ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к иммуноаналитическому способу количественного определения уровней IgE (иммуноглобулина класса Е) в образце, способам калибровки устройства, подходящим для проведения такого количественного определения, и к системе, которая позволяет проводить такое количественное определение.

Иммуноанализ представляет собой способ, который использует связывающую способность антител. Часто иммуноанализ используется для анализа на присутствие специфического антиген-специфического антитела в образце. Это достигается нанесением образца поверх специфического антигена, иммобилизованного на твердой подложке, с последующей визуализацией связавшегося антитела с использованием различных способов.

Как правило, иммуноанализ требует применения калибровочных стандартов для определения величин или концентраций неизвестных образцов. В классическом иммуноанализе проводят эксперимент с набором калибровочных стандартов, строят калибровочную кривую зависимости величины сигнала от концентрации и определяют концентрацию неизвестных образцов интерполяцией.

Аллергические состояния характеризуются неадекватным и чрезмерным иммунным ответом на безвредные антигены окружающей среды. Такие антигены в совокупности называются аллергенами. Иммунный ответ на аллергены включает первую стадию сенсибилизации, состоящую из: (i) процессирования аллергенов антигенпрезентирующими клетками (antigen presenting cells (АРС)), (ii) презентации процессированных клетками АРС аллергенов Т-хелперам 0 (Th0) - "наивным" (недифференцированным) клеткам, (iii) дифференцировки "наивных" клеток Th0 в Th2-клетки и (iv) стимуляции В-клеток Th2-клетками, что приводит к продукции и секреции аллерген-специфического иммуноглобулина класса Е (IgE) В-клетками.

Каждый специфический аллерген будет стимулировать выработку IgE, специфического к такому аллергену. IgE-антитела могут взаимодействовать с двумя различными типами клеток, тучными клетками и базофилами, которые содержат гранулы, содержащие гистамин.

Когда аллерген, который вызвал фазу сенсибилизации, попадает в организм во второй раз и распознается соответствующими тучными клетками и базофилами, он стимулирует вторую стадию механизма развития аллергических реакций, известную как "фаза ответа (challenge phase)". Аллерген связывается со специфическим к нему IgE, находящимся на поверхности тучных клеток и базофилов, что приводит к запуску механизма, который в конечном счете приводит к дегрануляции тучных клеток и базофилов и к секреции гистамина, который отвечает за воспалительную реакцию, типичную для аллергической реакции. Тяжесть последующей аллергической реакции коррелирует с уровнем аллерген-специфического IgE в данном индивидууме. Таким образом, важно обнаружить и определить концентрацию IgE-антител против специфических аллергенов, выработавшихся у индивидуума с тем, чтобы было возможно идентифицировать аллергичных (или атопичных) индивидуумов и охарактеризовать их аллергические реакции.

Количественные иммуноанализы для диагностики аллергии обычно используют или ссылаются на Международный стандартный препарат 75/502 Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (World Health Organization (WHO) International Reference Preparation 75/502) для разработки калибровочных систем. Он представляет собой образец лиофилизированной человеческой сыворотки с указанной величиной IgE-реактивности (Kontis K, et al (2006) Correlation of the Turbo-MP PIA with ImmunoCAP FEIA for Determination of Food Allergen-Specific Immunoglobulin-E. Ann Clin Lab Sci 36(1): 79-87; Bousquet J et al (1990) Comparison between RAST and Pharmacia CAP system: A new automated specific IgE assay. J Allergy Clin Immunol 85(6): 1039-43; Ссылка для продукта: htttp://www.nibsc.ас.uk/documents/ifu/75-502.pdf).

Измеренные величины ответа на аллерген-специфические антитела IgE, как правило, рассчитывают по калибровочной кривой для суммарного IgE по стандарту ВОЗ (WHO International Reference Preparation) и выражают в виде концентрации, измеряемой в (кило)единицах аллергена на литр кЕдА/л (Allergen specific Units per litre (kUA/l)). Стандартную кривую IgE используют для описания зависимостей "доза-ответ" для всех испытываемых аллергенов. Для этого требуется, чтобы концентрации аллергенных компонентов, иммобилизованных на твердой подложке для проведения иммуноанализа, были оптимизированы таким образом, что кривые "доза-ответ" для IgE и аллергенов имели бы одинаковые наклон и форму. Чтобы оптимизировать концентрации аллергенных концентраций для кривых "доза-ответ", различные концентрации аллергенов проверяют на панели образцов известной реактивности для определения концентрации, которая дает кривую "доза-ответ", одинаковую по форме и наклону с кривой, получаемой с использованием кривой для суммарного IgE по стандарту ВОЗ (WHO International Reference Preparation).

Иммуноанализы, используемые в настоящее время для диагностики аллергических заболеваний, включают: радиоаллергосорбентный тест (Radioallergosorbent Test, RAST), твердофазный иммуноферментный анализ (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) и реакцию иммунофлюоресценции на трехмерной пористой твердой фазе, ИФЛ, по технологии ImmunoCAP.

RAST включает ковалентное связывание аллергена (или другого антигена) с твердой фазой, нанесенной на бумажный диск. Бумажный диск затем инкубируют с сывороткой, полученной от пациента, чей аллергенный статус предстоит исследовать. Если в сыворотке присутствуют антитела против данного аллергена, то они реагируют с конъюгированным аллергеном, и связывание выявляется с помощью радиоактивно меченных aHTH-IgE-антител. В своем первоначальном виде результаты данного теста выражались в классах или условных единицах путем сопоставления со стандартной кривой для гетерологичного IgE против пыльцы березы. Березовый аллерген, связанный с бумажным диском, инкубируют с образцами сыворотки известной реактивности и строят стандартную кривую, откладывая величину полученного сигнала против известной концентрации IgE. Международный стандартный препарат IgE по стандарту ВОЗ (WHO/NIBSC International Reference IgE Preparation), как было указано выше, как правило, используется для калибровки стандартной системы для березы.

Аналогично, ELISA включает аллергены (или другие антигены), адсорбированные на твердой фазе (как правило, пластиковый многолуночный планшет), инкубируемые с сывороткой пациента, которую предстоит исследовать. Связывание IgE в образце с адсорбированными аллергенами выявляют инкубацией IgE, связанного с аллергенами, адсорбированными на твердой фазе, с aHTH-IgE-антителом, связанным с ферментом, с последующим добавлением соответствующего субстрата для фермента. Каталитическое превращение субстрата приводит к изменению цвета на планшете. Измерение интенсивности цвета делает возможным количественное определение содержания сывороточного IgE соотношение интерполяцией цветового сигнала к стандартной кривой. Стандартную кривую получают, покрывая лунки ELISA связывающими антителами против IgE человека и инкубируя их сначала со стандартом, калиброванным по стандарту ВОЗ (WHO/NIBSC International Reference IgE Preparation) с последующей инкубацией с aHTH-IgE-антителами, связанными с ферментом, с соответствующим субстратом. Концентрация связывающих aHTH-IgE-антител остается постоянной во всех стандартных лунках, которые титруются стандартным препаратом IgE с тем, чтобы получить стандартные кривые.

