ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ОТВЕТОМ НА СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ, КОТОРЫЕ ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННО ВОЗДЕЙСТВУЮТ НА ТОКСИН B CLOSTRIDIUM DIFFICILE Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/24 

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к генетическим маркерам на 6 хромосоме человека, прогнозирующим благоприятный ответ на лечение с использованием молекул, которые целенаправленно воздействуют на токсин В С. difficile у пациента, нуждающегося в этом. Настоящее изобретение также относится ко способам применения генетических маркеров для диагностики и/или лечения указанных пациентов.

Ссылка на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/508066, поданной 18 мая 2017 года, находящейся в настоящее время на рассмотрении, и международной заявке № PCT/CN16/109900, поданной 14 декабря 2016 года, находящейся в настоящее время на рассмотрении.

Уровень техники настоящего изобретения

Clostridium difficile (С. difficile), анаэробная спорообразующая грамположительная бацилла, является наиболее распространенной причиной нозокомиальных инфекций в Соединенных Штатах Америки (США) и Европе (Lessa et al. et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 2015 372(9): 825-34). Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) признали С. difficile неотложной угрозой для здоровья населения (Center for Disease Control and Prevention. Antibiotic resistance threats in the United States, 2013. Atlanta, GA: U.S., Department of Health and Human Services). По данным CDC предполагается, что в 2011 году С. difficile была ответственна практически за полмиллиона случаев инфекции, в том числе 453000 установленных случаев инфекции С. difficile (CDI) в США и дополнительные 83000 случаев рецидивов (Lessa et al., выше). CDI также связывали с примерно 29000 смертей (Lessa et al., 2015, выше). В европейских исследованиях сообщаются подобные оценки частоты рецидивов CDI (Bauer et al. Clostridium difficile infection in Europe: a hospital-based survey. Lancet 2011; 377:63-73).

Практически все антибиотики, в том числе клиндамицин, цефалоспорины, пенициллины и фторхинолоны, были ассоциированы с проявляющимся в клинических условиях заболеванием, вызванным токсикогенной С. difficile (Bartlett, J.G., Clin Infect Dis. 46(10): 1489-92 (2008); Gorbach, S.L., N Engl J Med, 341(22): 1690-1 (1999); Kelly et al., N Engl J Med 330(4): 257-62 (1994)). Ассоциированное с C. difficile заболевание включает в себя антибиотик-ассоциированную диарею, колит и псевдомембранозный колит, и в некоторых случаях оно может прогрессировать в токсический мегаколон, сепсис и смерть. Несмотря на то, что некоторые пациенты, страдающие от CDI, отвечают на прекращение антибиотикотерапии, для большинства требуется лечение с использованием дополнительных средств, таких как метронидазол или ванкомицин (рассматриваемые в DuPont et al., Current Opinion in Infectious Diseases 21:500-507 (2008)). Существующие методы терапии часто неспособны устранить CDI или приводят к рецидивирующей болезни; следовательно, необходимы новые способы профилактического или терапевтического лечения.

Одной из самых больших проблем при контроле CDI является предотвращение рецидивов. После успешного лечения первоначальной CDI у 15-35% пациентов проявляется рецидив (Bouza et al., Antimicrobial therapy of Clostridium difficile-associated diarrhea. Med Clin N Am 2006; 90: 1141-63; McFarland LV. Renewed interest in a difficult disease: Clostridium difficile infections-epidemiology и current treatment strategies. Curr Opin Gastroenterol. 2009, 25(1): 24-35). Большинство этих рецидивов возникают в течение 60 суток после лечения первоначального эпизода (Bouza et al., 2006, выше; McFarland 2009, выше). После первого рецидива у 40% возникнет еще один рецидив, а после двух рецидивов вероятность возникновения дополнительных эпизодов CDI возрастает еще больше (Bouza et al., 2006, выше; McFarland 2009, выше).

Безлотоксумаб представляет собой человеческое моноклональное антитело (mAb), которое связывается с токсином В С. difficile (TcdB) и нейтрализует его, и было недавно одобрено FDA для снижения проявления рецидивов инфекции Clostridium difficile (CDI) у пациентов в возрасте 18 лет или старше, которые получают лечение CDI с использованием антибактериального лекарственного средства и имеют высокий риск рецидива CDI. Клинические испытания фазы 3 продемонстрировали, что у пациентов, которые имеют CDI и получают антибиотикотерапию, внутривенное (IV) введение одной дозы 10 мг/кг безлотоксумаба является безопасным и эффективным в предотвращении рецидива CDI. Несмотря на благоприятное воздействие, ожидаемое за счет доступности нового лечебного средства для предотвращения рецидива CDI, терапевтический эффект лекарственного препарата, который целенаправленно воздействует на токсин В С. difficile, может варьировать в широких пределах у пациентов, пораженных инфекцией Clostridium difficile. Чтобы обеспечить лучшие и более экономически эффективные методы лечения для CDI, существует потребность в способе идентификации пациентов, на которых с наибольшей вероятностью оказывают благоприятное воздействие методы лечения с использованием лекарственного препарата, который целенаправленно воздействует на токсин В С. difficile, например, антитела к TcdB.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение основывается на открытии того, что генетическая вариация на хромосоме 6 человека, такая как однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и различные аллели лейкоцитарного антигена человека (HLA), является в значительной степени ассоциированной с ответом на лечение антителом к токсину В С. difficile («TcdB») у пациентов, страдающих от инфекции Clostridium difficile (CDI) и/или ассоциированного с Clostridium difficile заболевания (CDAD) и/или их симптомов. Генетические полиморфизмы и варианты аллелей, ассоциированные с ответом на лечение с использованием лекарственного препарата, который целенаправленно воздействует на TcdB, называются в данном документе «маркерами ответа на лечение TcdB».

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения маркер ответа на лечение TcdB представляет собой SNP, который представляет собой полиморфизм С/Т, идентифицированный как rs2516513 в базе данных SNP NCBI. Присутствие аллеля Т ассоциируется с лучшим ответом на лечение, присутствует ли он в гомозиготном (Т/Т) или гетерозиготном (С/Т) состоянии. В совокупности генотипы Т/Т и С/Т ассоциируются с ~2-кратным снижением частоты рецидивов С. difficile по сравнению с общей нестратифицированной популяцией пациентов, получавших лечение безлотоксумабом для CDI. Несмотря на то что аллель Т имеет меньшую распространенность, чем аллель С в большинстве этнических популяций (минорный аллель), он является распространенным во многих этнических популяциях и может являться основанием для практикующих врачей, органов здравоохранения и компаний-поставщиков медицинских страховых услуг при выборе подходящей популяции инфицированных С. difficile пациентов, на которых может оказывать благоприятное воздействие лекарственный препарат против TcdB, например, антитело к TcdB.

Авторы настоящего изобретения также идентифицировали ассоциации между другими генетическими вариациями на хромосоме 6 и благоприятным ответом на лечение с использованием лекарственного препарата, который целенаправленно воздействует на TcdB, например, улучшением частоты рецидивов С. difficile у пациентов с CDI. Генетические варианты, ассоциированные с благоприятным ответом на лечение, в случае средства для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, например, антитела к TcdB, являются описанными в таблице 1 ниже, где PS означает полиморфный сайт согласно базе данных SNP NCBI.

Авторы настоящего изобретения в данном документе предполагают, что исследование индивидов в отношении присутствия одного или нескольких маркеров ответа на лечение TcdB в таблице 1 будет пригодным в ряде фармакогенетических продуктов и в способах, включающих идентификацию пациентов, которые с наибольшей вероятностью отвечают на терапию лекарственным препаратом, целенаправленно воздействующим на TcdB у пациентов с CDI, а также в помощи медицинским работникам при принятии решения, прописывать ли такой лекарственный препарат, например, антитело к TcdB, пациенту с CDI или пациенту, который имел CDI. Например, авторы настоящего изобретения предполагают, что исследование субъектов в отношении присутствия по меньшей мере одной копии (т.е. гетерозиготность или гомозиготность) одного или нескольких из маркеров ответа на лечение TcdB, описанных в таблице 1; а именно, аллеля Т для SNP rs2516513, аллеля А для rs113379306, аллеля А для SNP rs76166871, аллеля HLA-DRB1*07:01, аллеля HLA-DQB1*02:02 или аллеля HLA-DQA1*02:01, будет пригодным для таких продуктов и способов, а также в помощи таким медицинским работникам.

Все из SNP и аллелей в таблице 1 (HLA-DRB1*07:01, rs2516513, rs113379306, rs76166871, HLA-DQB1*02:02 и HLA-DQA1*02:01) являются пригодными либо по отдельности, либо в комбинации для прогнозирования рецидива CDI. Кроме того, SNP и генетические варианты в неравновесном сцеплении (LD) с SNPS в таблице 1 можно применять по отдельности или в комбинациях с SNP и аллелями в таблице 1.

Кроме того, как описано выше для SNP rs2516513, общая частота маркеров ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению в популяции может иметь меньшую распространенность в популяции в целом, нежели в конкретных подгруппах или этнических популяциях. См., например, таблицу 1А ниже, в которой представлены частоты аллеля HLA-DRB1*07:01, аллеля HLA-DQB1*02:02 и аллеля HLA-DQA1*02:01 в иллюстративных этнических популяциях. Частоты представлены для различных специфических подгрупп, и они представляют собой выборки репрезентативных популяций. Частоты в других не указанных в списке популяциях будут варьировать, и их можно получить из Gonzalez-Galarza et al., Allele Frequency Net 2015 Update: New Features for HLA Epitopes, KIR and Disease and HLA Adverse Drug Reaction Associations. Nucleic Acid Research 2015, 28, D784-8. Такая информация может быть полезной при выборе подходящей популяции инфицированных С. difficile пациентов, на которых может оказывать благоприятное воздействие лекарственный препарат против TcdB, например, антитело к TcdB.

Под «исследованием субъектов в отношении присутствия по меньшей мере одной копии одного или нескольких из маркеров ответа на лечение TcdB» в данном документе понимают, что для применения в способах согласно настоящему изобретению субъекты могут быть подвергнуты исследованию в отношении одного, двух, трех, четырех, пяти или шести из маркеров ответа на лечение Tcd согласно настоящему изобретению в любой комбинации, а также в комбинациях со сцепленными вариантами маркеров ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению, как описано ниже.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу предотвращения рецидива инфекции Clostridium difficile (С. difficile), включающему: введение терапевтически эффективного количества средства для лечения, которое целенаправленно воздействует на токсин В С. difficile (средства для лечения TcdB), пациенту, нуждающемуся в этом, при этом указанный пациент перед введением средства для лечения TcdB по результатам исследования является положительным в отношении по меньшей мере одной копии характеризующегося лучшим ответом аллеля из одного или нескольких маркеров ответа на лечение TcdB или сцепленных вариантов (т.е. вариантов в высокой LD) маркеров ответа на лечение TcdB; при этом один или несколько маркеров ответа на лечение TcdB является выбранным из группы, состоящей из: (а) аллеля Т однонуклеотидного полиморфизма (SNP) rs2516513; (b) аллеля A SNP rs113379306; (с) аллеля A SNP rs76166871; (d) аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1; (е) аллеля HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1 и (f) аллеля HLA-DQA1*02:01 гена HLA-DQA1.

В данном документе также представлен способ определения того, способен ли пациент отвечать на лекарственный препарат, который целенаправленно воздействует на токсин В С. difficile (TcdB) у пациента-человека, причем указанный способ включает: (а) получение или использование полученного биологического образца от указанного пациента; (b) определение того присутствует ли характеризующийся лучшим ответом аллель по меньшей мере одного маркера ответа на TcdB согласно настоящему изобретению или сцепленный вариант в биологическом образце; и (с) диагностирование пациента как такого, на которого с большей вероятностью окажет благоприятное воздействие лечение с использованием лекарственного препарата против TcdB, когда выявляют присутствие одной или нескольких копий характеризующегося лучшим ответом аллеля в биологическом образце.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления этого аспекта настоящего изобретения способ дополнительно включает стадию (d), которая включает введение терапевтически эффективного количества лекарственного препарата против TcdB пациенту с поставленным диагнозом.

В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления способов, представленных в данном документе, средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, представляет собой антитело к TcdB или его антигенсвязывающий фрагмент. В соответствии с дополнительными предпочтительными вариантами осуществления антитело к TcdB представляет собой безлотоксумаб.

Настоящее изобретение дополнительно относится к лекарственному продукту, который содержит фармацевтическую композицию и инструкцию по медицинскому применению препарата, при этом фармацевтическая композиция содержит антитело к TcdB, и инструкция по медицинскому применению препарата содержит фармакогенетические показания, при этом фармакогенетические показания содержат лечение инфекции С. difficile или предотвращение рецидива С. difficile у пациентов, инфицированных С. difficile, которые по результатам исследования являются положительными в отношении по меньшей мере одной копии характеризующегося лучшим ответом аллеля, выбранного из маркера ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению или сцепленного варианта.

Настоящее изобретение также относится к наборам для исследования пациента в отношении присутствия или отсутствия по меньшей мере одной копии характеризующегося лучшим ответом аллеля, выбранного из маркера ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению, при этом набор содержит набор реактивов, которые могут включать в себя олигонуклеотиды, предназначенные для генотипирования по меньшей мере одного из маркеров ответа на лечение TcdB.

Настоящее изобретение также включает в себя применение безлотоксумаба в производстве лекарственного средства для предотвращения рецидива С. difficile у пациента-человека, при этом пациент по результатам исследования является положительным в отношении характеризующегося лучшим ответом аллеля маркера ответа на лечение TcdB, раскрытого в данном документе.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой графическое изображение планов исследований MODIFY I (PN001) и MODIFY II (PN002), применяемых при измерении эффективности у пациентов, получающих лечение антителом к TcdB, т.е. безлотоксумабом.

На фиг. 2 представлен анализ доли субъектов с рецидивом CDI (PN001+PN002, популяция FAS) после лечения с использованием актоксумаба/безлотоксумаба (MK3415A), безлотоксумаба (MK-6072) или плацебо.

На фиг. 3 представлен краткий отчет о рецидивах CDI в подгруппе с высоким риском (PN001+PN002, популяция FAS).

На фиг. 4 представлены процент и количества субъектов с рецидивом CDI в различных группах лечения, участвующих в PN001 и PN002, и среди субъектов, используемых в GWAS анализах.

На фиг. 5А представлены примеры SNP в неравновесном сцеплении (LD) с rs2516513, на фиг. 5В представлены примеры SNP в LD с rs113379306, и на фиг. 5С представлены примеры SNP в LD с rs76166871.

На фиг. 6 иллюстрируются данные по условной подстановке HLA на основании данных GWAS в хМНС, объединенных из PN001 и PN002 (N=1001). 219 аллелей HLA подставляли в 3 гена HLA класса 1 и 4 гена HLA класса II, из которых 112 были одинаковыми с MAF>0,01.

На фиг. 7 иллюстрируется манхэттенский график, который идентифицирует р-значения для генетических вариантов, ассоциированных с ответом на лечение и частотой рецидивов CDI.

На фиг. 8 иллюстрируется график QQ GWAS анализа рецидивирующей CDI.

На фиг. 9 иллюстрируется региональный график р-значений для генетических вариантов вблизи rs2516513, показывающий ассоциацию с ответом на лечение и рецидивом CDI. Точки, обозначенные ромбиками, представляют целевой SNP rs2516513. Шкала в виде оттенков серого представляет информацию о LD для SNP в связи с rs11209026. Кривая представляет собой частоту рекомбинации (сМ/Мбаз согласно данным НарМар).

Фиг. 10. rCDI, стратифицированная по генотипу и категории риска. На фиг. 10 показано значительное снижение частоты случаев rCDI, встречающихся у получавших лечение BEZ участников исследования, которые несли аллель T rs2516513 (отличие рисков -21,5% с р-значением = 3,04Е-05 в сравнении с отличием рисков -10,7% в целом без стратификации по генотипу) и аллель HLA-DRB1*07:01 (отличие рисков -32,3% с р-значением = 1,95Е-05 в сравнении с отличием рисков -10,5% в целом без стратификации по генотипу) по сравнению с реципиентами РВО.

Фиг. 11. rCDI, стратифицированная по генотипам, и категории риска rCDI. На фиг. 11 показано, что снижение риска rCDI у получающих лечение BEZ участников, несущих аллель Т rs2516513 и HLA-DRB1*07:01, по сравнению с реципиентами РВО варьировало в зависимости от факторов риска.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

I. Определения и сокращения.

Для того чтобы настоящее изобретение было проще для понимания, определенные технические и научные термины специально определены ниже. Если это специально не определено в других местах в данном документе, все другие технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, которое обычно будет понятно квалифицированному специалисту в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, когда оно используется в контекстах, подобных используемым в данном документе.

В контексте данного документа, в том числе в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают в себя соответствующие им формы множественного числа, если контекст явно не предписывает иное.

Термин «приблизительно», когда его используют для модификации количественно определяемого параметра, например, дозы для терапевтического средства, обсуждаемого в данном документе, или продолжительности периода лечения, означает, что параметр может изменяться на величину до 10% выше или ниже изложенного численного значения для этого параметра.

«Актоксумаб» (альтернативно называемый в данном документе «АСТ», также известный как MK3415) представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело IgG1 (mAb), которое специфически связывается с рецептор-связывающим доменом токсина А С. difficile. Актоксумаб содержит CDR легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3), состоящие из последовательности аминокислот, которые изложены в SEQ ID NO: 10, 11 и 12, соответственно, и CDR тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3), состоящие из последовательности аминокислот, которые изложены в SEQ ID NO: 14, 15 и 16, соответственно. Актоксумаб содержит V_L участок, содержащий последовательность аминокислот, которая изложена в SEQ ID NO: 9, и V_H участок, содержащий последовательность аминокислот, которая изложена в SEQ ID NO: 13.

«Актоксумаб/безлотоксумаб» (альтернативно называемые в данном документе «АСТ+BEZ», также известных как MK3415A) относится к комбинации антител актоксумаба и безлотоксумаба и/или применению такой комбинации для лечения пациентов с CDI, в том числе для предотвращения рецидива CDI.

«Аллель» представляет собой конкретную форму гена или другого генетического локуса, отличающуюся от других форм своим конкретным сочетанием нуклеотидных последовательностей, термин «аллель» также включает в себя любую из альтернативных форм гена в этом генетическом локусе.

