СРЕДСТВО ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КИШЕЧНОГО МИКРОБИОЦЕНОЗА ПРИ ДИСБИОЗАХ Российский патент 2016 года по МПК A61K31/19 A61K9/20 A61P1/00 

Изобретение относится к медицине, более точно к фармакологии и может быть использовано для получения средства, восстанавливающего кишечный микробиоценоз при дисбиозах.

Термин микробиоценоз обозначает нормальную микрофлору кишечника (М.Д. Ардатская. «Микробиоценоз кишечника и его роль в развитии и поддержании заболеваний желудочно-кишечного тракта». Учебно-научный медицинский центр управления делами президента Российской Федерации, Москва, Россия. http://www.mif-ua.com/archive/article/11927). Термин дисбиоз, то же что и дисбактериоз, рассматривается как клинико-лабораторный синдром, возникающий при ряде заболеваний и клинических ситуаций, характеризующийся изменением качественного и/или количественного состава нормальной микрофлоры, метаболическими и иммунными нарушениями, сопровождающимися у части больных клиническими проявлениями («Дисбактериоз, также дисбиоз». Википедия. https://ru.wikipedia.org/wiki/Дисбактериоз). Нормальная микрофлора играет существенную роль в жизнедеятельности организма хозяина: в обмене веществ, синтезе витаминов, детоксикации, формировании естественного иммунитета, создании колонизационной резистентности, противостоящей патогенным микроорганизмам на начальном этапе развития инфекционного процесса. К сожалению, многие факторы и стрессовые ситуации могут вызвать нарушения микробиоценоза кишечника (дисбактериоз или дисбиоз кишечника), приводящие к рассогласованию в работе органов и регуляторных систем организма и увеличению риска развития заболевания.

В арсенале лекарственных средств, направленных на восстановление нормальной микрофлоры (микробиоты), представлены пробиотики на основе живых микробов (бифидобактерии, лактобациллы, кишечная палочка и др.), пребиотики (неперевариваемые вещества, стимулирующие активность определенных микроорганизмов, синбиотики (комбинации пробиотиков и пребиотиков), а также микробные метаболиты (метаболитные пробиотики - метабиотики).

Использование пробиотиков для профилактики и лечения дисбактериоза многократно описано в специальной и патентной литературе РФ. Так, в патенте РФ №2491079 описан комплексный пробиотический препарат, включающий клетки пробиотических лактобактерий или бифидобактерий или их смеси и полимерную добавку, помещенные в кишечнорастворимую капсулу для устранения дисбактериоза. В патенте РФ №2302877 описана биологически активная добавка к пище, которая представляет собой биомассу штамма лактобактерий Lactobacillus rhamnosus ВКПМ В-9072, наращенную в питательной среде, содержащей панкреатический гидролизат казеина, дрожжи хлебопекарские прессованные, глюкозу и воду очищенную в заданном соотношении компонентов. Эта пищевая добавка согласно цитируемому патенту обеспечивает восполнение организма лактобактериями. В патенте РФ №2435423 описано приготовление пробиотика на основе штамма Lactobacillus acidophilus EP 317/402 и солей кальция, которые также восполняют дефицит лактобактерий в организме. С этой же целью в заявке на изобретение №2003129799 описано использование биопрепарата «Бифистим». Бифистим содержит сухую биомассу консорциума бифидобактерий штаммов Bifidobacterium bifidum I, B. bifidum 791-ИН, B. breve 79-88, B. longum Я-3, витаминный комплекс, микрокристаллическую целлюлозу, пектин, гидрофосфат кальция, фруктозу, вкусоароматическую добавку. Известно также использование биопрепарата, который содержит в качестве основы антибиотикоустойчивый антагонистически активный штамм Bacillus subtilis 3H (ГИСК 248) и наполнитель для лечения дисбактериозов (см. патент РФ №2130816). Наполнитель содержит 5% лактозы или 8% сахарозо-желатиновой смеси. Препарат характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и устойчивостью к целому ряду антибиотиков.