В качестве примера, набор ELISA RV-5 производства фирмы Allergopharma состоит из аллергенов определенной концентрации, адсорбированных на бумажных дисках, помещенных на дно плоских 96-луночных планшетов, а также из дисков, покрытых связывающим антителом против IgE человека в определенной концентрации. В то время как покрытые аллергеном диски инкубируют с образцами сыворотки крови пациента, диски, покрытые связывающим антителом против IgE, инкубируют с препаратом IgE человека, производным от стандарта ВОЗ (WHO/NIBSC International Reference). Стандартную кривую затем получают откладыванием величины, соответствующей интенсивности сигнала, полученного от лунок, покрытых связывающим антителом против IgE, против значений известных концентраций стандарта IgE ВОЗ (WHO/NIBSC). Полностью автоматизированный иммуноферментный анализ (ИФА, Enzyme Immunoassay (EIA)), используемый системой HYCOR для тестирования аллергии, основан на том же принципе.

Тест-система "CAP system-PHADIA" (стандартный способ) существенно отличается от описанных выше способов природой твердой фазы - ImmunoCAP. Твердая фаза ImmunoCAP представляет собой производное бромциан(CNBr)-активированной целлюлозы, которое имеет более сильную связывающую способность по сравнению с другими субстратами (David W. (2006), The immunoassay handbook, опубликовано Elsevier Ltd). Представляющие интерес аллергены ковалентно связаны с гидрофильным полимерным носителем, заключенным в капсулу. Носитель состоит из производного целлюлозы, обладающего способностью к сильному связыванию белков. ImmunoCAP может взаимодействовать со специфическим IgE в сыворотке пациента, и, после отмывания несвязанного IgE, связанные с ферментом анти-IgE-антитела, добавляют для образования комплекса, который затем инкубируют с флуоресцентным субстратом. Как и в способе ELISA, интенсивность окраски служит индикатором уровня аллерген-специфических IgE в сыворотке, который определяется сопоставлением с кривой "доза-ответ" для общего сывороточного IgE, используемой для калибровки. Данный анализ калиброван по стандарту ВОЗ для IgE и включает два набора калибровочных стандартов: от 0,35 до 100 kUA/l (для специфического IgE-антитела и низкого диапазона концентраций суммарного IgE) и от 2 до 2000 kUA/l (для широкого диапазона концентраций суммарного IgE). AHTH-IgE-антитело подобрано так, чтобы обеспечить более широкий диапазон измерений при том же начальном наклоне кривой "доза-ответ". Все твердофазные аллергены затем индивидуально оптимизируются для достижения максимальных ответа и пропускной способности и низкого уровня фонового шума для данного диапазона измерений.

Набор ImmunoCAP ISAC Kit производства PHADIA представляет собой базируемый на микроматрице (microarray) тест для диагностики аллергии. Он основан на современной технологии биочипов. ImmunoCAP ISAC представляет собой миниатюрную платформу для иммуноанализа, которая позволяет мультиплексное измерение специфических IgE-антител ко многим аллергенным компонентам. Очищенные природные или рекомбинантные аллергены (40 распространенных аллергенных источников) иммобилизованы на твердой подложке (биочип). Данный анализ представляет собой двухстадийный анализ. Во-первых, IgE-антитела из сыворотки пациента связываются с иммобилизованными аллергенными компонентами. Во-вторых, после короткой стадии промывки связанные с аллергеном IgE-антитела детектируют с помощью флуоресцентно меченного анти-IgE антитела. ImmunoCAP ISAC представляет собой полуколичественный анализ, и результаты приводятся в стандартизированных единицах ISAC (ISAC Standardized Units (ISU)).

Deinhofer et al. (2004) Methods: 32: 249-254 описывает применение технологии микроматриц для мультиаллергенных тест-систем.

ЕР 1322960 В1 описывает базируемую на микроматрице тест-систему для определения аллергенов.

Упоминание или обсуждение в данном описании очевидно уже опубликованного документа не обязательно должно рассматриваться как признание того, что данный документ является частью уровня техники или общеизвестных знаний.

Настоящее изобретение направлено на решение проблем с указанными выше иммуноанализами. Настоящее изобретение обеспечивает проведение более точного иммуноанализа для количественного определения уровней IgE в анализируемых образцах.

Первый объект изобретения относится к способу количественного определения нескольких антиген-специфических иммуноглобулинов в анализируемом образце, причем данный способ содержит следующие стадии:

(i) анализ связывания серии образцов, например образцов сыворотки, содержащей иммуноглобулин известной антигенной реактивности, причем данный иммуноглобулин представляет собой тот же подтип, что и иммуноглобулин в анализируемом образце, с несколькими рекомбинантными или очищенными антигенными компонентами или их фрагментами, иммобилизованными на первой твердой подложке,

(ii) сравнение уровня связывания на стадии (i) с известной реактивностью для получения кривой "доза-эффект" для каждого антигенного компонента или его фрагмента,

(iii) анализ связывания серийных разведений образца стандартного препарата иммуноглобулина того же подтипа иммуноглобулина, который используется в части (i), с известным количеством суммарного иммуноглобулина с серийными разведениями антииммуноглобулиновых антител, их фрагментов или производных, иммобилизованных на первой или на второй твердой подложке,

(iv) сравнение уровня связывания на стадии (iii) с известным суммарным количеством стандартного препарата иммуноглобулина для получения кривой связывающей способности для каждого разведения антииммуноглобулинового антитела, фрагмента или производного,

(v) сравнение кривых "доза-ответ", полученных на стадии (ii), с кривыми связывающей способности, полученными на стадии (iv), выявление кривой связывающей способности, которая в наибольшей степени соответствует кривой "доза-ответ" для каждого антигена или его фрагмента, и определение на основе полученных данных описывающей связывающую способность зависимости для каждого антигена или его фрагмента,

(vi) анализ связывания антиген-специфического иммуноглобулина в анализируемом образце с рекомбинантными или очищенными антигенными компонентами или их фрагментами, иммобилизованными на первой, второй или третьей твердой подложке, и

(vii) сравнение уровня связывания на стадии (vi) в отношении каждого отдельного антигена или его фрагмента с описывающей связывающую способность зависимостью, определенной для данного антигена или его фрагмента на стадии (v), и количественное определение уровня антиген-специфического иммуноглобулина, присутствующего в анализируемом образце.

