ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ПРОГРЕССИРОВАНИЯ ВОЗРАСТНОЙ МАКУЛОДИСТРОФИИ ДО ПОЗДНЕЙ СТАДИИ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИГЕННОГО ПОКАЗАТЕЛЯ Российский патент 2016 года по МПК C12Q1/68 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам выявления лиц с промежуточной возрастной макулодистрофией (ВМД), характеризующихся повышенным риском прогрессирования ВМД до поздней стадии, с помощью полигенного показателя, рассчитываемого на основании результатов полногеномного исследования генных ассоциаций, использующего тысячи однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП).

Уровень техники

Возрастная макулодистрофия (ВМД)

ВМД является возрастной дегенерацией желтого пятна, являющейся основной причиной необратимых нарушений зрения у лиц старше 60 лет. Существуют два типа ВМД - неэкссудативная (сухая) и экссудативная (влажная) ВМД. Сухая, или неэкссудативная, форма включает атрофические и гипертрофические изменения пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), подстилающего центральную область сетчатки (желтое пятно), а также отложения (друзы) в ПЭС. У пациентов с неэкссудативной ВМД может происходить прогрессирование до влажной, или экссудативной, формы ВМД. По мере прогрессирования заболевания, первоначально образовавшиеся друзы увеличиваются в размерах и количестве. На поздних стадиях ВМД под сетчаткой развиваются аномальные кровеносные сосуды, называемые хориоидальными неоваскулярными мембранами (CNVM), возникают утечки жидкости и крови, и в конечном итоге образуется дисковидный рубец в и под сетчаткой, что приводит к слепоте. Неэкссудативная ВМД, как правило, являющаяся предшественником экссудативной ВМД, является более распространенной.

Полногеномные исследования ассоциаций

Параллельно с секвенированием генома человека развивался международный проект, направленный на разработку карты гаплотипов генома человека HapMap, описывающей общую картину изменчивости последовательности ДНК человека. Проект HapMap стартовал в 2002 году, и его результаты общедоступны за счет периодических выпусков. Кроме того, быстрое развитие методик генотипирования и анализа позволили выполнить полногеномное исследование ассоциаций среди крупных групп населения для выявления генетических вариантов, характеризующихся значительной частотой среди населения. Это, в свою очередь, позволило выполнить исследование полигенных заболеваний и признаков. С тех пор полногеномные исследования ассоциаций выявили многочисленные генетические локусы, в которых находятся распространенные генетические варианты, воспроизводимо ассоциированные с полигенными признаками. См., например, Altshuler et al., Science (2008), 322:881-8 (генетическое картирование заболевания человека); Mohkle et al., Hum Mol Genet (2008) 17:R102-R108 (распространенные генетические варианты, ассоциированные с заболеваниями обмена веществ и сердечно-сосудистыми заболеваниями); Lettre et al., Hum Mol Genet (2008):17-R116-R121 (распространенные генетические варианты, ассоциированные с аутоиммунными заболеваниями); Purcell et al., Nature (2009) 460(7256):748-52 (распространенные генетические варианты, ассоциированные с риском шизофрении и биполярного расстройства) и Wei et al., PLoS Genet. (2009) 5(10):e1000678. Epub 2009 Oct 9 (сахарный диабет 1 типа).

Johanna M. Seddon, магистр наук медицинского факультета медицинского центра Новой Англии им. Тафтса, Бостон, США, и ее коллеги выполнили оценку прогностической значимости некоторых генетических вариантов для прогрессирования ВМД до поздней стадии и связанной с этим потери зрения, и сообщили о результатах своего исследования в статье Seddon et al., JAMA (2007) 297:1793-1800. В исследование были включены 1466 европеоидов-участников исследования возрастных заболеваний глаз (AREDS) - многоцентрового клинического исследования, проводившегося в США с 1990 по 2001 год при среднем времени наблюдения 6,3 года. В ходе исследования у 281 участника произошло прогрессирование ВМД до поздней стадии в одном или обоих глазах, включавшее: географическую атрофию (приводившую к истончению и обесцвечиванию сетчатки), экссудативное заболевание (выход жидкости, клеток и остатков клеток из кровеносных сосудов) или потерю зрения, вызванную ВМД. На основе генотипирования определили, что распространенные полиморфизмы в генах CFH и LOC387715 независимо друг от друга связаны с прогрессированием ВМД от ранних стадий ВМД (друзы и пигментные изменения) до поздних форм ВМД (географическая атрофия или неоваскулярная ВМД), приводивших к нарушениям зрения или слепоте. Исследователи обнаружили, что генетические полиморфизмы CFH Y402H и LOC387715 A69S связаны с прогрессированием до более поздней стадии ВМД, причем риск прогрессирования был в 2,6 раза выше для генотипа риска CFH и в 4,1 раза выше для генотипа риска LOC387715 с учетом других факторов, ассоциированных с ВМД. Вероятность прогрессирования составила 48 процентов для генотипа с наиболее высоким риском по сравнению с 5 процентами для генотипов с низким риском. Наличие всех неблагоприятных факторов (оба указанных генотипа риска, курение и индекс массы тела 25 или более) повышает риск в 19 раз. Курение и высокий индекс массы тела повышают вероятность прогрессирования в пределах каждого генотипа риска.

Эта же группа сообщила о результатах более позднего исследования, в ходе которого изучалось совместное влияние генетических, офтальмологических и экологических факторов и прогностических моделей на распространенность и заболеваемость ВМД. (Seddon et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science (2009) 50:2044-53. Авторы обнаружили независимую ассоциированность шести генетических вариантов (CFH Y402H; CFH rs1410996; LOC387715 A69S (ARMS2); C2 E318D; CFB; C3 R102G) как с распространенностью, так и с заболеваемостью ВМД на поздних стадиях. По мнению авторов, все указанные варианты, кроме CFB, были в значительной степени связаны с прогрессированием до поздних стадий ВМД, с учетом исходной стадии ВМД и других факторов.

Установлено, что генетические, демографические (например, возраст, пол) и экологические (например, курение) факторы вносят вклад в развитие и прогрессирование ВМД, причем генетические факторы включают однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП), варианты количества копий (ВКК) и эпигенетические варианты, связанные с метилированием ДНК или модификацией гистонами. Тем не менее, относительный вклад этих факторов, в том числе вклад каждого класса генетических вариантов, в риск возникновения или прогрессирования заболевания до сих пор неизвестен. Соответственно, существует потребность в лучшем понимании и инструментах для прогнозирования вероятности развития ВМД или, для пациентов, у которых уже диагностирована ВМД, риска прогрессирования их состояния.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение, по меньшей мере частично, основано на признании того, что тысячи распространенных генетических вариантов, оказывающих незначительный эффект, вносят вклад в прогрессирование промежуточной ВМД до ВМД поздней стадии, и, в общей сложности, с помощью полигенного показателя можно объяснить и прогнозировать риск прогрессирования от промежуточной ВМД до ВМД на поздней стадии.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки риска развития поздней стадии возрастной макулодистрофии (ВМД) у субъекта-человека, включающему определение в биологическом образце от субъекта наличия или отсутствия аллелей риска распространенных аллельных вариантов, ассоциированных с ВМД во множестве независимых локусов.

В одном варианте воплощения исследуемые аллели риска не включали комплемент rs10737680 и rs1329424 (фактор комплемента H); rs2285714 (фактор комплемента I); rs429608 и rs9380272 (комплемент C2), rs3793917 (HTRA1) и rs2230199 (комплемент C3).

В конкретном варианте воплощения после определения наличия или отсутствия аллелей риска рассчитывают полигенный показатель для субъекта, причем высокий полигенный показатель указывает на более высокий риск развития поздней стадии ВМД.

В различных вариантах воплощения определяют частоты аллелей в, по меньшей мере, 20, или, по меньшей мере, 50, или, по меньшей мере, 100, или, по меньшей мере, 200, или, по меньшей мере, 500, или, по меньшей мере, 750, или, по меньшей мере, 1000 или, по меньшей мере, 1500 или, по меньшей мере, 2000 или, по меньшей мере, 2500 или, по меньшей мере, 3000 или, по меньшей мере, 3500 или, по меньшей мере, 4000 или, по меньшей мере, 4500 или, по меньшей мере, 5000 или, по меньшей мере, 5500 или, по меньшей мере, 6000 или, по меньшей мере, 6500 или, по меньшей мере, 7000 или, по меньшей мере, 7500 или, по меньшей мере, 8000 или, по меньшей мере, 8500 или, по меньшей мере, 9000 или, по меньшей мере, 9500 или, по меньшей мере, 10000 независимых локусов.

В еще одном варианте воплощения у субъекта диагностирована ранняя стадия ВМД.

В еще одном варианте воплощения у субъекта диагностирована промежуточная стадия ВМД.

В другом варианте воплощения указанный способ дополнительно включает оценку одного или более аспектов анамнеза субъекта, например, одного или более из: возраста, этнической принадлежности, индекса массы тела, истории потребления алкоголя, истории курения, истории физических нагрузок, диеты, семейного анамнеза ВМД или других возрастных офтальмологических состояний, включая возраст родственников на момент постановки им диагноза, и индивидуальной истории лечения ВМД.

В другом варианте воплощения определение наличия или отсутствия аллелей риска осуществляют путем амплификации нуклеиновой кислоты из указанного образца.

В различных вариантах воплощения амплификация может включать ПЦР, амплификация может осуществляться на чипе, причем праймеры для амплификации специфичны к тестируемым аллелям распространенных генетических вариантов.