Однако практика показала, что применение пробиотиков не обеспечивает требуемый терапевтический эффект для профилактики или лечения дисбактериозов. Это обусловлено тем, что они являются «чужеродными» для микроорганизмов (биоценоза) конкретного человека. Иммунитет биопленки практически сводит на нет действие пробиотиков. Микробы, выращенные искусственно, являются инородными, они отторгаются вследствие бионесовместимости (см. Сателлитный симпозиум. Коррекция и профилактика дисбактериоза. Новые подходы терапии заболеваний желудочно-кишечной системы. Под ред. Н.А. Токаревой. Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. 2011, №3, стр. 77-84.), (Дармов И.В. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека / И.В. Дармов, И.Ю. Чичерин, И.П. Погорельский и др. // Эксперимент. и клин. гастроэнтерол. - 2011. - №3. - С. 6-11; Дармов И.В. Сравнительная оценка выживаемости микроорганизмов пробиотиков в составе коммерческих препаратов в условиях in vitro / И.В. Дармов, И.Ю. Чичерин, А.С. Ердякова и др. // Эксперимент. и клин. гастроэнтерол. - 2011. - №9. - С. 96-101).

В связи с этим, специалисты возлагают большие надежды на пребиотики и метабиотики, которые не содержат микроорганизмы и лишены вышеотмеченного отрицательного действия.

Единственным широко используемым в России препаратом из перспективной группы метаболитных пробиотиков (метабиотиков) является Хилак форте. (Грачева Н.М., Леонтьева Н.И., Щербаков И.Т. и др. Хилак-форте в комплексном лечении больных острыми кишечными инфекциями и хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта с явлениями дисбактериоза. Consilium medicum. 2004. №1, С. 31-34). Согласно Инструкции по медицинскому применению препарата (Инструкция по медицинскому применению препарата Хилак форте. Регистрационное удостоверение П №014917/01: «Меркле ГмбХ», г. Блаубойрен, Германия) действующими веществами являются «беззародышевые» водные субстраты продуктов обмена веществ Escherichia coli DSM 4087, Streptococcus faecalis DSM 4086, Lactobacillus acidophilus DSM 4149, Lactobacillus helveticus DSM 4183.

Однако несмотря на то, что Хилак форте в клинической практике показывает определенную эффективность, в последнее время при изучении его механизма действия появились экспериментальные данные, свидетельствующие о невысокой эффективности Хилак форте по стимулированию собственной микробиоты кишечника.

Выполненные исследования (И.Ю. Чичерин, И.П. Погорельский, И.А. Лундовских, И.В. Дармов, Д.А. Соляник. Экспериментальная оценка эффективности метаболитного пробиотика Хилак форте при дисбиозе кишечника. Журн. международной медицины. Педиатрия. - 2014. - №6(11). - С.123-129.) показали, что пробиотик Хилак форте практически не оказывает никакого влияния на рост и размножение бифидобактерий в сравнении с аналогичными показателями, полученными с использованием среды культивирования без пробиотика. Лактобациллы, выращенные в среде культивирования с добавлением Хилак форте, находятся в состоянии бактериостаза, а на кишечную палочку и особенно смешанную культуру кишечной микробиоты пробиотик оказывает выраженное угнетающее действие. При изучении влияния Хилак форте на восстановление микробиоценоза кишечника при антибиотико-ассоциированном дисбиозе (тот же источник) выявлено, что он повышает концентрацию полезных микробов в кишечнике только в 19-36 раз по сравнению с контролем, и сроки устойчивого появления представителей нормальной микробиоты составляют 13-14 суток.

Таким образом, современной наукой в очередной раз была продемонстрирована крайняя необходимость проведения экспериментальной оценки эффективности предлагаемых препаратов перед их внедрением в клиническую практику (И.Ю. Чичерин, И.П. Погорельский, И.А. Лундовских, И.В. Дармов, К.Е. Гаврилов, Н.В. Позолотина. Эволюция пробиотиков: историческая оценка и перспектива. Дневник Казанской медицинской школы, I (VII), март 2015, с. 42-51).