«Благоприятный результат» означает желаемый клинический результат лечения с использованием лекарственного препарата, который целенаправленно воздействует на TcdB, например, антитела к TcdB, в том числе, без ограничения: облегчение одного или нескольких симптомов заболевания, уменьшение степени тяжести заболевания (например, улучшение частоты рецидива С. difficile в контексте лечения CDI), стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) состояния заболевания, замедление прогрессирования заболевания, ослабление или временное облегчение болезненного состояния, продление жизни (по сравнению с ожидаемой продолжительностью жизни в отсутствие лечения), продолжительность жизни в отсутствие рецидивов, ремиссию (либо частичную, либо полную) и излечение (т.е. устранение заболевания).

«Характеризующийся лучшим ответом аллель» представляет собой конкретную форму гена или другого генетического локуса, которая, если она присутствует у пациента, приводит в результате к улучшенному клиническому показателю (например, улучшенному показателю частоты рецидивов С. difficile)) по сравнению с показателем у пациента, у которого отсутствует такая форма гена или другого генетического локуса.

«Безлотоксумаб» (альтернативно называемый в данном документе «BEZ», также известный как MK-6072) представляет собой полностью человеческое mAb подкласса изотипа IgG1/каппа, который с высокой аффинностью связывается с С-концевым лиганд-связывающим участком токсина В С. difficile (Kd=19 пМ) (патент США №8394819, раскрытие которого включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Безлотоксумаб в данное время разрабатывается для предотвращения рецидивов CDI у пациентов в возрасте 18 лет или старше, получающих антибиотикотерапию для CDI. Безлотоксумаб содержит CDR легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3), состоящие из последовательности аминокислот, которые изложены в SEQ ID NO: 2, 3 и 4, соответственно, и CDR тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3), состоящие из последовательности аминокислот, которые изложены в SEQ ID NO: 6, 7 и 8, соответственно. Безлотоксумаб содержит V_L участок, содержащий последовательность аминокислот, которая изложена в SEQ ID NO: 1, и V_H участок, содержащий последовательность аминокислот, которая изложена в SEQ ID NO: 5.

«Рецидив CDI», в целом, относится к новому эпизоду CDI у пациента, следующему за предшествующим эпизодом у пациента, который разрешился. Более конкретно, рецидив CDI у пациента диагностируют по проявлению новых симптомов CDAD, например, по проявлению нового эпизода диареи с положительным результатом анализа на токсин(токсины) С. difficile в кале после разрешения предшествующего эпизода и после прекращения терапии, являющейся стандартом лечения.

Термин «состоит, по существу, из» и его варианты, такие как «состоят, по существу, из» или «состоящий, по существу, из», которые используются в данном описании и формуле изобретения, указывают на включение любых перечисляемых элементов или группы элементов и необязательное включение других элементов, природа которых подобна или отличается от перечисленных элементов, не изменяющее существенно основные или новые свойства определенной схемы дозирования, способа или композиции.

Термин «пациент» (альтернативно называемый в данном документе «субъектом» или «индивидом») относится к млекопитающему, которое может быть инфицировано С. difficile. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления пациент представляет собой человека. В соответствии с дополнительными предпочтительными вариантами осуществления индивид представляет собой взрослого человека, т.е. возрастом по меньшей мере 18 лет. Пациент может получать профилактическое или терапевтическое лечение. Профилактическое лечение предполагает достаточно активный фармацевтический ингредиент (например, антитело к TcdB) для снижения вероятности или тяжести инфекции или рецидива С. difficile или их эффектов, т.е. CDAD. Терапевтическое лечение (например, антибиотиком) можно осуществлять для ослабления или прекращения инфекции С. difficile или ее эффектов или для снижения тяжести инфекции С. difficile или CDAD.

Пациент с «высоким риском» представляет собой пациента с 1 или более из следующих факторов риска рецидивирующей CDI: предшествующий эпизод CDI за прошедшие 6 месяцев, тяжелую CDI в начальный момент наблюдения (согласно оценке по Zar, как описано в Zar et al., A comparison of vancomycin and metronidazole for the treatment of Clostridium difficile-associated diarrhea, stratified by disease severity. Clin. Infect. Dis. 45: 302-307 (2007)), возраст ≤65 лет, CDI, вызванная гипервирулентным штаммом (риботипы 027, 078 или 244), ослабленный иммунитет, получение сопутствующих системных антибиотиков

Субъекты, «нуждающиеся в лечении», включают субъектов, которые уже имеют инфекцию С. difficile, а также субъектов, склонных к инфекции, или любое лицо, снижение вероятности инфекции у которого является желательным, или индивидов, у которых проявляются симптомы CDAD. Индивиды, склонные к CDI, включают индивидов, которые недавно страдали от инфекции С. difficile, независимо от того, являются ли такие индивиды по результатам исследования положительными в отношении CDI во время назначения конкретного средства для лечения или нет. Например, пациент, нуждающийся в лечении с использованием лекарственного препарата, который целенаправленно воздействует на TcdB, может включать пациента, который в настоящее время страдает от CDI, или лицо, которое недавно имело CDI, которая не выявлялась во время лечения, например, лицо, которое по результатам исследования является положительным в отношении CDI за 1 месяц до лечения с использованием лекарственного препарата против TcdB или за 3 недели, 2 недели, 1 неделю, 6 суток, 5 суток, 4 суток, 3 суток, 2 суток или 1 сутки до лечения с использованием лекарственного препарата против TcdB. Лица с повышенным риском инфекции С. difficile включают лиц, подвергающихся лечению антибиотиками, например, лечению определенным клиндамицином, цефалоспоринами и фторхинолонами, а также пациентов в пожилом возрасте (≤65 лет), пациентов с иммуносупрессией, пациентов, которые являются работниками сферы здравоохранения, и пациентов, подвергающихся госпитализации с увеличенной продолжительностью.

Термин «выделенный», как правило, используется для того, чтобы отразить очищенное состояние биологической молекулы, такой как РНК, ДНК, олигонуклеотид или белок, и в таком контексте означает молекулу, которая практически не содержит других биологических молекул, таких как нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы или другой материал, такой как клеточный дебрис и ростовая среда. В целом, не предполагается, что термин «выделенный» относится к полному отсутствию других биологических молекул или материала или к отсутствию воды, буферов или солей, если они присутствуют в количествах, которые создают значительные препятствия для способов согласно настоящему изобретению.

«Локус» относится к положению на хромосоме или молекуле ДНК, соответствующему гену, физическому признаку, такому как полиморфный сайт, или положению, ассоциированному с фенотипическим признаком.

«Пара нуклеотидов» представляет собой набор из двух нуклеотидов (которые могут быть одинаковыми или отличающимися), находящихся в полиморфном сайте на двух копиях хромосомы от индивида.

«Олигонуклеотид» относится к нуклеиновой кислоте, которая обычно имеет длину от 5 до 100 смежных оснований и наиболее часто имеет длину от 10-50, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 15-20, 20-50, 20-40, 20-30 или 20-25 смежных оснований. Последовательность олигонуклеотид а можно сконструировать таким образом, чтобы она специфически гибридизировалась с любой из аллельных форм локуса; такие олигонуклеотиды называются аллель-специфическими зондами. Если локус представляет собой PS, содержащий SNP, комплементарный аллель для этого SNP может встречаться в любом положении в пределах аллель-специфического зонда. Другие олигонуклеотиды, пригодные в практическом осуществлении настоящего изобретения, специфически гибридизируются с целевым участком, смежным с PS, причем их 3' конец располагается на расстоянии от одного нуклеотида до расстояния, меньшего или равного приблизительно 10 нуклеотидам, от PS, предпочтительно, приблизительно в 5 нуклеотидах. Такие олигонуклеотиды, гибридизирующиеся смежно с PS, являются пригодными в способах опосредованной полимеразой достройки праймеров и называются в данном документе «олигонуклеотидами для достройки праймеров». В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления 3'-конец олигонуклеотид а для достройки праймеров представляет собой дезоксинуклеотид, комплементарный нуклеотиду, располагающемуся смежно с PS.

«Фармацевтически приемлемый» относится к молекулам и композициям, которые «в целом, рассматриваются как безопасные», например, которые являются физиологически переносимыми и, как правило, не дают аллергическую или подобную нежелательную реакцию, такую как расстройство желудка и т.п., при введении человеку. В соответствии с еще одним вариантом осуществления этот термин относится к молекулам и композициям, одобренным регулирующим органом федерального правительства США или правительством штата или приведенным в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и, более конкретно, у людей.

«Полиморфный сайт» или «PS» относится к положению в генетическом локусе или гене, в котором находится полиморфизм, например, однонуклеотидный полиморфизм (SNP), полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP), переменное число тандемных повторов (VNTR), динуклеотидный повтор, тринуклеотидный повтор, тетрануклеотидный повтор, простая повторяющаяся последовательность, инсерционный элемент, такой как Alu, и делеция или вставка одного или нескольких нуклеотидов. Перед и после PS в популяции, представляющей интерес, обычно находятся высококонсервативные последовательности, и, следовательно, положение PS, как правило, указывают относительно консенсусной последовательности нуклеиновой кислоты из тридцати-шестидесяти нуклеотидов, которые окружают PS, эту последовательность в случае SNP обычно называют «контекстной последовательностью SNP». Положение PS также можно идентифицировать по ее положению в консенсусной или эталонной последовательности. Квалифицированный специалист в данной области техники понимает, что положение конкретной PS может не встречаться точно в одинаковом положении в эталонной или контекстной последовательности у каждого индивида в популяции, представляющей интерес, вследствие присутствия одной или нескольких вставок или делеций у этого индивида по сравнению с консенсусной или эталонной последовательностью. Более того, для квалифицированного специалиста в данной области техники является стандартной практикой создание робастных, специфических и точных анализов для выявления альтернативных аллелей в полиморфном сайте у любого заданного индивида, когда квалифицированный специалист в данной области техники обеспечен идентификационной информацией для подлежащих выявлению альтернативных аллелей в PS и одной или обеими из эталонной последовательности или контекстной последовательности, в которых встречается PS. Таким образом, квалифицированному специалисту в данной области техники будет понятно, что определение положения любого PS, описанного в данном документе, относительно конкретного положения в эталонной или контекстной последовательности дается только для удобства, и что любое специально пронумерованное положение нуклеотида буквально включает в себя любое положение нуклеотида в одинаковом PS, который фактически располагается в одинаковом локусе у любого индивида, подвергающегося исследованию в отношении присутствия или отсутствия генетического маркера согласно настоящему изобретению с применением любого из способов генотипирования, описанных в данном документе, или других способов генотипирования, хорошо известных в уровне техники.

Номер «эталонного SNP» или номер «rs» относится к номеру доступа, присвоенному отдельному SNP Национальным центром биотехнологической информации (NCBI).

«TcdA» относится к токсину А С. difficile, который представляет собой крупный клостридиальный токсин из токсикогенных изолятов Clostridium difficile.

«TcdB» относится к токсину В С. difficile, который представляет собой крупный клостридиальный токсин из токсикогенных изолятов Clostridium difficile.

«Антитело к TcdA» относится к антителу, которое специфически связывается с токсином A Clostridium difficile, например, у актоксумабу.

«Антитело к TcdB» относится к антителу, которое специфически связывается с токсином В Clostridium difficile, например, к безлотоксумабу.

«Лекарственный препарат против TcdB» относится к фармацевтическому или биологическому терапевтическому средству, которое целенаправленно воздействует на токсин В С. difficile. Как определено в данном документе, лекарственный препарат против TcdB включает в себя как лекарственные средства-малые молекулы, так и биологические лекарственные средства, такие как антитела или их антигенсвязывающие фрагменты.

Термин «маркер(маркеры) ответа на лечение TcdB», альтернативно называемый «маркером ответа на лекарственный препарат против TcdB», относится к генетическому маркеру согласно настоящему изобретению, который является пригодным для прогнозирования ответа пациента на лекарственный препарат против TcdB.

«Лечение» или «осуществление лечения» означает введение терапевтического средства, такого как композиция, содержащая антитело к TcdB, описанное в данном документе, внутрь или наружно индивиду, нуждающемуся в терапевтическом средстве. Как правило, терапевтическое средство вводят в терапевтически эффективном количестве, которое означает количество, эффективное для получения одного или нескольких благоприятных результатов. Терапевтически эффективное количество конкретного средства может варьировать в зависимости от таких факторов, как болезненное состояние, возраст и масса пациента, получающего лечение, и чувствительность пациента к терапевтическому средству, например, способность отвечать на терапевтическое средство. Был ли достигнут благоприятный или клинический результат, можно оценить с помощью любого клинического измерения, как правило, применяемого врачами, помощниками врачей или другими квалифицированными медицинскими работниками для оценки присутствия, тяжести или состояния прогрессирования являющегося мишенью заболевания, симптома или неблагоприятного эффекта. Как правило, терапевтически эффективное количество средства будет приводить в результате к улучшению соответствующего клинического измеряемого показателя(клинических измеряемых показателей) относительно исходного состояния или относительно ожидаемого состояния при отсутствии лечения по меньшей мере на 5%, обычно по меньшей мере на 10%, чаще по меньшей мере на 20%, наиболее часто по меньшей мере на 30%, предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 60%, в идеальном случае по меньшей мере на 70%, в более идеальном случае по меньшей мере на 80% и в наиболее идеальном случае по меньшей мере на 90%. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления, в котором состояние или нарушение представляет собой инфекцию С. difficile, клинический измеряемый показатель улучшения представляет собой улучшение измеряемого показателя частоты рецидивов С. difficile. Несмотря на то что вариант осуществления настоящего изобретения (например, способ лечения или изделие) может не достигать желаемого клинического благоприятного воздействия или результата у каждого пациента, он должен делать это у статистически значимого количества пациентов, которое определяется с помощью любого статистического критерия, известного в уровне техники, такого как логистическая регрессия с 2 степенями свободы на основе критерия отношения правдоподобия и т.д.

Следующие сокращения используются в тексте и имеют следующие значения:

ASO аллель-специфический олигонуклеотид

CDAD ассоциированное с Clostridium difficile заболевание

CDI инфекция Clostridium difficile

CDR гипервариабельный участок

GWAS полногеномное исследование ассоциаций

HLA лейкоцитарный антиген человека

LD неравновесное сцепление

mAB моноклональное антитело

ПЦР полимеразная цепная реакция

PS полиморфный сайт

rCDI рецидивирующая CDI

RFLP полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

SNP однонуклеотидный полиморфизм

TcdA токсин A Clostridium difficile

TcdB токсин В Clostridium difficile

V_H вариабельный участок тяжелой цепи антитела

V_L вариабельный участок легкой цепи антитела

VNTR вариабельное число тандемных повторов

II. Полезность маркеров ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению

Фенотипический эффект маркеров ответа, описанных в данном документе, подтверждает применение этих маркеров в ряде коммерческих применений, в том числе, без ограничения, в клинических испытаниях исследуемых или ранее одобренных лекарственных препаратов против TcdB у пациентов, выбранных на основании присутствия или отсутствия генетического маркера ответа согласно настоящему изобретению, в фармацевтических композициях и лекарственных продуктах, содержащих терапевтическое средство против TcdB (например, малую молекулу, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), для лечения пациентов, которые имеют маркер ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению, в диагностических способах и в фармакогенетических способах лечения, которые включают адаптацию лекарственной терапии у пациента на основании того, имеет ли пациент по меньшей мере один маркер ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению.

Для полезности любого из коммерческих применений, заявленных в данном документе, не требуется, чтобы корреляция между присутствием маркера ответа согласно настоящему изобретению и частотой возникновения желаемого ответа на лекарственный препарат против TcdB или антитело к TcdB наблюдалась у 100% индивидов, которые получают лекарственный препарат против TcdB или антитело к TcdB; а также не требуется, чтобы диагностический способ или набор характеризовался конкретной степенью специфичности или чувствительности при определении присутствия или отсутствия маркера ответа у каждого индивида, также не требуется, чтобы диагностический способ, заявленный в данном документе, был на 100% точным в прогнозировании для каждого индивида того, с какой вероятностью индивид имеет благоприятный ответ на лекарственный препарат против TcdB или антитело к TcdB. Таким образом, авторы настоящего изобретения предполагают в данном документе, что термины «определять», «определение» и «прогнозирование» не следует интерпретировать как требующие конкретного или определенного результата; вместо этого данные термины следует толковать как означающие, что заявленный способ обеспечивает точный результат для большинства индивидов, или что результат или прогноз для любого заданного индивида с большей вероятностью является верным, нежели неверным.

Предпочтительно, точность результата, обеспечиваемого диагностическим способом согласно настоящему изобретению, является такой, которую квалифицированный специалист в данной области техники или контролирующий орган будет считать подходящей для конкретного применения, в котором применяют способ. Подобным образом, для полезности заявленных лекарственных продуктов и способов лечения не требуется, чтобы они давали заявленный или желаемый эффект у каждого индивида; все, что требуется, - это то, чтобы практикующий врач при вынесении его или ее профессионального заключения в соответствии со всеми принятыми нормами принял решение, что вероятность достижения заявленного эффекта от лечения данного индивида в соответствии с заявленным способом или с использованием заявленного лекарственного продукта является достаточно высокой, чтобы оправдывать назначение лечения или лекарственного продукта.

А. Исследование в отношении маркера ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению

Присутствие или отсутствие маркеров ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению можно выявить с помощью любой из ряда методик генотипирования или секвенирования, обычно применяемых в данной области техники. Технологии, которые можно применять в генотипировании индивида в положениях маркеров ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению в геноме, включают в себя, без ограничения: технологии секвенирования и секвенирования нового поколения, секвенирование РНК, масс-спектрометрию, сравнительную геномную гибридизацию, анализа на чипах на основе SNP, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, секвенирование по Сэнгеру, химическое секвенирование (например, по Максаму и Гилберту), высокоэффективную жидкостную хроматографию в денатурирующих условиях, методики гибридизации ДНК и ПЦР. Специалист в данной области техники будет способен выбрать любую из множества методик, доступных для определения генотипа индивида по одному или нескольким маркерам ответа на лечение TcdB. Эти методики обеспечивают не только выявление присутствия или отсутствия конкретного маркера ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению, но также определение того, является индивид гетерозиготным или гомозиготным по этому сайту.

В иллюстративных методиках генотипирования или секвенирования могут использоваться один или несколько олигонуклеотидов, которые являются комплементарными участку, содержащему представляющий интерес PS или смежному с ним, тем не менее, можно применять способы гибридизации и альтернативные способы выявления вариантов или полиморфных сайтов. Последовательность олигонуклеотида, применяемого для генотипирования конкретного PS, представляющего интерес, как правило, конструируют на основе контекстной последовательности для PS.