Образцы, содержащие известную иммуноглобулиновую реактивность, могут представлять собой любой образец, содержащий известную реактивность иммуноглобулина к специфическим антигенам. Предпочтительно, чтобы образцы содержали известную реактивность к IgE. Реактивность образца определяют до его применения в способах по настоящему изобретению посредством осуществления соответствующего иммуноанализа, что очевидно специалисту. Примеры соответствующих иммуноанализов приведены выше, например, ELISA. Предпочтительно, чтобы образцы сыворотки представляли собой, например, образцы сыворотки человека. Реактивность может быть выражена в международных единицах на миллилитр (МЕ/мл (International Units per millilitre (IU/ml))). Зависимости "доза-ответ" получают, например, откладыванием значения интенсивности флуоресцентного сигнала, полученного при иммуноанализе, относительно значения реактивности IgE, выраженной в международных единицах/мл.

Предпочтительно, чтобы серии образцов, используемые на стадии (i), содержали панель образцов; каждый образец может взаимодействовать с одним или более из иммобилизованных или других антигенов. На данной стадии используются различные свойства различных образцов, причем каждый из данных образцов может обладать различными уровнями реактивности по отношению к одинаковым антигенам, чтобы обеспечить широкий спектр различных уровней связывания с каждым антигеном. Например, образец 1 может обладать реактивностью x по отношению к антигену А, образец 2 может обладать реактивностью y по отношению к антигену А, а образец 3 может обладать реактивностью z по отношению к антигену А. Когда значения, соответствующие реактивности образцов от 1 до 3 по отношению к антигену А, откладывают в виде зависимости, получается зависимость "доза-ответ". Таким образом, данные образцы с различной реактивностью по отношению к одинаковым антигенам, а также к различным антигенам, используются для построения зависимости "доза-ответ" для каждого иммобилизованного антигена, которая используется на последующих стадиях осуществления данного способа.

Предполагается, что образец, известный реактивности, и/или анализируемый образец представляют собой образцы, полученные от пациента, например от человека. Образец может представлять собой образец сыворотки, образец цельной крови, образец плазмы, образец лимфы, образец спинномозговой жидкости, образец костного мозга, образец аспирата содержимого полостей легких, образец мочи, образец кала, образец слюны, образец мокроты, образец ткани или любой другой образец, который может содержать иммуноглобулин. Предпочтительно, чтобы образцы сыворотки представляли собой образцы сыворотки, содержащие известную реактивность IgE.

Образец стандартного препарата иммуноглобулина содержит соответствующий класс иммуноглобулинов в соответствии с классом иммуноглобулинов, которые предполагается детектировать в анализируемом образце. Например, если иммуноанализ предназначен для выявления IgE в анализируемом образце, то образец стандартного препарата иммуноглобулина будет содержать известное количество суммарного IgE. Образец стандартного препарата иммуноглобулина может представлять собой любой образец иммуноглобулина, концентрация общего иммуноглобулина в котором известна. Например, когда иммуноглобулин представляет собой IgE, то стандартным образцом IgE может служить Международный стандарт ВОЗ (WHO/NIBSC International Reference). Содержание суммарного IgE может быть выражено в международных единицах/мл.

Предусмотрены альтернативные конструкции, в которых иммуноглобулин представляет собой IgG, IgA и/или IgM, или любой другой подкласс иммуноглобулина, который может быть использован в способах по изобретению. Соответствующие антииммуноглобулины будут предоставлены для получения кривых зависимостей, характеризующих антигенсвязывающую способность для каждого из данных различных классов иммуноглобулина. Другими словами, когда подкласс иммуноглобулина, который требуется обнаружить, представляет собой IgA, образцы стандартного препарата иммуноглобулина и иммуноглобулина известной реактивности будут содержать соответствующий IgA и антииммуноглобулиновое антитело будет представлять собой анти-IgA.

Антииммуноглобулиновые антитела, предлагаемые на стадии (iii) способа по первому объекту изобретения, иммобилизованные на первой или другой твердой подложке, направлены против класса антител, который ожидается обнаружить в анализируемом образце. Например, если в анализируемом образце ожидается обнаружить аллерген-специфичные IgE-антитела, то образцы сыворотки и стандартный образец будут содержать IgE известной реактивности и известное количество суммарного IgE, соответственно. Таким образом, антииммуноглобулиновые антитела будут представлять собой анти-IgE-антитела. Подкласс антител антииммуноглобулиновых антител, как правило, представляет собой IgG. Таким образом, предполагается, что антииммуноглобулиновые антитела могут представлять собой анти-IgE, IgG-антитела.

В понятие "антиген" авторы включают обозначение любого соединения, которое содержит эпитоп, который специфически распознается иммуноглобулином. Таким образом, антиген может происходить из натуральных экстрактов, он может представлять собой рекомбинантный белок или другой белок или другую молекулу (такую как полисахарид), очищенный из натуральных экстрактов или из любого другого источника. Предпочтительно антиген представляет собой аллерген, то есть антиген, который распознается как способный вызывать аллергическую реакцию у индивидуума при контакте с данным индивидуумом. Антиген может представлять собой охарактеризованный аллерген или аллерген, который еще предстоит охарактеризовать. Предполагается, что данный антиген может представлять собой любое соединение, которое специфически распознается молекулами IgE.

Примеры аллергенных компонентов, которые могут быть нанесены на твердую подложку, включают: Der p1 и Der p2 - основные аллергенные молекулы пылевого клеща, Dermatophagoides pteronyssinus; Bet v1 и Bet v2 - основные аллергенные молекулы пыльцы березы; Phl p1, Phl р5. Phl Р2 и Р6 Phl - основные аллергенные молекулы пыльцы тимофеевки луговой.

