Применение пептида Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанка) для коррекции дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе Российский патент 2019 года по МПК A61K38/08 C07K7/06 A61P1/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, патофизиологии, фармакологии, и может быть использовано для коррекции дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе.

Актуальной проблемой современной медицинской науки является изучение микробиоценоза кишечника. Микроэкологические изменения в микрофлоре кишечника регистрируют практически у 90% населения. Увеличение частоты и тяжести острых инфекционных заболеваний, торпидное течение и хронизация воспалительных процессов часто связано с развивающимися или уже имевшими место нарушениями микробиоты. Важно отметить, что микрофлора организма человека, являясь «экстракорпоральным органом», выполняет многообразные функции по поддержанию нормального гомеостаза (Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы актуальная проблема медицины // Вестн. РАМН. - 1997. - №3. - С. 4-7. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека. // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1998. - №1. - С. 61-65).

Одним из наиболее значимых доказанных этиологических факторов дисбиоза является стресс. В общебиологическом плане стресс является неспецифической психофизиологической реакцией организма на воздействие любых экстремальных факторов физической, биологической и психогенной природы, к числу таких факторов относится хроническая иммобилизация. Гиподинамия и гипокинезия относятся к актуальным проблемам современной биологии и медицины, что обусловлено рядом физических, физиологических и социальных причин (снижение нагрузки на опорно-двигательный аппарат, пребывание в помещениях малого объема, информационные перегрузки, малоподвижный образ жизни и др.) Кроме того, лечение ряда заболеваний и травм требует соблюдения постельного режима, который ограничивает двигательную активность пациентов.

Стрессорные факторы приводят к перестройке защитных систем организма, играют мобилизирующую роль, однако при чрезмерно выраженном или продолжительном воздействии происходит перегрузка адаптационных возможностей, что приводит к возникновению стрессорных заболеваний (Воробьева Е. Эпидемиология неинфекционных заболеваний: задачи на современном этапе / Воробьева Е., Бабанов С., Агаркова И. // Профилактическая медицина. - 2002. - №3. - С. 12-14).

В научной и клинической литературе неоднократно описывалось состояние микробиоты после действия стрессов. Было показано, что стресс приводит к дисбалансу в составе микробиоценоза со снижением уровня полезной составляющей. При частичной или полной элиминации бифидобактерий происходит угнетение иммунных сил организма, нарушаются важные процессы в кишечнике, включая пищеварение, всасывание и все виды обмена, в том числе снижение витаминсинтезирующей функции кишечной микрофлоры. Повышается воздействие условно-патогенной микробиоты, которая отличается от полезных микроорганизмов обменом веществ и многими физиологическими функциями (de Lartigue G. Vagal afferent neurons in high fat diet-induced obesity; intestinal microflora, gut inflammation and cholecystokinin / de Lartigue G., de La Serre C.B., Raybould H.E. // Physiol. Behav. - 2011. - V. 105. - P. 100-105). Нарушение нормального микробиоценоза влечет развитие или обострение психических расстройств, сопровождающихся воспалением и нарушениям в функционировании ЦНС через изменения в активации блуждающего нерва и/или спинномозгового нервного пути (Communication between gastrointestinal bacteria and the nervous system / Bravo J.A., Julio-Pieper M., Forsythe P. et al. // Curr. Opin. Pharmacol. - 2012. - V. 12. - P. 667-672). В связи с вышеизложенным большой интерес представляет восстановление стрессиндуцированных нарушений кишечного микробиоценоза.

В настоящее время коррекция дисбиотических нарушений проводится в соответствии с Отраслевым стандартом (Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника». Москва, 2003). Однако применение пробиотиков не обеспечивает требуемый терапевтический эффект для профилактики или лечения дисбактериозов. Это обусловлено тем обстоятельством, что они являются «чужеродными» для микроорганизмов (биоценоза) конкретного человека. Иммунитет биопленки практически сводит на нет действие пробиотиков. Микробы, выращенные искусственно, являются инородными, они отторгаются вследствие бионесовместимости (Сателлитный симпозиум. Коррекция и профилактика дисбактериоза. Новые подходы терапии заболеваний желудочно-кишечной системы. Под ред. Н.А. Токаревой. Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. 2011, №3, стр. 77-84.), (Дармов И.В. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в условиях in vitro, имитирующих процесс пищеварения у человека / И.В. Дармов, И.Ю. Чичерин, И.П. Погорельский и др. // Эксперимент. и клин. гастроэнтерол. - 2011. - №3. - С. 6-11; Дармов И.В. Сравнительная оценка выживаемости микроорганизмов пробиотиков в составе коммерческих препаратов в условиях in vitro / И.В. Дармов, И.Ю. Чичерин, А.С. Ердякова и др. // Эксперимент. и клин. гастроэнтерол. - 2011. - №9. - С. 96-101).