В конкретном варианте воплощения амплификация включает: (1) смешивание праймера для амплификации или пары праймеров для амплификации с нуклеотидной матрицей, выделенной из биологического образца, причем праймер или пара праймеров комплементарны или частично комплементарны области, располагающейся вблизи от или включающей полиморфизм, и способны инициировать полимеризацию нуклеиновой кислоты на матричной нуклеиновой кислоте за счет полимеразы; и б) удлинение праймера или пары праймеров в ходе реакции полимеризации ДНК с участием полимеразы и матричной нуклеиновой кислоты, приводящее к получению ампликона.

Ампликон можно, например, обнаружить с помощью способа, включающего одно или более из следующего: гибридизацию ампликона с набором фрагментов, гидролиз ампликона с помощью фермента рестрикции или анализ на основе ПЦР в реальном времени.

В еще одном варианте воплощения амплификация включает проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР), ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) или лигазной цепной реакции (ЛЦР) с использованием нуклеиновой кислоты, выделенной из организма или биологического образца, в качестве матрицы для ПЦР, ОТ-ПЦР или ЛЦР.

В еще одном варианте воплощения способ дополнительно может включать расщепление амплифицированной нуклеиновой кислоты.

В другом варианте воплощения биологический образец получают из физиологической жидкости, например, слюны или крови.

В других вариантах воплощения способ дополнительно включает этап принятия решения о расписании и/или частоте диагностического тестирования ВМД для субъекта и/или о расписании и/или частоте лечения ВМД для субъекта.

В другом варианте воплощения способ дополнительно включает этап лечения ВМД у субъекта с установленным повышенным риском развития поздней стадии ВМД, причем лечение может, например, включать введение лекарственного средства, выбранного из группы, состоящей из антител против фактора D, антител против ФРЭС, CRIg и гибрида CRIg-Ig.

В еще одном варианте воплощения указанный способ включает определение наличия или отсутствия аллелей риска для всех однонуклеотидных полиморфизмов, представленных в Таблице S1, и расчет полигенного показателя на основе такого определения.

В еще одном варианте воплощения указанный способ дополнительно включает этап записи результатов указанного определения на машиночитаемый носитель.

В еще одном варианте воплощения о результатах уведомляют субъекта или врача субъекта и/или записывают результаты в виде отчета.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к отчету, включающему результаты способов, описанных здесь.

Краткое описание чертежей

Файл настоящего патента содержит, по меньшей мере, один цветной рисунок. Копии настоящего патента или патентной публикации с цветным(и) рисунком(ами) будут предоставлены Управлением после запроса и оплаты в необходимом размере

Фигура 1: Известные гены риска ВМД дают возможность прогноза прогрессирования.

Фигура 2: Полигенный показатель идентифицирует лиц с повышенным риском прогрессирования ВМД до поздней стадии.

Фигура 3: Полигенный показатель идентифицирует лиц с повышенным риском прогрессирования ВМД до поздней стадии независимо от клинической оценки исходного уровня.

Таблица S1: Список 10617 ОНП. CHR= хромосома; ОНП= ОНП ID; BP= физическое положение (пар оснований); А1= код первого (минорного) аллеля; F_A - частота аллеля 1 в исследуемых случаях; F_U: частота аллеля в контрольных случаях; А2= код второго (основного) аллеля; CHISQ=значение хи-квадрат; Р= значение р (значимости теста ассоциированности "случай/контроль"); OR= коэффициент несогласия для ассоциированности с риском ВМД. В некоторых случаях минорный аллель ассоциирован с риском (OR>1), а в некоторых случаях основной аллель ассоциирован с риском ВМД (OR<1).

Подробное описание изобретения

I. Определения

При использовании здесь торговых наименований

подразумевается, что заявители независимо включают торговоенаименование состава продукта, непатентованное название лекарства и активный(е) фармацевтический(е) ингредиент(ы) продукта под торговым наименованием.

В настоящем описании подразумевается, что следующие термины и фразы имеют следующие значения, если не указано иное:

Термин "комплемент-ассоциированное состояние глаза" используется в самом широком смысле и включает все офтальмологические состояния, в патогенезе которых участвует комплемент, в том числе классический и альтернативный пути и, в частности, альтернативный путь комплемента. Комплемент-ассоциированные состояния глаза включают, без ограничения, дегенеративные заболевания желтого пятна, например, все стадии возрастной макулодистрофии (ВМД), включая сухую и влажную (неэкссудативную и экссудативную) формы, хориоидальную неоваскуляризацию (CNV), увеит, диабетическую и другие виды ишемической ретинопатии, и другие заболевания, сопровождающиеся внутриглазной неоваскуляризацией, например, диабетический отек желтого пятна, патологическую миопию, болезнь фон Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаз, окклюзию центральной вены сетчатки (CRVO), неоваскуляризацию роговицы и неоваскуляризацию сетчатки. Предпочтительная группа комплемент-ассоциированных состояний глаза включает возрастную макулодистрофию (ВМД), в том числе неэкссудативную (влажную) и экссудативную (сухую или атрофическую) ВМД, хориоидальную неоваскуляризацию (CNV), диабетическую ретинопатию (ДР) и эндофтальмит.

Термин "возрастная макулодистрофия" или "ВМД" используется здесь для охвата всех стадий ВМД, в том числе категории 2 (ранней стадии), категории 3 (промежуточной) и категории 4 (поздней стадии) ВМД.

"Лечение" является вмешательством, осуществляемым с целью предупреждения развития или изменения патологии расстройства. Соответственно, "лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим и предохранительным мероприятиям. "Те, кто нуждается в лечении", включают тех, кто уже страдает расстройством, а также тех, у кого расстройство следует предотвратить. При лечении комплемент-ассоциированных состояний глаз, например, ВМД, терапевтический агент может непосредственно благотворно влиять на величину, тяжесть, прогрессирование или симптомы заболевания или повышать восприимчивость заболевания к лечению другими терапевтическими агентами.

"Патология" заболевания, например, комплемент-ассоциированного состояния глаза, в том числе ВМД, включает все явления, угрожающие благополучию пациента. Указанный термин включает, без ограничения, морфологические явления, связанные с различными стадиями заболевания, например, наличие, количество и размер друз в одном или обоих глазах, накопление базальных пластинчатых отложений (BLamD) и базальных линейных отложений (BLinD), пигментные изменения, географическую атрофию (GA) и изменения пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), разрушение светочувствительных клеток и опорной ткани в центральной области сетчатки (поздняя стадия сухой формы), или аномальные и хрупкие кровеносные сосуды под сетчаткой (влажная форма); физиологические изменения, например, нарушение зрения, частичная или полная потеря зрения.

Термин "млекопитающее", как используется здесь, относится к любому животному, классифицируемому как млекопитающее, включая, без ограничения, людей, высших приматов, домашних и сельскохозяйственных животных, и животных, содержащихся в зоопарках, спортивных или комнатных животных, например, лошадей, свиней, крупный рогатый скот, собак, кошек и хорьков и т.д. В предпочтительном варианте осуществления изобретения млекопитающее является человеком или другим высшим приматом.

Введение "в комбинации с" одним или более дополнительным терапевтическим агентом включает одновременное (совместное) и последовательное введение в любом порядке.

"Фенотип" является признаком или совокупностью признаков, наблюдаемым/наблюдаемых у особи или в популяции. Указанный признак может быть количественным (количественный признак, или QTL) или качественным. Например, восприимчивость к ВМД является фенотипом, который можно отслеживать в соответствии со способами, композициями, наборами и системами, описанными здесь.

"Фенотип подверженности ВМД" является фенотипом, отражающим предрасположенность к развитию ВМД у субъекта. Фенотип, отражающий предрасположенность к ВМД, может, например, демонстрировать более высокую вероятность развития ВМД у субъекта с указанным фенотипом, чем у членов соответствующей общей популяции, при данном наборе условий окружающей среды (диета, режим физической активности, географическое положение и т.д.).

"Этническая принадлежность" может быть основана на самоидентификации (собственной оценке), но предпочтительно основывается на использовании полногеномных данных о ОНП с целью определения степени родства образцов и сравнения образцов с эталонными популяциями проекта Human HapMap для присвоения этнической принадлежности. Популяциями, включенными в HapMap, являются йоруба в г. Ибадан, Нигерия (обозначение: YRI); японцы в г. Токио, Япония (обозначение: JPT); китайские ханьцы в г. Пекин, Китай (обозначение: CHB); и CEPH (Центр по изучению полиморфизма у человека, Centre d'Etude du Polymorphisme Humain) (жители штата Юта, происходящие из северной и западной Европы) (обозначение: CEU). Анализ главных компонентов использует данные о генотипе для расчета осей изменчивости, которые можно интерпретировать как описание непрерывной наследственной гетерогенности в пределах группы лиц. Эти оси изменчивости определяются как верхние собственные векторы матрицы ковариации между индивидуумами в исследуемой популяции. Затем можно скорректировать ассоциацию между генотипами и фенотипами, связанную с родословной по каждой оси. Обычно образцы, являющиеся значимо аномальными образцами (по отношению к исследуемой популяции), исключают из анализа в целях контроля за расслоением популяции. В частности, генотипы из всего генома используют для расчета собственных векторов (форма анализа главных компонентов, PCA), а затем анализируют образцы на основе первичных собственных векторов. Экстремально аномальные значения (сигма > 6) удаляют, а результаты ассоциаций корректируют, используя первые 5 собственных векторов в качестве ковариат. См. также Price, A.L. et al. Principal components analysis corrects for stratification in genome-wide association studies. Nat. Genet. 38, 904-909 (2006) и Пример.

"Полиморфизм" является изменчивым локусом; т.е. в популяции присутствует более одной версии или аллеля нуклеотидной последовательности в области полиморфизма.