У конкретного индивида положение полиморфного сайта, идентифицированного выше, находится в эталонной кодирующей или геномной последовательности ДНК, окружающей PS, представляющий интерес, или в одной из контекстных последовательностей, описанных в таблице 2 ниже, или их комплементарных последовательностях. В таблице 2 приведены контекстные последовательности нуклеиновой кислоты для SNP, определенные как маркеры ответа на лечение TcdB в соответствии с настоящим изобретением. В данном документе было показано, что три аллеля HLA: HLA-DRB1*07:01, HLA-DQB1*02:02 и HLA-DQA1*02:01 представляют собой маркеры ответа на лечение TcdB в соответствии с настоящим изобретением.

Как будет понятно квалифицированному специалисту в данной области техники, образцы нуклеиновой кислоты, содержащие конкретный PS, могут быть комплементарными двухнитевым молекулам, и, следовательно, упоминание конкретного сайта на смысловой нити относится также к соответствующему сайту на комплементарной антисмысловой нити. Подобным образом, упоминание конкретного генотипа, полученного для PS на обеих копиях одной нити хромосомы, является эквивалентным комплементарному генотипу, полученному для того же PS на обеих копиях другой нити. В качестве примера, генотип С/С для PS rs2516513 на смысловой нити для гена является эквивалентным генотипу G/G для этого PS на антисмысловой нити.

Контекстные последовательности, перечисленные в данном документе, а также их комплементарные последовательности можно применять для конструирования зондов и праймеров для генотипирования маркеров ответа на лечение TcdB образце нуклеиновой кислоты, полученном от субъекта-человека, представляющего интерес, с применением любого из ряда способов, хорошо известных в уровне техники, что позволяет определить, имеет ли индивид по меньшей мере одну копию характеризующегося лучшим ответом аллеля одного или нескольких маркеров ответа на лечение TcdB, идентифицированных в данном документе. Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые в таких способах, обычно включают в себя РНК, геномную ДНК или кДНК, полученные из РНК.

Как правило, способы генотипирования включают анализ образца нуклеиновой кислоты, приготовленного из биологического образца, полученного от индивида для определения идентификационной информации для нуклеотида или пары нуклеотидов, присутствующих в одном или нескольких полиморфных сайтах, представляющих интерес. Образцы нуклеиновой кислоты могут быть приготовлены из практически любого биологического образца. Например, подходящие образцы включают в себя сыворотку цельной крови, сперму, слюну, слезы, каловые массы, мочу, пот, материал из щечного эпителия, кожу и волосы. Незлокачественные соматические клетки являются предпочтительными, поскольку они обеспечивают возможность определения идентификационной информации для обоих аллелей, присутствующих в PS, представляющем интерес, без контаминации опухолеспецифическими мутациями.

Образцы нуклеиновой кислоты могут быть приготовлены для анализа с применением любой методики, известной специалистам в данной области техники. Предпочтительно, таким методики приводят в результате к выделению геномной ДНК, достаточно чистой для определения генотипа для желаемого(желаемых) полиморфного(полиморфных) сайта(сайтов) в молекуле нуклеиновой кислоты. Для того чтобы повысить чувствительность и специфичность этого определения, часто желательной является амплификация из образца нуклеиновой кислоты целевого участка, содержащего PS, подлежащий генотипированию. Методики выделения и амплификации нуклеиновой кислоты можно найти, например, в Sambrook, et at., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) (2001).

Любую методику амплификации, известную специалистам в данной области техники, можно применять в практическом осуществлении настоящего изобретения, в том числе, без ограничения, методики полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР можно выполнять с применением материалов и способов, известных специалистам в данной области техники (в общих чертах, см. PCR Technology: Principals and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Matilla et al., Nucleic Acids Res. 19: 4967 (1991); Eckert et al., PCR Methods and Applications 1: 17(1991); ПЦР (под редакцией McPherson et al., IRL Press, Oxford); и патент США №4683202. Другие подходящие способы амплификации включают в себя лигазную цепную реакцию (LCR) (см. Wu and Wallace, Genomics 4: 560 (1989); и Landegren et al., Science 241: 1077 (1988)); транскрипционную амплификацию (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173 (1989)), самоподдерживающуюся репликацию последовательности (Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990)); изотермические способы (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-6 (1992)); и изотермическую амплификацию последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA).

Амплифицированный целевой участок подвергают анализу для определения идентификационной информации по меньшей мере для одного из аллелей, присутствующих в PS в целевом участке. Если оба аллеля локуса представлены в амплифицированной мишени, квалифицированному специалисту в данной области техники легко будет понять, что только один аллель будет выявляться в PS у индивидов, которые являются гомозиготными по этому PS, в то время как отличающиеся аллели будут выявляться, если индивид является гетерозиготным по этому PS.

Идентификационную информацию для аллеля можно идентифицировать напрямую, что известно как идентификация положительного типа, или на основании логического вывода, что называется идентификацией отрицательного типа. Например, в случае, когда известно, что SNP представляет собой гуанин или цитозин в эталонной популяции, PS можно положительно определить как представляющий собой либо гуанин, либо цитозин для индивида, гомозиготного по этому сайту, или как гуанин, так и цитозин, если индивид является гетерозиготным по этому сайту. В качестве альтернативы, PS можно определить отрицательно как не представляющий собой гуанин (и, следовательно, цитозин/цитозин) или не представляющий собой цистеин (и, следовательно, гуанин/гуанин). В любом из случаев когда определяют, что присутствует по меньшей мере одна копия характеризующегося лучшим ответом аллеля, который изложен в таблице 1, это определение считается положительным результатом анализа в отношении характеризующегося лучшим ответом аллеля в способах, применениях, лекарственных продуктах или наборах, описанных в данном документе.

Идентификацию аллеля или пары аллелей (например, двух нуклеотидов в случае SNP) в PS в образце нуклеиновой кислоты, полученном от индивида, можно выполнять с применением любой методики, известной специалисту в данной области техники. Предпочтительные методики позволяют быстрый точный анализ нескольких PS при минимальной обработке образцов. Некоторые примеры подходящих методик включают в себя, без ограничения, прямое секвенирование ДНК целевого участка (с амплификацией или без), капиллярный электрофорез, гибридизацию аллель-специфических зондов, анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК, электрофорез в геле с градиентом концентрации денатурирующего средства, электрофорез с температурным градиентом, выявление несовпадений; анализ нуклеиновых кислот на матрицах, праймер-специфическую достройку, выявление белка, условную подстановку и другие методики, хорошо известные в уровне техники. См., например, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) (2001); Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, New York) (1997); Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 2766-2770 (1989); Humphries et al., в Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, ed., pp. 32 1-340, 1996; Wartell et al., Nucl Acids Res. 18:2699-706 (1990); Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662; Sheffield et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:232-6 (1989); Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7575 (1985); Myers et al. (1985) Nature 313:495; Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys Chem. 265:12753; Modrich, Ann. Rev. Genet. 25:229-53 (1991); Howie et al., Fast and accurate genotype imputation in genome-wide association studies through pre-phasing. Nature Genetics 44(8): 955-959 (2012); патент США №6300063; патент США №5837832; патент США №5459039; и анализ картирования HuSNP, набор реактивов и инструкцию по применению, Affymetrix, номер по каталогу 90094 (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния).

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления идентификационную информацию для аллеля(аллелей) в PS определяют с применением способа опосредованной полимеразой достройки праймеров. Несколько таких способов были описаны в патентах и научной литературе и включают в себя способ «генетического бит-анализа» (WO 92/15712) и опосредованный лигазой/полимеразой генетический бит-анализ (патент США №5679524. Подобные способы раскрыты в международных заявках WO 91/02087, WO 90/09455, WO 95/17676 и патентах США №5302509 и №5945283. Достроенные праймеры, содержащие комплементарную последовательность полиморфизма, можно выявить с помощью масс-спектрометрии, как описано в патенте США №5605798.

В другом способе достройки праймеров используется аллель-специфическая ПЦР (Ruano, G. et al., Nucl. Acids Res. 17:8392 (1989); Ruano, G. et al., Nucl. Acids Res. 19:6877-82 (1991); WO 93/22456; Turki et al., J. Gun. Invest. 95:1635-41 (1995)).

В еще одном способе достройки праймеров для идентификации и анализа полиморфизмов используется удлинение на одно основание (SBE) меченого флуоресцентной меткой праймера в сочетании с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET) между меткой на присоединенном основании и меткой на праймере. Как правило, в способе, таком как описанный в Chen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 94:10756-61 (1997), применяют локус-специфический олигонуклеотидный праймер, меченый на 5'-конце 5-карбоксифлуоресцеином (FAM). Этот меченый праймер конструируют таким образом, чтобы 3'-конец непосредственно примыкал к полиморфному сайту, представляющему интерес. Меченый праймер гибридизируется с локусом, и достройка меченого праймера на одно основание осуществляется с использованием меченых флуоресцентной меткой дидезоксирибонуклеотидов (ddNTP) аналогично тому, как это происходит при секвенировании методом «терминаторов» с красителем, за исключением того, что отсутствуют дезоксирибонуклеотиды. Повышение флуоресценции добавленного ddNTP в ответ на возбуждение при длине волны, характерной для меченого праймера, применяют, чтобы получить идентификационную информацию для добавленного нуклеотида.

Одним примером анализа для генотипирования является анализ для генотипирования SNP TaqMan® SNP Genotyping Assay от Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США, или анализ, характеризующийся приблизительно такой же надежностью, точностью и специфичностью. В соответствии с определенными вариантами осуществления такого анализа два аллель-специфических зонда применяют для выявления конкретного PS, причем каждый зонд имеет отдельную флуоресцентную метку, связанную с ним, а также молекулу-гаситель. Кроме того, применяют два аллель-специфических праймера. При достройке нити ДНК Taq ДНК-полимераза отщепляет флуоресцентную метку, при этом данное отщепление приводит в результате к испусканиям флуоресценции, которые можно выявить.

Во всех из вышеупомянутых способов точность и специфичность анализа, предназначенного для выявления идентификационной информации для аллеля(аллелей) в любом PS, как правило, подтверждают посредством проведения анализа на образцах ДНК, в которых идентификационная информация для аллеля(аллелей) в этом PS является известной. Предпочтительно, образец, представляющий каждый возможный аллель, включают в процесс валидации. Для диплоидных локусов, таких как локусы на аутосомных хромосомах, образцы для валидации, как правило, будут включать в себя образец, который является гомозиготным по основному аллелю в PS, образец, который является гомозиготным по минорному аллелю в PS, и образец, который является гетерозиготным в этом PS. Эти образцы для валидации, как правило, также включают в качестве контролей при осуществлении анализа на исследуемом образце (т.е. образце, в котором идентификационная информация для аллеля(аллелей) в PS является неизвестной). Специфичность анализа также можно подтвердить посредством сравнения результата анализа для исследуемого образца с результатом, полученным для того же образца с применением отличающегося типа анализа, как например, посредством определения последовательности амплифицированного целевого участка, который, как полагают, содержит PS, представляющий интерес, и сравнения определенной последовательности с контекстными последовательностями, принятыми в уровне техники, такими как контекстные последовательности, представленные в данном документе.

Длина контекстной последовательности, необходимой для установления того, что анализу подвергают правильное положение в геноме, будет варьировать, исходя из уникальности последовательности в целевом участке (например, могут присутствовать одна или несколько последовательностей с высокой степенью гомологии, располагающихся в других участках генома). Квалифицированный специалист в данной области техники может легко определить подходящую длину контекстной последовательности для любого PS с применением известных методик, таких как сравнение контекстной последовательности с общедоступными базами данных последовательностей с использованием алгоритма BLAST. Для амплифицированных целевых участков, которые обеспечивают первый уровень специфичности, оценка контекстной последовательности приблизительно на 30-60 оснований в каждую сторону от PS в известных образцах, как правило, является достаточной, чтобы гарантировать, что схема анализа является специфической в отношении PS, представляющего интерес. В редких случаях валидированный анализ может оказаться неспособным обеспечить однозначный результат для исследуемого образца. Обычно это является результатом того, что образец содержит ДНК недостаточного качества или в недостаточном количестве, и однозначный результат обычно получают при повторной очистке или повторном выделении ДНК из образца или при анализе образца с применением отличающегося типа анализа.

Для выявления PS, характеризующегося вариантами со вставкой/делецией, можно использовать ряд методик анализа. Варианты со вставкой/делецией можно выявлять с помощью способов секвенирования по Сэнгеру, в которых используются дидезоксинуклеозидтрифосфаты. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления коммерчески доступные пакеты программного обеспечения, такие как программное обеспечение Mutation Surveyor®, доступное от SoftGenetics LLC, Стейт Колледж, Пенсильвания, США, которое может выявлять гомозиготные и гетерозиготные варианты со вставкой/делецией. Кроме того, способ анализа фрагментов, раскрытый Hjelm et al. в The Journal of Molecular Diagnostics 12(5), pp 607-610 (2010), можно применять для характеристики вариантов со вставкой и делецией.

Более того, при осуществлении любого из способов, описанных в данном документе, для которых требуется определение присутствия или отсутствия маркеров ответа на лечение TcdB, такое определение можно производить посредством обращения за справкой в хранилище данных, которое содержит достаточную информацию о наборе генов пациента для того, чтобы определить, имеет ли пациент маркер. Предпочтительно, в хранилище данных содержится информация о том, присутствуют или отсутствуют маркеры ответа на лечение TcdB у индивида. Хранилище данных может включать в себя историю болезни индивида, карту с медицинскими данными, файл (например, плоский файл в формате ASCII), доступные с помощью компьютера или другого электронного или неэлектронного носителя, на котором может храниться соответствующая информация или генетические данные. В контексте данного документа карта с медицинскими данными представляет собой переносной накопитель, такой как магнитная карта для хранения данных, чип-карта, которая имеет встроенный процессор, и которая реализуется такими поставщиками, как Siemens из Мюнхена, Германия, или карта флэш-памяти. Если хранилище данных представляет собой файл, доступный с помощью компьютера; такие файлы могут находиться на различных носителях, в том числе: на сервере, клиенте, жестком диске, CD, DVD, персональном цифровом помощнике, таком как смартфон, на магнитной ленте, zip-диске, во внутреннем ROM (постоянном запоминающем устройстве) компьютера, или в сети Интернет, или во «всемирной паутине». Другие носители для хранения файлов, доступных с помощью компьютера, будут очевидны для специалиста в данной области техники.

Настоящим изобретением также предполагается, что исследование в отношении маркеров ответа на лечение TcdB может быть определено посредством изучения того, имеет ли индивид аллель, например, конкретную нуклеотидную последовательность в отличающемся локусе, который находится в сильном неравновесном сцеплении (LD) с характеризующимся лучшим ответом аллелем для SNP rs2516513, SNP rs113379306, SNP rs76166871 или одного из других маркеров ответа на лечение TcdB, идентифицированных в таблице 1 выше. Два конкретных аллеля в различных локусах на одной и той же хромосоме считаются находящимися в LD, если присутствие одного из аллелей в одном локусе, как правило, предсказывает присутствие другого аллеля в другом локусе. Такие варианты, которые называются в данном документе «сцепленными вариантами» или прокси-вариантами, могут представлять собой любой тип варианта (например, SNP, вариант со вставкой или делецией), который находится в сильном LD с характеризующимся лучшим ответом аллелем, представляющим интерес.

Сцепленные варианты легко идентифицируются посредством определения степени неравновесного сцепления между характеризующимся лучшим ответом аллелем SNP rs2516513, SNP rs113379306 или SNP rs76166871, например, и сцепленным аллелем-кандидатом. Сцепленный вариант-кандидат может представлять собой аллель полиморфизма, который является известным в настоящее время. Другие сцепленные варианты-кандидаты могут быть легко идентифицированы квалифицированным специалистом в данной области техники с применением любой методики, хорошо известной в уровне техники для обнаружения полиморфизмов.

Степень LD между характеризующимся лучшим ответом аллелем у одного из маркеров ответа на лечение TcdB, например, SNP rs2516513, SNP rs113379306 и/или SNP rs76166871, и сцепленным вариантом-кандидатом можно определить с применением любого метода измерения LD, известного в уровне техники. Характер LD в участках генома легко определить эмпирически в соответствующим образом выбранных образцах с применением различных методик, известных в уровне техники для определения того, находятся ли любые два аллеля (например, между нуклеотидами в различных PS) в неравновесном сцеплении (см., например, GENETIC DATA ANALYSIS II, Weir, Sineuer Associates, Inc. Publishers, Sunderland, MA 1996). Квалифицированный специалист в данной области техники может легко выбрать, какой способ определения LD будет наилучшим образом подходить для размера выборки в конкретной популяции и участка генома. Одним из наиболее часто применяемых показателей для измерения неравновесного сцепления является r², который рассчитывают с применением формулы, описанной Devlin et al. (Genomics, 29(2):311-22 (1995)). r² является мерой того, как хорошо аллель X в первом локусе предсказывает присутствие аллеля Y во втором локусе на одной и той же хромосоме. Показатель достигает значения 1,0 только когда прогноз является идеальным (например, если X, то только Y).

