Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, - продуцент моноклональных антител против J @ Е человека Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для производства мо- ноклональных антител (МКАТ) против эпсилон-цепи иммуноглобулина Е (IgE), которые используются в иммунохимической диагностике аллергических заболеваний человека.

Содержание IgE в крови человека в 10-50 тысяч раз меньше уровня иммуноглобулинов других классов (IgA, IgG, IgM). Селективность и чувствительность современных методов выявления аллерген-специфических lgE-анти- тел (аллергосорбентный тест) или определения общего содержания IgE (двухде- терминантный иммунометрический тест) обеспечиваются реализацией принципа твердофазного иммуно-анализа, согласно

которому IgE, содержащийся в исследуемом образце, связывается иммобилизованным на твердой фазе аллергеном или МКАТ, направленными к одной из антигенных детерминант эпсилон-цепи, после чего сформированный на твердой фазе иммунный комплекс выявляется с помощью вторых МКАТ, несущих ферментную, изотопную или флуоресцентную метку 1.

В связи с этим МКАТ, предназначенные для использования в аллергодиагностиче- ских методах твердофазного иммуноанализа, подвергаются отбору по критерию сохранения функциональной активности при иммобилизации на твердой фазе и кова- лентном связывании с маркерными молекулами. Кроме того, при этом отбирают МКАТ,

XI

ч о о

специфичные к антигенным участкам эпсилон-цепи, которые,во-первых,не маскируются при формировании комплекса аллерген-lcE. а во-вторых пространственно удалены друг от друга, что исключает конкуренцию между ними за связывание IgE при постановке двухдетерминантного иммуно- метрического теста. Перспективными для практического применения считаются МКАТ, обладающие одним или несколькими из перечисленных свойств.

Известны гибридомные штаммы 2, 3. 4, вырабатывающие МКАТ против IgE человека (табл. 1).

В числе аналогов описано семейство гибридомных клонов 15, при получении которых реализованы упомянутые выше принципы отбора продуцентов (ПРОТОТИП). Гибридомы получены на основе миеломной линии РЗХ63, Ад8.653 и лимфоцитов мышей линии BALB/c, иммунизированныхмиелом- ным IgE человека. 5 штаммов этого семейства продуцируют МКАТ, относящиеся к lgG1, продукты двух других штаммов относятся к gG2a. Среди описываемых штаммов большинство продуцирует МКАТ, которые взаимодействуют как с гомогенным (мие- ломным), так и с поликлональным IgE человека, что дает основания считать их специфичными в отношении константной области эпсилон-цепи. Продукты 2-х штаммов сохраняют антиген-связывающую активность при иммобилизации на твердой фазе. МКАТ, способных выявлять аллерген- специфические lgE-антитела или служить основой меченого реагента для двухдетерминантного определения концентрации IgE, среди продуктов данного семейства гибридом не описано.

Недостаток известных гибридом, в том числе и прототипа, состоит в том, что для их получения в качестве родительских клеток использованы миеломные клеточные линии с низкой автономностью роста, требующие для размножения ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Высокая зависимость от ростовых факторов ограничивает возможности эксплуатации таких гибридом в качестве производственных штаммов, особенно при использовании метода массового культивирования в ферментерах, а также может служить причиной их недостаточной стабильности.

Цель настоящего изобретения состояла в получении гибридомного штамма, который:

1) не требует для размножения ростовых факторов эмбриональной сыворотки;

2) синтезирует МКАТ. пригодные для определения концентрации IgE в сыворотке крови человека.

Достижение поставленной цели было обеспечено:

1)использованием при получении гибридом клеток миеломного штамма 653.А (ВСКК(П) N 7 D, а.с. № 1381982), размножение которого не требует ростовых факторов

0 эмбриональной сыворотки;

2)отбором среди полученных гибридом штамма E/5D4, синтезирующего МКАТ, которые сохраняют антиген-связывающую активность при иммобилизации на твердой

5 фазе и при присоединении ферментной метки.

