СПОСОБ ОЦЕНКИ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ К ХИМИЧЕСКИМ СОЕДИНЕНИЯМ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/53 G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, в частности к области медицинской экологии, и предназначено для установления зависимости неблагоприятного воздействия экологически вредных химических веществ на возникновение аллергического заболевания.

Изобретение может быть использовано как в специализированных клиниках при обследовании пациентов, так и в обычных учреждениях здравоохранения.

Состояние окружающей среды и влияние промышленных химических веществ на заболеваемость населения являются актуальной медико-социальной проблемой. При аллергической патологии в отличие от многих других заболеваний возможна идентификация патогенетического вклада аллергенных факторов, в том числе промышленных, с помощью высокочувствительного, специфического и безопасного для организма тестирования in vitro. В качестве маркера реагинового механизма аллергических реакций используется уровень содержания в крови иммуноглобулина Е (IgE).

Известен способ определения сенсибилизации к аллергенам, который предусматривает инкубацию цельной крови с аллергеном и без него с первоначальным и последующим измерением хемилюминесценции проб, и установление сенсибилизации к аллергену при достижении особых показателей превышения их уровня (см. патент РФ 2153673, кл. G 01 N 33/52, 33/48, от 1998 г.).

Данный способ является аналогом реакции специфического лейколизиса (РСЛЛ) ("Аллергия к промышленным химическим соединениям" О.Г. Алексеева, Л. А. Дуева, 1978), с помощью которого определяется лейкотоксичность аллергена. На самом деле указанным известным способом (патент РФ 2153673) определяется лимфотоксичность аллергена, поскольку изменение содержания лимфоцитов in vitro не может быть критерием сенсибилизации (клеточные механизмы развития сенсибилизации осуществляются в тканях - in vivo), так как содержание лимфоцитов не является ее показателем. Поэтому показатель специфического IgE, выбранный в качестве критерия аллергии, является более корректным и точным.

Также известен способ диагностики специфической сенсибилизации к промышленным аллергенам организма рабочих гидролизно-дрожжевого производства, согласно которому формируют иммунные комплексы путем инкубации сыворотки крови с антигеном, добавляют к ним конъюгат антител с пероксидазой, производят окрашивание иммунохимического комплекса хромогеном, регистрируют хемилюминесцентный ответ аллергенспецифичных IgE, а наличие сенсибилизации организма к аллергенам определяют исходя из результирующей кривой зависимости кратности прироста этого хемилюминесцентного ответа от концентрации антигена (см. патент РФ 2146049, кл. G 01 N 33/48 от 1994 г.).

Однако указанный известный способ является довольно длительным, т.к. предусматривает обязательное проведение ряда опытов (не менее 3-4) для построения результатирующей кривой только для одного пациента.

Кроме того, несмотря на обилие опытов, предлагаемый способ является недостаточно точным. Это объясняется тем, что погрешность, которая всегда имеет место быть при проведении опытов, может быть как в большую, так и в меньшую стороны от истинного значения. При построении результирующей кривой с использованием различных концентраций антигена будут меняться условия опыта, а значит ошибка будет не однотипной, что и приведет к неточным результатам.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению по назначению является способ оценки сенсибилизации к химическим соединениям путем проведения иммуноферментного анализа с формированием иммунных комплексов (см., например, Л.А. Дуева, Ю.Л. Мизерницкий. Сенсибилизация к промышленным химическим аллергенам при бронхиальной астме у детей в условиях загрязнения окружающей среды. Журнал "Медицина, труд и промышленная экология", 2, 1997, с. 41-44).

Согласно указанному способу определяют концентрацию общего IgE до и после введения в сыворотку крови тестируемого аллергена и по разности этих показателей диагностируют сенсибилизацию к аллергену.

Недостатком указанного известного способа является его недостаточная точность и достоверность, т.к. содержащийся в пробе IgE, связанный с тестируемым аллергеном, может образовывать "сэндвич-комплекс" с анти-IgE (известно, что аллерген и идентичные к нему моноклональные антитела могут быть специфичными к разным участкам молекулы IgE), что делает результаты определения недостоверными и неточными.

Техническая задача, решаемая предлагаемым изобретением, состоит в повышении точности и информативности оценки сенсибилизации к химическим соединениям.

