагрузок, воздействия различных негативных факторов внутренней и внешней среды, для которых организм девочки - подростка в данный возрастной период наиболее уязвим.

Также весьма неспецифичен способ диагностики овариальной дисфункции у подростков на основании УЗ-эхографии, так как множественные кисты в яичниках считаются нормальным, физиологическим явлением в пубертате, они регрессируют параллельно с развитием овуляторной функции. Хотя для повышения точности эхографической диагностики СПКЯ выделяют количественные показатели - ЯМИ (в норме 3,5), повышение которого имеет важное значение для уточнения диагноза СПКЯ, однако у подавляющего большинства больных (91%) выявляется уменьшение переднезаднего размера матки при одновременном увеличении размеров и объема яичников (98%). У 90% больных яичниково-маточный индекс составляет более 3,5.

По некоторым данным при синдроме ГА у девочек-подростков показано отсутствие универсальных гормональных маркеров ГА; так выявлено, что до 15% случаев этого заболевания протекает без гиперандрогенемии, и степень повышения андрогенов не коррелирует с выраженностью клинических симптомов (Богданова П.С., Карева М.А, 2010).

Так как по данным современной литературы СПКЯ развивается в организме девочек в результате нарушения физиологического ритма продукции гонадолиберинов, то пытались определять соотношение ЛГ и ФСГ, которое отражает состояние высших регуляторных центров (Trent М.Е., Rich М V, Austin S.B., 2003). В норме ЛГ/ФСГ до менархе всегда меньше 1, более года после менархе колеблется от 1 до 1,5, более 2 лет - от 1,5 до 2 (Коколина В.Ф., 2001). Если для женщин фертильного возраста значение индекса ЛГ/ФСГ более 2 является патогномоничным для СПКЯ, то для подростков ЛГ/ФСГ более 1,5 также является патогномоничным для СПКЯ. В то же время только 20% обследуемых девочек-подростков индекс ЛГ/ФСГ был более 1,5, но менее 2, то есть данные метод диагностики обладает низкой точностью (Безуглова Н.Г, 2005).

Известен также способ диагностики, выбранный в качестве прототипа (Чайка В.К., Матыцина Л.А., Иотенко Б.А. Способ диагностики синдрома поликистозных яичников у девочек-подростков, 1999), предусматривающий определение уровня гормонов в крови у девочек со времени начала менархе, оценку численного значения степени гирсутизма и яичниково-маточного индекса, после чего рассчитывают степень тяжести СПКЯ по формуле

y = 0,02012p1 + 040292Iп(t) + 0,07243р - 1,12114п(tm) - 0,04008b + 0,07146gir + 0,07565ями + 3,74045, где y - степень тяжести заболевания; p1 - уровень пролактина, определяемый в крови иммунофлюоресцентным методом, нг/л; р - уровень прогестерона в сыворотке крови, нмоль/л; t - уровень тестостерона в сыворотке крови, нмоль/л; b - уровень тестостерон-эстрадиол (связывающего глобулина), нмоль/л; gir - степень гирсутизма; ями - яичниково-маточный индекс; tm - толщина матки, мм; при этом, если значение у 0,5, считают девочку здоровой; 0,5<y<1,0 - относят к группе риска по развитию СПКЯ; 1,0<y<2,0 - диагностируют легкую степень течения СПКЯ; 2,0<y<3,0 - средняя степень течения СПКЯ; y>3,0 - тяжелое течение СПКЯ.

Недостатками данного способа являются:

- его трудоемкость,

- арифметическая сложность для поликлинического врача,

- не учитывается высокая вариабельность значений пролактина и прогестерона в зависимости от фазы менструального цикла,

- не оправдана привязка к гирсутному числу, так как тяжесть андрогензависимой дермопатии не коррелирует с выраженностью овариальной дисфункции, а определяется активностью соответствующего рецепторного аппарата. Данные недостатки способа-прототипа снижают его точность и достоверность.