Описываемый штамм E/5D4 подобно ПРОТОТИПУ синтезирует МКАТ, специфичные к константной области IgE человека и

0 способные в адсорбированном на твердой фазе состоянии извлекать IgE из раствора. В отличие от ПРОТОТИПА штамм E/5D4 получен на основе миеломной клеточной линии 653.А и не требует для размно5 жения ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Синтезируемые штаммом E/5D4 МКАТ обладают свойством, наличие которого у прототипа неизвестно: в виде коныогата с ферментом они позхволяют оп0 ределять общее содержание IgE с помощью двухдетерминантного иммунометрического теста. Кроме перечисленного, штамм отличается от ПРОТОТИПА генотипом животных-доноров иммунных лимфоцитов

5 (мыши линии SJL/J).

Совокупность описанных свойств позволяет рассматривать предлагаемый гиб- ридомный штамм РИ-8-Е/504, как объект, обладающий существенными отличиями от

0 прототипа.

Штамм депонирован в ВСКК(П) под номером 403Д.

Справка о депонировании прилагается. Штамму присвоено авторское наимено5 вание РИ-8-Е/5Д4.

Получение гибридомного штамма. Донорами иммунных лимфоцитов служили сыши-масцы линии SJL/J, которых иммунизировали дважды с интервалом в 1

0 неделю подкожно препаратом миеломного 1дЕ/Ц40мкг) в полном адъювантеФрейнда, на 11 и 12 дни после этого давали бустер-иммунизации внутрибрюшинно по 10 мкг IgE в физиологическом растворе. Спленоциты

5 для слияния получали через 24 часа после последней бустер-иммунизации от мышей, у которых титр анти- дЕ-антител превышал 1:20000. Партнерами для гибридизации служили клетки миеломного штамма 653.А, выращенные на питательной среде.

содержащей модифицированную Дюльбек- ко среду Игла (90%) и сыворотку крупного рогатого скота (10%). Для слияния использовали 100 млн клеток селезенки и 50 млн клеток миеломы. Смесь клеток обрабатыва- ли раствором полиэтилен гликоля (50%) с молекулярной массой 1000. Для выращивания гибридов использовали питающий слой из перитонеальных макрофагов мышей и питательную среду указанного выше соста- ва, содержащую в 100 мл (мкг): аминопте- рин-10, гипоксантин-500 и тимидин-500.

Отбор и тестирование культуральных надосадков проводили трижды с 11 по 28 дни после слияния. Выявление МКАТ, спе- цифичных к константной области эпсилон- цепи вели с помощью твердофазного иммуноферментного анализа аналогично известному способу 3, 5, используя в каче- стве антигенов миеломные IgE, препараты IgG, IgM, а также легкие цепи иммуноглобулинов человека каппа- и лямбда-типов (табл. 2).

Из 480 первичных культур 12 синтези- ровали антитела, связывающие с lgE/L-им- муногеном. Среди них одна культура продуцировала антитела, направленные к легкой цепи каппа-типа.

Продукты синтеза 5 культур связыва- лисье lgE/L-иммуногеном, но не реагировали с миеломным lg.E/Ю. Наконец, 6 культур синтезировали антитела, взаимодействующие как с IgE/L, так и с lgE/Ю. Эти 6 культур, обозначенные как семейство гибридом РЙ-8, были подвергнуты дальнейшему изучению.

Гибридомы клонировали 2-4 раза методом лимитирующих разведений на питающем слое из перитонеальных макрофагов мышей. Клоны, которые при двух последовательных клонированиях с плотностью посева, равной 1 клетке на 1 или 2 лунки, давали более 95% субклонов, синтезирующих анти- дЕ-антитела, переводили в мае- совую культуру. Выращенные в культуре клетки внутрибрюшинно прививали гисто- совместимым мышам (по 5 млн клеток на мышь), которым за 7-18 дней до этого также внутрибрюшинно был введен пристан (по 0,5 мл).

От мышей с растущими опухолями на 14-21 дни получали асцитические жидкости. МКА из асцитов адсорбировали на твердой фазе и исследовали их способность связы- вать IgE из раствора. Заменяя растворы IgE на образцы сыворотки крови здоровых людей и больных аллергией, выявляли МКАТ, которые связывают поликлональный сывороточный IgE, т.е. специфичны к константным эпитопам эпсилон-цепи. Были

отобраны 5 клонов-продуцентов МКАТ, удовлетворяющих критериям селекции.

