СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ ПОСЛЕ СПЛЕНЭКТОМИИ ПО ИНДЕКСУ СООТНОШЕНИЯ МАСС CD4+/CD8+ Т-ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЕНКИ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии.

Способ позволяет прогнозировать течение апластической анемии (АА) после спленэктомии путем проведения морфометрической оценки количества CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов в гистологических срезах селезенки после иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания клеток, вычисления их массы и индекса соотношения масс (ИСМ) CD4+/CD8+Т-лимфоцитов селезенки.

АА - тяжелое гематологическое заболевание, характеризующееся синдромом костномозговой недостаточности. В основе этой патологии лежит апоптоз клеточных линий кроветворной ткани, сопровождающийся замещением клеточного костного мозга жировым и, как следствие, панцитопенией в периферической крови. Спленэктомия входит в программу комбинированной иммуносупрессивной терапии у пациентов с данной патологией. До сих пор роль CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов селезенки в патогенезе АА изучена недостаточно. Практически отсутствуют сведения о влиянии массы CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов селезенки и ИСМ CD4+/CD8+Т-клеток на течение АА после спленэктомии. Исследования популяционного состава лимфоцитов при этом заболевании многими авторами проводились преимущественно в крови и костном мозге (E.E.Solomou, S.Rezvani, S.Mielke [et al.] / Deficient CD4 CD25 FOXP3 T regulatory cells in acquired aplastic anemia // Blood. - 2007. - Vol. 110, No 5. - P. 1603-1606; A.M.Rizitano, H.Kook, W.Zeng [et al.] / Oligoclonal and polyclonal CD4 and CD8 lymphocytes in aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria measured by V-beta spectratyping and flow cytomenry // Blood. - 2002. - Vol. 100, No. 1. - P. 178-183).

Целью изобретения является разработка способа прогнозирования течения АА после спленэктомии по ИСМ CD4+/CD8+Т-лимфоцитов селезенки.

Прототип отсутствует.

Аналогами являются известные способы: 1. «Функциональная характеристика CD4+Т-клеток при апластической анемии» S.Kordasti, J.Marsh, S.AL-Khan [et al.] / Functional characterization of CD4+T cells in aplastic anemia // Blood. - 2012. - Vol. 119, No 9. - P. 2033-2043; 2. «Возрастание CD4+ и CD8+Т-клеток эффекторов памяти у больных апластической анемией». X.Hu, Y.Gu, Y.Wang [et al.] / Increased CD4+ and CD8+effector memory T cells in patients with aplastic anemia // Haematologica. - 2009. - Vol.94. - P. 428-429. В приведенных аналогах определяли содержание CD4+ и CD8+Т-клеток в крови и костном мозге больных АА при оценке характера течения заболевания, спленэктомия не проводилась.

Отличия заявляемого способа от аналогов включают:

1. Подсчет количества CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов проводят морфометрически после ИГХ окрашивания в гистологических срезах селезенки у больных АА после спленэктомии, а не в крови и костном мозге методом проточной цитометрии.

2. Течение АА после спленэктомии прогнозируют по ИСМ CD4+/CD8+Т-лимфоцитов селезенки.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предлагаемого изобретения.

Способа прогнозирования течения АА после спленэктомии по ИСМ CD4+/CD8+Т-лимфоцитов селезенки не существует.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории патоморфологии крови ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России в соответствии с планом НИР.

Способ осуществляется следующим образом

После проведения спленэктомии у больных АА определяют массу удаленной селезенки, проводку образцов послеоперационного материала выполняют на гистологических срезах, приготовленных из парафиновых блоков селезенок, толщиной 3-5 мкм общепринятым способом. Для идентификации CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов селезенки используют ИГХ метод окрашивания по стандартной методике в соответствии с протоколом систем визуализаций «Dako». Морфометрическую оценку количества CD4+ и CD8+Т-клеток выполняют на световом микроскопе фирмы «Leica» со встроенной фото- и видеокамерой, с помощью программного обеспечения анализа изображений ImageScope Color, версии М с окуляром х10, при объективе ×100. Исследования проводят в 20 полях зрения для каждого образца, начиная от капсулы вглубь лимфоидного органа. Исходя из полученных результатов, вычисляют массу CD4+ и CD8+лимфоцитов и рассчитывают ИСМ CD4+/CD8+клеток по формулам:

M₁=m×D₁%/100%

M₂=m×D₂%/100%

ИСМ=M₁/M₂,

где:

M₁ - масса CD4+Т-лимфоцитов, г,

М₂ - масса CD8+Т-лимфоцитов, г,

D₁ - количество CD4+Т-лимфоцитов, %,

D₂ - количество CD8+Т-лимфоцитов, %,

m - масса селезенки, г,

ИСМ - индекс соотношения масс CD4+/CD8+Т-лимфоцитов селезенки.