Для подтверждения надпочечникового происхождения андрогенов используют тест с синактеном (синтетическим аналогом АКТГ), который вводится в дозе 1 мкг внутривенно. Повышение уровня 17-ОН, ДГЭА-С через 60 минут и более свидетельствует о функциональной надпочечниковой гиперандрогении. Однако данная проба имеет определенные недостатки, такие как математическая сложность подсчетов и отсутствие единой стандартизации к ее проведению. У 22% больных, имеющих патологию гена CYP21, ответ стероидов на синактен может иметь дозозависимый характер, у них регистрируется значительно больший пиковый уровень 17-ОН на нагрузку. Возможно, недостаток стимуляции малой дозой АКТГ у больных с НК-ВГН объясняется адаптацией ткани гиперплазированного надпочечника к большему стимулу со стороны гипофиза. Авторы заключили, что низкодозированный тест с 1-24-АКТГ вполне точен в диагностике дефицита 21-гидроксилазы. Однако K. Unluhizarci и соавт. (2002) сравнили стандартный и низкодозированный тест с 1-24-АКТГ (1 мкг) в диагностике неклассической 11β-гидроксилазной недостаточности и показали, что низкодозированный тест с 1-24-АКТГ не может заменить стандартный тест во всех клинических ситуациях. Пациенткам с преимущественным повышением уровня 17-ОН (в сравнении с уровнем кортизола) требуется молекулярно- генетическое исследование с целью диагностики НК-ВГН. Молекулярно-генетическое исследование крови для выяснения наиболее частых мутаций в гене CYP21OHB является дорогостоящим и весьма трудоемким методом. При этом с помощью данного метода определяется всего 10 наиболее часто встречающихся мутаций гена, хотя существует их более 150.

Задача изобретения: разработка доступного, точного, достоверного способа дифференциальной диагностики гиперандрогении у девочек-подростков.

Поставленная задача достигается тем, что у девочек-подростков с клинической и биохимической гиперандрогенией в сочетании с нарушениями менструального цикла проводят определение андростендиона (Ан) и дегидроэпиандростерона (ДГЭА), рассчитывают индекс их соотношения и на основании полученного результата диагностируют овариальную или адреналовую гиперандрогению: при индексе андростендион/дегидроэпиандростерон равном или более 1, диагностируют овариальную гиперандрогению, при индексе андростендион/дегидроэпиандростерон равном или менее 0,5 диагностируют адреналовую гиперандрогению.

Технический результат от использования метода: повышение точности, расширение возрастного диапазона обследуемых пациентов, что позволит своевременно провести соответствующие лечебные мероприятия, что в дальнейшем будет способствовать сохранению репродуктивного здоровья будущих женщин.

Сложность и многофакторность патогенеза гиперандрогении связаны с тем, что функция яичников, надпочечников, гипоталамуса и гипофиза тесно переплетены друг с другом, и порой представляется весьма затруднительным выделить какое-либо одно ведущее патогенетическое звено в формировании нарушений менструального цикла (Шилин Д.Е., 2004).

Последние годы внимание исследователей привлекает дегидроэпиандростерон (ДГЭА) и его метаболит дегидроэпиандростерон-сульфат (ДГЭА-С) - андрогены, синтезируемые, преимущественно, корой надпочечников (95%). Из всех стероидов ДГЭА-С циркулирует в крови в наибольших концентрациях и имеет больший период полужизни, чем другие андрогены. ДГЭА обладает более слабым андрогенным действием, однако он является предшественником в системе синтеза половых стероидов и в периферических тканях способен превращаться в сильные андрогены - тестостерон и дигидротестостерон. Одной из причин гиперандрогении является врожденная гиперплазия надпочечников (ВГН), обусловленная генетическими дефектами ферментов, необходимых для нормального стероидогенеза. Развивающееся при этом нарушение синтеза кортизола по принципу отрицательной обратной связи стимулирует секрецию адренокортикотропного гормона (АКТГ), что также служит причиной гиперпродукции андрогенов. Восстановление менструальной функции и фертильности на фоне изолированного приема кортикостероидных препаратов служит прямым доказательством надпочечникового генеза гиперандрогении (Попова С.С., 2005). Однако ряд исследователей считают, что нарушения фолликулогенеза в наибольшей степени обусловлены повышением андрогенов яичникового происхождения, одним из которых является андростендион (Ajossa S. et al., 2004). Большая часть циркулирующего андростендиона вырабатывается в яичниках, а остальная (меньшая) - синтезируется надпочечниками под воздействием адренокортикотропного гормона (H.L. Judd, N. Fournet, 1994). Следует отметить, что результат определения андростендиона в сыворотке крови не всегда коррелирует со степенью выраженности клинических проявлений гиперандрогении. Иными словами, исследование позволяет оценить концентрацию гормона, но не его биоактивность в организме. Поэтому при высоком уровне андростендиона проводят дополнительные лабораторные и инструментальные исследования, чтобы установить доминирующий источник повышенной секреции андрогенов, с целью определения дальнейшей тактики лечения.