МКАТ, специфичные к константным эпитопам IgE, исследовали на способность сохранять иммунологическую активность при присоединении ферментной метки, Для этого МКАТ из асцитических жидкостей выделяли осаждением сульфатом аммония 6 и методом периодатного окисления к ним присоединяли фермент - пероксидазу хрена 7. Иммунологическую активность пол- ученных конъюгатов исследовали в твердофазном иммуноанализе, адсорбируя на твёрдой фазе миеломный IgE. Продукты пяти клонов после присоединения ферментной метки сохраняли антиген-связываю- щую активность.

Подбор МКАТ для двухдетерминатного иммунометрического теста определения IgE проводили, испытывая поочередно адсорбированные на твердой фазе МКАТ в сочетании с мечеными пероксидазой МКАТ в качестве выявляющих реагентов (табл. 3). Найдено несколько сочетаний иммобилизованных и меченых МКАТ, позволяющих определять IgE в сыворотке крови. Оптимальный результат был получен при иммобилизации на твердой фазе МКАТ клона 5Д4 и выявлении фиксированного IgE с помощью меченых пероксидазой МКАТ клона 4Ф4. Удовлетворительный результат был получен также при использовании конъюга- та, приготовленного на основе МКАТ Е/5Д4.

Таким образом, в результате ступенчатого отбора был получен штамм Е/5Д4, который обладает необходимой совокупностью свойств, т.е. способностью расти на среде, не содержащей эмбриональной сыворотки, и продуцировать МКАТ, пригодные для двухдетерминантного имму- нометрического метода определения содержания IgE в качестве меченого реагента или в качестве иммобилизованного антитела, извлекающего IgE из раствора.

Характеристика штамма.

Штамм Е/5Д4 принадлежит к семейству гибридом РИ-8.

1)С момента получения из родительских клеток штамм прошел 28 пассажей в культуре, включая 4 цикла клонирования методом лимитирующих разведений на питающем слое из макрофагов мышей.

2)Стандартными условиями культивирования являются следующие: питательная среда состоит из среды Игла в оригинальной прописи или в модификации Дюльбекко (90%) и сыворотки крупного рогатого скота (10%). Клетки выращивают при +37°С в герметично закрытых флаконах или в открытой

системе - в планшетах, чашках Петри или флаконах в атмосфере с 7.5% углекислоты в воздухе при 100% влажности.

3)Оптимальная посевная доза составляет 200 тыс клеток в 1 мл среды. Для поддержания клеток в пролиферирующем состоянии их рассевают 2 раза в неделю с коэффициентом 1:4 - 1:5 при использовании стандартного состава ростовой среды. Клетки сохраняют способность к пролиферации при снижении содержания сыворотки до 2,5%, при этом кратность рассева составляет 1:2. Максимальная плотность культуры с сохранением жизнеспособности 1,2-1,4 млн клеток в 1 мл.

4)Культура описываемого штамма представляет взвесь одиночных округлых прозрачных клеток, встречаются агрегаты из 4-х или более клеток, которые легко суспендируются пипетированием.

5)Культура штамма Е/5Д4, постоянно выращиваемая без антибиотиков, не содержит бактерий, грибов, дрожжей и микоплаз- мы.

6)Клетки штамма перевивают в виде асцитических или солидных опухолей (в зависимости от способа прививки) на гисто- совместимыхмышах-гибридах F1(SJL/JxBALB/c). При внутрибрюшинной прививке 5 млн клеток животным в возрасте 1,5-3 месяца, предобработанным за 7-18 дней до этого внутрибрюшинным введением пристана, асцит развивается в течение 14-21 дня. От одной мыши получают при первой пункции 4-10 мл, суммарно в результате повторных пункций от одного животного получают 7-26 мл асцита.

7)Маркерные признаки штамма:

а)штамм синтезирует МКАТ против IgE человека. Антитела выявляются в культу- ральной жидкости при поддержании клеток in vitro и в сыворотке или в асцитической жидкости при прививке животным;

б)штамм обладает онкогенностью, которая выражается в росте солидных или асцитических опухолей у гистосовместимых мышей-гибридов F1(SJL/JxBALB/c) при прививке им клеток гибридом

8)Характеристика МКАТ. продуцируемых штаммом гибридомы Е/5Д4. Клетки гибридомы продуцируют МКАТ субкласса lgG2a. Антитела специфичны к константной области эпсилон-цепи IgE человека. Специфичность МКАТ может быть проверена в твердофазном иммуноферментном анализе с помощью IgE, адсорбированного на твердой фазе. МКАТ связываются с белком А стафилококка, что может быть использовано при их очистке. При адсорбции на твердои фазе МКАТ способны связывать сывороточный IgE и могут использоваться в качестве захватывающих антител в системе двухдетерминантного иммуноанализа(в паре с мечеными lgE-специфичными антителами) или при афинном извлечении IgE из сывороточных препаратов. МКАТ Е/5Д4, сохраняя антиген-распознающие свойства после присоединения ферментной метки,