Неожиданно нами при проведении экспериментальных работ было обнаружено, что лактат кальция (кальций молочнокислый) оказывает более выраженный терапевтический эффект по восстановлению основных видов нормальной микробиоты кишечника - лактобацилл, бифидобактерий и кишечной палочки, что проявляется в более коротких сроках восстановления микробиоты в целом и отдельных ее представителей в количествах, значительно превышающих аналогичные показатели, чем при использовании Хилака форте.

Техническое решение, изложенное в статье Грачевой Н.М., Леонтьевой Н.И., Щербакова И.Т. и др. Хилак-форте в комплексном лечении больных острыми кишечными инфекциями и хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта с явлениями дисбактериоза. Consilium medicum. 2004. №1, С. 31-34 было выбрано нами в качестве прототипа заявляемого изобретения.

Техническим результатом заявленного изобретения является ускорение нормализации состава и количества микробиоты кишечника при дисбиозах.

Этот технический результат достигается тем, что в качестве средства для восстановления кишечного микробиоценоза при дисбиозах используют лактат кальция в эффективной терапевтической суточной дозе 0,5-1,5 г для взрослого человека.

Лактат кальция применяют в виде таблеток весом 0,5 г.

Эффективная суточная терапевтическая доза для детей с учетом меньшей массы тела несколько меньше и составляет приблизительно 0,2-1,0 г.

Лактат кальция используется в медицине как источник кальция при остеопорозах, для поддержания сердечной деятельности, для осуществления передачи нервных импульсов (http://www.neboleem.net/laktat-kalcija.php).

Лактат кальция используется также в качестве пищевой добавки, поскольку способен предупредить окисление и некоторые изменения в продуктах питания (см. патенты РФ №2512330, №2507911, 2202213).

Лактат кальция применяют в фармацевтической промышленности в качестве наполнителя при изготовлении твердых лекарственных форм.

Есть сведения о том, что он может быть эффективен при нормализации репродуктивной функции (см. патент РФ №2508117).

Для иллюстрации лечебных свойств лактата кальция были проведены следующие исследования.

У животных моделировали дисбиоз (дисбактериоз) кишечника путем введения им гентамицина.

Гентамицин в отличие от других аминогликозидов при приеме внутрь практически не всасывается в желудочно-кишечном тракте и оказывает местное действие. Вызывая микроэкологические нарушения в кишечнике, гентамицин инициирует развитие дисбактериоза кишечника у подопытных лабораторных животных при пероральном введении. В каждой группе было использовано по 10 животных.

С учетом среднесуточных доз препарата для людей, с целью инициации дисбактериоза, гентамицин вводили белым мышам и морским свинкам per os в дозах 2,9 и 30 мг 2 раза в сутки в пересчете на единицу поверхности тела. Начиная с первого дня введения антибиотика, у животных отбирали фекалии для определения общего количества фекальной микрофлоры. Кроме того, на «начало эксперимента», 2, 5 и 7 сутки экспериментов определяли содержание бифидобактерий, лактобацилл и эшерихий (кишечной палочки).

Было установлено, что под воздействием гентамицина к началу эксперимента по восстановлению микробиоценоза «общее количество» микроорганизмов (графа таблиц 1-4) кишечной микрофлоры в 1 г фекалий белых мышей снизилось по сравнению с исходным количеством в 2,8·10⁴ раз до значения (8,1±±0,5)·10⁴ КОЕ·г^-1 (колоний образующих единиц на грамм фекалий) (таблица 1 и 2), а морских свинок - в 2,3·10⁵ раз до значения (5,3±0,6)·10³ КОЕ·г^-1 (таблица 3 и 4). Таким образом, с помощью гентамицина был индуцирован «антибиотико-ассоциированный» дисбиоз кишечника у лабораторных животных.