Термин "аллель" относится к одной из двух или более различных нуклеотидных последовательностей, встречающихся или кодируемых в определенном локусе, или двух или более различных полипептидных последовательностей, кодируемых таким локусом. Например, первый аллель может находиться на одной хромосоме, в то время как второй аллель находится на второй гомологичной хромосоме, например, как это происходит с разными хромосомами гетерозиготной особи или между различными гомозиготными или гетерозиготными особями в популяции. Одним из примеров полиморфизма является "однонуклеотидный полиморфизм" (ОНП), являющийся полиморфизм по одиночному нуклеотидному положению в геноме (нуклеотид в указанном положении варьирует между отдельными лицами или популяциями).

Аллель "положительно" коррелирует с признаком, когда аллель сцеплен с признаком, и когда присутствие аллеля указывает на то, что признак или форма признака будет иметь место у особи, включающей указанный аллель. Аллель отрицательно коррелирует с признаком, когда аллель сцеплен с признаком, и когда присутствие аллеля указывает на то, что признак или форма признака не будет иметь место у особи, включающей указанный аллель.

Маркерный полиморфизм или аллель "коррелирует" или "ассоциирован" с указанным фенотипом (например, подверженностью ВМД и т.д.), если можно установить его статистическую связь (положительную или отрицательную) с фенотипом. То есть указанный полиморфизм чаще встречается в исследуемой популяции (например, пациентов с ВМД), чем в контрольной популяции (например, лиц, не страдающих раком молочной железы). Часто определяют, что эта корреляция носит причинный характер, но этого может и не быть - простой генетической связи (ассоциации) признака, лежащего в основе фенотипа, с локусом достаточно для возникновения корреляции/ассоциации.

"Благоприятный аллель" является аллелем конкретного локуса, положительно коррелирующим с желательным фенотипом, например, устойчивостью к ВМД, например, аллелем, отрицательно коррелирующим с предрасположенностью к ВМД. Благоприятный аллель сцепленного маркера является маркерным аллелем, который отделяют от благоприятного аллеля. Благоприятная аллельная форма сегмента хромосомы является сегментом хромосомы, включающим нуклеотидную последовательность, положительно коррелирующую с желательным фенотипом или отрицательно коррелирующую с неблагоприятным фенотипом, в одном или более генетических локусов, физически расположенных на сегменте хромосомы.

"Неблагоприятный аллель" является аллелем конкретного локуса, отрицательно коррелирующим с желательным фенотипом или положительно коррелирующим с нежелательным фенотипом, например, положительно коррелирующим с подверженностью раку молочной железы. Неблагоприятный аллель сцепленного маркера является маркерным аллелем, который отделяют от неблагоприятного аллеля. Неблагоприятная аллельная форма сегмента хромосомы является сегментом хромосомы, включающим нуклеотидную последовательность, отрицательно коррелирующую с желательным фенотипом или положительно коррелирующую с нежелательным фенотипом, в одном или более генетических локусов, физически расположенных на сегменте хромосомы.

"Аллель риска" является аллелем, положительно коррелирующим с риском развития заболевания или состояния, например, ВМД, то есть указывающим на то, что субъект обладает повышенной вероятностью развития ВМД, или прогрессирования ВМД до более поздней стадии.

"Полигенный показатель" используется для определения риска развития заболевания у субъекта или прогрессирования заболевания до более поздней стадии, на основе большого количества, обычно тысяч, распространенных генетических вариантов, каждый из которых по отдельности может оказывать незначительный эффект, внося вклад в заболевание или его прогрессирование, но в совокупности имеющих значительное прогностическое значение. В данном случае полигенный показатель используют для прогнозирования вероятности того, что ВМД у пациента будет прогрессировать до поздней стадии, с помощью распространенных однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП), ассоциированных с ВМД. Логарифм коэффициента несогласия (OR) каждого варианта, достигавшего P < 0,1 в наборе собранных данных, используют для расчета полигенного показателя. В частности, для каждого из 10617 вариантов, используемых при расчете показателя, логарифм коэффициента несогласия умножают на количество эталонных аллелей (0, 1 или 2), присутствующих у субъекта. Полученную сумму делят на количество вариантов, протестированных у каждого субъекта, получая конечный полигенный показатель. В соответствии с настоящим изобретением, "высокий полигенный показатель" используют для обозначения полигенного показателя > 0,0001, "низкий полигенный показатель" используют для обозначения полигенного показателя < 0,0001, а полигенные показатели между двумя указанными порогами определяются как "средние полигенные показатели".

"Частота аллеля" относится к частоте (доле или проценту), с которой аллель присутствует в локусе у субъекта, в пределах линии или популяции линий. Например, для аллеля "А" диплоидные особи генотипа "AA", "Aa" или "аа" могут обладать частотой аллеля 2, 1 или 0, соответственно. Частоту аллеля в пределах линии или популяции (например, исследуемой или контрольной) можно оценить путем усреднения частот аллелей в образцах особей из этой линии или популяции. Аналогично, можно рассчитать частоты аллелей в популяции линий путем усреднения частот аллелей линий, из которых состоит популяция.

Особь является "гомозиготной", если особь несет только один тип аллеля в данном локусе (например, диплоидная особь несет копию одного и того же аллеля в данном локусе на каждой из двух гомологичных хромосом). Особь является "гетерозиготной", если в данном локусе присутствует более одного типа аллеля (например, диплоидная особь несет одну копию каждого из двух различных аллелей). Термин "гомогенность" означает, что члены группы обладают одинаковым генотипом в одном или более конкретных локусах. В противоположность этому, термин "гетерогенность" используется для указания того, что особи в группе различаются по генотипу в одном или более указанных локусах.

"Локус" является положением или областью на хромосоме. Например, полиморфный локус является положением или областью, где расположена полиморфная нуклеиновая кислота, детерминанта признака, ген или маркер. В другом примере "локус гена" является определенным положением (областью) хромосомы в геноме вида, где может находиться определенный ген. Аналогично, термин "локус количественного признака" или "QTL" относится к локусу, содержащему, по меньшей мере, два аллеля, по-разному влияющие на экспрессию или изменяющие вариант количественного или непрерывного фенотипического признака в, по меньшей мере, одном генетическом окружении, например, в, по меньшей мере, одной популяции или потомстве.

"Маркер", "молекулярный маркер" или "маркерная нуклеиновая кислота" относится к нуклеотидной последовательности или кодируемому ею продукту (например, белку), используемому в качестве точки отсчета при идентификации локуса или сцепленного локуса. Маркер может происходить от геномной нуклеотидной последовательности или от экспрессированных нуклеотидных последовательностей (например, из РНК, ядерной _ΝРНК, мРНК, кДНК и т.д.), или от кодируемого полипептида. Данный термин также относится к нуклеотидным последовательностям, комплементарным или фланкирующим маркерные последовательности, например, нуклеиновым кислотам, используемым в качестве зондов или пар праймеров, способных амплифицировать маркерную последовательность.

"Маркерный зонд" является нуклеотидной последовательностью или молекулой, которую можно использовать для определения присутствия маркерного локуса, например, нуклеотидным зондом, комплементарным последовательности маркерного локуса. Нуклеиновые кислоты являются "комплементарными", когда они специфически гибридизуются в растворе, например, в соответствии с правилами спаривания оснований по Уотсону-Крику.

"Маркерный локус" является локусом, который можно использовать для отслеживания присутствия второго сцепленного локуса, например, сцепленного или коррелирующего локуса, кодирующего или вносящего вклад в популяционную изменчивость фенотипического признака. Например, маркерный локус можно использовать для мониторинга сегрегации аллелей в локусе, например, QTL, генетически или физически сцепленном с маркерным локусом. Таким образом, "маркерный аллель", или "аллель маркерного локуса" является одной из множества полиморфных нуклеотидных последовательностей, присутствующих в маркерном локусе в популяции, полиморфной по маркерному локусу. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает маркерные локусы, коррелирующие с интересующим фенотипом, например, фенотипом, увеличивающим вероятность того, что у субъекта с промежуточной ВМД заболевание будет прогрессировать до поздней стадии ВМД. Маркеры, соответствующие генетическим полиморфизмам у членов популяции, можно обнаружить с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Указанные способы включают, например, способы специфической амплификации последовательностей на основе ПЦР, обнаружение полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов (RFLP), обнаружение маркеров изоферментов, обнаружение аллель-специфической гибридизации (ASH), обнаружение однонуклеотидного расширения, обнаружение амплифицированных вариабельных последовательностей генома, обнаружение самоподдерживающейся репликации последовательностей, обнаружение простых повторов последовательности (SSR), обнаружение однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) или обнаружение полиморфизмов длины амплифицированных фрагментов (AFLP).

"Генотип" является генетической структурой особи (или группы особей) по одному или более генетическим локусам. Генотип определяется аллелем(ями) одного или более известных локусов особи, обычно, совокупностью аллелей, унаследованных от родителей. "Гаплотип" является генотипом особи по множеству генетических локусов в одной цепи ДНК. Как правило, генетические локусы, описываемые гаплотипом, физически и генетически сцеплены, т.е. находятся на одной и той же цепи хромосомы.

"Множество" маркеров или зондов относится к коллекции или группе маркеров или зондов, либо данным, полученным из них, используемым для достижения общей цели, например, идентификации особи с указанным фенотипом (например, подверженностью ВМД или подверженностью развитию поздней стадии ВМД). Часто данные, соответствующие маркерам или зондам, или полученные при их использовании, хранятся на электронном носителе. Хотя каждый из членов множества полезен для достижения указанной цели, отдельные маркеры, выбранные из множества, а также подмножества, включающие некоторые, но не все из маркеров, также являются эффективными для достижения указанной цели.