могут также служить выявляющим реагентом в двухдетерминантном иммуноанализе. Антитела специфичны в отношении эпитопа на IgE, который не экспрессируется при образовании комплекса IgE с антигеном (аллергеном), и не могут использоваться для выявления фракции специфического IgE в аллергосорбентном тесте.

9)Продуцируемый штаммом иммуног- лобулин выявляется в культуральной среде

при культивировании клеток. Обратный титр МКАТ в переросших культурах при выращивании клеток в стандартных условиях составляет 1000-21000. Такой же титр может

быть получен при снижении содержания сыворотки в ростовой среде с 10% до 1,2%. При росте гибридомных клеток в мышах обратный титр МКАТ в асцитической жидкости составляет 100000-600000. Среднее содержание иммуноглобулина в асците составляет 8 мг/мл.

10)Стабильность продукции МКАТ оценивали при пассировании клеток на мышах в течение 7 пассажей. За этот период клетки

сохраняли исходную продуктивность. В культуре сохранение уровня МКАТ прослежено в течение 24 пассажей.

11)Условия криоконсервации. Криосре- да состоит из 45% среды Игла, 45% сыворотки крови крупного рогатого скота и 10% диметилсульфоксида. Ампулы, содержащие 1-10 млн клеток в криосреде помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1,5 см и выдерживают в нем при -70С в

течение суток, затем хранят при -70С или переносят в жидкий азот. Для размораживания клеток ампулы извлекают из низкотемпературного хранилища и на 3 минуты погруж-жя в воду с температурой МО С.

Затем центрифугируют 3 мин при 1000 об/мин, убирают надосадок, а клетки суспендируют в ростовой среде и рассевают в платы при концентрации 500 тыс клеток в 1 мл. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составляет 60-70% поданным пробы с 0,5% трипановым синим. Через 1 сутки клетки повторно рассевают с концентрацией 200 тыс клеток в 1 мл ростовой среды.

МАТЕРИАЛЫ, ПОЯСНЯЮЩИЕ СУЩНОСТЬ ПРЕДЛАГАЕМОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ Схема 1. Выявление IgE с помощью двухде- терминантного иммунометрического теста. Схема 2. Выявление аллерген-специфиче- ского Ig E с помощью аллерго-сорбентноготеста. Таблица 1. Гибридомные штаммы-продуценты МКАТ против IgE человека. Таблица 2. Результат тестирования специфичности антител, продуцируемых первич- ными культурами гибридом. Таблица 3. Выявление IgE с помощью двух- детерминантного твердофазного иммуно- ферментного анализа.

Таблица 4. Титры МКАТ, продуцируемых клетками штамма 8Е/5Д4 при выращивании в среде с низким содержанием сыворотки.

Таблица 5, Титры МКАТ, продуцируемых клетками штамма Е/5Д4, в культуральной среде и в асцитической жидкости. Таблица 6. Содержание IgE в образцах сыворотки крови человека, определенное в двухсайтовом иммуноанализе с помощью иммобилизованных МКАТ Е/5Д4,

Таблица 7. Выявление IgE в образцах сыворотки крови в двухсайтовом иммуноанализе с помощью меченых МКАТ Е/5Д4. Фиг. 1. Калибровочная кривая для определения содержания IgE в сыворотке крови человека в двухдетерминантном иммуно- метрическом тесте с помощью иммобилизованных МКАТ Е/5Д4.

Фиг. 2. Калиибровочная кривая для определения содержания IgE в сыворотке крови человека в двухдетерминантном иммуно- метрическом тесте с помощью меченых МКАТЕ/5Д4.

Примеры получения и использования МКАТ, синтезируемых штаммом Е/5Д4.