Исследования проведены на гистологических срезах селезенок от 32 больных АА после спленэктомии в возрасте от 18 до 65 лет (12 - нетяжелой формой заболевания и 20 - тяжелой). При оценке ИСМ CD4+/CD8+Т-лимфоцитов селезенки благоприятное течение заболевания установлено у 13 пациентов (9 - с нетяжелой формой и 4 - тяжелой). У 19 больных АА определен неблагоприятный прогноз (3 - при нетяжелой форме и 16 - тяжелой). Группу сравнения составили образцы селезенок, взятых от 20 лиц, не имевших в анамнезе заболеваний системы крови.

Результаты исследований представлены в примерах, подтверждающих возможность заявляемого способа прогнозировать течение АА после спленэктомии по ИСМ CD4+/CD8+Т-лимфоцитов селезенки.

Пример 1.

Больной В., 28 лет, поступил в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России 19.01.2001 г. Диагноз: АА, нетяжелая форма. Анализ крови при поступлении: гемоглобин 71 г/л, гранулоциты 0,63×10⁹/л, тромбоциты 45×10⁹/л. Через месяц (20.02.2001 г.) выполнена хирургическая операция, спленэктомия - без осложнений. Масса селезенки (т) составила 140 г. В гистологических срезах селезенки проведено ИГХ окрашивание лимфоцитов по стандартной методике. Морфометрически определено количество (D₁) CD4+8,7% и (D₂) CD8+3,5% Т-лимфоцитов. По ранее приведенным формулам вычислены их массы: (M₁) CD4+ и (М₂) CD8+. Установленные величины масс получены в ходе следующих расчетов: M_{1 (CD4+)}=140 г × 8,7% / 100% (12,20 г) и М_{2 (CD8+)}=140 г × 3,5% / 100% (4,90 г). ИСМ CD4+/CD8+Т-лимфоцитов селезенки составил 2,5 (>1,0).

Заключение: по результатам ИСМ CD4+/CD8+Т-лимфоцитов селезенки установлено, что у больного АА благоприятный прогноз течения заболевания.

Состояние клинико-гематологического улучшения наступило через месяц после операции (23.03.2001 г.): гемоглобин 70 г/л, гранулоциты 1,38×10⁹/л, тромбоциты 150×10⁹/л. Зависимость от гемотрансфузий уменьшилась. Состояние ремиссии было достигнуто через 8 месяцев (27.06.2002 г.): гемоглобин 102 г/л, гранулоциты 2,01×10⁹/л, тромбоциты 250×10⁹/л. Зависимости от гемотрансфузий нет.

Пример 2.

Больной Р., 38 лет, поступил в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России 23.01.1998 г. Диагноз: апластическая анемия, тяжелая форма. Анализ крови при поступлении: гемоглобин 92 г/л, гранулоциты 0,36×10⁹/л, тромбоциты 10×10⁹/л. Через две недели (03.02.1998 г.) выполнена хирургическая операция, спленэктомия - без осложнений. Масса селезенки (m) составила 105 г. В гистологических срезах селезенки проведено ИГХ окрашивание лимфоцитов по стандартной методике. Морфометрически определено количество (D₁) CD4+ 7,0% и (D₂) CD8+ 6,0% Т-лимфоцитов селезенки. По ранее приведенным формулам вычислены их массы: (M₁) CD4+ и (М₂) CD8+. Установленные величины масс получены в ходе следующих расчетов: M_{1 (CD4+)}=105 г × 7,0% / 100% (7,35 г) и М_{2 (CD8+)}=105 г × 6,0% / 100% (6,30 г). ИСМ CD4+/CD8+Т-лимфоцитов селезенки составил 1,2 (>1,0).