"Машиночитаемый носитель" является носителем информации, который может быть доступен с помощью компьютера при использовании доступного или пользовательского интерфейса. Примеры включают память (например, ПЗУ или ОЗУ, флэш-память и т.д.), оптические накопители (например, CD-ROM), магнитные накопители (например, жесткие диски, гибкие диски и т.д.), перфокарты, и многие другие носители, доступные и известные специалистам в данной области техники. Информацию можно передавать между интересующей системой и компьютером, или в или из компьютера на или с машиночитаемого носителя для хранения и доступа к хранимой информации. Эта передача может являться электрической передачей, либо может осуществляться другими доступными способами, например, с помощью ИК-связи, беспроводного соединения и т.п.

Термины "фактор D" и "фактор комплемента D" используются взаимозаменяемо и относятся к нативной последовательности и вариантным полипептидам фактора D.

Фактор D с "нативной последовательностью" является полипептидом, обладающим аминокислотной последовательностью, аналогичной полипептиду фактора D, полученному из природного источника, независимо от способа его получения. Таким образом, фактор D с нативной последовательностью можно выделить из естественных источников или получить рекомбинантным и/или синтетическим путем. В дополнение к зрелому белку фактора D, например, зрелому белку фактора D человека, термин "фактор D с нативной последовательностью", в частности, охватывает природные формы-предшественники фактора D (например, неактивный белок-предшественник, протеолитически расщепляющийся с получением активной формы), природные вариантные формы (например, формы, получаемые при альтернативном сплайсинге) и природные аллельные варианты фактора D, а также структурные конформационные варианты молекул фактора D, обладающих аминокислотной последовательностью, аналогичной полипептиду фактора D, полученному из природного источника. Полипептиды фактора D животных, не являющихся человеком, в том числе высших приматов и млекопитающих, не являющихся человеком, специфически включены в данное определение.

"Вариант фактора D" или "вариант фактора комплемента D" означает активный полипептид фактора D, как определено ниже, обладающий, по меньшей мере, приблизительно 80% идентичностью аминокислотной последовательности нативной последовательности полипептида фактора D. Обычно вариант фактора D обладает, по меньшей мере, приблизительно 80% идентичностью аминокислотной последовательности, или, по меньшей мере, приблизительно 85% идентичностью аминокислотной последовательности, или, по меньшей мере, приблизительно 90% идентичностью аминокислотной последовательности, или, по меньшей мере, приблизительно 95% идентичностью аминокислотной последовательности или, по меньшей мере, приблизительно 98% идентичностью аминокислотной последовательности, или, по меньшей мере, приблизительно 99% идентичностью аминокислотной последовательности зрелому полипептиду фактора D. Предпочтительно, наибольшая степень идентичности последовательности имеет место в пределах активного центра фактора D.

"Активный центр" фактора D определяется His-57, Asp-102 и Ser-195 (химотрипсиногенная нумерация) последовательности фактора D человека. Фактор D содержит Asp189 (химотрипсиновая нумерация) в нижней части кармана первичной специфичности и расщепляет пептидную связь Arg. Указанная каталитическая триада состоит из His-57, Asp-102 и Ser-195. Asp-102 и His57 демонстрируют атипичные конформации по сравнению с другими сериновыми протеазами (Narayana et al., J. Mol. Biol. 235 (1994), 695-708). Между Asp189 и Arg218 в нижней части кармана S1 наблюдается уникальный солевой мостик, поднимающий петлю 214-218 и образующий глубокий и узкий карман 1 (Jinget al., J. Mol. Biol. 282 (1998) 1061-1081). Мутационный анализ показал, что эта петля и несколько других остатков вокруг активного сайта являются ключевыми структурными детерминантами эстеролитической активности фактора D (Kim et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 24399-24405). На основании этих результатов предполагалось, что фактор D может подвергаться конформационному изменению при связывании C3b-связанного фактора В, что приводит к проявлению протеолитической активности (Volanakis and Narayana, Protein Sci. 5 (1996) 553-564).

Термин "ФРЭС" или "VEGF", как используется здесь, относится к 165-аминокислотному фактору роста эндотелия сосудов человека и родственным 121-, 189- и 206-аминокислотным факторам роста эндотелия сосудов человека, как описано в Leung et al. Science, 246:1306 (1989), и Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), а также их природным аллельным и полученным в результате процессинга формам. Термин "ФРЭС" также относится к ФРЭС видов, не являющихся человеком, например, мыши, крысы или приматов. Иногда ФРЭС из определенного вида обозначают такими терминами, как hVEGF для ФРЭС человека, mVEGF для ФРЭС мыши и т.д. Термин "ФРЭС" также используют по отношению к укороченным формам полипептида, включающим аминокислоты 8-109 или 1-109 165-аминокислотного фактора роста эндотелия сосудов человека. Упоминание таких форм ФРЭС в настоящей заявке можно определить, например, по "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" или "VEGF.sub.165". Аминокислотные положения в "укороченном" нативном ФРЭС нумеруют, как указано в нативной последовательности ФРЭС. Например, аминокислотное положение 17 (метионин) в укороченном нативном ФРЭС также является положением 17 (метионин) в нативном ФРЭС. Укороченный нативный ФРЭС обладает сродством связывания с рецепторами KDR и Fit-1, сопоставимым со сродством нативного ФРЭС.

Термин "вариант ФРЭС", как используется здесь, относится к полипептиду ФРЭС, включающему одну или более аминокислотных мутаций в нативной последовательности ФРЭС. Необязательно, указанные одна или несколько аминокислотных мутаций включают аминокислотную(ые) замену(ы). Для условного обозначения вариантов ФРЭС, описанных здесь, следует отметить, что числа относятся к положению аминокислотного остатка в аминокислотной последовательности предполагаемого нативного ФРЭС (представленной в Leung et al., supra и Houck et al., supra.).

"Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" определяют как процентное содержание аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, идентичных аминокислотным остаткам в эталонной последовательности фактора D после выравнивания последовательностей и, при необходимости, внедрения пробелов для достижения максимальной процентной идентичности последовательности, без учета консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения процентной идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществить различными способами, известными специалистам в данной области, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, например, программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры измерения выравнивания, включая алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Затем рассчитывают идентичность последовательности по отношению к более длинной последовательности, т.е. даже если более короткая последовательность демонстрирует 100% идентичность последовательности фрагменту более длинной последовательности, общая идентичность последовательностей составляет менее 100%.

"Процент (%) идентичности нуклеотидной последовательности" определяют как процентное содержание нуклеотидов в последовательности-кандидате, идентичных нуклеотидам в эталонной последовательности, кодирующей фактор D, после выравнивания последовательностей и, при необходимости, внедрения пробелов для достижения максимальной процентной идентичности последовательности. Выравнивание для целей определения процентной идентичности нуклеотидных последовательностей можно осуществить различными способами, известными специалистам, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, например, программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры измерения выравнивания, включая алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Затем рассчитывают идентичность последовательности по отношению к более длинной последовательности, т.е. даже если более короткая последовательность демонстрирует 100% идентичность последовательности фрагменту более длинной последовательности, общая идентичность последовательностей составляет менее 100%.

"Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты является молекулой нуклеиновой кислоты, идентифицированной и отделенной от, по меньшей мере, одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциирована в природном источнике нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается по форме или структуре от молекул, встречающихся в естественных условиях. Поэтому выделенные молекулы нуклеиновых кислот отличаются от молекул нуклеиновых кислот в том виде, как они существуют в природных клетках. В то же время, выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулы нуклеиновых кислот, содержащиеся в клетках, обычно экспрессирующих кодируемый полипептид, где, например, указанная молекула нуклеиновой кислоты располагается на хромосоме в положении, отличающемся от положения в природных клетках.

"Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид фактора D, является молекулой нуклеиновой кислоты, идентифицированной и отделенной от, по меньшей мере, одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциирована в природном источнике нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор D. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид фактора D, отличается по форме или окружению от молекул, встречающихся в естественных условиях. Поэтому выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид фактора D, отличаются от кодирующих(ей) молекул(ы) нуклеиновых кислот в том виде, как они существуют в природных клетках. В то же время, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая фактор D, включает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие фактор D и содержащиеся в клетках, обычно экспрессирующих фактор D, где, например, указанная молекула нуклеиновой кислоты располагается на хромосоме в положении, отличающемся от положения в природных клетках.

Термин "антагонист" используется в самом широком смысле и включает любую молекулу, которая способна нейтрализовать, блокировать, частично или полностью ингибировать, устранять, снижать или препятствовать биологической активности фактора D. Антагонисты фактора D включают, без ограничения, антитела против фактора D и их антигенсвязывающие фрагменты, другие связывающие полипептиды, пептиды и непептидные низкомолекулярные соединения, связывающиеся с фактором D и способные нейтрализовать, блокировать, частично или полностью ингибировать, устранить, снизить или препятствовать активности фактора D, например, способности фактора D участвовать в патологии комплемент-ассоциированного состояния глаз, в частности, ВМД.

"Низкомолекулярное соединение", согласно определению, приведенному здесь, обладает молекулярной массой менее приблизительно 600, предпочтительно менее приблизительно 1000 дальтон.

"Активный" или "активность" или "биологическая активность" в контексте антагониста фактора D является способностью противодействовать (частично или полностью ингибировать) биологической активности фактора D. Предпочтительной биологической активностью антагониста фактора D является способность обеспечить измеримое улучшение, например, патологии заболевания или состояния, ассоциированного с фактором D, например, комплемент-ассоциированного состояния глаз, в частности, ВМД. Активность можно определять с помощью тестов in vitro или in vivo, в том числе, анализов связывания, используя соответствующую модель животного или клиническое исследование на людях.