I. Выращивание культуры гибридомы для последующей поививки мышам.

Посевным материалом служат гибри- домные клетки, хранящиеся в жидком азоте. Для размораживания пробирку, содержа- щую 5 млн клеток, извлекают из сосуда с жидким азотом, погружают на 3 минуты в воду с температурой +40 С, после полного оттаивания пробирку центрифугируют 3 минуты при 1000 об/мин, удаляют надосадок, клетки ресуспендируют в 10 мл ростовой среды (модифицированная Дюльбекко среда Игла-90%, сыворотка крупного рогатого скота-10%) и помещают в культуральный флакон (объем 25 мл). Флакон помещают в инкубатор с температурой +37 С, 100% влажности и 7,5% углекислоты в воздухе, Через сутки проводят визуальный контроль состояния клеток с помощью инвертированного микроскопа и к содержимому флакона

прибавляют 15 мл ростовой среды. На 4 сутки после размораживания клетки пересевают в разведении 1:5 и переносят во флакон объемом 250 мл. Через 2 суток берут пробу для подсчета клеток - в 1 мл суспензии содержится 800 тыс гибридомных клеток. Суммарное содержание клеток в культуре 100 млн, что составляет 20 прививочных доз. Клетки осаждают центрифугированием (1000 об/мин, 20 мин), суспензируют в среде Хенкса и вводят по 5 млн в объеме 2 мл внутрибрюшинно мышам- межлинейным гибридам F1(SJL/JxBALB/c), получившим за 11 дней до прививки внутри- брюшинную инъекцию пристана.

II.Получение гибридомных асцитиче- ских жидкостей и выделение из них глобули- новой фракции, содержащей МКАТ.

Накопление асцита в брюшной полости мышей начинается на 11-й день после прививки клеток гибридомы. На 14-й день проводят первую пункцию. При этом получают от каждых 10 мышей 45-50 мл асцита. На 17 день повторно пунктируют оставшихся в живых мышей и получают еще 40-45 мл асцита. К 20-му дню остается около 50% привитых сышей. В результате третьей пункции получают 10-15 мл асцита. Общее количество асцита, получаемое от 10 мышей, составляет 105-110 мл.

После образования фибринового сгустка и отделения его от клеточной массы с помощью центрифугирования из 110 мл асцита получают 100мл надосадочной жидкости, из которой выделяют глобулиновую фракцию. Для этого к жидкости приливают по каплям в условиях непрерывного перемешивания равный объем насыщенного раствора сульфата аммония с рН-7,0. Осадок отделяют центрифугированием (6000 об/мин, 15 мин), надосадок отбрасывают, а осадок растворяют в дистиллированной воде, доводя объем раствора до исходного. Процедуру высаливания повторяют, полученный осадок суспендируют в половинном объеме полунасыщенного сульфата аммония и в таком виде хранят при +4С.

III.Получение содержащих МКАТ куль- туральных жидкостей при выращивании клеток гибридом на среде с низким содержанием сыворотки.

Источником клеток служит гибридом- ный штамм, хранящийся в жидком азоте. Клетки размораживают и высевают как описано в примере 1, Через сутки контролируют состояние клеток с помощью инвертированного микроскопа и определяют их содержание в культуре с помощью камеры Горяева. Суспензия содержит 400 тыс клеток в 1 мл. При первом пересеве к 10 мл культуры добаоляют 10мл ростовой среды, содержащей 10% сыворотки. Через 1 сутки культуру разделяют на 2 части: первую оставляют без пересевов до перероста для определения титра МКАТ. Ко второй прибавляют 10 мл бессывороточной среды, в результате концентрация сыворотки снижается до 5%. Через 2 суток взвесь клеток, выросших на среде с 5% сыворотки, разделяют на 3 части. Первую оставляют без рассева до перероста для определения титра МКАТ. Вторую часть четырехкратно пересевают на среде с 5% сыворотки (каждые 3 дня с коэффициентом 1:4) и затем оставляют до перероста для определения титра МКАТ. Третью часть пересевают с одновременным снижением концентрации сыворотки до 1,5%. На 3 сутки культуру разделяют на 2 части: первую оставляют до перероста, во второй содержание сыворотки снижают до 1.25% и спустя 6 дней из нее берут пробу для определения титра МКАТ. Данные определения титров МКАТ на всех стадиях процесса приведены в таблице 4.

IV. Определение титра мышиных антител против IgE человека.

Источником мышиных антител против IgE служат:

а)сыворотка крови мышей, иммунизированных IgE человека,

б)культуральная жидкость от растущих гиб- ридомных клеток,

в)асцитическая жидкость мышей с растущими гибридомными опухолями,

г)глобулиновая фракция содержащих МКАТ асцитических жидкостей.