Подробное описание способа и примеры его конкретного выполнения.

У пациенток 15-17 лет, с нарушениями менструального цикла, с клиническими признаками гиперандрогении (избыточный рост волос в атипичных местах, угревая сыпь), определяют исходный уровень андростендиона и дегидроэпиандростерона в сыворотке крови на 5 день менструального цикла.

Уровень андростендиона в сыворотке крови пациентов определяют методом иммуноферментного анализа с помощью набора DRG Androstendion ELISA EIA-3265 (Германия). Стандартные растворы, растворы конъюгатов, промывочный буфер готовят согласно инструкции к набору. Закрепляют желаемое количество полосок с подготовленными лунками в держателе и вносят по 20 мкл стандартов, контролей и проб в соответствующие лунки, после чего добавляют 200 мкл иммуноферментного конъюгата в каждую лунку. В течение 10 секунд необходимо тщательно смешать реагенты в панели, добиваясь полного смешивания. Далее, не закрывая панель, инкубируют в течение 60 минут. Затем освобождают лунки от содержимого и четырежды промывают лунки раствором для промывки (по 400 мкл в лунку), тщательно оставляя остатки жидкости на фильтрованной бумаге. В каждую лунку с равными временными интервалами вносят 200 мкл энзим-субстрата и инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Затем добавляют 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку, используя полуавтоматический диспенсер, и измеряют оптическую плотность ячеек при 450 нм ± 10 нм. Измерение оптической плотности микропланшета должно быть выполнено в течение 10 минут после добавления стоп-реагента раствора. Уровень андростендиона выражается в нг/мл (в норме 0,39-2,77 нг/мл).

ДГЭА в сыворотке крови пациентов определяют методом иммуноферментного анализа с помощью набора DRG ELISA DHEA EIA-1562 (Германия). Стандартные растворы, растворы конъюгатов, промывочный буфер готовят согласно инструкции к набору. Закрепляют желаемое количество полосок с подготовленными лунками в держателе и вносят по 25 мкл стандартов, контролей и проб в соответствующие лунки, после чего добавляют 200 мкл иммуноферментного конъюгата в каждую лунку. В течение 10 секунд необходимо тщательно смешать реагенты в панели, добиваясь полного смешивания. Далее, не закрывая панель, инкубируют в течение 60 минут. Затем освобождают лунки от содержимого и трижды промывают лунки раствором для промывки (по 400 мкл в лунку), тщательно оставляя остатки жидкости на фильтрованной бумаге. В каждую лунку вносят 100 мкл субстрата и инкубируют 15 минут при комнатной температуре. Затем добавляют 50 мкл стоп-реагента в каждую лунку, используя полуавтоматический диспенсер, и измеряют оптическую плотность ячеек при 450 нм ± 10 нм. Измерение оптической плотности микропланшета должно быть выполнено в течение 10 минут после добавления стоп-реагента раствора. Уровень ДГЭА выражается в нг/мл (в норме 1-12 нг/мл).

Для дифференциальной диагностики овариальной и адреналовой гиперандрогении нами предложен индекс, вычисляющийся по соотношению Ан к ДГЭА. Индекс Ан/ДГЭА. При индексе равном или более 1 диагностируют овариальную гиперандрогению, при индексе равном или менее 0,5- адреналовую гиперандрогению. В зависимости от выявленных нарушений применялись дифференцированные подходы к лечению: кортикостероиды (метил-преднизолон) в возрастной дозе - при адреналовой гиперандрогении, спиронолактон в возрастной дозе - при овариальной гиперандрогении.

Работоспособность заявляемого способа подтверждаются следующими конкретными примерами.

Пример 1

Пациентка Ольга С-ова, 17 лет, страдает нарушениями менструального цикла по типу аменореи в течение 5 лет, усиленным ростом волос в атипичных местах. Перинатальный анамнез не отягощен. Менструальный цикл с 12 лет, нерегулярно с 14 лет, с задержками до 4-6 месяцев.

Результаты исследования: 17-ОН - 6,1 нг/мл; ДГЭА - 17,9 нг/мл; ДГЭА-С - 5,4 мкг/мл; тестостерон - 10,2 нмоль/л; тестостерон свободный - 17,7 пг/мл, андростендион - 5,8 нг/мл.