Термин "антитело" используется в самом широком смысле и включает, без ограничения, одиночные моноклональные антитела (включая агонистические, антагонистические и нейтрализующие антитела) и композиции антител с полиэпитопной специфичностью. Термин "моноклональное антитело", как используется здесь, относится к антителу, полученному из популяции практически однородных антител, т.е. отдельные антитела в составе популяции являются идентичными, за исключением мутаций, происходящих по естественным причинам, которые могут присутствовать в небольших количествах.

Термин "моноклональное антитело", как используется здесь, относится к антителу, полученному из популяции практически однородных антител, т.е. отдельные антитела в составе популяции являются идентичными, за исключением мутаций, происходящих по естественным причинам, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, поскольку они направлены против одиночной антигенной детерминанты. Кроме того, по сравнению с традиционными (поликлональными) препаратами антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одиночной детерминанты антигена. Определение "моноклональное" указывает на особенность антител, заключающуюся в том, что они получены из практически однородной популяции антител, и не должно расцениваться как необходимость получения антител с помощью какого-либо конкретного способа. Например, моноклональные антитела для использования в соответствии с настоящим изобретением можно получить с помощью гибридомной технологии, впервые описанной в работе Kohler et al. (1975) Nature 256:495, либо с помощью технологии рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). "Моноклональные антитела" также можно выделить из фаговых библиотек антител с помощью методик, описанных, например, в публикациях Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628 и Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597.

Моноклональные антитела здесь, в частности, включают "химерные" антитела (иммуноглобулины), в которых фрагмент тяжелой и/или легкой цепи идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям антител, полученных из организмов конкретной видовой принадлежности, или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных из организмов другой видовой принадлежности, или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они обладают желательной биологической активностью (патент США № 4816567; и Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855).

"Гуманизированные" формы антител нечеловеческого происхождения (например, антител мыши) являются химерными антителами, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения. В большинстве случаев, гуманизированные антитела являются иммуноглобулинами человека (антителами реципиента), в которых остатки из гипервариабельного участка реципиента замещены остатками из гипервариабельного участка антитела нечеловеческого происхождения (антитела донора), например, антитела мыши, крысы, кролика или примата, не являющегося человеком, обладающими желательной специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасного участка Fv (FR) иммуноглобулина человека замещают соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не присутствующие в антителах реципиента или в антителах донора. Эти модификации вносят для дальнейшей оптимизации функционирования антител. В общем случае гуманизированные антитела содержат практически все из, по меньшей мере, одного, а обычно - двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют аналогичным участкам из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, и все или практически все FR-области соответствуют последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированные антитела также необязательно содержат, по меньшей мере, фрагмент константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно происходящий из иммуноглобулина человека. Дополнительные подробности см. в Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; и Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.

"Видоспецифичное антитело" является антителом, которое имеет более сильное сродство связывания с антигеном первого вида млекопитающих, чем с гомологом указанного антигена второго вида млекопитающих. В норме видоспецифичное антитело “специфически связывается” с антигеном человека (т.е. обладает значением сродства связывания (K_d) не более приблизительно 1 × 10^-7 M, предпочтительно не более приблизительно 1 × 10^-8 М и наиболее предпочтительно не более приблизительно 1 × 10^-9 M), но обладает, по меньшей мере, приблизительно в 50 раз или, по меньшей мере, приблизительно в 500 раз или, по меньшей мере, приблизительно в 1000 раз более слабым сродством связывания к гомологу этого антигена у млекопитающего другого вида, не являющегося человеком, чем сродство связывания этого антитела с антигеном человека. Видоспецифичное антитело может являться антителом любого из различных типов, определение которых приведено выше, но предпочтительно является гуманизированным антителом или антителом человека.

Как используется здесь, термин "антитело-мутант" или "вариант антитела" относится к варианту аминокислотной последовательности антитела, в котором модифицированы один или несколько аминокислотных остатков антитела. Такие мутанты обязательно обладают менее чем 100% идентичностью последовательности или сходством с эталонным антителом. В предпочтительном варианте воплощения антитело-мутант обладает аминокислотной последовательностью, обладающей, по меньшей мере, 75% идентичностью аминокислотной последовательности или сходством с аминокислотной последовательностью вариабельного домена тяжелой или легкой цепи эталонного антитела, более предпочтительно - по меньшей мере, 80%, более предпочтительно - по меньшей мере, 85%, более предпочтительно - по меньшей мере, 90%, и наиболее предпочтительно - по меньшей мере, 95%. Идентичность или сходство по отношению к указанной последовательности определяется здесь как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, идентичных (т.е. совпадающий остаток) или аналогичных (т.е., аминокислотный остаток из той же группы на основании общих свойств боковых цепей) остаткам эталонного антитела после выравнивания последовательностей и, при необходимости, введения пробелов для достижения максимального процента идентичности последовательностей. N-концевые, С-концевые или внутренние расширения, делеции или вставки в последовательности антитела вне вариабельного домена не должны рассматриваться как влияющие на идентичность или сходство последовательности.

"Выделенное" антитело является антителом, идентифицированным и отделенным и/или очищенным от компонента своего природного окружения. Загрязняющие компоненты природного окружения являются материалами, которые обычно мешают диагностическому или терапевтическому использованию антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковоподобные или небелковоподобные растворенные вещества. В предпочтительных вариантах воплощения антитело очищают (1) до более чем 95 масс. % антитела в соответствии с определением по способу Лоури, и более предпочтительно - до более чем 99 масс. %, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с помощью секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности, определяемой при электрофорезе в ДСН-ПААГ при восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с помощью окрашивания Кумасси голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ в составе рекомбинантных клеток, при условии отсутствия, по меньшей мере, одного компонента природного окружения антитела. В то же время выделенное антитело обычно получают с использованием, по меньшей мере, одного этапа очистки.

Как используется здесь, термин "вариабельный домен антитела" относится к фрагментам легких и тяжелых цепей молекул антител, включающим аминокислотные последовательности областей, определяющих комплементарность (CDR; т.е. CDR1, CDR2 и CDR3) и каркасных областей (FR). V_H относится к вариабельному домену тяжелой цепи. V_L относится к вариабельному домену легкой цепи. В соответствии со способами, используемыми в настоящем изобретении, положения аминокислот, присваиваемые CDR и FR, можно определить согласно Кабату (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 и 1991)). Нумерация аминокислот антител или антигенсвязывающих фрагментов также соответствует нумерации по Кабату.

Как используется здесь, термин "области, определяющие комплементарность (CDR; т.е. CDR1, CDR2 и CDR3) относится к аминокислотным остаткам вариабельного домена антитела, присутствие которых необходимо для связывания антигена. Каждый вариабельный домен обычно содержит три области CDR, определяемые как CDR1, CDR2 и CDR3. Каждая область, определяющая комплементарность, может включать аминокислотные остатки из "области, определяющей комплементарность" согласно Кабату (т.е., приблизительно, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) и/или остатков из "гипервариабельной петли" (т.е., приблизительно, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917). В некоторых случаях область, определяющая комплементарность, может включать аминокислоты как из CDR, определяемой по Кабату, так и из гипервариабельной петли. Например, CDRH1 тяжелой цепи антитела 4D5 включает аминокислоты 26-35.

"Каркасные области" (далее FR) являются остатками вариабельного домена, отличающимися от остатков CDR. Каждый вариабельный домен обычно содержит четыре FR, определяемые как FR1, FR2, FR3 и FR4. Если CDR определяют по Кабату, остатки FR легкой цепи расположены приблизительно в области остатков 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) и 98-107 (LCFR4), а FR-остатки тяжелой цепи расположены приблизительно в области остатков тяжелой цепи 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) и 103-113 (HCFR4). Если CDR включают аминокислотные остатки гипервариабельных петель, остатки FR легкой цепи расположены приблизительно в области остатков легкой цепи 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) и 97-107 (LCFR4), а FR-остатки тяжелой цепи расположены приблизительно в области остатков тяжелой цепи 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) и 102-113 (HCFR4). В некоторых случаях, когда CDR включает аминокислоты как из CDR по Кабату, так и из гипервариабельной петли, FR-остатки корректируют соответствующим образом. Например, когда CDRH1 включает аминокислоты H26-H35, остатки FR1 тяжелой цепи располагаются в положениях 1-25, а остатки FR2 - в положениях 36-49.

Как используется здесь, "набор кодонов" относится к набору различных нуклеотидных триплетных последовательностей, используемых для кодирования желательного варианта аминокислот. Набор олигонуклеотидов можно синтезировать, например, путем твердофазного синтеза, включая последовательности, представляющие собой все возможные комбинации нуклеотидных триплетов, обеспечиваемые набором кодонов, и кодирующие желательную группу аминокислот. Стандартная форма обозначений кодонов является обозначениями по коду Международного биохимического союза, известному в данной области техники и описанному здесь. Набор кодонов обычно представлен 3 прописными буквами курсивом, например, NNK, NNS, XYZ, DVK и т.п. "Неслучайный набор кодонов", как используется здесь, таким образом, относится к набору кодонов, кодирующему выбранные аминокислоты, отвечающие частично, предпочтительно полностью, критериям выбора аминокислот, как описано здесь. Синтез олигонуклеотидов с выбранной нуклеотидной "вырожденностью" в определенных положениях хорошо известен в данной области техники, например, подход TRIM (Knappek et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57-86); Garrard & Henner (1993) Gene 128:103). Такие наборы олигонуклеотидов, содержащие определенные наборы кодонов, можно синтезировать с использованием коммерческих синтезаторов нуклеиновых кислот (доступных, например, от Applied Biosystems, Фостер-Сити, штат Калифорния, США), или получить коммерческим путем (например, от Life Technologies, Роквилл, штат Мэриленд, США). Следовательно, синтезированный набор олигонуклеотидов, содержащий определенный набор кодонов, как правило, включает множество олигонуклеотидов с различными последовательностями, причем различия устанавливаются набором кодонов в пределах полной последовательности. Олигонуклеотиды, используемые в соответствии с изобретением, обладают последовательностями, обеспечивающими гибридизацию с нуклеотидной матрицей вариабельного домена, а также могут, но не обязательно, включать сайты рестрикции, например, для целей клонирования.