Стадия (ii) первого объекта изобретения, приведенная выше, дает кривую зависимости "доза-эффект" для каждого антигена, содержащегося на твердой подложке. Концентрации антигена на твердой подложке могут быть оптимизированы таким образом, чтобы получать соответствующий ответ. Антигены (например, аллергены) могут быть оптимизированы с точки зрения концентрации белка и наиболее подходящего буфера. Оптимизация концентрации антигена и буфера выполняется до осуществления способов по настоящему изобретению. Оптимизация осуществляется определением, для каждого антигена, наиболее соответствующей концентрации белка и наиболее подходящего буфера, необходимого для разведения белка, что дает самую высокую согласованность по реактивности по сравнению с образцами известной реактивности для такого заданного антигена. Примеры соответствующих буферов для использования при растворении антигенов, которые должны быть иммобилизованы на твердой подложке, и оптимизации концентрации антигенов, включают: фосфатный солевой буфер pH 7,4; фосфатный солевой буфер pH 7,4 с 0,1 г/л твин (Tween) 20; и/или фосфатный солевой буфер pH 7,4 с 10-процентным глицерином.

После завершения стадий от (i) до (iv) первого объекта изобретения в распоряжении специалиста окажется кривая зависимости "доза-ответ" для каждого иммобилизованного антигена и кривая зависимости, характеризующая связывающую способность для каждой концентрации антииммуноглобулинового антитела, присутствующего на первой или на дополнительной твердой подложке. Таким образом, будет получено два графика: первый график сравнения интенсивности связывания для каждого антигена с реактивностью антиген-специфического иммуноглобулина, присутствующего в известном образце (см. фиг. 1 для примера такой кривой с образцами, содержащими IgE); второй график сравнения интенсивности связывания для каждого разведения антииммуноглобулинового антитела с увеличивающимися концентрациями суммарного иммуноглобулина, присутствующего в стандартном образце (см. фиг. 2А для примера такой кривой зависимости для образцов, содержащих IgE).

Стадия (v) первого объекта изобретения предусматривает сравнение двух подобных графиков для установления соответствия кривых зависимостей, полученных для каждого антигена, с кривыми зависимостей, полученных для каждой концентрации антииммуноглобулинового антитела. Такое сравнение может осуществляться визуально или с помощью других средств, например, с использованием компьютерного программного обеспечения.

После того, как образец каждого антигена соотносится с определенной концентрацией антииммуноглобулина, данная концентрация иммуноглобулина приписывается данному антигену и в дальнейшем используется в качестве более точной стандартной, или калибровочной, кривой зависимости для данного антигена, точнее описывая связывающую способность данного специфического антигена. Таким образом, концентрация антител, специфических к данному антигену в анализируемом образце, может быть точнее определена с помощью заново определенной калибровочной кривой связывающей способности для данного антигена.

Авторы установили, что применение одной стандартной кривой для калибровки иммуноанализов для нескольких антигенов, в частности нескольких аллергенов, как это принято в стандартной практике в данной области техники, является недостаточным для описания различных связывающих способностей, которые проявляют различные аллергены. Авторы обнаружили, что в случае, когда иммуноанализы проводили с образцами сыворотки с известной реактивностью IgE, инкубируемыми с экстрактами различных аллергенов, различные кривые "доза-эффект" были получены с данными, полученными для каждого аллергена. Это иллюстрируется на фиг. 1. Таким образом, в примере тестирования на аллергены калибровочные системы, используемые в предыдущих иммуноанализах определения аллергенов, являются недостаточными для обеспечения точной количественной информации для IgE-реактивности образцов сыворотки, когда несколько аллергенов тестируют в мультиплексном анализе.

Авторы попытались предоставить калибровочную систему, в которой были бы учтены недостатки имеющихся иммуноанализов, и обеспечить более точный количественный иммуноанализ. Стадия определения специальной стандартной кривой для каждого антигена, как в настоящем изобретении, на основе его способности к связыванию, дает возможность более точного количественного определения специфического иммуноглобулина в анализируемом образце. В примере тестирования на аллергены настоящее изобретение описывает характер зависимости "доза-ответ" аллергена точнее, чем в предыдущих тестах.

Кривые зависимостей, описывающие связывающую способность, могут быть загружены в программное обеспечение, которое контролирует приборы для выполнения иммуноанализа с тем, чтобы использоваться в качестве стандартов для будущих анализов. Внутренние контроли в каждом анализе могут быть использованы для компенсации незначительных изменений окружающей среды в каждом анализе. Тем не менее, предполагается, что когда новые партии аллергена будут готовы для нанесения на твердую подложку, кривые зависимостей, описывающих связывающую способность, могут быть скорректированы соответствующим образом или могут быть получены новые кривые зависимостей, описывающих связывающую способность, как описано в данном документе, чтобы обеспечить точность анализа. Такие мероприятия по контролю качества будут легко понятны специалистам.

На стадиях (vi) и (vii) по первому объекту настоящего изобретения используются кривые зависимостей, описывающих связывающую способность, генерируемые на более ранних стадиях для количественного определения уровней антиген-специфических иммуноглобулинов в анализируемом образце. Предполагается, что все иммобилизованные компоненты, описанные в первом объекте изобретения, могут быть иммобилизованы на одинаковых или различных твердых подложках, как того требует аналитическое оборудование, которое используется для осуществления способа. Таким образом, все соответствующие иммобилизованные компоненты могут быть иммобилизованы на одной твердой подложке, например на чипе, включая антигены, связывающие иммуноглобулины и положительные и отрицательные контроли. Тем не менее, предполагается, что каждый образец будет инкубироваться с отдельной твердой подложкой, например с чипом, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение. Таким образом, в каждом анализе будет использоваться ряд твердых подложек, например чипов. Например, если 50 образцов сыворотки необходимо инкубировать на твердой подложке, может быть использовано 50 отдельных твердых подложек с соответствующими иммобилизованными антигенами/иммуноглобулинами/контролями. Аналогичным образом, каждый стандартный образец можно инкубировать на отдельной твердой подложке во избежание перекрестного загрязнения. Используемое для анализа оборудование будет влиять на точную механику инкубации образцов, что очевидно специалисту в данной области техники.

В предпочтительном варианте осуществления стандартный образец иммуноглобулина (например, международный стандарт IgE ВОЗ) используют с конечными концентрациями иммуноглобулинов в диапазоне от 0,1 до 100 МЕ/мл. Предпочтительно антииммуноглобулиновое антитело, которое иммобилизовано на твердой подложке (например, aHTH-IgE-антитело), используется при концентрациях в пределах от 30 до 0,1 мкг/мл.

Понятие "иммуноглобулин(ы)" используется здесь взаимозаменяемо с понятием "антитело" или "антитела".