В соответствии с одним вариантом осуществления локус сцепленного варианта находится в участке генома, составляющем приблизительно 100 килобаз, более предпочтительно, приблизительно 10 килобаз, который охватывает любой из PS для маркера ответа на лечение TcdB, представляющего интерес, например, SNP rs2516513, SNP rs113379306, SNP rs76166871, аллель HLA-DRB1*07:01, аллель HLA-DQB1*02:02 или аллель HLA-DQA1*02:01. Другие сцепленные варианты представляют собой те, в которых LD с характеризующимся лучшим ответом аллелем имеет значение r², которое измерено в подходящей эталонной популяции, составляющее по меньшей мере 0,5, более предпочтительно по меньшей мере 0,75, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,85 или по меньшей мере 0,90, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,95 и наиболее предпочтительно 1,0. Эталонная популяция, используемая в этом измерении r², может представлять собой общую популяцию, популяцию, в которой применяют лекарственный препарат против TcdB, популяцию, у которой диагностируют CDAD и/или CDI, или популяцию, члены которой идентифицируют себя как принадлежащих к одинаковой этнической группе, такой как представитель европеоидной расы, афроамериканец, испанец, латиноамериканец, коренной американец и т.п., или к любой комбинации этих категорий. Предпочтительно, эталонная популяция отражает генетическое разнообразие популяции пациентов, подлежащих лечению с использованием лекарственного препарата против TcdB. Например, можно наблюдать несколько значений r2 с SNP rs2516513, rs113379306 и rs76166871 на фиг. 5А, 5В и 5С. Кроме того, также известно, что существует несколько аллелей HLA, которые находятся в сильном LD друг с другом, например, HLA-DRB1*07:01 и HLA-DQA1*02:01 находятся в почти идеальном LD друг с другом (r²=0,98) по данным GWAS.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления медицинский работник определяет, имеет ли пациент маркер ответа на лечение TcdB, описанный в данном документе, посредством назначения диагностического исследования, которое предназначено для определения того, имеет ли пациент по меньшей мере одну копию характеризующегося лучшим ответом аллеля одного или нескольких из маркеров ответа на лечение TcdB из таблицы 1, например, SNP rs2516513, SNP rs113379306, SNP rs76166871, аллель HLA-DRB1*07:01, аллель HLA-DQB1*02:02 или аллель HLA-DQA1*02:01. Предпочтительно, в исследовании определяют идентификационную информацию как для связанного с ответом аллеля, так и для альтернативного аллеля, т.е. генотипа, в этом PS. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления исследовательская лаборатория приготовит образец нуклеиновой кислоты из биологического образца (такого как образец крови или щечный мазок), полученного от пациента. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления образец крови у пациента забирает медицинский работник, например, врач или сотрудник медицинского учреждения, или лаборант в диагностической лаборатории. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления пациента обеспечивают набором для взятия щечного мазка с внутренней поверхности его щеки, который пациент затем отдает сотруднику медицинского учреждения или направляет непосредственно в диагностическую лабораторию.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления исследовательская лаборатория не обладает идентификационной информацией о конкретном индивиде, образец от которого подвергается исследованию; т.е. образец, получаемый лабораторией, неким образом делают анонимным перед тем, как направить его в лабораторию. Например, образец можно идентифицировать только по номеру или некоему другому коду («ID образца»), и результаты диагностического способа могут быть сообщены стороне, назначившей исследование, с использованием ID образца.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления после того, как результаты исследования были получены, исследовательская лаборатория создает отчет об исследовании, в котором указано, присутствует или отсутствует характеризующийся лучшим ответом аллель в генотипируемом полиморфном сайте, и предпочтительно в нем указано, является ли пациент гетерозиготным или гомозиготным по характеризующемуся лучшим ответом аллелю. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления отчет об исследовании представляет собой письменный документ, подготовленный исследовательской лабораторией и направляемый пациенту или медицинскому работнику, осуществляющему лечение пациента, в виде копии на бумаге или через электронную почту. В соответствии с другими вариантами осуществления отчет об исследовании создается с помощью компьютерной программы и отображается на видеомониторе в офисе медицинского работника. Отчет об исследовании также может включать устную передачу результатов анализа непосредственно пациенту или медицинскому работнику, осуществляющему лечение пациента, например, врачу, или уполномоченному работнику в офисе медицинского работника. Подобным образом, отчет об исследовании может содержать запись результатов исследований, которые медицинский работник проводит в течение жизни пациента.

В соответствии с одним вариантом осуществления, если пациент по результатам исследования является положительным в отношении по меньшей мере одной копии характеризующегося лучшим ответом аллеля, то в отчете об исследовании дополнительно указывается, что пациент по результатам исследования является положительным в отношении маркера ответа на лечение TcdB, тогда как, если индивид по результатам исследования является отрицательным в отношении характеризующегося лучшим ответом аллеля, то в отчете об исследовании дополнительно указывается, что пациент по результатам исследования является отрицательным в отношении маркера ответа на лечение TcdB.

Как правило, индивид будет подвергаться исследованию в отношении присутствия маркера ответа на лечение TcdB перед началом терапии лекарственным препаратом против TcdB, например, антителом к TcdB, но предполагается, что такое исследование можно осуществлять в любое время после того, как индивиду вводят первую дозу лекарственного препарата против TcdB. Например, медицинский работник (например, врач или помощник врача) может быть обеспокоен тем, что пациент не проявляет достаточный ответ, и желает провести исследование с индивидом, чтобы определить, обосновано ли продолжение лечения с использованием лекарственного препарата против TcdB. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления медицинский работник может определять, следует ли проводить исследование индивида в отношении маркера ответа на лечение TcdB или нет. Например, медицинский работник может рассматривать: прописывать ли пациенту фармацевтический продукт, который показан для пациентов, которые по результатам исследования являются положительными в отношении маркера ответа на лечение TcdB.

Принимая решение о том, как применять результаты анализа маркера ответа на лечение TcdB в лечении любого отдельного пациента, медицинский работник также может принимать во внимание другие соответствующие обстоятельства: считается ли пациент имеющим «высокий риск» рецидива CDI или нет, возраст, массу, пол, генетическое окружение и расу пациента, в том числе вводя комбинацию этих факторов и результатов исследования генетических маркеров в модель, которая поможет указать медицинскому работнику на выбор терапии и/или схемы лечения с использованием этой терапии.

Выявление присутствия или отсутствия любого из маркеров ответа на лечение TcdB можно осуществлять с применением набора, который был специально предназначен для этой цели. В соответствии с одним вариантом осуществления набор согласно настоящему изобретению содержит набор олигонуклеотид о в, предназначенных для идентификации каждого из аллелей в PS, например, SNP rs2516513, SNP rs113379306, SNP rs76166871, аллеля HLA-DRB1*07:01, аллеля HLA-DQB1*02:02 или аллеля HLA-DQA1*02:01.

Соответственно, настоящее изобретение относится к набору для исследования пациента в отношении присутствия или отсутствия по меньшей мере одной копии характеризующегося лучшим ответом аллеля одного или нескольких маркеров ответа на лечение TcdB, при этом один или несколько маркеров ответа на лечение TcdB являются выбранными из группы, состоящей из:

a) аллеля Т однонуклеотидного полиморфизма (SNP) rs2516513,

b) аллеля A SNP rs113379306,

c) аллеля A SNP rs76166871,

d) аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1,

e) аллеля HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1 и

f) аллеля HLA-DQA1*02:01 гена HLA-DQA1

или сцепленного варианта маркера ответа на лечение TcdB, при этом набор содержит один или несколько наборов олигонуклеотидов, предназначенных для генотипирования по меньшей мере одного из маркеров ответа на лечение TcdB.

В соответствии с одним вариантом осуществления этого аспекта настоящего изобретения у пациента была диагностирована инфекция С. difficile, предполагается наличие инфекции С. difficile, или проявляются симптомы CDAD. В соответствии с еще одним вариантом осуществления пациент имеет высокий риск rCDI.

В соответствии с первым вариантом осуществления этого аспекта настоящего изобретения маркер ответа на лечение TcdB представляет собой SNP rs2516513, и характеризующийся лучшим ответом аллель представляет собой аллель Т.

В соответствии со вторым вариантом осуществления маркер ответа на лечение TcdB представляет собой SNP rs113379306, и характеризующийся лучшим ответом аллель представляет собой аллель А.

В соответствии с третьим вариантом осуществления маркер ответа на лечение TcdB представляет собой SNP rs76166871, и характеризующийся лучшим ответом аллель представляет собой аллель А.

В соответствии с четвертым вариантом осуществления маркер ответа на лечение TcdB представляет собой ген HLA-DRB1, и характеризующийся лучшим ответом аллель представляет собой аллель HLA-DRB1*07:01.

В соответствии с пятым вариантом осуществления маркер ответа на лечение TcdB представляет собой ген HLA-DQB1, и характеризующийся лучшим ответом аллель представляет собой аллель HLA-DQB1*02:02.

В соответствии с шестым вариантом осуществления маркер ответа на лечение TcdB представляет собой HLA-DQA1, и характеризующийся лучшим ответом аллель представляет собой аллель HLA-DQA1*02:01.

В соответствии с седьмым вариантом осуществления набор содержит по меньшей мере два набора олигонуклеотидов, предназначенных для генотипирования по меньшей мере двух из маркеров ответа на лечение TcdB.

В соответствии с подвариантом осуществления седьмого варианта осуществления по меньшей мере два маркера ответа на лечение TcdB содержат аллель Т SNP rs2516513 и аллель HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1.

В соответствии с предпочтительными подвариантами осуществления любого из вышеупомянутых вариантов осуществления олигонуклеотиды представляют собой аллель-специфические олигонуклеотидные зонды.

Как указано выше, один аспект согласно настоящему изобретению относится к набору для исследования пациента в отношении присутствия или отсутствия по меньшей мере одной копии характеризующегося лучшим ответом аллеля одного или нескольких маркеров ответа на лечение TcdB, определенных выше. В соответствии с подвариантами осуществления любого из вариантов осуществления, описанных выше, набор содержит один набор олигонуклеотидов, предназначенных для генотипирования одного из маркеров ответа на лечение TcdB. В случае дополнительных подвариантов осуществления набор содержит два, три, четыре, пять, шесть или больше наборов олигонуклеотидов, предназначенных для генотипирования нескольких маркеров ответа на лечение Tcd согласно настоящему изобретению.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления олигонуклеотиды в наборе представляют собой либо аллель-специфические зонды, либо аллель-специфические праймеры. В соответствии с другими вариантами осуществления набор содержит олигонуклеотиды для достройки праймеров. В соответствии с дополнительными вариантами осуществления набор олигонуклеотидов представляет собой комбинацию аллель-специфических зондов, аллель-специфических праймеров и олигонуклеотидов для достройки праймеров. Набор может содержать олигонуклеотиды, предназначенные для выявления присутствия других генетических маркеров, связанных с ответом на лекарственный препарат против TcdB.

Олигонуклеотиды в наборах согласно настоящему изобретению должны быть способны к специфической гибридизации с целевым участком полинуклеотида. В контексте данного документа специфическая гибридизация означает, что олигонуклеотид образует антипараллельную двухнитевую структуру с целевым участком при определенных условиях гибридизации, в то же время он неспособен к образованию такой структуры с участками, не являющимися целевыми, при инкубировании с полинуклеотидом в таких же условиях гибридизации. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления целевой участок содержит PS, представляющий интерес, тогда как в соответствии с другими вариантами осуществления целевой участок располагается смежно с PS на расстоянии от одного до 10 нуклеотидов.

Состав и длина каждого олигонуклеотид а в наборе будут зависеть от природы участка генома, содержащего PS, а также от типа анализа, осуществляемого с использованием олигонуклеотида, и они могут быть легко определены квалифицированным специалистом в данной области техники.

Например, полинуклеотид, применяемый в анализе, может составлять продукт амплификации, и, следовательно, требуемая специфичность олигонуклеотида относится к гибридизации с целевым участком в продукте амплификации, а не в геномной ДНК или кДНК, выделенной из индивида. В качестве еще одного примера, если набор предназначен для генотипирования двух или более полиморфных сайтов одновременно, температуры плавления олигонуклеотидов для каждого PS в наборе, как правило, будут находиться в пределах узкого диапазона, предпочтительно, меньшего чем приблизительно 5°С и, более предпочтительно, меньшего чем приблизительно 2°С.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления каждый олигонуклеотид в наборе представляет собой полностью комплементарную последовательность своего целевого участка. Олигонуклеотид считается «полностью» или «идеально» комплементарной последовательностью другой молекулы нуклеиновой кислоты, если каждый нуклеотид в одной из молекул является комплементарным нуклеотиду в соответствующем положении в другой молекуле. Несмотря на то что для выявления полиморфизмов предпочтительными являются полностью комплементарные олигонуклеотиды, отклонения от полной комплементарности предполагаются в случаях, когда такие отклонения не предотвращают специфическую гибридизацию молекулы с целевым участком, который определен выше. Например, олигонуклеотидный праймер может иметь некомплементарный фрагмент на своем 5' конце, при этом остальная часть праймера является полностью комплементарной целевому участку. В качестве альтернативы, некомплементарные нуклеотиды могут быть вставлены в зонд или праймер при условии, что полученный в результате зонд или праймер все еще способен к специфической гибридизации с целевым участком.

В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами осуществления каждый олигонуклеотид в наборе специфически гибридизируется со своим целевым участком в жестких условиях гибридизации. Жесткие условия гибридизации являются зависимыми от последовательности и варьируют в зависимости от обстоятельств. В целом, жесткие условия выбирают таким образом, чтобы они были приблизительно на 5°С ниже, чем температура плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и рН. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных целевой последовательности, гибридизируются с целевой последовательностью в равновесном состоянии. Поскольку целевые последовательности обычно присутствуют в избытке, при Tm 50% зондов заняты в равновесном состоянии.

Как правило, жесткие условия включают в себя концентрацию соли по меньшей мере приблизительно от 0,01 до 1,0 М ионов натрия (или других солей) при рН от 7,0 до 8, 3, и температура составляет по меньшей мере приблизительно 25°С для коротких олигонуклеотидных зондов (например, 10-50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты добавлением дестабилизирующих средств, таких как формамид. Например, условия 5×SSPE (750 мМ NaCl, 50 мМ Na-фосфат, 5 мМ EDTA, рН 7,4) и температуры 25-30°С являются подходящими для гибридизаций аллель-специфических зондов. Дополнительные жесткие условия можно найти в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), главы 7, 9 и 11, и в NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, A PRACTICAL APPROACH, Haymes et al., IRL Press, Washington, D.C., 1985.

Один неограничивающий пример жестких условий гибридизации включает в себя гибридизацию в 4× хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при приблизительно 65-70°С (или, в качестве альтернативы, гибридизацию в 4× SSC плюс 50% формамиде при приблизительно 42-50°С) с последующими одной или несколькими отмывками в 1× SSC при приблизительно 65-70°С. Неограничивающий пример условий гибридизации высокой жесткости включает в себя гибридизацию в 1× SSC при приблизительно 65-70°С (или, в качестве альтернативы, гибридизацию в 1× SSC плюс 50% формамиде при приблизительно 42-50°С) с последующими одной или несколькими отмывками в 0,3× SSC при приблизительно 65-70°С. Неограничивающий пример условий гибридизации уменьшенной жесткости включает в себя гибридизацию в 4× SSC при приблизительно 50-60°С (или, в качестве альтернативы, гибридизацию в 6× SSC плюс 50% формамиде при приблизительно 40-45°С) с последующими одной или несколькими отмывками в 2× SSC при приблизительно 50-60°С. Предполагается, что условия с жесткостью в диапазонах, промежуточных относительно вышеупомянутых значений, например, при 65-70°С или при 42-50°С, также охватываются настоящим изобретением. SSPE (1× SSPE представляет собой 0,15 M NaCl, 10 мМ NaH₂PO₄ и 1,25 мМ EDTA, рН 7,4) может заменять SSC (1× SSC представляет собой 0,15 М NaCl и 15 мМ цитрат натрия) в гибридизационном и отмывочном буферах; отмывки осуществляют в течение 15 минут каждый раз после завершения гибридизации.

Температура гибридизации для гибридов, которые, как ожидается, имеют длину менее 50 пар оснований, должна быть на 5-10°С меньше, чем температура плавления (Tm) гибрида, при этом Tm определяют в соответствии со следующими уравнениями. Для гибридов длиной менее 18 пар оснований Tm (°С) = 2 (кол-во оснований А+Т) + 4 (кол-во оснований G+С). Для гибридов длиной от 18 до 49 пар оснований Tm (°С) = 81,5+16,6 (log₁₀[Na+])+0,41(%G+C)-(600/N), где N представляет собой количество оснований в гибриде, и [Na+] представляет собой концентрацию ионов натрия в гибридизационном буфере ([Na+] для 1× SSC=0,165 М).

Олигонуклеотиды в наборах согласно настоящему изобретению могут состоять из рибонуклеотидов, дезоксирибонуклеотидов и ациклических производных нуклеотидов в любом состоянии фосфорилирования, а также других функционально эквивалентных производных. В качестве альтернативы, олигонуклеотиды могут иметь бесфосфатный остов, который может состоять из мостиков, таких как крабоксиметил, ацетамидат, карбамат, полиамид (пептидонуклеиновая кислота (PNA)) и т.п. (Varma, в Molecular Biology and Biotechnology, A Comprehensive Desk Reference, Meyers, ed., pp. 6 17-20, VCH Publishers, Inc., 1995). Олигонуклеотиды можно получить посредством химического синтеза с применением любой подходящей методики, известной в уровне техники, или их можно получить из биологического образца, например, при расщеплении рестрикционными ферментами. Олигонуклеотиды могут содержать выявляемую метку согласно любой методике, известной в уровне техники, включая применение радиоактивных меток, флуоресцентных меток, ферментных меток, белков, гаптенов, антител, меток в виде последовательностей и т.п. Олигонуклеотиды в составе набора могут производиться и поставляться на рынок в виде специфических реактивов для анализируемого вещества (ASR) или могут составлять компоненты одобренного диагностического устройства.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления набор олигонуклеотидов в составе набора может иметь отличающиеся метки, чтобы обеспечить возможность одновременного определения идентификационной информации для аллелей в двух или более полиморфных сайтах. Олигонуклеотиды также могут содержать упорядоченный массив олигонуклеотидов, иммобилизированных на твердой поверхности, такой как микрочип, гранулы диоксида кремния (как например, используемые в технологии BeadArray от Illumina, Сан-Диего, Калифорния) или предметное стекло (см., например, международные заявки WO 98/20020 и WO 98/20019). Наборы, содержащие такие иммобилизированные олигонуклеотиды, могут быть предназначены для осуществления ряда анализов для выявления полиморфизмов, в том числе, без ограничения, анализов гибридизации зондов и анализов достройки полимеразой.

Наборы согласно настоящему изобретению также могут содержать другие реактивы, такие как гибридизационный буфер (например, в случае, когда олигонуклеотиды должны применяться в качестве аллель-специфических зондов) или дидезоксинуклеотидтрифосфаты (ddNTP; например, в случае, когда аллели в полиморфных сайтах должны выявляться с помощью достройки праймеров). Наборы, предназначенные для применения в опосредованных полимеразой анализах генотипирования, также могут содержать полимеразу и реакционный буфер, оптимизированный для осуществления опосредованного полимеразой анализа.

Наборы согласно настоящему изобретению также могут включать в себя реактивы для выявления того, когда произошла специфическая гибридизация или произошла специфическая опосредованная полимеразой достройка. Такие реактивы для выявления могут включать в себя олигонуклеотиды или ddNTP с биотиновой или флуоресцентной меткой и/или меченое ферментом антитело и один или несколько субстратов, которые образуют выявляемый сигнал, когда на них действует фермент.