Наряду со снижением общего количества фекальной микрофлоры у белых мышей и морских свинок под влиянием гентамицина отмечалось снижение количества бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий. Даже после прекращения перорального введения животным гентамицина в течение последующих 4 суток происходит дальнейшее понижение количества указанных представителей фекальной микробиоты (графа «Общее количество» таблиц 2 и 4 соответственно для белых мышей и морских свинок).

На 5 сутки после прекращения перорального введения гентамицина белые мыши и морские свинки с выраженными дисбиотическими изменениями фекальной микрофлоры были разделены на две группы. Опытным группам животных вводили лактат кальция в суточной дозе 2,6 мг для белых мышей (таблица 1) и 26 мг для морских свинок (таблица 3). Контрольные группы животных не получали лактат кальция (таблицы 2 и 4 соответственно).

Непосредственно в день начала введения лактата кальция у животных опытных и контрольных групп отбирали фекалии для бактериологического исследования. По результатам бактериологического исследования фекалий животных судили об эффективности лактата кальция. Результаты определений представлены в таблицах 1-4, где Таблица 1 - Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей опытной группы при антибиотико-ассоциированном дисбактериозе на фоне введения лактата кальция ; Таблица 2 - Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом белых мышей контрольной группы при антибиотико-ассоциированном дисбактериозе ; Таблица 3 - Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом морских свинок опытной группы при антибиотико-ассоциированном дисбактериозе на фоне введения лактата кальция ; Таблица 4 - Динамика концентрации микроорганизмов в кишечном содержимом морских свинок контрольной группы при антибиотико-ассоциированном дисбактериозе .

Из приведенных результатов следует, что исходное (после индуцирования дисбиоза кишечника) общее содержание фекальной микрофлоры составило (графа «начало эксперимента»): у белых мышей - 8,1·10⁴ КОЕ·г^-1 (таблицы 1-2), у морских свинок - 5,3·10³ КОЕ·г^-1 (таблицы 3-4).

Однако уже через сутки после начала перорального введения лактата кальция животным опытных групп (1-е сутки эксперимента, таблицы 1 и 3) общее содержание фекальной микрофлоры как у белых мышей, так и у морских свинок, превысило почти в 1000 раз аналогичный показатель у животных контрольных групп, не получавших лактат кальция.

Результаты проведенных бактериологических исследований фекалий белых мышей и морских свинок показали, что у лабораторных животных на фоне перорального введения гентамицина развился дисбактериоз кишечника, сопровождавшийся «вздутием живота» и нарушением перистальтики кишечника. При этом кишечная микробиота у лабораторных животных фактически являлась критическим звеном нарушенной регуляции, требующим определенного воздействия для восстановления.

На фоне лечения лактатом кальция у больных отмечалась нормализация диспептических явлений со стороны желудочно-кишечного тракта, а также отчетливая тенденция к закреплению стула и исчезновению побочных эффектов - «вздутия живота» и повышенной перистальтики кишечника.

На 7 сутки экспериментов (таблицы 1-4) результаты бактериологического исследования фекалий животных опытных и контрольных групп наглядно свидетельствуют о значительном отставании «скорости восстановления» собственной микробиоты кишечника у животных контрольных групп в сравнении с аналогичным процессом у животных опытных групп.

Скорость восстановления общего количества кишечной микробиоты при использовании лактата кальция выше в 7200 раз у белых мышей по сравнению с контролем (самовосстановление без лактата кальция) и в 800 раз у морских свинок соответственно (итоговая таблица 5).

При этом важным является следующее:

1) при пероральном введении лактата кальция у белых мышей и морских свинок отмечается выраженная положительная динамика восстановления общего содержания кишечной микробиоты, а также отдельных ее представителей - бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий (кишечной палочки);

2) применение лактата кальция характеризуется хорошей переносимостью животными и отсутствием побочных эффектов;

3) при использовании лактата кальция кратность восстановления микробиоты к контролю значительно выше, чем при использовании Хилака форте;

4) восстановление микробиоты наблюдалось у всех без исключения животных опытных групп, получавших лактат кальция;

5) сроки устойчивого появления представителей нормальной микробиоты составляют 6-7 суток, что примерно в 2 раза меньше, чем при использовании Хилака форте.