Таким образом, пробиотики уступают в своей эффективности пребиотикам и метабиотикам, которые не содержат микроорганизмы и лишены вышеотмеченного отрицательного действия.

Известен способ коррекции дисбиоза, вызванного иммобилизационным стрессом, с использованием экзополисахаридов молочнокислых бактерий - лаксаранов 1596, 1936 и Z, который был выбран в качестве прототипа нашего изобретения (М.И. Правдивцева, Л.В. Карпунина, М.Д. Сметанина. Влияние экзополисахаридов лактобацилл на микрофлору толстого отдела кишечника самок крыс при различных видах стресса / Известия Саратовского университета. - 2011.- Т. 11. Сер. Химия. Биология. Экология, вып. 2. - С. 82-94).

К недостаткам данного метода можно отнести недостаточную изученность биологической роли бактериальных экзополисахаридов в макроорганизме, отсутствие влияния на содержание стафилококков и кишечных палочек, отсутствие данных о воздействии данных препаратов на состав условно-патогенных представителей кишечного микробиоценоза.

При этом представляет интерес одновременное воздействие препаратов для коррекции стресс-индуцированного дисбиоза на состояние микробиоценоза кишечника и купирование стресса.

До настоящего времени наиболее распространенными средствами лечения тревожных и стресс-ассоциированных расстройств остаются бензодиазепины, основным механизмом действия которых является влияние на ГАМК-бензодиазепиновый рецепторный комплекс. Несмотря на значительный терапевтический потенциал данных соединений, их применение сопровождается развитием нежелательных побочных эффектов (седация, привыкание) (Вальдман А.В. Модулирующее действие коротких пептидов на моноаминергические процессы мозга как основа их психотропного эффекта // Вопр. мед. хим. - 1984. - Т. 30. - С. 36-63).

Однако в последнее время особый интерес представляют анксиолитические препараты, разработанные на основе регуляторных пептидов, в частности, селанк. Известно, что регуляторные пептиды обладают широким спектром биологической активности, имеющим огромное значение в координации функций организма благодаря нейроэндокринным, иммунологическим, клеточным и молекулярным взаимодействиям (Зозуля А.А., Кост Н.В., Соколов О.Ю., Габаева М.В., Гривенников И.А., Андреева Л.А., Золотарев Ю.А., Иванов С.В., Андрющенко А.В., Мясоедов Н.Ф., Смулевич А.Б. Эффективность и значимость регуляторных пептидов возрастает при воздействии негативных факторов окружающей среды (Ашмарин И.П., Стукалов П.В., Ещенко Н.Д. Биохимия мозга. / СПб - 1999. - Изд-во С.-Петербургского университета. - 325 с.).

Важными достоинствами препаратов на основе регуляторных пептидов являются отсутствие токсичности и аллергенных свойств.

Селанк (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro) - гептапептид, являющийся комбинацией гликопролина и молекулы тафцина. Глипролин (Pro-Gly-Pro) - это фрагмент коллагена, при присоединении к другим олигопептидам с С-конца способен повышать устойчивость конечной молекулы к действию протеаз. Тафцин (Thr-Lys-Pro-Arg) - это синтетический аналог короткого фрагмента тяжелой цепи иммуноглобулина G - является иммуномодулятором, обладающим некоторым действием на ЦНС (Siemiona I. Tuftsin: On the 30-year anniversary of Victor Najjar's discovery / I. Siemiona, A. Kluczyka // Peptides. - Elsevier. - June 1999. - Vol. 20. - N. 5. - P. 645-674. - doi: 10.1016/S0196-9781 (99)00019-4).