Заключение: по результатам ИСМ CD4+/CD8+лимфоцитов селезенки установлено, что у больного АА благоприятный прогноз течения заболевания.

Состояние клинико-гематологического улучшения наступило через 4 месяца после операции (30.06.1998 г.): гемоглобин 111 г/л, гранулоциты 3,08×10⁹/л, тромбоциты 60×10⁹/л. Зависимость от гемотрансфузий снижена. Состояние ремиссии было достигнуто через 12 месяцев (01.03.1999 г.): гемоглобин 124 г/л, гранулоциты 6,0×10⁹/л, тромбоциты 130×10⁹/л. Зависимости от гемотрансфузий нет.

Пример 3.

Больной К., 26 лет, поступил в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России 12.09.1995 г. Диагноз: апластическая анемия, нетяжелая форма. Анализ крови при поступлении: гемоглобин 82 г/л, гранулоциты 0,68×10⁹/л, тромбоциты 15,0×10⁹/л. Через неделю (19.09.1995 г.) выполнена хирургическая операция, спленэктомия - без осложнений. Масса селезенки (m) составила 70 г. В гистологических срезах селезенки проведено ИГХ окрашивание лимфоцитов по стандартной методике. Морфометрически определено количество (D₁) CD4+ 3,2% и (D₂) CD8+ 7,9% Т-лимфоцитов селезенки. По ранее приведенным формулам вычислены их массы: (M₁) CD4+ и (М₂) CD8+. Установленные величины масс получены в ходе следующих расчетов: M_{1 (CD4+)}=70 г × 3,2% / 100% (2,24 г. ) и М_{2 (CD8+)}=70 г × 7,9% / 100% (5,53 г. ). ИСМ CD4+/CD8+Т-лимфоцитов селезенки составил 0,4 (<1,0).

Заключение: по результатам ИСМ CD4+/CD8+Т-лимфоцитов селезенки установлено, что у больного АА неблагоприятный прогноз течения заболевания.

В ходе динамического наблюдения за пациентом выявленные данные были подтверждены проведенной оценкой результатов лечения. Состояние клинико-гематологического улучшения не наступило. Спустя 6 месяцев после операции (13.03.1996) больной умер.

Заявляемое изобретение обладает новизной, существенными отличиями, дает при использовании положительный результат, заключающийся в возможности по ИСМ CD4+/CD8+Т-лимфоцитов селезенки прогнозировать течение АА после спленэктомии. При величинах ИСМ CD4+/CD8+Т-лимфоцитов селезенки >1,0 прогнозируют благоприятное течение АА, а при значениях <1,0 - неблагоприятное течение заболевания.

Предлагаемый способ информативен, может быть использован в гематологических отделениях, морфологических и гистологических лабораториях в качестве дополнительного критерия при прогнозировании течения АА после спленэктомии.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии по индексу соотношения масс CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов. Сущность способа состоит в том, что после спленэктомии определяют массу селезенки, морфометрически в гистологических срезах селезенки подсчитывают количество CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов, вычисляют индекс соотношения масс CD4+/CD8+Т-лимфоцитам (ИСМ) по формулам. При значениях ИСМ селезенки >1,0 прогнозируют благоприятное течение апластической анемии, а при ≤1,0 - неблагоприятное течение заболевания. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии. 3 пр.

Способ прогнозирования течения апластической анемии, включающий определение лимфоцитов периферической крови, отличающийся тем, что после спленэктомии определяют массу селезенки, морфометрически в гистологических срезах лимфоидного органа после иммуногистохимического окрашивания подсчитывают количество CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, вычисляют индекс соотношения масс (ИСМ) по формулам:
M₁=m×D₁%/100%
M₂=m×D₂%/100%
ИСМ=M₁/M₂,
где:
M₁ - масса CD4+ Т-лимфоцитов, г,
М₂ - масса CD8+ Т-лимфоцитов, г,
D₁ - количество CD4+ Т-лимфоцитов, %,
D₂ - количество CD8+ Т-лимфоцитов, %,
m - масса селезенки, г,
ИСМ - индекс соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки,
и при значениях ИСМ >1,0 прогнозируют благоприятное течение апластической анемии, а при ИСМ≤1,0 прогнозируют неблагоприятное течение заболевания.