Титр антител против IgE человека определяют с помощью твердофазного иммуно- ферментного анализа. Реакцию проводят в 4 этапа. На всех этапах для промывания и разбавления реагентов используют раствор, содержащий 0,85% хлористого натрия, 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,4 и 0,05% твина-20.

На первом этапе на твердую фазу адсорбируют антиген. Для этого в ячейки планшетов для иммуноанализа вносят по 100 мкл раствора, содержащего 10 мкг IgE/L в 1 мл карбонзт-бикарбонатного буфера (0.01 М, рН-9,5). Инкубируют не менее 10 часов при +4С. Удаляют антиген из ячеек и однократно промывают.

На втором этапе в лунках планшетов готовят серийные разведения исследуемых образцов объем по 100 мкл, инкубируют 1 час при +37 С, лунки освобождают от проб и трижды промывают.

На третьем этапе к связанным на твердой фазе мышиным антителам присоединяют меченые пероксидэзой кроличьи

антитела против иммуноглобулинов мышей. 8 лунки вносят по 100 мкл рабочего разведения коньюгата, инкубируют 45 мин при +37 С, удаляют конъюгат и 5-кратно промывают.

На последнем этапе с помощью цветной реакции выявляют активность перокси- дазы, связавшейся с твердой фазой. В лунки вносят по 100 мкл субстратной смеси (1 мг

0 орто-фенилендиамина и 2 мкл 33% перекиси водорода в 10 мл« 0,05 М цитратного буфера с рН-4,7), инкубируют 30 минут при комнатной температуре в темноте и затем реакцию останавливают добавлением 50

5 мкл 2Н серной кислоты. Оптическую плотность проб регистрируют на фотометре Мультискан-МС при длине волны 492 нм. Результаты представлены в таблице 5.

V, Использование иммобилизованных

0 на твердой фазе МКАТ Е/5Д4 для количественного определения содержания IgE в сыворотке крови человека

Концентрацию IgE в сыворотке крови определяют с помощью двухдетерминант5 ного твердофазного иммуноанализа, Адсорбированные на твердой фазе МКАТ 8У/5Д4 служат для захвата антигена из образца. Для выявления IgE, включенного на твердой фазе в иммунный комплекс, используют ме0 ченые ферментом специфичные к IgE поли- клональные антитела, изготовляемые НПО АЛЛЕРГЕН (г. Ставрополь), или монокло- нальные антитела, например, МКАТ продуцируемые клоном РИ-8-Е/4Ф4. Реакцию

5 проводят в полистироловых планшетах фирмы NUNC. Для разбавления реагентов и отмывания планшетов используют раствор того же состава, что в примере IV.

На первом этапе в лунки планшета вно0 сят раствор МКАТ Е/5Д4, содержащий 5 мкг белка в 1 мл 0,01 М карбонат-бикарбонатно- го буфера. рН-9,5. Инкубируют в течение ночи при +4С, раствор удаляют и лунки однократно промывают.

5 На втором этапе в лунки вносят образцы исследуемых сывороток и растворы с известным содержанием IgE, предназначенные для построения калибровочной кривой (калибраторы фирмы Pharmacia). Инкубируют

0 при +37 С 1 час, образцы удаляют и лунки трехкратно промывают.

На третьем этапе в лунки вносят рабочее разведение конъюгата, инкубируют 1 час при +37 С, раствор удаляют, планшет

5 промывают пятикратно.

На четвертом этапе в лунки вносят субстратную смесь для выявления активности пероксидазы. Состав смеси приведен в примере IV. Инкубируют 30 минут в темноте при комнатной температуре, реакцию останавливают серной кислотой и измеряют оптическую плотность проб при длине волны 492 нм (по примеру IV). На основании полученных данных строят калибровочную кривую. По оси абсцисс откладывают концентрацию IgE в МЕ/мл, по оси ординат - оптическую плотность проб {фиг. 1). Пользуясь калибровочной кривой и учитывая коэффициент раз- ведения исследуемых сывороток, определяют содержание в них IgE (таблица 6).

VI. Использование МКАТ Е/5Д4 в качестве меченого реагента для количественного определения содержания IgE в сыворотке крови человека.