Препарат нейтрализует стресс-эффекты, предупреждает психическое утомление и астеноневротические расстройства разного генеза, оказывает активирующее действие на мнестические и когнитивные функции. Доказано наличие антидепрессивного и психостимулирующего компонента в спектре нейропсихотропной активности селанка (Козловская М.М. Влияние гептапептида селанка на депрессию поведения высоко- и низкотревожных мышей BALB/c и С25В L/6 и крыс с наследуемой депрессивностью поведения WAG/RIJ / М.М. Козловская, К.Ю. Саркисова, И.И. Козловский // Психофармакология и биологическая наркология. - 2005. - Т. 5. - №3. - С. 989-996).

Анксиолитическое и антидепрессивное действия селанка связаны с регуляцией на уровне генома синтеза и метаболизма норадреналина, серотонина и энкефалинов в эмоциогенных зонах головного мозга. Селанк стабилизирует процессы возбуждения и торможения в головном мозге и повышает устойчивость нейронов коры полушарий к функциональным нагрузкам высокой интенсивности (Козловская М.М., Незнамов Г.Г., Кошелев В.В., Телешова Е.С., Бочкарев В.К. Результаты клинико-фармакологического исследования пептидного препарата Селанк в качестве анксиолитического средства. // Социальная и клиническая психиатрия. - 2003. - №4. - С. 28-36). Ингибирующий эффект селанка на активность энкефалиндеградирующих ферментов как один из возможных механизмов его анксиолитического действия. // Бюл. Эксп. Биол. Мед. - 2001. - Т. 131. №4.- С. 376-378)

Селанк обладает протекторными противоязвенными свойствами, проявляющимися повышением устойчивости слизистой оболочки желудка к действию различных ульцерогенных факторов. (Павлов Т.С. Селанк и его метаболиты поддерживают гомеостаз слизистой оболочки желудка / Т.С. Павлов, Т.Е. Самонина, З.В. Бакаева, Ю.А. Золотарев, А.А. Гусева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 143. - №1. - С. 57-59; Самонина Г.Е. Трипептид Pro-Gly-Pro и гомеостаз слизистой оболочки желудка / Г.Е. Самонина, Г.Н. Копылова, Б.А. Умарова // Нейрохимия. - 2008. - Т. 25. - №1).

Однако использование пептида Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанка) для коррекции дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе не изучено.

Техническим результатом изобретения является применение по новому назначению пептида Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанка) для коррекции дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе.

Технический результат изобретения достигается путем применения пептида Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанка) для коррекции дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе.

Химическая формула данного пептида известна. Нами был использован препарат, синтезированный в Институте молекулярной генетики РАН. Растворенный в физиологическом растворе пептид вводят экспериментальным животным (крысам) парентерально (внутрибрюшинно) в дозе 250 мкг/кг массы тела за 15 минут до начала формирования иммобилизационного стресса.

Пример конкретного выполнения

Экспериментальные животные (крысы Вистар) массой 250-280 г были разделены на две группы по 13 особей в каждой. Первая группа представлена животными, которым вводили физиологический раствор и моделировали иммобилизационный стресс, животным второй группы вводили селанк и моделировали иммобилизационный стресс. Животные содержались в помещении при температуре воздуха 22-24°С, световом режиме 12 часов - свет, 12 часов - темнота и получали стандартный гранулированный корм и воду в свободном доступе в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. №199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», принципами 3R, изложенными в рекомендациях ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments, 2010). На момент выполнения эксперимента все животные были здоровыми, изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования не выявлено.

Пептид Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанк) растворяли в физиологическом растворе и вводили экспериментальным животным парентерально (внутрибрюшинно) в дозе 250 мкг/кг массы тела за 15 минут до начала стрессорного воздействия в объеме из расчета 1 мл на 1 кг массы тела.

Контрольным животным вводили эквивалентные объемы физиологического раствора.

Хронический иммобилизационный стресс моделировали помещением крыс в индивидуальные тесные пластиковые боксы с отверстиями для вентиляции ежедневно на 2 часа в течение 14 дней. По истечении указанного срока животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом обескровливанием путем забора крови из правого желудочка сердца.

Количественное и качественное исследование мукозной микрофлоры толстого кишечника мышей проводили по известной методике Л.И. Кафарской и В.М. Коршунова (Богданова, Е.А. Исследование пристеночной микрофлоры желудочно-кишечного тракта крыс при пероральном введении пробиотических препаратов / Е.А. Богданова, Ю.В. Несвижский, А.А. Воробьев // Вестн. РАМН. - 2006. - №2. - С. 6-10). Биоптаты слизистой оболочки толстого кишечника освобождали от химуса и взвешивали в асептических условиях. После этого материал помещали в стерильный раствор фосфатного буфера в соотношении 1:10 и выдерживали в нем 2 часа для разжижения муцина.