Квалифицированному специалисту в данной области техники будет понятно, что набор олигонуклеотидов и реактивов для осуществления анализа будет обеспечиваться в отдельных резервуарах, размещенных в контейнере для набора, если это является подходящим для сохранения биологической или химической активности и обеспечивает возможность надлежащего применения в анализе.

В соответствии с другими вариантами осуществления качество каждого из олигонуклеотидов и всех остальных реактивов в наборе было проверено для оптимальной работы в анализе, предназначенном для определения генотипа в отношении по меньшей мере одного или нескольких из PS в таблице 1 выше, например, SNP rs2516513, SNP rs113379306, SNP rs76166871, аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1, аллеля HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1 или аллеля HLA-DQA1*02:01 гена HLA-DQA1. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления набор включает в себя инструкцию о порядке работы, в которой описывается, как применять определенный генотип для определения в исследуемом образце нуклеиновой кислоты присутствия или отсутствия маркера ответа.

В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами осуществления набор олигонуклеотидов в составе набора представляет собой аллель-специфические олигонуклеотиды. В контексте данного документа термин аллель-специфический олигонуклеотид (ASO) означает олигонуклеотид, который является способным к специфической гибридизации в достаточно жестких условиях с одним аллелем PS в целевом участке, содержащем PS, в то же время не гибридизируясь с таким же участком, содержащим отличающийся аллель. Как понятно квалифицированному специалисту в данной области техники, аллелеспецифичность будет зависеть от ряда легко оптимизируемых условий жесткости, включающих в себя концентрации соли и формамида, а также температуры для стадий и гибридизации, и отмывки.

Примеры условий гибридизации и отмывки, как правило, применяемых для ASO зондов и праймеров, находятся в Kogan et al., "Genetic Prediction of Hemophilia А" в PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, 1990, and Ruaflo et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:6296-300 (1990).

Как правило, ASO будет полностью комплементарным одному аллелю, и при этом будет содержать одно несовпадение с другим аллелем. В ASO зондах одно несовпадение предпочтительно находится в пределах центрального положения в олигонуклеотидном зонде, если его выравнивать с полиморфным сайтом в целевом участке (например, примерно 7-е или 8-е положение в последовательности из 15 мономерных звеньев, 8-е или 9-е положение в последовательности из 16 мономерных звеньев и 10-е или 11-е положение в последовательности из 20 мономерных звеньев). Одно несовпадение в ASO праймерах располагается в 3'-концевом нуклеотиде или, предпочтительно, в предпоследнем 3' нуклеотиде. Настоящим изобретением предполагаются ASO зонды и праймеры, гибридизирующиеся либо с кодирующей, либо с некодирующей нитью.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления набор содержит пару аллель-специфических олигонуклеотидов для каждого PS, подлежащего анализу, причем один член пары является специфическим в отношении одного аллеля (например, характеризующийся лучшим ответом аллель), а другой член является специфическим в отношении другого аллеля. В соответствии с такими вариантами осуществления олигонуклеотиды в паре могут иметь отличающуюся длину или могут иметь отличающиеся выявляемые метки, чтобы позволить пользователю набора определить генотип по анализируемому PS.

В соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления олигонуклеотиды в наборе представляют собой олигонуклеотиды для достройки праймеров. Миксы для терминации опосредованной полимеразой достройки из любого из этих олигонуклеотидов выбирают для терминации достройки олигонуклеотида в PS, представляющем интерес, или в одном основании после него в зависимости от альтернативных нуклеотидов, присутствующих в PS.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления набор содержит пару аллель-специфических олигонуклеотидных зондов для генотипирования по меньшей мере одного из полиморфных сайтов в таблице 1. В соответствии с одним вариантом осуществления один ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая является идентичной или полностью комплементарной характеризующемуся лучшим ответом аллелю в контекстной последовательности, представленной в таблице 2, а другой ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая является идентичной или полностью комплементарной другому аллелю в контекстной последовательности, приведенной в таблице 2.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления набор содержит пару ASO зондов, содержащую первый и второй ASO зонд для генотипирования SNP rs2516513, SNP rs113379306 или SNP rs76166871. В соответствии с одним вариантом осуществления первый ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая является идентичной или полностью комплементарной характеризующемуся лучшим ответом аллеля SNP rs2516513, SNP rs113379306 или SNP rs76166871, и второй ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая является идентичной или полностью комплементарной другому аллелю SNP rs2516513, SNP rs113379306 или SNP rs76166871.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления набор содержит две или больше пар ASO зондов. В соответствии с конкретными вариантами осуществления набор содержит одну пару ASO зондов для генотипирования SNP rs2516513 и вторую пару ASO зондов для генотипирования SNP rs113379306. В соответствии с еще одним вариантом осуществления набор содержит одну пару ASO зондов для генотипирования SNP rs2516513 и вторую пару ASO зондов для генотипирования SNP rs76166871. В соответствии с дополнительным вариантом осуществления набор содержит одну пару ASO зондов для генотипирования SNP rs113379306 и вторую пару ASO зондов для генотипирования SNP rs76166871. В соответствии с дополнительным вариантом осуществления набор содержит одну пару ASO зондов для генотипирования SNP rs2516513, вторую пару ASO зондов для генотипирования SNP rs113379306 и третью пару ASO зондов для генотипирования SNP rs76166871.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления набор содержит пару аллель-специфических олигонуклеотидных зондов для генотипирования аллеля HLA-DRB1*7:01. В соответствии с одним вариантом осуществления один ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая является идентичной или полностью комплементарной характеризующемуся лучшим ответом аллелю HLA-DRB1*07:01, в другой ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая: (1) является идентичной или полностью комплементарной отличающемуся аллелю гена HLA-DRB1, например, аллелю гена HLA-DRB1, который является широко распространенным в исследуемой популяции, или (2) не гибридизируется с аллелем HLA-DRB1*07:01 в условиях высокой жесткости, а связывается более чем с одним отличающимся аллелем гена HLA-DRB1, например, консенсусная олигонуклеотидная последовательность. В соответствии с еще одним вариантом осуществления набор содержит ASO зонд, который является идентичным или полностью комплементарным характеризующемуся лучшим ответом аллелю HLA-DRB1*07:01, и смесь, содержащую два или больше ASO зондов, которые связываются с более чем одним отличающимся аллелем гена HLA-DRB1. В соответствии с альтернативным вариантом осуществления один ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая является идентичной или полностью комплементарной характеризующемуся лучшим ответом аллелю HLA-DRB1*07:01, а другой ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая представляет собой контрольную последовательность, т.е. положительный или отрицательный контроль.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления набор содержит пару аллель-специфических олигонуклеотидных зондов для генотипирования аллеля HLA-DQB1*02:02. В соответствии с одним вариантом осуществления один ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая является идентичной или полностью комплементарной характеризующемуся лучшим ответом аллелю HLA-DQB1*02:02, а другой ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая: (1) является идентичной или полностью комплементарной отличающемуся аллелю гена HLA-DQB1, например, аллелю гена HLA-DQB1, который является широко распространенным в исследуемой популяции, или (2) не гибридизируется с аллелем HLA-DQB1*02:02 в условиях высокой жесткости, а связывается более чем с одним отличающимся аллелем гена HLA-DQB1, например, консенсусная олигонуклеотидная последовательность. В соответствии с еще одним вариантом осуществления набор содержит один ASO зонд, который является идентичным или полностью комплементарным характеризующемуся лучшим ответом аллелю HLA-DQB1*02:02, и смесь, содержащую два или более ASO зондов, которые связываются с более чем одним отличающимся аллелем гена HLA-DRB1. В соответствии с альтернативным вариантом осуществления один ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая является идентичной или полностью комплементарной характеризующемуся лучшим ответом аллелю HLA-DQB1*02:02, а другой ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая представляет собой контрольную последовательность, т.е. положительный или отрицательный контроль.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления набор содержит пару аллель-специфических олигонуклеотидных зондов для генотипирования аллеля HLA-DQA1*02:01. В соответствии с одним вариантом осуществления один ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая является идентичной или полностью комплементарной характеризующемуся лучшим ответом аллелю HLA-DQA1*2:01, а другой ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая: (1) является идентичной или полностью комплементарной отличающемуся аллелю гена HLA-DQA1, например, аллелю гена HLA-DQA1, который является широко распространенным в исследуемой популяции, или (2) не гибридизируется с аллелем HLA-DQA1*02:01, а связывается более чем с одним отличающимся аллелем гена HLA-DQA1, например, консенсусная олигонуклеотидная последовательность. В соответствии с еще одним вариантом осуществления набор содержит один ASO зонд, который является идентичным или полностью комплементарным характеризующемуся лучшим ответом аллелю HLA-DQA1*02:01, и смесь, содержащую два или более ASO зондов, которые связываются с более чем одним отличающимся аллелем гена HLA-DQA1. В соответствии с альтернативным вариантом осуществления один ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая является идентичной или полностью комплементарной характеризующемуся лучшим ответом аллелю HLA-DQA1*2:01, а другой ASO зонд в паре содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая представляет собой контрольную последовательность, т.е. положительный или отрицательный контроль.

В соответствии с дополнительными вариантами осуществления любого из наборов, описанных выше, ASO зонд, который связывается с аллелем HLA-DRB1*07:01, аллелем HLA-DQB1*02:02 или аллелем HLA-DQA1*02:01, не является идентичным или полностью комплементарным характеризующемуся лучшим ответом аллелю HLA-DRB1*07:01, но содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 15 нуклеотидов, которая характеризуется высокой степенью гомологии с аллелем HLA-DRB1*07:01 или характеризуется высокой степенью гомологии с комплементарной последовательностью аллеля HLA-DRB1*07:01. Под «высокой степенью гомологии» подразумевается, что зонд характеризуется достаточной гомологией с целевой последовательностью для того, чтобы специфически связываться, т.е. гибридизироваться, с целевой последовательностью в условиях высокой жесткости.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из наборов согласно настоящему изобретению, описанных выше, набор содержит один набор ASO зондов для выявления SNP rs2516513, SNP rs113379306, SNP rs76166871, аллеля HLA-DRB1*07:01, аллеля HLA-DQB1*02:02 или аллеля HLA-DQA1*02:01. В соответствии с дополнительными вариантами осуществления набор содержит два, три, четыре, пять, шесть или более наборов ASO зондов для выявления более чем одного из маркеров ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению или сцепленных вариантов маркеров ответа на лечение TcdB.

В. Фармацевтические композиции, лекарственные продукты и схемы лечения

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к способу предотвращения рецидива инфекции Clostridium difficile (С. difficile), включающему: введение терапевтически эффективного количества средства для лечения, которое целенаправленно воздействует на токсин В С. difficile (средства для лечения TcdB, в качестве альтернативы, лекарственного препарата против TcdB), пациенту, нуждающемуся в этом, при этом указанный пациент перед введением средства для лечения TcdB по результатам исследования является положительным в отношении по меньшей мере одной копии характеризующегося лучшим ответом аллеля из одного или нескольких маркеров ответа на лечение TcdB или сцепленных вариантов; при этом один или несколько маркеров ответа на лечение TcdB являются выбранными из группы, состоящей из: (а) аллеля Т однонуклеотидного полиморфизма (SNP) rs2516513; (b) аллеля A SNP rs113379306; (с) аллеля A SNP rs76166871; (d) аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1; (е) аллеля HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1 и (f) аллеля HLA-DQA1*02:01 гена HLA-DQA1.

В соответствии с первым вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е1) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, представляет собой антитело к TcdB или его антигенсвязывающий фрагмент.

В соответствии со вторым вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е2) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, представляет собой лекарственный продукт на основе малой молекулы.

В соответствии с третьим вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е3) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, представляет собой антитело к TcdB или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит три CDR тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3) и три CDR легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3), при этом:

a) CDRH1 состоит из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 7, или представляет собой вариант SEQ ID NO: 7, имеющий одну или две консервативные аминокислотные замены;

b) CDRH2 состоит из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 8, или представляет собой вариант SEQ ID NO: 8, имеющий одну или две консервативные аминокислотные замены;

c) CDRH3 состоит из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 9, или представляет собой вариант SEQ ID NO: 9, имеющий одну или две консервативные аминокислотные замены;

d) CDRL1 состоит из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, или представляет собой вариант SEQ ID NO: 2, имеющий одну или две консервативные аминокислотные замены;

e) CDRL2 состоит из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 3, или представляет собой вариант SEQ ID NO: 3, имеющий одну или две консервативные аминокислотные замены; и

f) CDRL3 состоит из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 4, или представляет собой вариант SEQ ID NO: 4, имеющий одну или две консервативные аминокислотные замены.

В соответствии с четвертым вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е4) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, представляет собой антитело к TcdB или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, которая изложена в SEQ ID NO: 5, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, которая изложена в SEQ ID NO: 1.

В соответствии с пятым вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е5) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, представляет собой безлотоксумаб.

В соответствии с шестым вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е6) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, является таким, как изложено в любом из вариантов осуществления Е1-Е5, и пациент представляет собой пациента-человека, который перед введением средства для лечения TcdB по результатам исследования является положительным в отношении CDI.

В соответствии с седьмым вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е7) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, является таким, как изложено в любом из вариантов осуществления Е1-Е5, и пациент представляет собой пациента-человека, который перед введением средства для лечения TcdB предположительно имеет CDI, или у которого проявляются симптомы CDAD; или который предположительно имел CDI, или у которого проявлялись симптомы CDAD.

В соответствии с восьмым вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е8) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, является таким, как изложено в любом из вариантов осуществления Е1-Е5, пациент является таким, как изложено в вариантах осуществления Е6 или Е7; и маркер ответа на лечение TcdB содержит один или несколько маркеров ответа на лечение TcdB, выбранных из группы, состоящей из: (а) аллеля Т SNP rs2516513; (b) аллеля A SNP rs113379306; (с) аллеля A SNP rs76166871; (d) аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1; (е) аллеля HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1 и (f) аллеля HLA-DQA1*02:01 гена HLA-DQA1.

В соответствии с девятым вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е9) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, является таким, как изложено в любом из вариантов осуществления Е1-Е5, пациент является таким, как изложено в вариантах осуществления Е6 или Е7; и маркер ответа на лечение TcdB содержит аллель Т SNP rs2516513 или сцепленный вариант.

В соответствии с десятым вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е10) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, является таким, как изложено в любом из вариантов осуществления Е1-Е5, пациент является таким, как изложено в вариантах осуществления Е6 или Е7; и маркер ответа на лечение TcdB содержит аллель A SNP rs113379306 или сцепленный вариант.

В соответствии с одиннадцатым вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е11) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, является таким, как изложено в любом из вариантов осуществления Е1-Е5, пациент является таким, как изложено в вариантах осуществления Е6 или Е7; и маркер ответа на лечение TcdB содержит аллель A SNP rs76166871 или сцепленный вариант.

В соответствии с двенадцатым вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е12) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, является таким, как изложено в любом из вариантов осуществления Е1-Е5, пациент является таким, как изложено в вариантах осуществления Е6 или Е7; и маркер ответа на лечение TcdB содержит аллель HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1 или сцепленный вариант.

В соответствии с тринадцатым вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е13) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, является таким, как изложено в любом из вариантов осуществления Е1-Е5, пациент является таким, как изложено в вариантах осуществления Е6 или Е7; и маркер ответа на лечение TcdB содержит аллель HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1 или сцепленный вариант.

В соответствии с четырнадцатым вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е14) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, является таким, как изложено в любом из вариантов осуществления Е1-Е5, пациент является таким, как изложено в вариантах осуществления Е6 или Е7; и маркер ответа на лечение TcdB содержит аллель HLA-DQA1*02:01 гена HLA-DQA1 или сцепленный вариант.

В соответствии с пятнадцатым вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е15) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, является таким, как изложено в любом из вариантов осуществления Е1-Е5, пациент является таким, как изложено в вариантах осуществления Е6 или Е7; и маркер ответа на лечение TcdB содержит как аллель Т SNP rs2516513, так и аллель HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1.

В соответствии с восьмым вариантом осуществления описанного выше способа (вариант осуществления Е16) средство для лечения, которое целенаправленно воздействует на TcdB, является таким, как изложено в любом из вариантов осуществления Е1-Е5, пациент является таким, как изложено в вариантах осуществления Е6 или Е7; и маркер ответа на лечение TcdB содержит более чем один из маркеров ответа на лечение TcdB, изложенных в таблице 1, или сцепленных вариантов.

В соответствии с дополнительным вариантом осуществления любого описанных выше из способов и вариантов осуществления (например, варианты осуществления Е1-Е16) способ дополнительно включает лечение указанного пациента с использованием антибиотика, который является эффективным против инфекции С. difficile.

В соответствии с дополнительными вариантами осуществления любого из описанных выше способов и вариантов осуществления (например, вариант осуществления Е1-Е16) пациент представляет собой пациента с высоким риском.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антибиотик является выбранным из группы, состоящей из ванкомицина, метронидазола и фидаксомицина.

В соответствии с подвариантами осуществления любого из вариантов осуществления, описанных выше, пациент по результатам исследования является положительным в отношении одной копии характеризующегося лучшим ответом аллеля одного или нескольких маркеров ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению или сцепленных вариантов. В соответствии с альтернативными подвариантами осуществления пациенты по результатам исследования являются положительными в отношении двух копий характеризующегося лучшим ответом аллеля одного или нескольких маркеров ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению или сцепленных вариантов.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу определения того, способен ли пациент отвечать на лекарственный препарат, который целенаправленно воздействует на токсин В С. difficile (TcdB) у пациента-человека, причем указанный способ включает: (а) получение или использование полученного биологического образца от указанного пациента; (b) определение того, присутствует ли характеризующийся лучшим ответом аллель по меньшей мере одного маркера ответа на TcdB или сцепленный вариант в биологическом образце, при этом маркер ответа на TcdB является выбранным из группы, состоящей из: (i) аллеля Т однонуклеотидного полиморфизма (SNP) rs2516513; (ii) аллеля A SNP rs113379306; (iii) аллеля A SNP rs76166871; (iv) аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1; (v) аллеля HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1 и (vi) аллеля HLA-DQA1*02:01 гена HLA-DQA1; и (с) диагностирование пациента как чувствительного к лечению с использованием лекарственного препарата против TcdB, когда выявляют присутствие характеризующегося лучшим ответом аллеля в биологическом образце.