Первый объект может включать дополнительную стадию, в которой кривые зависимостей, описывающих связывающую способность, полученные на стадии (iv), сгруппированы в репрезентативные кривые зависимостей, описывающих связывающую способность, чтобы представлять различные уровни связывающей способности, например очень сильное связывание, сильное связывание, среднее связывание и слабое связывание, и в которой сравнение на стадии (v) осуществляется по отношению к кривым зависимостей доза-ответ, полученным на стадии (ii), и репрезентативным кривым зависимостей, описывающих связывающую способность, а не по отношению к кривым зависимостей, описывающих связывающую способность, полученным на стадии (iv).

Предусматривается, что включение данной дополнительной стадии обеспечения меньшего числа консолидированных кривых зависимостей, описывающих связывающую способность, может упростить управление данными, что упрощает процесс калибровки. Такие кривые зависимостей, описывающих связывающую способность, как в примере, приведенном на фиг. 2В, могут быть сохранены в программном обеспечении приборов иммунологических анализаторов для последующего анализа образцов.

В понятие "антииммуноглобулиновые антитела, их фрагменты или их производные" авторы включают понятие, означающее, что данные антитела содержат антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, такой как Fab-подобные молекулы; Fv-молекулы; одноцепочечные Fv (ScFv) молекулы, где соседние домены VH и VL связаны через гибкий олигопептид; и антитела с одним доменом (dAbs), содержащие изолированные V-домены, но это также может быть любой другой лиганд, который проявляет свойство предпочтительного связывания, упомянутое выше.

Второй объект изобретения относится к способу калибровки устройства, подходящий для анализа связывания нескольких антиген-специфических иммуноглобулинов с несколькими антигенами или их фрагментами, иммобилизованными на твердой подложке, причем данный способ содержит следующие стадии:

(i) анализ связывания серии образцов, например образцов сыворотки, содержащих иммуноглобулин известных антигенной реактивности, с несколькими рекомбинантными или очищенными антигенными компонентами или их фрагментами, иммобилизованными на первой твердой подложке,

(ii) сравнение уровня связывания на стадии (i) с известной реактивностью для получения кривой зависимости "доза-эффект" для каждого антигенного компонента или его фрагмента,

(iii) анализ связывания серийных разведений образца стандартного иммуноглобулина того же подтипа, что и в части (i) с известным общим количеством иммуноглобулина с серийными разведениями антииммуноглобулиновых антител, их фрагментов или производных, иммобилизованных на первой или второй твердой подложке,

(iv) сравнение уровня связывания на стадии (iii) с известным общим количеством стандартного иммуноглобулина для получения кривой зависимости, описывающей связывающую способность для каждого разведения антииммуноглобулинового антитела, фрагмента или производного,

(v) сравнение кривых зависимостей "доза-ответ", полученных на стадии (ii) с кривыми зависимостей, описывающих связывающую способность, полученных на стадии (iv), выявление кривой зависимости, описывающей связывающую способность, которая в наибольшей степени соответствует кривой зависимости "доза-ответ" для каждого антигена или его фрагмента, и приписывание кривой зависимости, описывающей связывающую способность, каждому антигену или его фрагменту на данной основе, и

(vi) ввод кривых зависимостей, описывающих связывающую способность, полученных на стадии (v), в устройство таким образом, чтобы кривые зависимостей, описывающие связывающую способность для каждого антигена могут быть интерполированы с сигналами, полученными от образцов, содержащих неизвестные количества иммуноглобулина, который специфически связывает данный антиген.

Втором объект может включать дополнительную стадию, в которой кривые зависимостей, описывающих связывающую способность, полученные на стадии (iv), сгруппированы в репрезентативные кривые зависимостей, описывающих связывающую способность, чтобы представлять различные уровни связывающей способности, например очень сильное связывание, сильное связывание, среднее связывание и слабое связывание, и в которой сравнение на стадии (v) осуществляется по отношению к кривым зависимостей "доза-ответ", полученным на стадии (ii) и репрезентативным кривым зависимостей, описывающих связывающую способность, а не по отношению к кривым зависимостей, описывающих связывающую способность, полученным на стадии (iv).

После того, как устройство было откалибровано способом по второму объекту настоящего изобретения, оно может быть использовано для анализа и количественной оценки антиген-специфического иммуноглобулина в анализируемых образцах.

Например, слайд микроматриц (твердая подложка) после соответствующей обработки для визуализации антигенов, связанных с антителом, может быть считан с помощью прибора ADAM (Microtest Matrices Ltd). Необработанные данные собираются и используются для расчета кривой зависимости "доза-ответ". На выходе прибора генерируется текстовый файл, где перечислены все точки микроматриц; они описываются координатами и числовым значением, которое соответствует количеству фотонов, испускаемых каждой точкой на микрочипе. С помощью программы численного моделирования, похожей на Matlab, рассчитываются все данные, полученные от считывающего устройства, и генерируется набор параметров, описывающих кривые зависимостей "доза-ответ". Прибор ADAM использует данные параметры для создания внутренней калибровочной кривой Master (Master Calibration Curve), вставленной в файл конфигурации.

В предпочтительных вариантах осуществления первого и второго объектов изобретения антигены представляют собой аллергены, иммуноглобулин представляет собой IgE и антииммуноглобулиновые антитела представляют собой aHTH-IgE-антитела. Таким образом, в таких вариантах осуществления данные способы могут быть использованы для обнаружения у пациентов аллергии на некоторые аллергены анализом образцов, полученных от пациента, на IgE-реактивность по отношению к аллергенным компонентам или их фрагментам, иммобилизованным на твердой подложке. Такая информация может помочь в диагностике аллергии к специфическим аллергенам.

Примеры аллергенов, которые могут быть иммобилизованы на твердой подложке, включают аллергены, перечисленные в таблице 1.

Третий объект настоящего изобретения относится к мультиаллергенной тест-системе, содержащей серийные разведения анти-IgE-антител, их фрагментов или производных, иммобилизованных на твердой подложке. Такая мультиаллергенная тест-система может быть использована в способах по предыдущим объектам настоящего изобретения.

В варианте осуществления третьего объекта настоящего изобретения данная система дополнительно содержит рекомбинантные или очищенные аллергенные компоненты или их фрагменты, иммобилизованные на первой или второй твердой подложке.

Четвертый объект настоящего изобретения относится к набору частей, содержащему мультиаллергенные тест-системы третьего объекта настоящего изобретения и одно или более из следующего:

i) стандартный образец IgE;

ii) первый препарат антител, содержащий первые антитела, которые связываются с IgE;

iii) второй препарат антител, содержащий вторые антитела, которые специфически связываются с первыми антителами;

iv) третий препарат антител, содержащий третьи антитела, которые специфически связываются со вторыми антителами; и

в котором или вторые антитела или третьи антитела конъюгированы с детектируемым маркером.