Термин "фрагмент антитела" используется здесь в самом широком смысле и включает, без ограничения, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, (scFv)₂, dAb, и фрагменты области, определяющей комплементарность (CDR), линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител, миниантитела, диатела и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

"Fv"-фрагмент является фрагментом антитела, содержащим полный сайт распознавания и связывания антигена. Эта область состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой и одного вариабельного домена легкой цепи в прочной связи друг с другом, которая может иметь ковалентную природу, например, в scFv. Именно в этой конфигурации происходит взаимодействие трех CDR каждого вариабельного домена с образованием антиген-связывающего сайта на поверхности димера V_H-V_L. В совокупности шесть CDR или их поднабор придают антителу специфичность связывания с антигеном. В то же время, даже одиночный вариабельный домен (или половина Fv-фрагмента, включающая только три CDR, специфичных к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и обычно с более низкой аффинностью по сравнению с полноразмерным сайтом связывания.

"Fab"-фрагмент содержит вариабельный и константный домен легкой цепи и вариабельный домен и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. F(ab')₂-фрагменты антитела включают пару Fab-фрагментов, обычно ковалентно связанных друг с другом вблизи их С-концов шарнирными остатками цистеина. В данной области техники также известны другие варианты химического сопряжения фрагментов антитела.

"Одноцепочечные Fv-" или "scFv"-фрагменты антител включают V_H- и V_L-домены антитела, причем указанные домены присутствуют в одной полипептидной цепи. В общем случае полипептид Fv также содержит полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, позволяющий scFv формировать структуру, желательную для связывания с антигеном. Обзор scFv см. в работе Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Термин "диатела" относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, причем указанные фрагменты включают вариабельный домен тяжелой цепи (V.sub.H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в одной полипептидной цепи (V_H и V_L). За счет линкера, который является слишком коротким для спаривания двух доменов на одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Более полное описание диател приведено, например, в источниках EP 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.

Термин "линейные антитела" относится к антителам, описанным в Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062). Вкратце, указанные антитела включают пару тандемных Fd-сегментов (V_H-C_H1-V_H-C_H1), которые вместе с дополняющими полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

II. Подробное описание

Возрастная макулодистрофия (ВМД)

Возрастная макулодистрофия (ВМД) является медленно прогрессирующим дегенеративным заболеванием, достигающим кульминации при потере центрального зрения. В зависимости от тяжести заболевания, ВМД можно классифицировать на четыре категории, обладающие характеристиками, перечисленными в следующей Таблице 1.

Таблица 1 Категория 1 Категория 2 Категория 3 Категория 4 ВМД отсутствует Ранняя стадия ВМД Промежуточная ВМД Поздняя стадия ВМД Малое количество небольших друз или друзы отсутствуют Несколько небольших друз или малое количество друз среднего размера в одном или обоих глазах Много друз среднего размера или одна или более крупных друз в одном или обоих глазах Только в одном глазу, или разрушение светочувствительных клеток и опорной ткани в центральной области сетчатки (поздняя стадия сухой формы), или аномальные и хрупкие кровеносные сосуды под сетчаткой

      (влажная форма) Категория 1 по AREDS:
оба глаза практически не содержат аномалий Категория 2 по AREDS:
умеренные изменения в худшем глазу, в том числе множественные мелкие друзы, нераспространенные промежуточные друзы и/или пигментные аномалии Категория 3 по AREDS:
в худшем глазу, по меньшей мере, одна крупная друза диаметром, по меньшей мере, 125 мкм, распространенные промежуточные друзы и/или нецентральная географическая атрофия Категория 4 по AREDS:
в одном глазу ВМД на поздней стадии, или неоваскулярная или центральная географическая атрофия, или потеря зрения вследствие ВМД независимо от фенотипа, или в обоих глазах

Только у 18% пациентов с промежуточной ВМД (категория 3) имеет место прогрессирование до поздней стадии ВМД (категория 4) в течение 5 лет. Выявление людей с большим риском прогрессирования могло бы дать возможность клинических исследований с целью тестирования новых способов лечения ВМД и обеспечения понимания патогенных путей.

Известно, что полиморфизмы фактора комплемента Н, фактора комплемента I, фактора комплемента С2, сериновой пептидазы HtrA1, фактора комплемента C3 ассоциированы с ВМД. Мутации в CFH могут активировать комплемент, что, в свою очередь, может привести к ВМД/CNV. Сообщалось, что полиморфизм фактора комплемента H (CFH) составляет 50% атрибутивного риска ВМД (Klein et al., Science 308:385-9 (2005)). Обнаружено, что распространенный гаплотип при CFH (HF1/CFH) обуславливает предрасположенность к возрастной макулодистрофии (Hageman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102(2):7227-7232 (2005)). ВМД расщепляется как аутосомно-доминантный признак, причем локус заболевания картирован на хромосоме 1q25-q31 между маркерами D1S466 и D1S413, с максимальным показателем сцепления генов приблизительно 3,20 (Klein et al., Arch Opthalmol. 116(8):1082-9 (1998); Majewski et al., Am. J. Hum. Genet. 73(3):540-50 (2003); Seddon et al., Am. J. Hum. Genet. 73(4):780-90 (2003); Weeks et al., Am. J. Ophthalmol. 132(5):682-92 (2001); Iyengar et al., Am. J. Hum. Genet. 74(1):20-39 (2004)); на хромосоме 2q3/2q32 между маркерами D12S1391 и D2S1384, с максимальным показателем сцепления генов 2,32/2,03 (Seddon et al., supra); 3p13, между маркерами D12S1300 и D12S1763, с максимальным показателем сцепления генов 2,19 (Majewski et al., supra; Schick et al., Am. J Hum. Genet. 72(6):1412-24 (2003)); 6q14 между маркерами D6S1056 и DS249 с максимальным показателем сцепления генов 3,59/3,17 (Kniazeva et al., Am. J. Ophthalmol. 130(2):197-202 (2000)); 9q33, в области маркера D9S934, с максимальным показателем сцепления генов 2,06 (Mejwski et al., supra); 10q26 в области маркера D10S1230, с максимальным показателем сцепления генов 3,06 (Majewski et al., supra; Iyengar et al., supra; Kenealy et al., Mol. Vis. 10:57-61 (2004); 17q25 в области маркера D17S928, максимальный показатель сцепления генов 3,16 (Weeks et al., supra); и 22q12 в области маркера D22S1045, с максимальный показатель сцепления генов 2,0 (Seddon et al., supra). Соответственно, генетический скрининг является важной частью идентификации пациентов, являющихся особенно хорошими кандидатами для профилактического лечения, в том числе предотвращения прогрессирования заболевания до более тяжелой формы.

Способы генотипирования

Настоящее изобретение включает обнаружение и анализ большого количества распространенных генетических вариантов (например, ОНП), которые можно использовать для расчета полигенного показателя с целью выявления лиц с повышенным риском прогрессирования ВМД до поздней стадии. Способы обнаружения соответствующих аллелей включают различные способы, хорошо известные в данной области, например, технологии амплификации генов. Например, обнаружение может включать амплификацию полиморфизма или последовательности, ассоциированной с ним, и обнаружение полученного ампликона. Указанный подход может включать смешивание праймера для амплификации или пары праймеров для амплификации с нуклеотидной матрицей, выделенной из организма или биологического образца (например, включающей ОНП или другой полиморфизм), причем праймер или пара праймеров комплементарны или частично комплементарны, по меньшей мере, фрагменту гена-мишени, или последовательности, расположенной поблизости от него. Амплификацию можно выполнить с помощью реакции полимеризации ДНК (например, ПЦР, ОТ-ПЦР), включающей полимеразу и нуклеотидную матрицу, с целью получения ампликона. Ампликон обнаруживают любым доступным способом обнаружения, например, секвенированием, гибридизацией ампликона с набором фрагментов ДНК (или фиксацией ампликона на матрице и гибридизацией зондов с ампликоном), гидролизом ампликона ферментом рестрикции (например, RFLP), анализом на основе ПЦР в реальном времени, однонуклеотидным расширением, аллель-специфической гибридизацией и т.п. Генотипирование также можно выполнить с помощью других известных методик, например, использованием увеличения массы праймера и масс-спектрометрического (МС) анализа с времяпролётной ионизацией лазерной десорбцией и использованием матрицы (MALDI-TOF), например, технологии MassEXTEND (Sequenom, Сан-Диего, штат Калифорния, США).