Концентрацию IgE в сыворотке крови определяют с помощью двухсайтового варианта твердофазного иммуноанализа. Адсорбированные на твердой фазе lgE-специфические антитела служат для захвата антигена из образца. Для выявления IgE, включенного на твердой фазе в иммунный комплекс используют меченые перок- сидазой МКАТ 8Е/5Д4. Реакцию проводят в полистироловых планшетах фирмы NUNC. Для разбавления реагентов и отмывания планшетов от несвязавшихся компонентов используют раствор того же состава, что в примере IV.

На первом этапе в лунки планшета вносят раствор МКАТ-8Е/4Ф4, содержащий 5 мкг белка в 1 мл 0,01 М карбонат-бикарбо- натного буфера, рН-9,5. Инкубируют в течение ночи при +4С, затем раствор удаляют и лунки однократно промывают.

На втором этапе разведения исследуемых сывороток и растворы с известным содержанием IgE, предназначенные для построения калибровочной кривой (калибраторы фирмы Pharmacia) вносят в лунки планшетов, инкубируют при +37 С 1 час, затем лунки освобождают от раствора и промывают трехкратно.

На третьем этапе рабочее разведение коньюгата МКАТ 8Е/5Д4 с пероксидазой вносят в лунки, инкубируют 1 час при+37С, раствор удаляют, планшет промывают 5 раз.

На четвертом этапе в лунки вносят субстратную смесь для выявления активности пероксидазы. Состав смеси приведен в примере IV. Инкубируют 30 минут в темноте при комнатной температуре, затем останавливают реакцию добавлением серной кислоты и измеряют оптическую плотность проб при длине волны 492 нм (по примеру IV). На

основании полученных данных строят калибровочную кривую. По оси абсцисс (лога- рифмическая шкала) откладывают концентрацию IgE в МЕ/мл, а по оси ординат - оптическую плотность соответствующих проб (фиг. 2). Пользуясь калибровочной кривой и учитывая коэффициент разведения исследуемых сывороток, определяют содержание в них IgE (таблица 7).

Технико-экономическая эффективность изобретения.

Преимущество предлагаемого гибри- домного штамма РИ-8-Е/5Д4 определяется тем, что для поддержания его в культуре не

требуются ростовые факторы эмбриональной сыворотки. Поскольку применяемая в работе с полученным штаммом сыворотка крупного рогатого скота в 50-100 раз дешевле эмбриональной сыворотки, затраты при

наработке МКАТ в условиях культивирования и при наращивании клеточной массы для прививки животным существенно снижаются.

Преимущества МКАТ, продуцируемых

предложенным штаммом, в сравнении с по- ликлональными антителами состоят, во- первых, в том, что для получения каждой новой партии антител не требуется повторения цикла иммунизации и расхода очищенного IgE человека,, который из-за редкой встречаемости больных с lgE-продуцирую- щей миеловой чрезвычайно малодоступен. Во-вторых, иммунохимические тесты, основанные на применении МКАТ против IgE,

обладают абсолютной специфичностью, тогда как специфичность поликлональных сывороток может варьировать в широких пределах.

К преимуществам описываемого штамма относится то, что синтезируемые им МКАТ, иммобилизованные на твердой фазе, могут в сочетании с мечеными lgE-специ- фичными моно- или поликлональными антителами обеспечивать определение общего

IgE в сыворотке крови человека. МКАТ, продуцируемые штаммом, сохраняют антиген- распознающую способность при присоединении ферментной метки и могут также служить выявляющим реагентом при

определении IgE методом двухдетерминан- тного твердофазного иммуноанализа. Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК (П) №

403Д - продуцент моноклональных антител против IgE человека.

Таблица 1

Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: штамм получают гибридизацией спленоцитов инбредных мышей SJLAT. иммунизированных миеломным IgE, с клетками миеломы 653.А. Клетки штамма поддерживают в культуре в среде ДМЕМ, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скога, или перевивают на мышах-гибридах F1 (SjL/Jlx BALB/c). Обратный титр МКА в культураль- ных жидкостях составляет 1-21 тыс., а в асцитах - 100-600 тыс. Моноклональные антитела (МКА) относятся к lgG2a. При иммобилизации на твердой фазе МКА могут использоваться в паре с другими IgE - специфичными мечеными антителами в двухде- терминантном иммунометрическом тесте определения содержания IgE. МКА сохраняют антиген-распознающую способность при присоединении ферментной метки и пригодны в качестве меченого реагента для определения концентрации IgE в двухцент- ровом методе иммуноанализа. Штамм обозначен РИ-8Е/5Д4 и депонирован под номером ВСКК (П) 403Д.