Индекс Ан/ДГЭА - 0,32, что свидетельствовало об адреналовой гиперандрогении. Назначено лечение - метилпреднизолон в суточной дозе 0,1 мг/кг веса в течение 1 месяца с последующим контролем уровня гормонов. На фоне лечения метилпреднизолоном происходило снижение уровня надпочечниковых гормонов, включая ДГЭА почти на 50%, при этом уровень андростендиона снижался незначимо - 5,2 нг/мл. Диагноз также был верифицирован молекулярно-генетическим исследованием, обнаружено наличие точечной мутации гена CYP 21, в связи с чем, у пациентки был установлен диагноз неклассической формы врожденной гиперплазии надпочечников.

Результаты исследования (после лечения): 17-ОН - 4,9 нг/мл; ДГЭА - 9,3 нг/мл; ДГЭА-С - 3,4 мкг/мл; тестостерон - 5,2 нмоль/л; тестостерон свободный - 7,4 пг/мл, андростендион 5,2 нг/мл. Индекс Ан/ДГЭА - 0,5, что подтверждало адреналовую гиперандрогению.

Пример 2

Пациентка Наталья Д., 16 лет, страдает нарушениями менструального цикла по типу первичной олигоменореи в течение 3 лет, угревой сыпью, усиленным ростом волос в атипичных местах. Менструальный цикл с 13 лет, нерегулярно с менархе, с задержками до 2-3-х месяцев.

Результаты исследования: 17-ОН - 5,6 нг/мл; ДГЭА - 16,2 нг/мл; ДГЭА-С - 6,1 мкг/мл; тестостерон - 8,4 нмоль/л; тестостерон свободный - 7,7 пг/мл, андростендион 5,7 нг/мл.

Индекс Ан/ДГЭА - 0,35, что свидетельствовало об адреналовой гиперандрогении.

Пациентке было назначено лечение метилпреднизолоном в суточной дозе 0,1 мг/кг веса с последующим контролем уровня гормонов через 1 месяц. На фоне проводимого лечения снизился уровень надпочечниковых гормонов, при этом уровень андростендиона снижался незначимо - 5,0 нг/мл, что подтвердило адреналовую гиперандрогению. Диагноз верифицирован молекулярно-генетическим исследованием, в связи с чем у пациентки был установлен диагноз неклассической формы врожденной гиперплазии надпочечников.

Результаты исследования (после лечения): 17-ОН - 3,1 нг/мл; ДГЭА - 9,1 нг/мл; ДГЭА-С - 4,2 мкг/мл; тестостерон - 5,1 нмоль/л; тестостерон свободный - 4,9 пг/мл, андростендион 5,0 нг/мл.

Индекс Ан/ДГЭА - 0,45, что подтверждало адреналовую гиперандрогению.

Пример 3

Пациентка Светлана Н-ко, 16 лет, страдает нерегулярным менструальным циклом, ростом волос в атипичных местах. Менструальный цикл с 14 лет, с задержками до 2-3-х месяцев с периода менархе. У матери был установлен диагноз - синдром поликистозных яичников.

Результаты исследования: 17-ОН - 0,8 нг/мл; ДГЭА - 8,2 нг/мл; ДГЭА-С - 3,4 мкг/мл; тестостерон - 4,8 нмоль/л; тестостерон свободный - 7,3 пг/мл, андростендион - 9,2 нг/мл.

Индекс Ан/ДГЭА - 1,12, что свидетельствовало о гиперандрогении овариального генеза.

Результаты исследования (после лечения): 17-ОН - 1,1 нг/мл; ДГЭА - 4,8 нг/мл; ДГЭА-С - 3,1 мкг/мл; тестостерон - 3,6 нмоль/л; тестостерон свободный - 4,1 пг/мл, андростендион - 4,9 нг/мл.

Индекс Ан/ДГЭА - 1,02, подтверждал гиперандрогению овариального генеза.

Пациентке назначено лечение спиронолактоном перорально 75 мг в сутки, на фоне которого произошло снижение уровня андростендиона, свободного тестостерона в 2 и более раза от исходного уровня. При дополнительном обследовании пациентки были выявлены УЗ признаки СПКЯ в виде увеличения количества незрелых фолликулов и общего объема яичников, повышение уровня свободного тестостерона и антимюллерова гормона, что подтверждало гиперандрогению овариального генеза и формирование синдрома поликистозных яичников.