Полигенный показатель для прогнозирования прогрессирования ВМД до поздней стадии

Известные аллели риска ВМД ограничивают возможность прогнозирования прогрессирования ВМД, например, прогрессирования от промежуточной ВМД к поздней стадии ВМД, по отдельности или в совокупности. Таким образом, авторы изобретения вначале разработали полигенный показатель ВМД, анализируя результаты полногеномного исследования ассоциаций в 1100 случаях ВМД поздней стадии, 8300 контрольных случаях и 610000 ОНП, а также создав упорядоченный список всех независимых ОНП ниже порога Р < 0,1. Затем авторы изобретения проверили гипотезу о том, что полигенный показатель, состоящий из тысяч распространенных вариантов, может являться прогностическим средством прогрессирования промежуточной ВМД до поздней стадии ВМД, и обнаружили, что полигенный показатель эффективно идентифицирует лиц с повышенным риском прогрессирования ВМД до поздней стадии. Согласно полногеномному исследованию ассоциаций был создан упорядоченный список всех независимых ОНП ниже порогового значения P (например, P < 0,1, P < 0,05, P < 0,001). Показатель для каждого лица является количеством присутствующих у него вариантов риска, взвешенных с учетом величины эффекта (коэффициента несогласия). На следующем этапе выполнили оценку эффективности полигенного показателя при прогнозировании прогрессирования ВМД до поздней стадии.

Результаты, обсуждаемые ниже в разделе "Пример", показывают, что лица с высоким полигенным показателем, страдающие промежуточной ВМД, характеризуются повышенным приблизительно в 2,3 раза риском прогрессирования ВМД в течение 2 лет и повышенным приблизительно в 2,6 раза риском прогрессирования ВМД в течение 5 лет. Полигенный показатель значительно повышает возможность прогнозирования прогрессирования по сравнению с известными локусами риска ВМД, при использовании отдельно или в комбинации. Соответственно, полигенный показатель является полезным инструментом для выявления таких пациентов с целью раннего вмешательства, а также для проверки агентов-кандидатов, которые могут быть эффективны при замедлении или ингибирования прогрессирования ВМД до поздней стадии у наиболее уязвимой популяции пациентов.

Настоящее изобретение обеспечивает улучшенные средства раннего обнаружения для выявления пациентов, подверженных наибольшему риску развития поздней стадии ВМД, что позволяет, в некоторых случаях, предотвратить развитие, или, по меньшей мере, замедлить прогрессирование ВМД, например, путем принятия ранних профилактических мер, лечения пациентов любыми существующими средствами, изменения образа жизни пациента, в том числе диеты, физической нагрузки и т.д. Кроме того, полигенный показатель, определяемый в соответствии с настоящим изобретением, может также помочь в получении информации о степени вероятности ответа пациента на конкретный способ лечения ВМД, включая экспериментальные процедуры. Соответственно, настоящее изобретение также позволяет выявить популяцию пациентов для тестирования терапевтических средств для предотвращения или замедления прогрессирования ранней стадии ВМД до поздней стадии ВМД.

Лечение ВМД

Ингибиторы комплемента, которые можно использовать для лечения ВМД, включают, например, антагонисты фактора D и антагонисты фактора Н и ингибиторы, блокирующие действие пропердина, фактора B, фактора Ba, фактора Bb, C2, С2а, С3а, C5, С5а, C5b, С6, С7, С8, С9 или C5b-9. Ингибиторы комплемента для лечения ВМД описаны, например, в патентных публикациях США №№ 20090181017 и 20090214538. Антитела против фактора D, пригодные для ингибирования активации комплемента и лечения комплемент-ассоциированных заболеваний, включая ВМД, также описаны в патентах США №№ 6956107; 7112327; и 7527970.

Для лечения ВМД также можно использовать антитела против ФРЭС, описанные, например, в патенте США № 7758859. В июне 2006 года FDA одобрило использование Lucentis^® (луцентиса, ранибизумаба) для лечения поздних или "влажных" форм макулодистрофии. Другие средства для лечения включают, без ограничения, Macugen^® (пегаптаниб-натрий), вводимый путем внутриглазной инъекции, причем лечение необходимо осуществлять каждые шесть недель.

Существуют экспериментальные средства лечения, например, гибридные молекулы STIgMA (CRIg) или STIgMA-(CRIg)-Ig (см., например, патент США № 7419663); антагонисты ИФР-1 (см., например, патент США № 7432244);

Все публикации (в том числе патенты и патентные заявки), процитированные здесь, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

Дальнейшие подробности изобретения представлены в следующем неограничивающем примере.

ПРИМЕР

Прогнозирование прогрессирования возрастной макулодистрофии до поздней стадии с помощью полигенного показателя

СПОСОБЫ

Образцы для исследования, определение и генотипирование

Случаи ВМД. В исследовании использовали 4 коллекции случаев ВМД: AREDS (Исследование возрастных заболеваний глаз на основе Национального института глаза США), DAWN, исследование UCSD и OSHU. Авторы изобретения выбрали 564 образца из коллекции Исследования возрастных заболеваний глаз (AREDS). Критерий включения, основанный на окончательном статусе ВМД (AMDSTAT) пациентов (6 = крупные друзы, 11 = CNV, 12 = CGA, 13 = и CNV, и CGA), использовали в ходе анализа в качестве случаев. Авторы изобретения также включили 352 случая ВМД CNV из исследования DAWN. Исследование DAWN является генетическим суб-исследованием, являющимся коллекцией образцов, полученных во время трех клинических испытаний фазы II/III препарата луцентис (FOCUS, MARINA и ANCHOR). Еще 142 образца отобрали из UCSD-исследования ВМД. Наконец, в качестве дополнительных случаев включили 42 случая CNV, полученных при испытаниях луцентиса IST, финансируемых разработчиком, выполненных в OSHU.

Контрольные образцы ВМД. Контрольные образцы для анализа получили из 4 отдельных коллекций. Авторы изобретения включили 441 образец из исследования AREDS с окончательным статусом ВМД в диапазоне от 1 до 5 (1 = контроль, 2 = контроль сомнителен 1, 3 = контроль сомнителен 2, 4 = контроль сомнителен 3, 5 = контроль сомнителен 4). В общей сложности 1861 контрольного субъекта из проекта рака г. Нью-Йорк отобрали для исследования и затем генотипировали на основе представленных в самоописании родословной, пола и возраста. Кроме того, получили данные о генотипе 1722 контрольных образцов (согласно самоописанию североамериканцевевропейского происхождения) из общедоступной базы данных iControlDB (www.illumina.com/pages.ilmn?ID=231). После разрешения на получение включили 2277 дополнительных случаев рака предстательной железы и контрольных образцов и 2287 случаев рака молочной железы и контрольных образцов из проекта "Генетические маркеры предрасположенности раку" (Cancer Genetic Markers of Susceptibility, Project CGEMS) (http://cgems.cancer.gov/data/).

После выполнения теста контроля качества (КК) каждой коллекции образцов по отдельности все коллекции образцов объединяли и выполняли дополнительный тест контроля качества.

В Таблице S1 описано количество лиц в каждой коллекции, матрица генотипирования и количество генотипированных образцов ОНП.

Контроль качества

Перед объединением коллекций образцов авторы изобретения выполнили независимые тесты контроля качества в каждой коллекции образцов. Авторы удалили ОНП с низким качеством (частота встречаемости < 50%) и отдельные образцы с частотой встречаемости менее 95%.

Контроль качества образцов.

Авторы изобретения исключили образцы с > 5% отсутствующих генотипов, один образец из каждой из неявных или непредусмотренных пар дубликатов (определенных по идентичности происхождения, рассчитанной с использованием PLINK), аномальные для популяции образцы (образцы со значениями > 5 SD от среднего для первых 10 собственных векторов), выявленные с использованием программы eigenstrat, и образцы с несоответствием между представленной и определенной на основе данных генотипа половой принадлежностью.

Контроль качества ОНП

После объединения всех образцов авторы изобретения выполнили следующие тесты КК ОНП. Авторы удалили ОНП с частотой встречаемости < 95%. ОНП с различным набором отсутствующих данных между исследуемой и контрольной группами (Р < 1x10-4) были исключены из окончательного набора данных. Кроме того, авторы протестировали каждый ОНП на соответствие закону Харди-Вайнберга и исключили ОНП, не прошедшие порог P < 1x10-4 в контрольной группе.

Анализ стратификации популяции

Для каждой группы авторы изобретения использовали маркеры родословной для коррекции возможной стратификации популяции. Подмножество из 5486 некоррелированных маркеров родословной, удовлетворяющих жестким критериям контроля качества, использовали для получения десяти главных компонентов генетической изменчивости с помощью EIGENSTRAT (Price, A.L. et al. Principal components analysis corrects for stratification in genome-wide association studies. Nat. Genet. 38, 904-909 (2006)). Из каждого набора образцов удалили аномальные значения (определяемые как s.d. > 6). Для коррекции стратификации случай-контроль авторы изобретения применили коррекцию критерия Кохрена-Армитажа, включенную в EIGENSTRAT.

Анализ ассоциаций

Авторы изобретения выполнили логистическую регрессию статуса ВМД для каждого ОНП, используя главные компоненты в качестве ковариат. Авторы включили в модель основные компоненты, продемонстрировавшие ассоциацию со статусом ВМД в экспериментальной/контрольной группах.

Получение полигенного показателя в целевых выборках

Авторы изобретения отобрали ОНП с частотой минорного аллеля > 2% в объединенной выборке и частотой встречаемости при генотипировании > 99%. Поскольку многие из оставшихся ОНП характеризуются выраженным неравновесным сцеплением друг с другом, авторы изобретения удалили указанные ОНП с целью получения независимого набора ОНП. Авторы изобретения использовали команду PLINK --indep-pairwise с порогом r2 = 0,25, скользящее окно 200 ОНП и перекрывание между соседними окнами 20 ОНП.