Гибридомные штамма-продуценты МКА.Т ПРОТИВ IgE человека

№

Характеристика штаммов .

продуцентов ЩЩшифрштамма партнеры в слиянии

шелома

лимфоциты

Balb/c

нкг/1

НЕЗ НЕ4УЗ

РЗхбЗ Ва1Ь/с Ag8.653

4, IgE/11-l Р3х853 Balb/0

применения

Биб- лш- гра- фия

Шлуколичвствввный одноступенчатый двухсай- товьй ишлуноферментный тест вщвленкк общэго IgE

Твердофазный аллергосор- бентный радиоиммуноана- Л113 для выявления аллер- гвнсшцифического IgE Количественное определение обшэго IgE в радио- или иммунофершнтном анализе

Определение обшрго IgE с помощью двухсайтово- го иммутюфермвнтного анализа

Результат тестирования специфичности антител, продуцируемых первичными культурами гибридом.

Примечания: + антитела связываются с антигеном

- отсутствие реакции между антителами и антигеном

Выявление igE с поменяю двухдетерминантного твердофазного шмуноферментного анализа.

Примечание. Определение IgE проводилось в пуле иэ 13 сывороток от аллергических больных. Разведение образца 1:10.

Таблица .

Таблица 3

Титры ШАТ, продуцируемых клетками штамма 8Е/5Д4 .при выращивании в низкосывороточной среде.

Примечание. В таблице представлены средние и предельные ( в скобках) значения обратных титров, полученные для 6-9 отдельных культур.

Таблица 5

Титры МШ, продуцируемых клетками шташа Е/5Д4 в культуральной среде и в асцитической жидкости.

Примэчаняэ.1 В таблице представлены средние показатели обратных титров МШ, полученные при анализе 4-6 образцов.

Таблица 4

21

Содержание IgE в образцах сыворотки крови Человека, определенное в двухсайтовом иммуноанализе с помощью иммобилизованных МКАТ Е/5Д4.

NN образца

Оптическая плотность

0,955 0,775 1,190 0,681 1,166 0,600 0,884 0,998

Примечание. Определение содержания IgE в сыворотке проведено с помощью калибровочной кривой, ФЯГ. 1.

Таблица 7

Выявление IgE в образцах сыворотки крови в двухсайтовом иммуноанализе с помощью меченых МШ Е/5Д4.

Примечание. Определение содержания ItfE в МЕ/мд в сыворотках проведено с помощью калибровочной кривой, представленной на ФИГ. 2.

1776691

22

Таблица 6

Количество IgE -ME/MI

42 18 103 21 92 10 28 50

Ветвление UE с помощью двухдвтериинантяого пкмуяоютричвского теста.

NN I Сущность этапа анализа втвла

ЯшюОшяаашп URAT-I

Проявление реакции - выяв- ленив метки, фиксированной на фазе.

Примечание после каждого из указанных этапов

производится отшвание от компонентов, не связавшихся с твердой фазой.

Выявление аллерген-специфичного IgE с помощью аллергосорбентного теста.

NN этапа

Сущность этапа анализа

Инкубация с сывороткой, тестируемой на присутствие. IgE-антител. Формирование иммунных комплексов сывороточных антител с аллергеном.

Инкубация с МКАТ против IjE, мечеными ферментом или изотопом. Формирование иммунного комплекса UKAT И 1еЕ, связанного с аллергеном.

Примечание. После каждого из указанных этап-Vпроизводится отмывание от компонентов, не связавшихся с твердой фазой.

Схеиатическое изображение

V V V

Схема 2.

Схематическое изображение

ММ

OD/«2 m

г.ъл

.в

IB

вкг. 1

Штамп гивридячх культивируемы кгеток животных Ша msculus L., (BCMflV No 403Д). используемый дм получения ионбхлоаалышх

антител против юыуяогловуво Е чвдоавка. Ось абсцисс - концентрация IgE в UE/ita, ос ординат - оптичвсчкая плотность при диве воляи «2 ни.

01/492 ш 2.8-1

U

U/il

S8 18В