В варианте осуществления четвертого объекта настоящего изобретения детектируемый маркер может представлять собой фермент, например пероксидазу хрена (Horseradish Peroxidase (HRP)) или щелочную фосфатазу, что очевидно специалисту в данной области техники. Соответствующие субстраты для HRP включают хромогенные субстраты (например, 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин (Tetramethylbenzidine (ТМВ)), 3,3′-диаминобензидин (Diaminobenzidine (DAB)), и 2,2′-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфокислоту)) (2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS)) и хемилюминесцентные субстраты (например, SuperSignala и ECL). Особенно предпочтительным субстратом является Tyramide, помеченный флуорофором Alexa555.

В альтернативном варианте осуществления четвертого объекта настоящего изобретения детектируемый маркер может представлять собой хемилюминесцентный остаток (например, соединение сложного эфира акридина), радиоактивный остаток (например, ³²Р) или флуоресцентный остаток (например, флуоресцеин (FITC)). Другие подходящие детектируемые метки и способы их обнаружения и их конъюгации с антителами хорошо известны специалистам в данной области техники.

В одном варианте осуществления любого объекта настоящего изобретения твердая подложка может представлять собой микроматричный чип. Соответствующие микроматричные чипы могут быть выполнены следующим образом: белковые растворы (например, аллергены) первоначально получают разведением исходного раствора белка до конечной оптимальной концентрации в оптимальном буфере (определено ранее, см. выше). Для каждого отдельного антигена конечная концентрация может отличаться, что очевидно специалисту в данной области техники. Белковые растворы затем вносят в 384-луночный планшет. Планшет и твердую подложку затем помещают внутри принтера, например бесконтактного пьезоэлектрического принтера. Принтер имеет ряд сопел, которые всасывают растворы из лунок, а затем дозирует их по каплям на твердую подложку (микрочип). После дозирования каждого раствора сопла промывают и подготавливают для следующего раствора. Принтер имеет камеру, называемую стробоскоп, которая следит за правильным дозированием растворов посредством съемки дозируемых капель. Если раствор не дозируется должным образом, стробоскоп сообщает об этом. Любая подходящая оптическая подложка может быть использована для изготовления микроматриц. Как правило, любая подложка из стекла или подобное будет адекватна. Различные подложки такого типа хорошо известны специалисту в данной области техники.

Варианты осуществления настоящего изобретения теперь будут описаны посредством примера со ссылкой на фигуры, в котором:

фиг. 1 является графическим представлением кривых зависимостей "доза-ответ" нескольких аллергенов;

фиг. 2А является графическим представлением кривых зависимостей, описывающих способность к множественному связыванию; и

фиг. 2В является графическим представлением кривых зависимостей, описывающих связывающую способность в соответствии с изобретением.

Пример 1. Иммуноанализ с системой калибровки связывающей способности.

Описана система калибровки, подходящая для точного количественного определения сывороточного аллерген-специфического IgE с использованием иммуноанализа на основе микроматриц в качестве платформы. Описанный иммуноанализный набор содержит приблизительно 100 различных аллергенных экстрактов, которые охватывают панель приблизительно 100 различных аллергий.

Описанная система калибровки может надежно описывать поведение "доза-ответ" всех 100 аллергенных экстрактов. Каждый аллергенный экстракт представляет собой уникальное соединение с различной IgE-связывающей способностью, т.е. различной крутизной кривой зависимости "доза-ответ". Настоящая система калибровки учитывает данные различные связывающие способности с тем, чтобы обеспечить точную систему измерения аллерген-специфических уровней IgE в образце.

Пример: микроматричный чип

Описанная здесь система представляет собой тест на основе микроматриц, использующий миниатюрные иммуноанализы, предназначенные для измерения вплоть до приблизительно 103 аллергенов. Аллергенные экстракты иммобилизованы на химически активированных предметных стеклах для создания массивов. Каждый натуральный аллергенный экстракт наносят на микроматрицу в оптимальной концентрации белка и буфера (ранее выбранного). В дополнение, микроматрица содержит положительные контроли (например, козий антимышиный IgG) и отрицательные контроли (например, неспецифический белок, такой как бычий сывороточный альбумин), а также связывающее анти-IgE антитело против IgE человека (поликлональное козье антитело против IgE человека), нанесенное в серийных разведениях.

Пример: протокол визуализации антител

Ниже приведен пример протокола, который может быть использован для визуализации связывания IgE, либо в образце сыворотки или в стандартном образце (анализы проводили в то же время, с теми же реагентами, где было можно, так что потенциальные изменения окружающей среды находятся под контролем), с описанной здесь микроматрицей.

Отдельные матрицы сначала инкубируют с образцами IgE (в качестве сыворотки или контроля), а затем с моноклональным антителом, направленным против человеческого IgE (или другим соответствующим антителом, в зависимости от анализируемых образцов) (например, мышиный IgG против IgE человека), которое будет связываться с человеческим IgE из сыворотки или стандартного образца, если IgE присутствует и связан с аллергенами, нанесенными в виде пятен. Затем козье поликлональное антимышиное IgG-антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP), добавляют к матрице с последующим добавлением Tyramide, меченного флуорофором Alexa555. Соответствующие стадии промывки осуществляют между каждой стадией инкубации антител.

В присутствии пероксида водорода (Н₂О₂) фермент HRP превращает Tyramide-Alexa555 в короткоживущие радикалы tyramide-Alexa555 с сильной реакционной способностью, которые взаимодействуют с нуклеофильными остатками в непосредственной близости от сайта взаимодействия HRP-мишень. Это приводит к излучению флуоресценции на специфической длине волны (555 нм) с интенсивностью, пропорциональной количеству связанного фермента HRP.

Применение поликлонального антитела и системы HRP-Tyramide (системы нелинейного усиления сигнала) значительно повышает чувствительность теста иммуноанализа на микроматрицах.

Приведенный выше протокол позволяет получить значения интенсивности флуоресценции для каждого пятна аллергена, которые откладывают в виде зависимости от концентрации сывороточного образца с тем, чтобы получить кривую зависимости, которая интерполируется со стандартной кривой зависимости для количественного определения уровня IgE.

Способ калибровки по изобретению

Описанный здесь способ калибровки иллюстрируется следующими стадиями с использованием микроматричного чипа по изобретению.

1. Определение кривой зависимости "доза-ответ" для каждого аллергена. Ряд образцов сыворотки с известной IgE-реактивностью проверяют с помощью микроматричного чипа. Значения интенсивности сигналов, полученных от аллергенов, собирают и используют для получения кривых зависимостей "доза-ответ" аллергена.