Таким образом, установлена высокая метабиотическая активность лактата кальция в коррекции нарушений микробиоценоза кишечника (дисбактериоза).

Были доказаны исследуемые свойства лактата кальция при дисбиозах у людей.

С этой целью было изучено влияние лактата кальция на восстановление кишечной микробиоты у волонтеров - практически здоровых людей (ПЗЛ), получавших антибактериальную терапию.

Средний возраст ПЗЛ составил 34,5±4 года, из них мужчин - 4, женщин - 8. Для достижения дисбиотических нарушений микробиоценоза кишечника всем пациентам назначали антибиотик рифампицин в дозе 300 мг (по 2 капсулы 150 мг) 2 раза в сутки в течение 5 дней.

В дальнейшем через 2 дня после окончания курса антибиотикотерапии всех пациентов разделили на 4 равные группы по 3 человека. Первая, вторая и третья группы получали лактат кальция в суточной дозе 0,5 г, 1,0 г и 1,5 г соответственно в течение 5 суток.

Четвертая группа была контрольной и никаких препаратов не получала (самовосстановление микробиоты).

В начале лечения и через 7 суток после его начала кишечное содержимое пациентов (фекалии) были подвергнуты бактериологическому анализу на содержание основных видов микроорганизмов - лактобацилл, бифидобактерий и кишечной палочки. Данные исследований представлены в Таблице 6 - Восстановление кишечного микробиоценоза у пациентов с антибиотико-ассоциированным дисбиозом на фоне приема лактата кальция в суточной дозе 0,5-1,5 г, КОЕ×г^-1.

Как видно из представленных данных, восстановление кишечной микробиоты на фоне приема лактата кальция протекает значительно эффективнее. Содержание основных видов кишечной микробиоты на фоне приема лактата кальция превышает аналогичные показатели контроля в 5-100 раз в зависимости от дозы лактата кальция.

У всех пациентов опытных групп отмечена высокая эффективность восстановления микробиоценоза кишечника по сравнению с контролем.

На фоне лечения лактатом кальция у больных отмечалась нормализация диспептических явлений со стороны желудочно-кишечного тракта, а также отчетливая тенденция к нормализации стула и исчезновение побочных эффектов - «вздутия живота» и повышенной перистальтики кишечника.

Таким образом, у пациентов выявлена высокая эффективность лактата кальция в суточной дозе 0,5-1,5 г для коррекции дисбиотических нарушений в кишечнике после антибиотикотерапии.

Анализируя результаты представленных наблюдений, мы считаем, что действие лактата кальция обусловлено следующим. Основным компонентом надосадочной жидкости (раствора экзометаболитов) пробиотических микроорганизмов является молочная кислота (И.Ю. Чичерин, И.П. Погорельский, И.А. Лундовских и др. Динамика содержания лактобацилл, микробных метаболитов и антибактериальной активности растущей культуры Lactobacillus Plantarum 8Р-А3. Журнал инфектологии, том 5, №3, 2013, с. 50-55). Лактат кальция является солью молочной кислоты, которая, попадая в желудочно-кишечный тракт, распадается на ионы кальция и молочную кислоту, позволяя отнести лактат кальция к препаратам метаболитного ряда - метабиотикам. Эти субстраты и обеспечивают тот терапевтический эффект, который показан в наших наблюдениях.

Изобретение относится к фармацевтике. Описано применение лактата кальция для восстановления кишечного микробиоценоза при дисбиозах в эффективной терапевтической суточной дозе 0,5-1,5 г для взрослого человека. Изобретение обеспечивает ускорение нормализации состава и количества микрофлоры кишечника при дисбиозах. 1 з.п. ф-лы, 6 табл.

1. Применение лактата кальция для восстановления кишечного микробиоценоза при дисбиозах в эффективной терапевтической суточной дозе 0,5-1,5 г для взрослого человека.

2. Применение лактата кальция по п. 1, отличающееся тем, что лактат кальция применяют в виде таблеток весом 0,5 г.