Пример 4

Пациентка Татьяна В-ова, 15 лет, страдает нерегулярным менструальным циклом с менархе, жалобами на угревую сыпь в области лица и спины, жирность кожи и волос. Менструальный цикл с 14 лет, кровотечения чередуются с задержками менструаций до 2-4 х месяцев.

Результаты исследования: 17-ОН - 1,1 нг/мл; ДГЭА - 7,3 нг/мл; ДГЭА-С - 4,9 мкг/мл; тестостерон - 5,4 нмоль/л; тестостерон свободный - 8,8 пг/мл, андростендион - 8,9 нг/мл.

Индекс Ан/ДГЭА - 1,23, свидетельствовал о гиперандрогении овариального генеза.

Проведено лечение спиронолактоном перорально в дозе 75 мг в сутки, через 1 месяц на фоне проводимой терапии отмечалось снижение уровня андростендиона, свободного тестостерона в 2 и более раза от исходного уровня. Также были выявлены УЗ признаки СПКЯ в виде увеличения количества незрелых фолликулов и общего объема яичников, повышение уровня тестостерона и антимюллерова гормона, что подтверждало гиперандрогению овариального генеза и формирование синдрома поликистозных яичников.

Результаты исследования (после лечения): 17-ОН - 1,0 нг/мл; ДГЭА - 3,9 нг/мл; ДГЭА-С - 4,4 мкг/мл; тестостерон - 4,1 нмоль/л; тестостерон свободный - 3,9 пг/мл, андростендион - 3,9 нг/мл.

Индекс Ан/ДГЭА - 1,0, подтверждал гиперандрогению овариального генеза.

По заявляемому способу обследовано 60 пациенток в возрасте от 15 до 17 лет с нарушениями менструального цикла и различными клиническими проявлениями синдрома гиперандрогении. Медиана индекса составила 1,2 (квартили 0,20; 2,80).

У 20 пациенток с клиническими признаками ГА и нарушениями менструального цикла коэффициент Ан/ДГЭА был равным или менее 0,5 (n=18), что свидетельствовало о гиперандрогении адреналового генеза (84,6%).

У 30 девочек-подростков с клиническими признаками гиперандрогении и нарушениями менструального цикла индекс Ан/ДГЭА был равным или более 1 (n=28), что свидетельствовало об овариальном генезе гиперандрогении (88,9%).

Таким образом, вычисление коэффициента гиперандрогении у девочек-подростков с нарушениями менструального цикла показало, что он является информативным и объективным критерием для проведения дифференциальной диагностики синдрома гиперандрогении. Точность заявляемого способа достигает 83,3%.

Исходя из вышеизложенного, заявляемый способ дифференциальной диагностики гиперандрогении у девочек-подростков по сравнению с существующими имеет следующие преимущества:

1. Способ позволяет осуществить дифференциальную диагностику овариальной и адреналовой гиперандрогении с целью оптимизации подходов к лечению;

2. Данный способ объективен, точен, не связан с клиническими проявлениями гиперандрогении, такими как гирсутное число и степень дермопатии, не зависит от высокой вариабельности значений в зависимости от эмоционального состояния и фаз менструального цикла, не имеет противопоказаний и позволяет достоверно провести дифференциальную диагностику яичниковой и адреналовой гиперандрогении;

3. Предлагаемый способ прост и удобен в исполнении и найдет широкое применение в гинекологической и эндокринологической практике.

Изобретение относится к медицине, а именно гинекологии и эндокринологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики овариальной и адреналовой гиперандрогении у девочек пубертатного возраста. Для этого в сыворотке крови проводят определение уровня андростендиона и дегидроэпиандростерона, рассчитывают их соотношение, и если это соотношение равно 1,0 и более - диагностируют овариальную гиперандрогению, при соотношении равном 0,5 и менее - диагностируют адреналовую гиперандрогению. Способ позволяет с высокой точностью осуществить дифференциальную диагностику овариальной и адреналовой гиперандрогении при его простоте, удобстве и отсутствии противопоказаний. 4 пр.

Способ дифференциальной диагностики овариальной и адреналовой гиперандрогении у девочек пубертатного возраста путем исследования крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови проводят определение уровня андростендиона и дегидроэпиандростерона, рассчитывают их соотношение, и если это соотношение равно 1,0 и более - диагностируют овариальную гиперандрогению, при соотношении равном 0,5 и менее - диагностируют адреналовую гиперандрогению.