Из подготовленных образцов кишечника готовили разведения материала до концентраций 10^-2-10^-4. По 0,1 мл каждого разведения взвесей засевали газоном на поверхность питательных сред (Эндо, Сабуро, SSA-агар, ЦПХ-агар, желточно-солевой агар, висмут-сульфит агар, лактоагар MRS, бифидоагар) и инкубировали при температуре 37°С в аэробных и анаэробных условиях.

Идентификацию микроорганизмов проводили с помощью масс-спектрометра Maldi Biotyper Bruker. Количество микроорганизмов в 1 грамме материала рассчитывали исходя из числа выросших колоний микроорганизмов - колониеобразующих единиц (КОЕ) при посеве из максимального разведения, где отмечался рост не менее 10 колоний, учитывая при этом объем посевного материала. Для расчета использовали формулу: К=Е/к*v*n, где К - колониеобразующая единица, Е - общее количество бактерий, к - количество внесенного материала, v - количество чашек Петри, n - разведение. Удельное содержание микроорганизмов вычисляли как количество микроорганизмов, выделенных из биопроб, и выражали в lg КОЕ/г массы биологического материала.

Статистическую значимость различий средних величин вычисляли по t-критерию Стьюдента после проверки нормальности распределения изучаемых показателей.

Примечание: * - р≤0,05 по сравнению с контрольной группой, ** - р≤0,01 по сравнению с контрольной группой, *** - р≤0,001 по сравнению с контрольной группой.

После применения пептида Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанка) происходило увеличение содержания таких облигатных представителей микробиоценоза, как лактобактерии и бифидобактерии (в 1,5 раза и 1,6 раза соответственно), при этом lg КОЕ/г для лактобактерий составил 13,67±0,51 (против 9,33±0,34 в контроле), а для бифидобактерий - 14,01±0,41 (против 8,8±0,34 в контроле).

Число кишечных палочек с нормальной ферментативной активностью после применения нейропептида увеличилось в 1,3 раза и составило 5,66±0,37. При этом отмечалось снижение количества других грамотрицательных микроорганизмов. Так, содержание энтеробактеров уменьшилось с 2,73±0,66 до 0,56±0,39 (в 4,9 раза), а протеев - с 3,14±0,63 до 0,92±0,49 (в 3,4 раза). Бактерии родов Citrobacter и Acinetobacter, встречавшиеся в контроле в количестве 1,6±0,51 и 1,46±0,56 соответственно, отсутствовали в после введения пептида Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанка).

Введение пептида Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанка) в дозе 250 мкг/кг стрессированным животным приводило к уменьшению содержания стафилококков. В частности, не выявлялись золотистые стафилококки, тогда как в группе контроля их количество составляло 2,02±0,47, а число коагулазоотрицательных стафилококков снизилось в 2,1 раза до 2,71±0,73.

Не было выявлено достоверных различий между значениями определяемого показателя для кишечных палочек со сниженной ферментативной активностью, клебсиелл, морганелл и энтерококков. Однако необходимо отметить, что число этих факультативных представителей кишечного микробиоценоза снизилось. Исключение составили лишь энтерококки, количество которых увеличилось в два раза по сравнению с контролем.

Таким образом, результаты проведенных экспериментальных исследований показывают, что использование пептида Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанка) в дозе 250 мкг/кг вызывает выраженный эффект для коррекции дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе, приводя к увеличению количества облигатных представителей кишечной микробиоты и уменьшению содержания условно-патогенных микроорганизмов. Данный способ основан на применении регуляторного пептида, относящегося к классу биологически активных веществ, обладающих выраженным модуляторным эффектом и полифункциональностью, является патогенетически обоснованным, не трудоемкий и не требует использования сложного оборудования.

Изобретение относится к применению пептида Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанка) для коррекции дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе. Пептид Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанк) растворяли в физиологическом растворе и вводили экспериментальным животным (крысам) парентерально (внутрибрюшинно) в дозе 250 мкг/кг массы тела за 15 минут до начала стрессорного воздействия в объеме из расчета 1 мл на 1 кг массы тела. Изобретение обеспечивает повышение эффективности коррекции дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе. 1 табл., 1 пр.

Применение пептида Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанка) для коррекции дисбиоза при хроническом иммобилизационном стрессе.