В соответствии с некоторыми описанными выше вариантами осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает стадию (d), которая включает введение терапевтически эффективного количества лекарственного препарата против TcdB диагностированному пациенту.

В соответствии с одним вариантом осуществления описанного выше способа лекарственный препарат против TcdB представляет собой антитело к TcdB или его антигенсвязывающий фрагмент. В соответствии с конкретными вариантами осуществления антитело к TcdB или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой безлотоксумаб.

В соответствии с дополнительными вариантами осуществления способ дополнительно включает введение пациенту антибиотика, который является эффективным против инфекции Clostridium difficile. В соответствии с конкретными вариантами осуществления антибиотик является выбранным из группы, состоящей из ванкомицина, метронидазола и фидаксомицина.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из вышеописанных способов на стадии выявляют (b) аллель Т SNP rs2516513 или аллель HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1, а на стадии (с) пациент диагностируется как чувствительный к лечению с использованием антитела к TcdB, когда выявляют аллель Т SNP rs2516513 или аллель HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1, или если выявляют как SNP rs2516513, так и аллель HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1.

В соответствии с вариантами осуществления описанного выше способа определения пациент представляет собой человека, у которого была диагностирована инфекция Clostridium difficile, или проявляются симптомы ассоциированного с Clostridium difficile заболевания. В соответствии с конкретными вариантами осуществления пациент представляет собой взрослого человека.

В соответствии с вариантами осуществления вышеуказанного способа определения стадия (b) включает направление биологического образца в диагностическую лабораторию для определения того, присутствует ли характеризующийся лучшим ответом аллель маркера ответа на лечение TcdB в образце.

Настоящее изобретение также относится к лекарственному продукту, который содержит фармацевтическую композицию и инструкцию по применению, при этом фармацевтическая композиция содержит антитело к TcdB, и инструкция по применению содержит фармакогенетические показания, при этом фармакогенетические показания содержат лечение инфекции С. difficile или предотвращение рецидива С. difficile у пациентов, инфицированных С. difficile, которые по результатам исследования являются положительными в отношении по меньшей мере одной копии характеризующегося лучшим ответом аллеля, выбранного из маркера ответа на лечение TcdB или сцепленного варианта, выбранного из группы, состоящей из: (а) аллеля Т однонуклеотидного полиморфизма (SNP) rs2516513; (b) аллеля A SNP rs113379306; (с); аллеля A SNP rs76166871; (d) аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1; (е) аллеля HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1 и (f) аллеля HLA-DQA1*02:01 гена HLA-DQA1.

В соответствии с вариантами осуществления этого аспекта настоящего изобретения маркер ответа на антитело к TcdB представляет собой аллель Т SNP rs2516513 и/или аллель HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1.

В соответствии с дополнительными вариантами осуществления лекарственного продукта согласно настоящему изобретению фармакогенетические показания дополнительно содержат лечение инфекции С. difficile с использованием антибиотика. В соответствии с конкретными вариантами осуществления антибиотик является выбранным из группы, состоящей из ванкомицина, метронидазола и фидаксомицина.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления любого из лекарственных продуктов согласно настоящему изобретению антитело к TcdB представляет собой безлотоксумаб.

Настоящее изобретение также относится к безлотоксумабу для применения в предотвращении рецидива С. difficile в подгруппе пациентов, которые по результатам исследования являются положительными в отношении характеризующегося лучшим ответом аллеля маркера ответа на лечение TcdB, выбранного из группы, состоящей из: (а) аллеля Т SNP rs2516513; (b) аллеля A SNP rs113379306; (с) аллеля A SNP rs76166871; (d) аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1; (е) аллеля HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1 и (f) аллеля HLA-DQA1*02:0] гена HLA-DQA1 или сцепленного варианта маркера ответа на лечение TcdB.

Настоящим изобретением дополнительно предполагается применение безлотоксумаба в производстве лекарственного средства для предотвращения рецидива С. difficile у пациента-человека, при этом пациент по результатам исследования является положительным в отношении характеризующегося лучшим ответом аллеля маркера ответа на лечение TcdB, выбранного из группы, состоящей из (а) аллеля Т SNP rs2516513; (b) аллеля A SNP rs113379306; (с) аллеля A SNP rs76166871; (d) аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1; (е) аллеля HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1 и (f) аллеля HLA-DQA1*02:01 гена HLA-DQA1 или сцепленного варианта маркера ответа на лечение TcdB.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления описанного выше применения характеризующийся лучшим ответом аллель маркера ответа на лечение TcdB представляет собой аллель Т SNP rs2516513 или аллель HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1. В соответствии с дополнительными вариантами осуществления описанного выше применения пациент по результатам исследования является положительным в отношении как аллеля Т SNP rs2516513, так и аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления лекарственный препарат против TcdB, применяемый в фармацевтических композициях, лекарственных продуктах, наборах, способах и применениях согласно настоящему изобретению, может представлять собой любой известный лекарственный препарат против TcdB, такой как антитело. В соответствии с одним вариантом осуществления лекарственный препарат против TcdB представляет собой антитело к TcdB. В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами осуществления антитело к TcdB представляет собой безлотоксумаб. В соответствии с дополнительными вариантами осуществления антитело к TcdB представляет собой антитело, которое специфически связывается с TcdB, или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат CDR легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3), состоящие из последовательности аминокислот, которые изложены в SEQ ID NO: 2, 3 и 4, соответственно, и CDR тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3), состоящие из последовательности аминокислот, которые изложены в SEQ ID NO: 6, 7 и 8, соответственно. В соответствии с дополнительными вариантами осуществления антитело к TcdB представляет собой антитело, которое специфически связывается с TcdB, или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат V_L участок, содержащий последовательность аминокислот, которая изложена в SEQ ID NO: 1, и V_H участок, содержащий последовательность аминокислот, которая изложена в SEQ ID NO: 5.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способов и применений согласно настоящему изобретению антитело к TcdB вводят в комбинации с антибиотиком. В соответствии с дополнительными вариантами осуществления антитело к TcdB вводят в комбинации с антибиотиком, выбранным из группы, состоящей из: ванкомицина, метронидазола и фидаксомицина. Антитело к TcdB и антибиотик можно вводить в одной и той же или отдельных лекарственных формах.

Нарушения, лечение которых можно осуществлять использованием фармацевтических композиций, лекарственных продуктов, наборов, способов и применений согласно настоящему изобретению, обычно представляют собой те, которые являются чувствительными к лечению с использованием лекарственного препарата против TcdB, т.е. антитело к TcdB достигает клинически измеримого благоприятного результата в группе пациентов с заболеванием. Иллюстративные заболевания и состояния, чувствительные к лечению с использованием лекарственного препарата против TcdB, включают в себя антибиотик-ассоциированную диарею, колит и псевдомембранозный колит и/или инфекцию С. difficile.

В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, лекарственному продукту, набору, способу или применению для лечения инфекции С. difficile, которые включают в себя инструкции по введению терапевтически эффективной дозы антитела к TcdB пациенту, нуждающемуся в таком лечении. В соответствии с конкретным вариантом осуществления заболевание или состояние, подлежащее лечению, представляет собой инфекцию С. difficile. В соответствии с дополнительными вариантами осуществления у пациента проявляются симптомы CDAD.

В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления маркер ответа на антитело к TcdB согласно настоящему изобретению применяют совместно с любой монотерапией антителом к TcdB или схемой лечения с комплексной терапией, содержащий антитело к TcdB и антибиотик. В соответствии с конкретными вариантами осуществления антибиотик является выбранным из группы, состоящей из метронидазола, ванкомицина и фидаксомицина.

Доза и схема дозирования других средств, применяемых в методах комплексной терапии согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, чувствительных к лечению с помощью антитела к TcdB, может быть определена лечащим врачом-клиницистом, принимая во внимание одобренные дозы и схемы дозирования в листке-вкладыше в упаковке; а также возраст, пол и общее состояние здоровья пациента. Средства вводимые в составе комплексной терапии можно вводить одновременно (т.е. в одной и той же композиции или в отдельных композициях одно сразу после другого) или последовательно. Это является особенно полезным, когда компоненты комбинации дают согласно отличающимся режимам дозирования, например, один компонент вводят один раз в сутки, а другой дают один раз в неделю, или когда предпочтительные фармацевтические композиции отличаются, например, одна представляет собой таблетку, а другая представляет собой капсулу или инфузионный раствор. Следовательно, преимущественным является набор, содержащий отдельные лекарственные формы.

При назначении комплексной терапии, которую выбирают для лечения пациента на основании присутствия или отсутствия маркера ответа на лечение TcdB у пациента, терапевтические средства в комбинации или фармацевтическую композицию или композиции, содержащие терапевтические средства, можно вводить в любом порядке, как например, последовательно, параллельно, совместно, одновременно и т.п. Количества различных терапевтических средств при такой комплексной терапии могут представлять собой отличающиеся количества (отличающиеся величины дозы) или одинаковые количества (одинаковые величины дозы). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления средства в комбинации вводят в дозах, обычно применяемых, когда такие средства применяют в качестве монотерапии для лечения заболевания или состояния пациента, в то время как в соответствии с другими вариантами осуществления средства вводят в дозах ниже, чем дозы, обычно используемые, когда такие средства применяют в качестве монотерапии для лечения заболевания или состояния.

Авторы настоящего изобретения в данном документе также предполагают, что маркеры ответа на лечение TcdB, описанные в данном документе, можно применять для обращения с целью получения одобрения контролирующим органом для реализации на рынке нового лекарственного препарата против TcdB или антитела к TcdB по фармакогенетическим показаниям, т.е. по показаниям, которые включают в себя составляющую заболевания и составляющую маркера для лечения TcdB. Составляющая заболевания представляет собой заболевание, чувствительное к лечению с использованием лекарственного препарата против TcdB, такое как CDI, а составляющая генетического маркера представляет собой пациента, который по результатам исследования является положительным в отношении по меньшей мере одной копии одного из характеризующихся лучшим ответом аллелей, которые изложены в таблице 1 (например, в отношении по меньшей мере одного из одной копии аллеля Т SNP rs2516513). Подобным образом, авторы настоящего изобретения в данном документе предполагают, что маркеры ответа на лечение TcdB являются полезными для для обращения с целью получения одобрения таких фармакогенетических показаний для одобренного в настоящее время лекарственного препарата против TcdB или антител к TcdB, которые медицинские работники вынуждены прописывать для определенных заболеваний на основании предельного соотношения польза/риск от лекарственного средства для таких заболеваний в общей популяции.

Получение одобрения для фармакогенетических показаний может включать измерение частоты возникновения желаемого ответа на лекарственное средство в двух отдельных группах пациентов, получающих лечение лекарственным средством. Каждый индивид в пределах одной из групп имеет заболевание и генетические профили, которые ставят индивида в пределы предлагаемых фармакогенетических показаний. Индивиды в другой группе могут быть выбраны случайным образом независимо от того, имеют ли они составляющую генетического маркера в предлагаемых фармакогенетических показаниях. В качестве альтернативы, индивидов относят к другой группе таким образом, который дает в результате «контрольную» группу, в которой процент индивидов, которые соответствуют и не соответствуют условию, что составляющая генетического маркера является подобной той, которая наблюдается в общей популяции или в популяции пациентов с составляющей заболевания предлагаемых фармакогенетических показаний. Лекарственный продукт, за получением одобрения для которого обращаются, можно вводить двум группам в проспективном испытании. В качестве альтернативы, можно проводить ретроспективный фармакогенетический анализ пациентов, ранее получавших лечение лекарственным средством. Специалист в данной области техники может легко определить альтернативный план исследования для изучения конкретных фармакогенетических показаний, представляющих интерес.

Лекарственный продукт, для которого обращаются за фармакогенетическими показаниями, можно оценить с использованием других терапевтически активных средств, например, другого лекарственного средства с эффективностью в отношении лечения заболевания или состояния при предлагаемых фармакогенетических показаниях или средства, которое предназначено для снижения частоты возникновения неблагоприятного эффекта, вызванного лекарственным средством. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармакогенетические показания, за одобрением контролирующим органом для которых обращаются, могут включать в себя другие маркеры (генетические маркеры или биологические маркеры) или прогностические факторы ответа на лекарственное средство.

Фармакогенетическое исследование может быть спланировано после консультации с представителями регуляторного органа или государственной организации, одобрение от которой требуется перед реализацией на рынке фармакогенетического лекарственного продукта в конкретной стране. Предпочтительно, регуляторный орган уполномочен правительством одной из основных индустриально развитых стран, таких как Австралия, Канада, Китай, член Европейского союза, Япония, Южная Корея, Тайвань или подобная. Наиболее предпочтительно, регуляторный орган уполномочен правительством Соединенных Штатов Америки, и тип заявки на одобрение, которую подают, будет зависеть от требований законодательств а, изложенных в последней принятой версии Закона о пищевых продуктах, лекарственных препаратах и косметических средствах, который является применимым к лекарственному продукту, и также может включать другие факторы, которые необходимо учитывать, такие как затраты на подачу в регуляторный орган и маркетинговую стратегию для лекарственного продукта. Например, если фармацевтический состав в лекарственном продукте был ранее одобрен для составляющей болезни в предлагаемых фармакогенетических показаниях, то заявка может представлять собой бумажную NDA (заявка на одобрение нового лекарственного средства) или заявку, поданную согласно разделу 351(k) Закона об общественном здравоохранении, дополняющую NDA или BLA (заявка на лицензирование биологического препарата) или сокращенную NDA или BLA, но может потребоваться, чтобы заявка представляла собой полную NDA или BLA, если фармацевтический состав никогда не был одобрен ранее; при этом эти термины имеют значения, применяемые к ним специалистами в области фармацевтики, или которые определены в Законе о ценовой конкуренции в сфере лекарственных средств и восстановлении срока действия патентов от 1984 года или в Законе о ценовой конкуренции и инновациях в сфере биологических препаратов от 2009 года (BPCIA) в Законе о защите пациентов и доступном здравоохранении (2010).

Одним желательным конечным результатом фармакогенетического клинического испытания с применением маркера ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению является одобрение реализации на рынке лекарственного продукта, который содержит (1) фармацевтическую композицию лекарственного препарата против TcdB и (2) инструкцию по медицинскому применению препарата, которая включает в себя фармакогенетические показания, для которых рекомендована фармацевтическая композиция. Инструкция по медицинскому применению препарата, как правило, находится в листке-вкладыше, также часто называемом листком-вкладышем в упаковке или этикеткой, для лекарственного средства.

Как обсуждалось выше, фармакогенетические показания имеют две составляющие: составляющую заболевания и составляющую маркера ответа на лечение TcdB. Таким образом, в инструкции по медицинскому применению препарата будет описываться генетически определенная группа пациентов, для которых лекарственное средство продемонстрировало эффективность в отношении одного или нескольких заболеваний, симптомов или медицинских состояний. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления в инструкции по медицинскому применению препарата будет обсуждаться, как идентифицировать индивидов, которые находятся в генетически определенной группе. Например, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления в инструкции по медицинскому применению препарата указывается, что лекарственное средство показано для индивидов, которые по результатам исследования являются положительными в отношении характеризующегося лучшим ответом аллеля маркера ответа на антитело к TcdB, описанного в данном документе. В качестве альтернативы, в инструкции по медицинскому применению препарата может указываться, что лекарственное средство является противопоказанным для индивидов, которые по результатам исследования являются отрицательными в отношении характеризующегося лучшим ответом аллеля маркера ответа на антитело к TcdB, описанного в данном документе. В соответствии с другими вариантами осуществления на одобренной этикетке может быть указано, что лекарственный препарат против TcdB показан для предотвращения рецидивов CDI у пациентов, которые несут конкретный генотип маркера ответа на лечение TcdB, например, пациенты, которые являются гомозиготными (Т/Т) или гетерозиготными (С/Т) по SNP rs2516513, или пациенты, которые несут характеризующийся лучшим ответом аллель другого маркера ответа на лечение TcdB, изложенного в данном документе. В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами осуществления инструкция по медицинскому применению препарата включает в себя название по меньшей мере одного одобренного диагностического исследования, которое применяют для выявления присутствия или отсутствия требующейся составляющей генетического маркера в фармакогенетических показаниях. Как описано выше, фармакогенетические показания для фармакогенетического лекарственного продукта согласно настоящему изобретению могут включать в себя дополнительные маркеры или прогностические факторы для ответа на фармацевтическую композицию лекарственного препарата против TcdB и/или требование по применению лекарственного средства в комбинации с одним или несколькими другими терапевтически активными средствами (например, антибиотиками). Инструкция по медицинскому применению препарата может включать в себя информацию о рекомендованных дозировках и схемах лечения.

В предпочтительных фармакогенетических лекарственных продуктах согласно настоящему изобретению фармацевтическая композиция содержит лекарственный препарат против TcdB. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления этого аспекта настоящего изобретения лекарственный препарат против TcdB представляет собой антитело к TcdB. В соответствии с дополнительным предпочтительным вариантом осуществления антитело к TcdB представляет собой безлотоксумаб. В соответствии с дополнительными вариантами осуществления антитело к TcdB представляет собой антитело, которое специфически связывается с TcdB, или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат CDR легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3), состоящие из последовательности аминокислот, которые изложены в SEQ ID NO: 2, 3 и 4, соответственно, и CDR тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3), состоящие из последовательности аминокислот, которые изложены в SEQ ID NO: 6, 7 и 8, соответственно. В соответствии с дополнительными вариантами осуществления антитело к TcdB представляет собой антитело, которое специфически связывается с TcdB, или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат V_L участок, содержащий последовательность аминокислот, которая изложена в SEQ ID NO: 1, и V_H участок, содержащий последовательность аминокислот, которая изложена в SEQ ID NO: 5.

Предпочтительные фармакогенетические показания для лекарственных продуктов согласно настоящему изобретению включают применение фармацевтической композиции для лечения пациентов, страдающих от инфекции С. difficile, и имеющих по меньшей мере одну копию одного из характеризующихся лучшим ответом аллелей для маркеров ответа на антитело к TcdB, изложенных в таблице 1. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления пациенты по результатам исследования являются положительными в отношении по меньшей мере одной копии аллеля Т для SNP rs2516513. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления в инструкции по медицинскому применению препарата указывается, что фармацевтическая композиция антитела к TcdB показана в комбинации с антибиотиком (например, ванкомицином, метронидазолом или фидаксомицином) для лечения пациентов, страдающих от инфекции С. difficile.