2. Получение панели кривых, описывающих связывающую способность. Серийные разведения Международного стандартного препарата IgE WHO/NIBSC (от 0,1 до 100 Международных единиц/мл) инкубируют на чипах. IgE связываются пятнами, содержащими препарат антитела, направленного против человеческого IgE, и интенсивность генерируемого сигнала измеряется и используется для создания панели зависимостей, описывающих связывающую способность. Каждая кривая зависимости соответствует одной из различных концентраций препарата антитела, направленного против человеческого IgE, и ее получают путем нанесения на график значений концентраций препарата IgE WHO/NIBSC, используемых для инкубации на чипе, относительно соответствующей полученной интенсивности сигнала. Число полученных кривых зависимостей, описывающих связывающую способность, соответствует числу различных пятен препарата антитела, направленного против человеческого IgE, имеющихся на чипе (см. фиг. 2А, где каждая кривая зависимости соответствует одной из различных концентраций препарата антитела, направленного против человеческого IgE, нанесенного в виде пятна на матрицу, и она была получена откладыванием значений концентраций препарата IgE WHO/NIBSC относительно соответственно полученного сигнала интенсивности).

3. Группирование кривых зависимостей, описывающих связывающую способность. Кривые зависимостей, описывающих связывающую способность, затем объединяют в группы, представляющие различные связывающие способности (например, очень сильную, сильную, среднюю и слабую связывающую способность). Кривая регрессионной зависимости получается для каждой группы и хранится в программном обеспечении прибора-анализатора (см. фиг. 2В, на которой представлены кривые зависимостей, описывающих связывающую способность, объединенные в группы).

4. "Приписывание" кривых зависимостей, описывающих связывающую способность аллергенам. В соответствии с наклоном и формой кривых зависимостей "доза-ответ" аллергена, полученных, как описано в пункте 1, одна из кривых связывающей способности (Master Curves) приписывается каждому аллергену.

5. Количественное определение аллерген-специфического IgE. С помощью данной системы калибровки аллерген-специфические IgE сыворотки неизвестного пациента измеряются путем сопоставления интенсивности сигнала, полученного от специфического аллергена, нанесенного на микроматричный чип, со специфически приписанной кривой зависимости, описывающей связывающую способность. Аллергенная реактивность выражается в Международных единицах/мл и/или оценке класса (Class Score).

6. Используя внутренние контроли (регулятор) для каждого чипа, система может создавать внутреннюю кривую зависимости (Internal Curve) "доза-ответ" с учетом хранения и условий окружающей среды слайда, "подгоняя" кривые зависимостей, описывающих связывающую способность Master Curves, полученные по пункту 4, соответственно. Внутренняя калибровка состоит из выполнения алгоритма с целью перемещения кривой калибровки Master Calibration Curve на основе сигнала регулирующих параметров. Например, если сигнал регулирующего параметра, чье ожидаемое значение равно 1000 единиц, имеет величину 950, данный алгоритм может привести к смещению кривой калибровочной зависимости Master Calibration Curve, составляющему 5%.

В отличие от обычных иммуноанализов для определения аллергенов, которые используют одну кривую калибровки, система иммуноанализа по изобретению учитывает различия в связывающей способности каждого аллергена. Это обеспечивает гораздо более точный анализ для количественного определения аллерген-специфического IgE в образце.

Группа изобретений относится к медицине и касается способа количественного определения нескольких антиген-специфических иммуноглобулинов в анализируемом образце, включающего стадию анализа связывания серии образцов, содержащих иммуноглобулин известной антигенной реактивности, с несколькими антигенными компонентами или их фрагментами, иммобилизованными на твердой подложке. Группа изобретений также касается способа калибровки устройства, подходящего для анализа связывания нескольких антиген-специфических иммуноглобулинов с несколькими антигенами или их фрагментами, иммобилизованными на твердой подложке; и набора для осуществления указанных способов. Группа изобретений обеспечивает высокий уровень количественной оценки и калибровки. 3 н. и 20 з.п. ф-лы, 1 пр., 2 ил., 1 табл.

1. Способ количественного определения нескольких антиген-специфических иммуноглобулинов в анализируемом образце, включающий следующие стадии:
(i) анализ связывания серии образцов, содержащих иммуноглобулин известной антигенной реактивности, с несколькими антигенными компонентами или их фрагментами, иммобилизованными на первой твердой подложке,
(ii) сравнение уровня связывания на стадии (i) с известной реактивностью для получения кривой зависимости "доза-эффект" для каждого антигенного компонента или его фрагмента,
(iii) анализ связывания серийных разведений образца стандартного препарата иммуноглобулина того же подтипа иммуноглобулина, который используется на стадии (i), с известным общим количеством иммуноглобулина, с серийными разведениями антииммуноглобулиновых антител, их фрагментов или производных, иммобилизованных на первой или второй твердой подложке,
(iv) сравнение уровня связывания на стадии (iii) с известным общим количеством стандартного препарата иммуноглобулина для получения кривой зависимости, описывающей связывающую способность для каждого разведения антииммуноглобулинового антитела, фрагмента или производного,
(v) сравнение кривых зависимостей "доза-ответ", полученных на стадии (ii), с кривыми зависимостей, описывающих связывающую способность, полученными на стадии (iv), выявление кривой зависимости, описывающей связывающую способность, которая в наибольшей степени соответствует кривой зависимости "доза-ответ" для каждого антигена или его фрагмента, и приписывание кривой зависимости, описывающей связывающую способность, каждому антигену или его фрагменту на данной основе,
(vi) анализ связывания антиген-специфического иммуноглобулина в анализируемом образце с антигенными компонентами или их фрагментами, иммобилизованными на первой, второй или третьей твердой подложке, и
(vii) сравнение уровня связывания на стадии (vi), в отношении каждого отдельного антигена или его фрагмента, с кривой зависимости, описывающей связывающую способность, установленной для данного антигена или его фрагмента на стадии (v), и количественное определение уровня антиген-специфического иммуноглобулина, присутствующего в анализируемом образце.

2. Способ по п. 1, в котором кривые зависимостей, описывающих связывающую способность, полученные на стадии (iv), объединены в группы репрезентативных кривых зависимостей, описывающих связывающую способность для представления различных уровней связывающей способности, например очень сильное связывание, сильное связывание, среднее связывание и слабое связывание, и в котором сравнение на стадии (v) осуществляют по отношению к кривым зависимостей "доза-ответ", полученным на стадии (ii), и к репрезентативным кривым зависимостей, описывающих связывающую способность, а не по отношению к кривым зависимостей, описывающих связывающую способность, полученным на стадии (iv).