Указанная техническая задача достигается способом оценки сенсибилизации к химическим соединениям, включающем проведение иммуноферментного анализа (ИФА) путем инкубации сыворотки пробы, в котором новым является то, что иммуноферментный анализ ведут в две стадии, на первой из которых производят инкубацию образцов сыворотки крови с антителами к контактным доменам IgE, иммобилизированным на поверхности лунок, затем после отмыва лунок осуществляют вторую стадию, на которой в лунки добавляют конъюгат антител к вариабельным доменам IgE с пероксидазой и одновременно - химическое соединение - аллерген, образовавшийся при этом иммунохимический комплекс специфичных IgE-антител окрашивают хромогеном, регистрируют оптическую плотность и при уменьшении оптической плотности в пробе относительно контроля в 1,5 раза и более диагностируют сенсибилизацию к химическому соединению - аллергену.

Достижение поставленной технической задачи обеспечивается благодаря следующему.

Предлагаемый способ представляет собой 2-стадийный конкурентный иммуноферментный анализ по установлению аллерген-специфичных IgE. При этом на первой стадии инкубируют сыворотку крови с антителами к константным доменам IgE; на второй стадии отмытое содержимое лунок добавляют конъюгат антител к вариабельным доменам IgE с пероксидазой и одновременно изучаемый аллерген. В результате конкуренции за вариабельные фрагменты специфичных к данному аллергену IgE число иммобилизованных иммуннохимических комплексов с ферментной меткой в опытной лунке будет меньше, чем в контрольной, и разница между концентрациями IgE в опытной и контрольной лунках будет соответствовать содержанию специфичного IgE к данному аллергену в анализируемой пробе.

На первой стадии происходит связывание Fc-фрагмента IgE (константной части иммуноглобулина, определяющей его класс) с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. Проба ставится в двух лунках (опытной и контрольной). На второй стадии, после отмыва лунок, в первую (опытную) лунку добавляется исследуемый аллерген и конъюгат антител к вариабельным доменам IgE с пероксидазой. Во время инкубации устанавливается равновесие между антителами и аллергеном за связывание с Fab-фрагментами (вариабельной частью антител), специфичных к данному аллергену IgE. Во вторую лунку с данной пробой аллерген не вносится (контроль). После добавления хромогена-субстрата измеряется оптическая плотность и рассчитывается разница между контрольной и опытной пробой. В пробах, имеющих специфичные IgE, оптическая плотность контрольной пробы сбудет превышать оптическую плотность опытной пробы.

Благодаря тому, что при осуществлении предлагаемого способа берут два образца исследуемой пробы (опытный и контрольный), обеспечиваются равнозначные условия в обоих дублированных образцах пробы к условиям опыта, что повышает точность определения.

Благодаря тому что на второй стадии проведения иммуноферментного анализа в пробу вводится химическое соединение - аллерген одновременно с введением в пробу конъюгата антител к вариабельным доменам IgE с пероксидазой, обеспечивается полное исключение неспецифичных реакций вследствие того, что на первой стадии происходит специфическая селекция антител с элиминацией тех из них, которые могут оказать неспецифическое мешающее влияние на конечный результат измерения (например, IgG), благодаря чему достигается высокая точность способа.

Для реализации предлагаемого способа в лабораторных условиях осуществляют следующие операции в нижеуказанной последовательности:
- производят забор крови у пациента;
- получают из нее образцы сыворотки;
- на поверхность лунок полистироловых микрострипов с нанесенными моноклональными антителами к константным доменам IgE человека вносят по два образца исследуемой пробы сыворотки (опытный и контрольный). При инкубации образцов сыворотки происходит связывание IgE, содержащегося в сыворотке, с антителами, прикрепленными к пластику;
- после отмывки лунок на второй стадии предлагаемого способа во все лунки вносят конъюгат антител к IgE с пероксидазой (конъюгат моноклональных антител и иммобилизованные на лунках антитела специфичны к разным участкам молекулы IgE);
- одновременно в опытный образец вводят аллерген в подобранной концентрации, при этом конъюгат моноклональных антител и аллерген конкурируют во время инкубации за специфичные вариабельные участки молекулы IgE;
- проводят инкубацию опытной и контрольной пробы с хромогенным субстратом. Окрашивание опытных проб, имеющих специфичные IgE к аллергену, будет менее интенсивным, чем окраска соответствующей контрольной пробы из-за потери конъюгата в конкуренции с аллергеном;
- идентификация результатов происходит с помощью многоканального спектрофотометра. В случае, если оптическая плотность исследуемой пробы в 1,5 и более раз меньше, чем оптическая плотность контрольной пробы, то диагностируют наличие сенсибилизации пациента к данному химическому соединению - исследуемому аллергену.

Пример конкретного осуществления предлагаемого способа.