Любые или все аналитические и математические операции, задействованные в осуществлении способов и применений, описанных в данном документе или в применении наборов, композиции и лекарственных продуктов, описанных в данном документе, могут быть реализованы с помощью компьютера. Например, компьютер может выполнять компьютерную программу, которая оценивает присутствие или отсутствие характеризующегося лучшим ответом аллеля маркера ответа на антитело к TcdB у индивида на основании данных о генотипе, вводимых работником исследовательской лаборатории или медицинским работником, осуществляющим лечение. Кроме того, тот же компьютер или другой компьютер может выдавать прогнозируемый ответ на терапию антителом к TcdB на основании оценки этого маркера ответа. Данные, относящиеся к присутствию или отсутствию характеризующегося лучшим ответом аллеля маркера ответа на антитело к TcdB у индивида, могут храниться в составе реляционной базы данных (например, вариант базы данных Oracle или набор плоских файлов в формате ASCII), содержащей другие клинические и/или генетические данные для индивида. Эти данные могут храниться на жестком диске компьютера или могут, например, храниться на CD-ROM или на одном или нескольких устройствах для хранения данных, доступных компьютеру. Например, данные могут храниться в одной или нескольких базах данных, связанных с компьютером с помощью сети.

Все публикации, упомянутые в данном документе, включены посредством ссылки с целью описания и раскрытия методов и материалов, которые можно применять вместе с настоящим изобретением.

Описывая различные варианты осуществления настоящего изобретения в данном документе со ссылкой на прилагаемые графические материалы, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается в точности этими варианты осуществления, и что различные изменения и модификации могут быть произведены в них специалистом в данной области техники без отступления от объема или идеи настоящего изобретения, которые определяются в пунктах прилагаемой формулы изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Клинические испытания актоксумаба/безлотоксумаба и безлотоксумаба у субъектов с CDI

Для того чтобы идентифицировать генетические факторы, вносящие вклад в ответ на лечение, авторы настоящего изобретения проводили фармакогенетический (PGx) анализ на инфицированных С. difficile субъектах, которые подверглись клиническим испытаниям с использованием антитела к токсину В С. difficile для оценки того, варьирует ли среднее различие в лечении в подгруппах пациентов, определяемых генетическими вариантами с применением подхода полногеномного исследования ассоциаций (GWAS). План клинического исследования в двух клинических испытаниях, называемых MODIFY I (PN001) и MODIFY II (PN002), изображен на фиг. 1.

PN001 представляло собой испытание фазы 3 с адаптивным планом, и субъектов с подтвержденной CDI и получающих стандартное лечение для CDI (метронидазол, ванкомицин или фидаксомицин) рандомизировали в соотношении 1:1:1:1 в 1 из 4 групп лечения (безлотоксумаб, актоксумаб, актоксумаб/безлотоксумаб или плацебо). При промежуточном анализе по переменным, заранее предусмотренным в плане исследования, исследование в группе актоксумаба прекращали, решение обуславливалось как низкой эффективностью, так и наблюдавшимся увеличением числа случаев смерти и SAE (системные неблагоприятные эффекты) по сравнению с плацебо. В целом, в общей сложности 1412 пациентов с подтвержденной CDI рандомизировали, и они получали исследуемый препарат: 390 в группе с безлотоксумабом, 235 в группе с актоксумабом, 387 в группе актоксумабом/безлотоксумабом и 400 в группе с плацебо. PN001 соответствует главной цели эффективности, демонстрируя, что лечение с использованием безлотоксумаба существенно уменьшает долю субъектов с рецидивом CDI за 12 недель по сравнению с лечением плацебо (односторонний критерий р=0,0003). Частоты рецидивов CDI составляли 17,4% в группе с безлотоксумабом и 27,6% в группе с плацебо. Для группы с актоксумабом/безлотоксумабом частота рецидивов CDI составляла 15,9% и была значительно лучшей, чем у плацебо (односторонний критерий р<0,0001), но не была значительно лучшей, чем у безлотоксумаба (р=0,2997). Следовательно, добавление актоксумаба/безлотоксумаба к терапии (т.е. актоксумаб/безлотоксумаб) не оказывало благоприятное воздействие на эффективность по сравнению с безлотоксумабом отдельно. Снижение частоты рецидивов CDI для группы с безлотоксумабом относительно плацебо также наблюдали в заранее определенных подгруппах субъектов с высоким риском рецидива и/или связанных с CDI неблагоприятных исходов (т.е. пациенты возрастом ≤65 лет, имеющие в анамнезе CDI в последние 6 месяцев перед эпизодом на этапе включения, тяжелую клиническую форму CDI, риботип 027, эпидемический штамм или ослабленный иммунитет). Несмотря на то что присутствовало численное различие в пользу группы лечения с использованием безлотоксумаба (60,1%) по сравнению с плацебо (55,2%) в отношении ключевого дополнительного ожидаемого результата полного излечения (также известного как устойчивый клинический ответ), статистическая значимость не достигалась (р=0,0861). Актоксумаб/безлотоксумаб не имели преимущества над безлотоксумабом (односторонний критерий р=0,6532) в случае ожидаемого результата полного излечения для любого из них (58,7% для актоксумаба/безлотоксумаба, 60,1% для безлотоксумаба). PN002 являлся идентичным с PN001 в отношении плана и проведения со следующими 3 исключениями: PN002, содержащее 3 группы лечения (безлотоксумабом, актоксумабом/безлотоксумабом и плацебо), представляло собой традиционное клиническое испытание с фиксированным планом, и оно имело продленный на 9 месяцев период последующего наблюдения за субпопуляции субъектов (-300) для оценки рецидива CDI и колонизации токсикогенной С. difficile. Все другие характеристики плана были идентичными у PN001 и PN002. В общей сложности 1167 пациентов с подтвержденной CDI рандомизировали, и они получали исследуемый препарат: 396 в группе с безлотоксумабом, 390 в группе с актоксумабом/безлотоксумабом и 381 в группе с плацебо. PN002 также соответствовал главной цели эффективности и подтверждал, что лечение с использованием безлотоксумаба существенно уменьшает долю субъектов с рецидивом CDI в течение 12 недельного периода по сравнению с лечением плацебо (односторонний критерий p=0,0003). Частоты рецидивов CDI составляли 15,7% и 25,7% в группах с безлотоксумабом и плацебо, соответственно [-9,9 (95% CI: -15,5, -4,3)]. Частота рецидивов CDI в группе с актоксумабом/безлотоксумабом составляла 14,9% и была значительно лучшей, чем у плацебо (односторонний критерий р<0,0001), но не была значительно лучшей, чем у безлотоксумаба (р=0,3718). В соответствии с PN001 снижение частоты рецидивов CDI для группы с безлотоксумабом по сравнению с плацебо наблюдали во всех заранее определенных подгруппах субъектов. Безлотоксумаб демонстрировал превосходство над плацебо в отношении ключевого дополнительного ожидаемого результата полного излечения (66,8% в группе с безлотоксумабом и 52,1% в группе с плацебо; односторонний критерий p=0,0001 [14,6 (95% CI: 7,7, 21,4)]. При сравнении актоксумаба/безлотоксумаба с безлотоксумабом отдельно в отношении достижения полного излечения планируемое р-значение одностороннего критерия, предназначенное для демонстрации того, что актоксумаб/безлотоксумаб превосходил безлотоксумаб, составляло 0,9969, и р-значение одностороннего критерия для оценки того, превосходил ли безлотоксумаб актоксумаб/безлотоксумаб, составляло 0,0031.

Согласно плану интегрированного статистического анализа (ISAP) данные от двух испытаний фазы 3 объединяли для обеспечения интегрированных статистических анализов эффективности и безопасности. На основании объединенного набора данных (PN001+PN002) частоты рецидивов CDI составляли 16,5% для безлотоксумаба и 26,6% для плацебо; скорректированное различие в частотах рецидивов CDI между группами с безлотоксумабом и плацебо составляло 10,0% (95% CI: от -14,0% до -6,0%, односторонний критерий р<0,0001) (показано на фиг. 2).

В предварительно определенных подгруппах субъектов (т.е. пациенты возрастом ≤65 лет, имеющие в анамнезе CDI в последние 6 месяцев перед эпизодом на этапе включения, тяжелую клиническую форму CDI, риботип 027, эпидемический штамм или ослабленный иммунитет) безлотоксумаб снижал частоты рецидивов CDI по сравнению с плацебо (фиг. 3).

Например, частоты рецидивов CDI среди пациентов возрастом ≤65 лет в группе с безлотоксумабом составляли 15,4% по сравнению с 31,4% в группе с плацебо (отличие -16,0 [95% CI, -21,7, -10,2]). Среди пациентов, имеющих в анамнезе CDI в последние 6 месяцев перед эпизодом на этапе включения, частота рецидивов CDI составляла 25,0% в группе с безлотоксумабом в сравнении с 41,1% в группе с плацебо (отличие -16,1 [95% CI, -24,7, -7,3]). Результаты от объединенного набора данных в отношении ключевого дополнительного ожидаемого результата полного излечения обеспечивают веское убедительное доказательство того, что лечение с использованием безлотоксумаба значительно увеличивало долю субъектов, которые достигали полного излечения в течение периода 12 недель по сравнению с плацебо. Значения доли полного излечения составляли 63,5% для безлотоксумаба и 53,7% для плацебо; оцененное скорректированное различие между группой с безлотоксумабом и группой с плацебо составляло 9,7% (95% CI: от 4,8% до 14,5%, односторонний критерий р<0,0001).

В заключение, испытания фазы 3 продемонстрировали, что у пациентов, получавших являющееся стандартом лечения для CDI, лечение с использованием безлотоксумаба превосходило плацебо в предотвращении рецидива CDI (основной ожидаемый результат) в течение периода 12 недель. В обоих испытаниях фазы 3 безлотоксумаб был эффективен в испытуемой популяции в целом, также как и во всех подгруппах пациентов, которые считаются имеющими высокий риск рецидива CDI и/или связанных с CDI неблагоприятных исходов. Превосходящую эффективность безлотоксумаба отдельно по сравнению с плацебо также продемонстрировали для дополнительного ожидаемого результата, полного излечения, в PN002 и в объединенном наборе данных от PN001+PN002. Безлотоксумаб хорошо переносился и имел профиль безопасности, подобный плацебо.

Пример 2. Полногеномное исследование ассоциаций для идентификации SNP, ассоциированных с ответом на лечение, содержащее антитело к TcdB и антибиотик

Полногеномное исследование ассоциаций осуществляли для оценки того, ассоциированы ли генетические варианты в геноме человека с различиями в лечении среди пациентов, рандомизированных в различные группы исследований. Поскольку анализ клинических исследований продемонстрировал, что терапевтический благоприятный эффект преимущественно получают для лечения безлотоксумабом, а не актоксумабом, субъектов из групп лечения, содержащих безлотоксумаб (безлотоксумаб отдельно и безлотоксумаб + актоксумаб) объединяли в группу и сравнивали с плацебо (без введения моноклональных антител, только 0,9% NaCl). Объединенный набор данных для GWAS анализа основывался примерно на 897 пациентах из как MODIFY I, так и из MODIFY II (PN001 и PN002, также называемые в данном документе «набор данных PGx»). Субъектов из группы с актоксумабом отдельно не использовали в GWAS анализе. Только субъектов, которые соответствующим образом оформили свое согласие на генетический анализ, включали в GWAS анализ. Краткая информация о субъектах, которых использовали в GWAS анализах, и частота рецидивов CDI в каждой из групп субъектов представлены на фиг. 4.

Данные о генотипе и клинические данные

ДНК экстрагировали из периферической крови давших согласие субъектов с применением стандартных процедур. Генетические данные получали из образцов ДНК с применением матрицы UK Biobank Axiom® Array (Affymetrix, Санта-Клара) и рекомендованных производителем реактивов и условий. Матрица охватывает примерно 800000 полиморфных сайтов в геноме. Соответствующие процедуры для контроля качества в генетических анализах и методы условной подстановки применяли к наборам данных.

Пример 3. Статистические методы

Два базовых исследования MODIFY I и II (PN001 и PN002) проводили для оценки безлотоксумаба (MK-6072), актоксумаба (MK-3415), комбинации безлотоксумаба и актоксумаба (MK-3415А), а также плацебо для предотвращения рецидива С. difficile (rCDI) у пациентов, получавших являющиеся стандартом лечения антибиотики. Основным клиническим конечным показателем, представляющим интерес, являлся rCDI, определенный как проявление нового эпизода диареи (3 или более жидких стула за 24 или меньше часов), ассоциированного с положительным анализом кала местной или центральной лабораторией в отношении токсикогенной С. difficile, после клинического выздоровления после первоначального эпизода CDI. Основным конечным показателем эффективности была доля пациентов с рецидивом CDI, оцениваемая в течение 12 недель. Первоначальные результаты эффективности из двух исследований показывали, что безлотоксумаб превосходил плацебо в снижении частоты рецидивов CDI (р<0,0001), а актоксумаб отдельно не демонстрировал эффективность по сравнению с плацебо 0=0,3182).

Генетические данные получали на коммерческой платформе Affymetrix Axiom^r с применением матрицы UK Biobank. Матрицы Axiom имеет примерно 836000 генетических вариантов. Условную подстановку генотипа на генотипируемых образцах как из исследования PN001, так и из PN002 с применением справочных данных для 1000 геномов из фазы 3 и программного обеспечения Impute2 (Howie et al., Fast and accurate genotype imputation in genome-wide association studies through pre-phasing. Nature Genetics 44(8): 955-959 (2012)) осуществляли после контроля качества (QC) в генетических исследованиях, но перед генетическим анализом. Основной набор генетических вариантов, используемый в качестве исходной информации в анализах, описанных ниже, включал в себя как анализируемые, так и подставляемые SNP. Цели исследования заключались в проведении полногеномного анализа отдельных вариантов для идентификации генетической вариации, которая ассоциируется с ответом на лечение, что определяется по пониженному риску рецидива CDI.

Генетические основные составляющие (PC) рассчитывали с применением EIGENSOFT (Price et al. (2006) Principal components analysis corrects for stratification in genome-wide association studies. Nat Genet 38: 904-909), и первые пять PC использовали в качестве ковариат в статистических моделях для контроля в отношении искажения вследствие стратификации популяции в выборках, которые включали в себя пациентов из нескольких расовых групп. Для анализа конечного показателя рецидива CDI основанную на критерии отношения подобия (LRT) логистическую регрессию применяли для оценки объединенной прогностической и связанной с лечением ассоциации каждого генетического варианта с ответом. Релевантные ковариаты, включающие в себя 5 главных PC и HOSPSTR (указатель госпитализации, стационарной или амбулаторной), а также и SOCSTR (указатель стандарта лечения (SOC), фидаксомицин, метронидазол или ванкомицин), были включены в модели, и генотипы кодировали для выявления аддитивных генетических эффектов. В пределах каждого генетического варианта генотип кодировали с помощью цифр для отдельного пациента как 0, 1 или 2 в зависимости от числа копий минорного аллеля. Лечение записывали с помощью цифр 0, 1 и 2 в зависимости от того, получал ли пациент плацебо + SOC терапию, монотерапию (актотоксумаб или безлотоксумаб отдельно, MK-3415 или MK-6072, соответственно) + SOC терапию или комплексную терапию (актотоксумаб + безлотоксумаб MK-3415А) + SOC терапию, соответственно, в рамках исследования или сравнения. Полная модель представляла собой:

logit(p_ij)=β₀+HOSPSTR+SOCSTR+PC1+PC2+PC3+PC4+PC5+β₁×trt_i+β₂×g_j+β₃×trt_i×g_j где p_ij представляет собой частоту рецидивов CDI для группы лечения i и генотипа j.

Сравнительная модель представляла собой:

Различие в -2×log(LR) сравнивали с распределением хи-квадрат с 2 степенями свободы. Вследствие ограниченной мощности в SNP с низкой MAF только широко распространенные SNP с частотой минорного аллеля (MAF) ≥0,01 исследовали в этом анализе. Поправку Бонферрони использовали для коррекции на множественность. Пороговое р-значение для критерия, составляющее 5Е-8, использовали для признания статистической значимости, что означает, что SNP с р-значениями, меньшими чем 5Е-8, будут считаться статистически значимыми в масштабе всего генома.

В дополнение к традиционному GWAS анализу проводили анализ ассоциаций HLA в хМНС (расширенная область генов главного комплекса гистосовместимости). Аллели HLA в трех локусах класса I (HLA-A, HLA-B и HLA-C) и четырех локусах класса II (HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1 и HLA-DPB1) условно подставляли с применением HIBAG (Zheng., et al. HIBAG - HLA Genotype Imputation with Attribute Bagging, The Pharmacogenomics Journal, doi: 10.1038/tpj.2013.18). Использовали наиболее вероятные подставляемые типы HLA, устанавливая пороговое значения для частоты сигнала 0,5, это означает, что подставленные генотипы считали пропущенными, если апостериорная вероятность их условной подстановки составляла менее 0,5. Многоаллельные типы HLA превращали в двухаллельные аллели HLA для каждого отдельного аллеля HLA. Двухаллельные аллели HLA затем записывали как 0,1 и 2 по числу носителей их минорного аллеля, предполагая аддитивную генетическую модель. Например, если аллель HLA представляет собой HLA-A*11:01, его генотипы Х/Х, HLA-A*11:01/X и HLA-A*11:01/HLA-А*11:01 будут обозначаться как 0, 1 и 2, соответственно. В общей сложности 219 аллелей HLA от трех генов HLA класса I и четырех генов HLA класса II подставляли с помощью HIBAG, из которых 112 были широко распространенными с MAF >1% и использовались для анализа. Метод статистического анализа для аллелей HLA был точно таким же, как описанный выше для GWAS SNP. Поправку Бонферрони использовали для коррекции по множественности и пороговое р-значение для статистической значимости различий устанавливали как 4,46Е-04 (0,05/112) для анализа ассоциаций HLA.