3. Способ калибровки устройства, подходящий для анализа связывания нескольких антиген-специфических иммуноглобулинов с несколькими антигенами или их фрагментами, иммобилизованными на твердой подложке, включающий следующие стадии:
(i) анализ связывания серии образцов, содержащих иммуноглобулин известной антигенной реактивности, с несколькими антигенными компонентами или их фрагментами, иммобилизованными на первой твердой подложке,
(ii) сравнение уровня связывания на стадии (i) с известной реактивностью для получения кривой зависимости "доза-эффект" для каждого антигенного компонента или его фрагмента,
(iii) анализ связывания серийных разведений образца стандартного препарата иммуноглобулина того же подтипа иммуноглобулина, который используется на стадии (i), с известным общим количеством иммуноглобулина серийных разведений антииммуноглобулиновых антител, их фрагментов или производных, иммобилизованных на первой или второй твердой подложке,
(iv) сравнение уровня связывания на стадии (iii) с известным общим количеством стандартного препарата иммуноглобулина для получения кривой зависимости, описывающей связывающую способность для каждого разведения антииммуноглобулинового антитела, фрагмента или производного,
(v) сравнение кривых зависимостей "доза-ответ", полученных на стадии (ii), с кривыми зависимостей, описывающих связывающую способность, полученными на стадии (iv), выявление кривой зависимости, описывающей связывающую способность, которая в наибольшей степени соответствует кривой зависимости "доза-ответ" для каждого антигена или его фрагмента, и приписывание кривой зависимости, описывающей связывающую способность, каждому антигену или его фрагменту на данной основе, и
(vi) ввод кривых зависимостей, описывающих связывающую способность, полученных на стадии (v), в устройство таким образом, что кривые зависимостей, описывающих связывающую способность для каждого антигена, могут быть интерполированы с сигналами, полученными от образцов, содержащих неизвестные количества иммуноглобулина, который специфически связывает данный антиген.

4. Способ по п. 3, в котором кривые зависимостей, описывающих связывающую способность, полученные на стадии (iv), объединены в группы репрезентативных кривых зависимостей, описывающих связывающую способность для представления различных уровней связывающей способности, например очень сильное связывание, сильное связывание, среднее связывание и слабое связывание, и в котором сравнение на стадии (v) осуществляют по отношению к кривым зависимостей "доза-ответ", полученным на стадии (ii), и к репрезентативным кривым зависимостей, описывающих связывающую способность, а не по отношению к кривым зависимостей, описывающих связывающую способность, полученным на стадии (iv).

5. Способ по п. 1, в котором антигены являются рекомбинантными или получены из натурального экстракта, или являются их комбинацией и необязательно, в котором антигены являются очищенными.

6. Способ по п. 2, в котором антигены являются рекомбинантными или получены из натурального экстракта, или являются их комбинацией и необязательно, в котором антигены являются очищенными.

7. Способ по п. 3, в котором антигены являются рекомбинантными или получены из натурального экстракта, или являются их комбинацией и необязательно, в котором антигены являются очищенными.

8. Способ по п. 4, в котором антигены являются рекомбинантными или получены из натурального экстракта, или являются их комбинацией и необязательно, в котором антигены являются очищенными.

9. Способ по п. 1, в котором антигены представляют собой аллергены, иммуноглобулин представляет собой IgE и антииммуноглобулиновые антитела представляют собой анти-IgE-антитела.

10. Способ по п. 2, в котором антигены представляют собой аллергены, иммуноглобулин представляет собой IgE и антииммуноглобулиновые антитела представляют собой анти-IgE-антитела.

11. Способ по п. 3, в котором антигены представляют собой аллергены, иммуноглобулин представляет собой IgE и антииммуноглобулиновые антитела представляют собой анти-IgE-антитела.

12. Способ по п. 4, в котором антигены представляют собой аллергены, иммуноглобулин представляет собой IgE и антииммуноглобулиновые антитела представляют собой анти-IgE-антитела.

13. Способ по п. 5, в котором антигены представляют собой аллергены, иммуноглобулин представляет собой IgE и антииммуноглобулиновые антитела представляют собой анти-IgE-антитела.

14. Способ по п. 6, в котором антигены представляют собой аллергены, иммуноглобулин представляет собой IgE и антииммуноглобулиновые антитела представляют собой анти-IgE-антитела.

15. Способ по п. 7, в котором антигены представляют собой аллергены, иммуноглобулин представляет собой IgE и антииммуноглобулиновые антитела представляют собой анти-IgE-антитела.

16. Способ по п. 8, в котором антигены представляют собой аллергены, иммуноглобулин представляет собой IgE и антииммуноглобулиновые антитела представляют собой анти-IgE-антитела.

17. Набор, состоящий из частей, для осуществления способа по п. 1 или 3, содержащий:
a) тест-систему для определения нескольких аллергенов, содержащую серийные разведения анти-IgE-антител, их фрагментов или производных, иммобилизованных на твердой подложке, аллергенные компоненты или их фрагменты, иммобилизованые на первой или второй твердой подложке, положительные и отрицательные контроли на первой, второй или третьей твердой подложке; и
b) одно или более из следующего:
i) образец стандартного препарата IgE;
ii) первый препарат антител, содержащий первые антитела, которые связываются с IgE;
iii) второй препарат антител, содержащий вторые антитела, которые специфически связываются с первыми антителами;
iv) третий препарат антител, содержащий третьи антитела, которые специфически связываются со вторыми антителами; и
в котором или вторые антитела, или третьи антитела конъюгированы с детектируемым маркером.

18. Набор по п. 17, в котором аллергенные компоненты или их фрагменты являются рекомбинантными или получены из натурального экстракта или являются их комбинацией и необязательно, в котором аллергенные компоненты или их фрагменты являются очищенными.

19. Набор по любому из пп. 17 или 18, в котором детектируемый маркер представляет собой фермент, например пероксидазу хрена (HRP).

20. Набор по любому из пп. 17 или 18, в котором детектируемый маркер представляет собой хемилюминесцентный остаток, радиоактивный остаток или флуоресцентный остаток.

21. Способ по любому из пп. 1 или 2, в котором твердая подложка представляет собой микроматричный чип.

22. Способ по любому из пп. 3-16, в котором твердая подложка представляет собой микроматричный чип.

23. Набор по любому из пп. 17 или 18, в котором твердая подложка представляет собой микроматричный чип.