В процессе испытаний была исследована кровь у 15 пациентов. После отбора крови из вены стандартным методом центрифугирования была получена сыворотка, которая в последующем подверглась исследованиям.

Для этого в лунки стандартной планшеты для иммуноферментного анализа с иммобилизованными на поверхности лунок антителами к Fc-фрагменту IgE вносили дублированные образцы (опытный и контрольный) исследуемой пробы сыворотки в количестве 50 мкл. По завершении 30-минутной экспозиции и промывки лунок фосфатным буфером на втором этапе иммуноферментного анализа для образования классического "сэндвича" в опытный образец одновременно вносили 50 мкл конъюгированных с пероксидазой моноклональных антител к Fab-фрагменту IgE и тестируемый аллерген (формальдегид) в количестве 50 мкл 0,5% раствора. В контрольную пробу с конъюгатом вместо формальдегида вносили 50 мкл физиологического раствора. Во время часовой инкубации опытного образца при комнатной температуре происходило конкурентное связывание формальдегида со специфическими участками вариабельных доменов Fab-фрагментов IgE в присутствии моноклональных антител к IgE, конъюгированных с пероксидазой, имеющих аналогичный формальдегиду аффинитет к соответствующим фрагментам IgE. После промывки лунок фосфатным буфером и проявления окраски посредством добавления хромогенного субстрата проводилось ее фотометрическое измерение и сопоставление результатов с соответствующей оптической плотностью стандартных образцов с известной концентрацией IgE. При наличии в пробе специфичных к формальдегиду IgE значение оптической плотности в контрольном образце превысило аналогичное значение в опытном образце (в "сэндвиче" больше конъюгированных антител, а значит меньше формальдегида, не нашедшего специфичные рецепторы). По разности содержания IgE в контрольном и опытном образцах определяли количество специфичных к формальдегиду IgE в сыворотке крови пациента. Диагностически значимым при установлении сенсибилизации к химическим веществам предлагается считать превышение оптической плотности в контрольном образце над оптической плотностью в опытном в 1,5 раза и выше.

Данные, полученные в ходе испытаний, приведены в таблице.

Данные, приведенные в таблице, показывают, что результаты оценки сенсибилизации к формальдегиду предлагаемым способом коррелируют с положительными результатами химического анализа крови на содержание формальдегида.

Предлагаемый способ является более точным и информативным по сравнению с прототипом, т. к. позволяет благодаря приему внесения аллергена in vitro на второй стадии иммуноферментного анализа освободиться от мешающего влияния антител другого класса иммуноглобулинов, а введение критерия 1,5 при оценке превышения оптической плотности контрольного образца над опытным позволяет не только точно определять количественное значение специфического IgE, но и качественно характеризовать состояние пациента как наличие сенсибилизации к конкретному промышленному химическому аллергену.

Кроме того, преимуществом предлагаемого способа является возможность диагностики сенсибилизации к химическим соединениям вызываемой не только облигатными аллергенами, но и гаптенами (низкомолекулярными веществами), приобретающими свойства полноценных аллергенов после конъюгации (сцепления) с белками организма.

Получение точных данных о сенсибилизации к химическим соединениям позволяет своевременно проводить профилактические и терапевтические мероприятия по предотвращению или уменьшению тяжести аллергических заболеваний у населения.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской экологии. Сущность изобретения: проводят двухстадийный иммуноферментный анализ, где на первой стадии производят инкубацию образцов сыворотки крови с антителами к константным доменам IgE, на второй стадии добавляют конъюгат антител к вариабельным доменам IgE с пероксидазой и одновременно - химическое вещество-аллерген, производят окрашивание образовавшегося иммунохимического комплекса специфичных IgE-антител хромогеном, регистрируют оптическую плотность и при уменьшении оптической плотности в пробе относительно контроля в 1,5 раза и более диагностируют сенсибилизацию к химическому соединению - аллергену. 1 табл.

Способ оценки сенсибилизации к химическим соединениям, включающий проведение иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что иммуноферментный анализ ведут в две стадии, на первой из которых производят инкубацию образцов сыворотки крови с антителами к константным доменам IgE, иммобилизованным на поверхности лунок, затем после отмыва лунок осуществляют вторую стадию, на которой в лунки добавляют конъюгат антител к вариабельным доменам IgE с пероксидазой и одновременно - химическое соединение-аллерген, образовавшийся при этом иммунохимический комплекс специфичных IgE-антител окрашивают хромогеном, регистрируют оптическую плотность и при уменьшении оптической плотности в пробе относительно контроля в 1,5 раза и более диагностируют сенсибилизацию к химическому соединению-аллергену.