Пример 4. Оценка результатов GWAS в отношении рецидивов CDI при сравнении групп, содержащих безлотоксумаб, с плацебо

Исходные данные GWAS подвергали контролю качества и дополнительно подвергали условной подстановке с применением программного обеспечения Impute2. Для фильтрования субъектов удаляли субъектов с генотипами ≤97% локусов, проблематичной проверкой пола (F>0,8 отвечали по мужскому типу, F<0,2 отвечали по женскому типу), дубликаты или родственников по меньшей мере 2-й степени родства при проверке всех значений парной IBD (идентичность по происхождению) и с большой степенью гетерозиготности (≥3 стандартных отклонения от среднего значения). Для фильтрования SNP (после фильтрования выборки) удаляли SNP с показателями ответа ≤97% и неаутосомные SNP. После QC (контроль качества) и условной подстановки 1001 субъектов и 7570264 вариантов были доступны для анализа. 104 субъекта, которые получали актоксумаб отдельно, дополнительно удаляли из анализа, поскольку актоксумаб не демонстрировал по сравнению с плацебо (р=0,3182). По определению, субъекты с rCDI первоначально должны были достигнуть клинического выздоровления (определенного как ≤14 суток SOC терапии и отсутствие диареи (≤2 жидких стула за 24 часа) в течение 2 последовательных суток после завершения SOC терапии для первоначального эпизода CDI), и, таким образом, 193 пациента, которые не имели первоначального клинического выздоровления, не были включены в анализы. Данные MAF или распределения аллелей HLA по частоте для подставленных HLA на основании данных GWAS в хМНС, объединенных из обоих из PN001 и PN002 (N=1001), визуально представлены на фиг. 6.

Результаты ассоциаций в полногеномном масштабе обобщены на манхэттенском графике (фиг. 7) и QQ-графике (фиг. 8). Три SNP идентифицировали в результате GWAS анализа как ассоциированные с конечным показателем rCDI, из которых rs2516513 (6: 31447588) располагался в хМНС, a rs113379306 (6:17333351) и rs76166871 (6:17329940) располагался за ее пределами, но вблизи хМНС. Кроме того, в анализах ассоциации HLA идентифицировали три аллеля HLA, также ассоциированные с конечным показателем rCDI. Подробные результаты по ассоциации этих шести маркеров обобщены в таблице 3. Подобные результаты получали при анализе данных GWAS при включении пациентов, которые не достигали клинического выздоровления, в качестве анализа чувствительности, и с данными для субпопуляции пациентов европейского происхождения (результаты не показаны). Региональный график rs2516513 показан на фиг. 9.

Дополнительные условные анализы проводили для идентификации относительно независимых сигналов для шести аллелей SNP и HLA. В таблице 4 представлена информация о попарном неравновесном сцеплении (LD) для статистически значимых аллелей SNP и HLA на основании GWAS и анализов ассоциации HLA для шести маркеров. SNP rs76166871 и rs113379306 находились в практически идеальном LD друг с другом (LD r²=0,99), и HLA-DRB1*07:01 и HLA-DQA1*02:01 находились в практически идеальном LD друг с другом (LD r¹=0,98), в то время как SNP rs2516513 и rs113379306 являлись полностью независимыми друг от друга (LD r²=0). Аллели HLA-DRB1*07:01 и HLA-DQB1*02:02 находились в умеренном LD (LD r²=0,68). Единственным уникальным статистически значимым результатом условного анализа был SNP rs2516513 на основании результатов GWAS, поскольку р-значение для rs76166871 не было значимым (р>0,05), если условие задавали по rs2516513. HLA-DRB1*07:01 и HLA-DQB1*02:02 имеют коэффициент корреляции r¹ для LD, составляющий 0,68, и HLA-DRB1*07:01 является более значимым в анализе отдельных маркеров. Кроме того, HLA-DRB1*07:01 может объяснить большую вариацию, чем HLA-DQB1*02:02 при объединении с rs2516513. Результаты условного анализа между двумя самыми лучшими сигналами rs2516513 и HLA-DRB1*07:01 показаны в таблице 5 и указывают на то, что они были относительно независимыми друг от друга.

Региональный график ассоциации SNP для rs2516513 (6:31447588, анализируемый) в участке хМНС показан на фиг. 9. rs2516513 представляет собой межгенный и лежащий ниже по ходу транскрипции вариант вблизи гена НСР5. Несколько SNP вокруг SNP rs2516513 также проявляли ассоциацию с конечным показателем rCDI, но она преимущественно обусловлена их высоким LD с этим SNP. Генетические эффекты кратко изложены в таблице 6 и таблице 7 для маркеров rs2516513 и HLA-DRB1*07:01, соответственно. Отличие рисков ((безлотоксумаб + (комбинированные безлотоксумаб/актоксумаб)) - плацебо) развития rCDI в субпопуляции носителей аллеля Т составляло -21,50%, что приблизительно вдвое больше показателя от общей популяции (-10,70%). Подобным образом, отличие рисков проявления rCDI в субпопуляции носителей HLA-DRB1*07:01 составляет -32,30%, что приблизительно втрое больше показателя от общей популяции (-10,70%). Эти результаты демонстрируют релевантность маркеров, идентифицированных на основании анализов ассоциации GWAS и HLA, для прогнозирования субъектов, на которых оказывает улучшенное благоприятное воздействие лечение безлотоксумабом. Кроме того, комбинация SNP и аллелей HLA также может обеспечивать пользу в прогнозировании субъектов, на которых оказывает улучшенное благоприятное воздействие лечение безлотоксумабом. В качестве примера, в таблице 8 показаны генетические эффекты у субъектов, которые несут любой из аллеля Т rs2516513 или аллеля HLA-DRB1*07:01, а также у субъектов, которые несут как аллель Т rs2516513, так и аллель HLA-DRB1*07:01.

Пример 5. rCDI, стратифицированная по генотипу и категории риска

Частоты rCDI для популяции PGx сравнивали с подгруппами с высоким/низким риском rCDI, стратифицированными по SNP rs2516513. Высокий риск rCDI определяли как наличие одного или нескольких из следующих шести факторов: наличие в анамнезе одного или нескольких эпизодов CDI в последние шесть месяцев, тяжелая CDI на этапе включения (согласно оценке по Zar), возраст ≥65 лет, CDI, вызванная гипервирулентным штаммом (риботипы 027, 078 или 244), ослабленный иммунитет или одновременное получение системных антибиотиков. Низкий риск rCDI определяли как отсутствие любого из факторов высокого риска rCDI.

Значительное снижение частоты rCDI, встречающихся у получавших лечение безлотоксумабом («BEZ») участников исследования, которые несли аллель Т rs2516513 (отличие рисков -21,5% с р-значением = 3,04Е-05 в сравнении с отличием рисков -10,7% в целом без стратификации по генотипу) и аллель HLA-DRB1*07:01 (отличие рисков -32,3% с р-значением = 1,95Е-05 в сравнении с отличием рисков -10,5% в целом без стратификации по генотипу) по сравнению с реципиентами РВО (см. фиг. 10). Величины эффектов аллелей Т и HLA-DRB1*07:01 были более выраженными у получавших лечение BEZ участников исследования с высоким риском rCDI (отличие рисков -24,6% в сравнении с РВО, р-значение = 5,69Е-05; и отличие рисков -33,2% в сравнении с РВО, р-значение = 9,81Е-05, соответственно). У гомозиготных СС пациентов частоты rCDI были подобными в обеих группах лечения и у пациентов с высоким и низким риском rCDI.

Тенденции в эффекте этих аллелей также наблюдали у участников исследования в подгруппах с низким риском, хотя они не были статистически значимыми (аллель Т: отличие рисков -10,6% в сравнении с РВО, р-значение = 0,15; и аллель HLA-DRB1*07:01: отличие рисков -28,3% в сравнении с РВО, р-значение = 0,085), что может быть обусловлено малым количеством участников исследования в этих подгруппах.

На фиг. 11 показано, что снижение риска rCDI у получающих лечение BEZ участников, несущих аллель Т rs2516513 и HLA-DRB1*07:01, по сравнению с реципиентами РВО варьировало в соответствии с факторами риска. Результаты для генотипа rs2516513 указывают на то, что участники исследования, несущие аллель Т, проявляли четкую тенденцию в отношении благоприятного воздействия от лечения BEZ независимо от категорий риска rCDI; в то время как на 47% участников исследования, несущих генотип СС, которые имели высокий риск rCDI, оказывало ограниченное благоприятное воздействие лечение BEZ. На участников исследования с высоким риском, имеющих генотип HLA-DRB1*07:01, оказывало благоприятное воздействие лечение BEZ независимо от генетической стратификации, хотя ассоциация не является статистически значимой в подгруппе с низким риском (р-значение = 0,085). В подгруппах с низким риском примерно на 9% участников исследования, несущих аллель Т, и примерно на 4%, несущих аллель HLA-DRB1*07:01, могло оказать благоприятное воздействие лечение BEZ.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетическим маркерам на 6-й хромосоме человека, которые являются ассоциированными с благоприятным ответом на лечение, целенаправленно воздействующее на токсин В Clostridium difficile (С. difficile) (TcdB), например, антитело к TcdB. Эти маркеры ответа на лечение TcdB являются полезными, среди прочего, для идентификации пациентов, на которых с наибольшей вероятностью будет оказывать благоприятное воздействие лечение с использованием средства для лечения, целенаправленно воздействующего на TcdB. Настоящее изобретение также относится к антителам, лекарственным средствам и наборам, пригодным вместе с маркерами ответа на лечение TcdB согласно настоящему изобретению. 6 н. и 24 з.п. ф-лы, 11 ил., 9 табл., 5 пр.

1. Способ предотвращения рецидива инфекции Clostridium difficile (C. difficile), включающий:

введение терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента к токсину B C. difficile (TcdB) пациенту, нуждающемуся в этом, при этом указанный пациент перед введением антитела TcdB по результатам исследования является положительным в отношении по меньшей мере одной копии характеризующегося лучшим ответом аллеля одного или более маркеров ответа на лечение TcdB, выбранных из группы, состоящей из:

a) аллеля T однонуклеотидного полиморфизма (SNP) rs2516513;

b) аллеля A SNP rs113379306;

c) аллеля A SNP rs76166871;

d) аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1;

e) аллеля HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1;

f) аллеля HLA-DQA1*02:01 гена HLA-DQA1 и

g) сцепленного варианта одного или более из маркеров ответа на лечение TcdB, изложенных в a)–f).

2. Способ по п. 1, в котором антитело к TcdB или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3) и три CDR легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3), причем:

a) CDRH1 состоит из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO:7, или представляет собой вариант SEQ ID NO:7, имеющий одну или две консервативные аминокислотные замены;

b) CDRH2 состоит из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO:8, или представляет собой вариант SEQ ID NO:8, имеющий одну или две консервативные аминокислотные замены;

c) CDRH3 состоит из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO:9, или представляет собой вариант SEQ ID NO:9, имеющий одну или две консервативные аминокислотные замены;

d) CDRL1 состоит из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO:2, или представляет собой вариант SEQ ID NO:2, имеющий одну или две консервативные аминокислотные замены;

e) CDRL2 состоит из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO:3, или представляет собой вариант SEQ ID NO:3, имеющий одну или две консервативные аминокислотные замены; и

f) CDRL3 состоит из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO:4, или представляет собой вариант SEQ ID NO:4, имеющий одну или две консервативные аминокислотные замены.

3. Способ по п. 1 или 2, в котором антитело к TcdB содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, которая изложена в SEQ ID NO:5, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, которая изложена в SEQ ID NO:1.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором средство для лечения TcdB представляет собой безлотоксумаб.

5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором указанный пациент перед введением антитела к TcdB по результатам исследования является положительным в отношении по меньшей мере одной копии аллеля T SNP rs2516513 или аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1.

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором указанный пациент перед введением антитела к TcdB по результатам исследования является положительным в отношении по меньшей мере одной копии аллеля T SNP rs2516513 и аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1.

7. Способ по любому предыдущему пункту, при этом способ дополнительно включает лечение указанного пациента антибиотиком, который является эффективным против инфекции C. difficile.

8. Способ по п. 7, в котором антибиотик является выбранным из группы, состоящей из ванкомицина, метронидазола и фидаксомицина.

9. Способ определения того, с какой вероятностью пациент отвечает на антитело или его антигенсвязывающий фрагмент к токсину B C. difficile (TcdB) у пациента-человека, причем указанный способ включает:

(a) получение или обеспечение полученного биологического образца от указанного пациента;

(b) определение того, присутствует ли характеризующийся лучшим ответом аллель по меньшей мере одного маркера ответа на TcdB в биологическом образце, при этом маркер ответа на TcdB является выбранным из группы, состоящей из:

i. аллеля T однонуклеотидного полиморфизма (SNP) rs2516513;

ii. аллеля A SNP rs113379306;

iii. аллеля A SNP rs76166871;

iv. аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1;

v. аллеля HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1;

vi. аллеля HLA-DQA1*02:01 гена HLA-DQA1 и

vii. сцепленного варианта одного или более из маркеров ответа на лечение TcdB, изложенных в i)–vi), и

(c) диагностирование пациента как чувствительного к лечению лекарственным препаратом против TcdB, когда выявляют присутствие характеризующегося лучшим ответом аллеля в биологическом образце.

10. Способ по п. 9, дополнительно включающий стадию (d), которая включает введение терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента к TcdB пациенту с поставленным диагнозом.

11. Способ по п. 10, в котором антитело к TcdB или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело к TcdB.

12. Способ по п. 11, в котором стадия (d) дополнительно включает введение пациенту антибиотика, который является эффективным против инфекции Clostridium difficile.

13. Способ по п. 12, в котором антибиотик является выбранным из группы, состоящей из ванкомицина, метронидазола и фидаксомицина.

14. Способ по любому из пп. 9-13, в котором на стадии (b) выявляют аллель T SNP rs2516513 или аллель HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1, а на стадии (c) пациента диагностируют как чувствительного к лечению антителом к TcdB, когда выявляют аллель T SNP rs2516513, или аллель HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1, или если выявляют как SNP rs2516513, так и аллель HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1.

15. Способ по любому из пп. 11-14, в котором антитело к TcdB представляет собой безлотоксумаб.

16. Способ по любому из пп. 9-15, в котором пациент представляет собой человека, у которого была диагностирована инфекция Clostridium difficile, или проявляются симптомы ассоциированного с Clostridium difficile заболевания.

17. Способ по любому из пп. 9-16, в котором стадия (b) включает направление биологического образца в диагностическую лабораторию для определения того, присутствует ли характеризующийся лучшим ответом аллель маркера ответа на лечение TcdB в образце.

18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором пациент имеет высокий риск рецидивирующей CDI.

19. Лекарственный продукт для лечения инфекции C. difficile, содержащий фармацевтическую композицию и инструкцию по медицинскому применению, при этом фармацевтическая композиция содержит антитело к токсину B C. Difficile (TcdB) и инструкция по медицинскому применению препарата содержит фармакогенетические показания, причем фармакогенетические показания содержат лечение инфекции C. difficile или предотвращение рецидива C. difficile у пациентов, инфицированных C. difficile, которые по результатам исследования являются положительными в отношении по меньшей мере одной копии характеризующегося лучшим ответом аллеля одного или более маркеров ответа на лечение TcdB, выбранных из группы, состоящей из:

a) аллеля T однонуклеотидного полиморфизма (SNP) rs2516513;

b) аллеля A SNP rs113379306;

c) аллеля A SNP rs76166871;

d) аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1;

e) аллеля HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1;

f) аллеля HLA-DQA1*02:01 гена HLA-DQA1;

g) сцепленного варианта одного или более из маркеров ответа на лечение TcdB, изложенных в a)–f).

20. Лекарственный продукт по п. 19, в котором маркер ответа на антитело к TcdB представляет собой аллель T SNP rs2516513 или аллель HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1.

21. Лекарственный продукт по п. 19 или 20, при этом фармакогенетические показания дополнительно содержат лечение инфекции C. difficile антибиотиком.

22. Лекарственный продукт по п. 21, в котором антибиотик является выбранным из группы, состоящей из: ванкомицина, метронидазола и фидаксомицина.

23. Лекарственный продукт по любому из пп. 19-22, в котором антитело к TcdB представляет собой безлотоксумаб.

24. Набор для исследования пациента в отношении присутствия или отсутствия по меньшей мере одной копии характеризующегося лучшим ответом аллеля одного или более маркеров ответа на лечение, направленное на токсин B C. difficile (TcdB), выбранных из группы, состоящей из:

a) аллеля T однонуклеотидного полиморфизма (SNP) rs2516513;

b) аллеля A SNP rs113379306;

c) аллеля A SNP rs76166871;

d) аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1;

e) аллеля HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1 и

f) аллеля HLA-DQA1*02:01 гена HLA-DQA1 или сцепленного варианта маркера ответа на лечение TcdB, при этом набор содержит набор олигонуклеотидов, предназначенных для генотипирования по меньшей мере одного из маркеров ответа на лечение TcdB.

25. Набор по п. 24, при этом маркер ответа на лечение TcdB представляет собой SNP rs2516513.

26. Набор по п. 24 или 25, при этом олигонуклеотиды представляют собой аллель-специфические олигонуклеотидные зонды.

27. Применение безлотоксумаба для предотвращения рецидива C. difficile в подгруппе пациентов, которые по результатам исследования являются положительными в отношении характеризующегося лучшим ответом аллеля маркера ответа на лечение, направленное на токсин B C. difficile (TcdB), выбранного из группы, состоящей из:

a) аллеля T однонуклеотидного полиморфизма (SNP) rs2516513;

b) аллеля A SNP rs113379306;

c) аллеля A SNP rs76166871;

d) аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1;

e) аллеля HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1;

f) аллеля HLA-DQA1*02:01 гена HLA-DQA1 и

g) сцепленного варианта одного или более из маркеров ответа на лечение TcdB, изложенных в a)–f).

28. Применение безлотоксумаба в производстве лекарственного средства для предотвращения рецидива C. difficile у пациента-человека, при этом пациент по результатам исследования является положительным в отношении характеризующегося лучшим ответом аллеля одного или более маркеров ответа на лечение, направленное на токсин B C. difficile (TcdB), или одного или более сцепленных вариантов маркеров ответа на лечение TcdB, причем маркеры ответа на лечение TcdB являются выбранными из группы, состоящей из:

a) аллеля T однонуклеотидного полиморфизма (SNP) rs2516513;

b) аллеля A SNP rs113379306;

c) аллеля A SNP rs76166871;

d) аллеля HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1;

e) аллеля HLA-DQB1*02:02 гена HLA-DQB1 и

f) аллеля HLA-DQA1*02:01 гена HLA-DQA1.

29. Применение по п. 28, в котором характеризующийся лучшим ответом аллель маркера ответа на лечение TcdB представляет собой аллель T SNP rs2516513 или аллель HLA-DRB1*07:01 гена HLA-DRB1.

30. Применение по п. 28 или 29, в котором пациент имеет высокий риск рецидива инфекции C. difficile (CDI).