В каждом анализе авторы изобретения образовали независимые выборки для обнаружения ошибок и целевые выборки. В каждом из сценариев, описанных выше, авторы рассчитали критерии ассоциаций для каждого ОНП в выборке для обнаружения ошибок, используя логистическую регрессию с основными компонентами в качестве ковариат. Для укороченного списка ОНП авторы изобретения получили список, упорядоченный по значению P. Авторы изобретения получили подмножества ОНП на основании различных пороговых значений P (P < 0,0001, Р < 0,001, Р < 0,01, Р < 0,05, Р < 0,10, Р < 0,20, Р < 0,30, Р < 0,40, Р < 0,50, Р < 1,00). Для каждого подмножества ОНП авторы изобретения использовали эталонный аллель и логарифм коэффициента несогласия (OR) выборки для обнаружения ошибок для получения полигенного показателя во второй независимой целевой выборке. Указанный показатель являлся средней по всем ОНП суммой количества эталонных аллелей (0, 1 или 2) каждого ОНП, умноженной на логарифм OR для указанного ОНП. Авторы изобретения приступили к проверке гипотезы о том, что полигенный показатель является прогностическим средством заболевания или прогрессирования заболевания.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Вначале авторы изобретения подтвердили способность 7 известных ОНП в 5 известных локусах, ассоциированных с ВМД: фактора комплемента Н (rs10737680 и rs1329424), фактора комплемента I (rs2285714); комплемента C2 (rs429608 и rs9380272)'HTRA1 (rs3793917) и комплемента С3 (rs2230199) (см. таблицу 1 в статье Chen et al., PNAS 107(16):7401-7406 (2010)) усиливать прогрессирование ВМД до поздней стадии у 764 лиц с промежуточной ВМД (категория 3) на основании исследования истории болезни при возрастном заболевании глаз. Используя суммарный показатель на основе 7 известных аллелей риска ВМД, авторы изобретения выявили популяцию (14% популяции с промежуточной ВМД) с частотой прогрессирования 31% в течение 5 лет, что в 1,6 раза больше по сравнению с неотселектированной популяцией. Затем авторы изобретения проверили гипотезу о том, что полигенный показатель, состоящий из тысяч распространенных вариантов, может являться прогностическим средством прогрессирования ВМД до поздней стадии. Авторы изобретения выполнили полногеномное исследование ассоциаций по 925 случаям поздней стадии ВМД и 7863 здоровых контрольных лиц европейского происхождения. Авторы изобретения получили полигенный показатель, состоящий из 10616 независимых локусов со значением р < 0,10, полученных при полногеномном сканировании ассоциаций. Для каждого из 764 лиц с промежуточной ВМД (категория 3) рассчитывали полигенный показатель как среднюю сумму количества аллелей риска (0, 1 или 2) каждого ОНП, взвешенных по логарифму коэффициента несогласия для указанного ОНП. Лица с высоким полигенным показателем (14% популяции с промежуточной ВМД) характеризуются 47% риском прогрессирования в течение 5 лет по сравнению с 13% риском для остальной части популяции с промежуточной ВМД. Результаты показаны на Фигурах 1-3. Указанный результат представляет собой 2,6-кратное увеличение риска по сравнению с неотселектированной популяцией и значительное улучшение эффективности прогноза по сравнению с показателем, состоящим из 7 подтвержденных локусов ВМД. Результаты показывают, что тысячи распространенных вариантов позволяют прогнозировать прогрессирование ВМД, и означают, что в наследовании ВМД участвуют сотни локусов риска ВМД с незначительными отдельными эффектами.

Настоящая заявка включает таблицу, озаглавленную "Таблица S1". Таблица S1 представлена в альбомной ориентации при подаче настоящей заявки. Таблица S1 содержит список 10617 ОНП. CHR = хромосома; ОНП = ОНП ID; BP = физическое положение (пар оснований); А1=код первого (минорного) аллеля; F_A - частота аллеля 1 в исследуемых случаях; F_U: частота аллеля в контрольных случаях; А2 = код второго (основного) аллеля; CHISQ=значение хи-квадрат; Р = значение р (значимости теста ассоциированности "случай/контроль"); OR = коэффициент несогласия для ассоциированности с риском ВМД. В некоторых случаях минорный аллель ассоциирован с риском (OR>1), а в некоторых случаях основной аллель ассоциирован с риском ВМД (OR<1).

Результаты указанного анализа полигенного показателя могут быть доработаны и дополнены анализом данных дополнительного полногеномного исследования ассоциаций (GWAS), которые находятся в открытом доступе или будут получены в будущих GWAS-исследованиях. Дальнейшая доработка указанного анализа также может достигаться путем дальнейшего анализа существующих или будущих наборов данных, например, путем учета данных сравнительного анализа хориоидальной неоваскуляризации (CNV) и географической атрофии, вовлекающей центр желтого пятна (CGA). Кроме того, существуют другие методики определения полигенных показателей риска, например, алгоритмы опорных векторов (SMV).

Настоящее изобретение относится к способам выявления лиц с промежуточной возрастной макулодистрофией (ВМД), характеризующихся повышенным риском прогрессирования ВМД до поздней стадии, с помощью полигенного показателя, рассчитываемого на основании результатов полногеномного исследования генных ассоциаций, использующего тысячи однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП). Способ может быть использован в медицине. 24 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Способ идентификации и лечения человека с диагнозом ранней или средней стадии возрастной макулодистрофии (ВМД) как имеющего риск развития поздней стадии возрастной ВМД, включающий
(a) определение в биологическом образце, взятого у указанного индивида, наличия или отсутствия аллелей риска распространенных аллельных вариантов, ассоциированных с ВМД, по меньшей мере в 1000 независимых локусах, выбранных из единичных нуклеотидных полиморфизмов, как указано в таблице S1, каждый единичный нуклеотидный полиморфизм имеет отношение коэффициента несогласия,
(b) вычисление полигенного показателя для указанного индивида путем умножения логарифма коэффициента несогласия для каждого указанного единичного нуклеотидного полиморфизма на количество эталонных аллелей, присутствующих у индивида, и путем деления полученной суммы на количество протестированных единичных нуклеотидов, где полигенный показатель свыше 0,0001 указывает на то, что у индивида имеется риск развития поздней стадии ВМД, и
(c) лечение ВМД у индивида с установленным повышенным риском развития поздней стадии ВМД.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что наличие или отсутствие риска аллелей определяют по меньшей мере в 2500, или по меньшей мере в 5000, или по меньшей мере в 7500, или по меньшей мере в 10000 независимых локусах.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что у индивида диагностирована ранняя стадия ВМД.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что у индивида диагностирована промежуточная ВМД.

5. Способ по п. 1, дополнительно включающий оценку одного или более аспектов анамнеза индивида.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанные один или несколько аспектов выбраны из группы, состоящей из возраста, этнической принадлежности, индекса массы тела, истории потребления алкоголя, истории курения, истории физических нагрузок, диеты, семейного анамнеза ВМД или других возрастных офтальмологических состояний, включая возраст родственников на момент постановки им диагноза, и истории лечения ВМД.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обнаружение наличия или отсутствия аллелей риска осуществляют путем амплификации нуклеиновой кислоты из указанного образца.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что амплификация включает ПЦР.

9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что праймеры для амплификации расположены на чипе.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что праймеры для амплификации специфичны по отношению к аллелям указанных распространенных генетических вариантов.

11. Способ, по п. 7, отличающийся тем, что амплификация включает:
(i) смешивание праймера для амплификации или пары праймеров для амплификации с нуклеотидной матрицей, выделенной из биологического образца, причем праймер или пара праймеров комплементарны или частично комплементарны области, располагающейся вблизи от или включающей полиморфизм, и способны инициировать полимеризацию нуклеиновой кислоты на матричной нуклеиновой кислоте за счет полимеразы; и
b) удлинение праймера или пары праймеров в ходе реакции полимеризации ДНК с участием полимеразы и матричной нуклеиновой кислоты, приводящее к получению ампликона.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что ампликон обнаруживают с помощью способа, включающего одно или более из следующего: гибридизацию ампликона с набором фрагментов, гидролиз ампликона с помощью фермента рестрикции или анализ на основе ПЦР в реальном времени.

13. Способ по п. 7, отличающийся тем, что амплификация включает выполнение полимеразной цепной реакции (ПЦР), ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) или лигазной цепной реакции (ЛЦР) с использованием нуклеиновой кислоты, выделенной из организма или биологического образца, в качестве матрицы для ПЦР, ОТ-ПЦР или ЛЦР.

14. Способ по п. 7, дополнительно включающий расщепление амплифицированной нуклеиновой кислоты.

15. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанный образец получен из слюны или крови.

16. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию принятия решения о расписании и/или частоте диагностического тестирования ВМД для указанного индивида.

17. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию принятия решения о расписании и/или частоте лечения ВМД для указанного индивида.

18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное лечение включает введение лекарственного средства, выбранного из группы, состоящей из антител против фактора D, антител против ФРЭС, CRIg и гибрида CRIg-Ig.

19. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное лечение включает введение антитела против фактора D.

20. Способ по п. 1, отличающийся тем, что наличие или отсутствие аллелей риска определяют для всех однонуклеотидных полиморфизмов, представленных в таблице S1.

21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что полигенный показатель рассчитывают на основании указанного определения.

22. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию записи результатов указанного определения на стадии (а) на машиночитаемый носитель.

23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что об указанных результатах уведомляют индивида или врача индивида.

24. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанные результаты записывают в виде отчета.

25. Способ по п. 1, отличающийся тем, что исследуемые аллели риска не включают комплемент rs10737680 и rs1329424 (фактор комплемента Н); rs2285714 (фактор комплемента I); rs429608 и rs9380272 (комплемент С2), rs3793917 (HTRA1) и rs2230199 (комплемент С3).