СПОСОБ МОРФОМЕТРИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ПРОГНОЗА ТЕЧЕНИЯ ДИФФУЗНОЙ В-КРУПНОКЛЕТОЧНОЙ ЛИМФОМЫ ПО ИНДЕКСУ ДОЛИ CD4+ и CD8+ Т-ЛИМФОЦИТОВ МИКРООКРУЖЕНИЯ В ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛАХ Российский патент 2025 года по МПК G01N33/483 G01N33/68 G01N1/30 

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДBКЛ) с помощью метода морфометрического подсчета относительного количества CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов микроокружения опухоли, после иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания гистологических срезов и последующего расчета индекса доли клеток (ИД_CD4+/CD8+) в лимфатических узлах.

ДВКЛ представляет собой агрессивную опухоль со множеством подтипов, отличающихся по клиническим проявлениями, иммунофенотипическим и молекулярно-генетическим характеристикам. Возможности иммунохимиотерапии по протоколу R-CHOP считаются неудовлетворительными у пациентов из группы высокого риска, около 40% пациентов с ДВКЛ демонстрируют резистентность к первой линии лечения. Попытки адаптации международного прогностического индекса (МПИ) под задачи современной химиотерапии оказались не столь эффективными, в частности с точки зрения выделения группы крайне высокого риска. В связи с этим актуальным является поиск биологических факторов, независимых от МПИ, которые могли бы использоваться как для оценки прогноза заболевания, так и в качестве мишеней для новых химиопрепаратов [Takahara, T., Nakamura, S., Tsuzuki, T., Satou, A. The Immunology of DLBCL. Cancers. 2023;15:835. https://doi.org/10.3390/ cancers15030835]. К числу таких факторов относится опухолевое микроокружение, которое формируется в результате образования перекрестных связей между опухолью и разными типами окружающих ее клеток. Среди последних ключевое значение имеют CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоциты. CD4⁺ клетки играют важную роль в адаптивной иммунной системе, являясь «вспомогательными» клетками, запускающими реакцию организма на чужеродные антигены. Они секретируют интерферон-γ, фактор некроза опухоли и цитокин IL2, играющие решающую роль в активации CD8+ Т-лимфоцитов [Cioroianu A I, Stinga P I, Sticlaru L at al. Tumor Microenvironment in Diffuse Large B-Cell Lymphoma: Role and Prognosis. Analytical Cellular Pathology. 2019;1-9. doi.org/10.1155/2019/8586354]. Цитотоксические лимфоциты (CD8⁺) являются основными эффекторами в формировании иммунного ответа. Они стимулируют апоптоз за счет гранзим-перфоринового механизма или влияют на гибель злокачественных клеток, взаимодействуя с мембранными рецепторами клеток-мишеней CD95. Дефицит CD8⁺ Т-лимфоцитов, а также нарушение регуляции их функций ведет к снижению противоопухолевого иммунитета.

Близким техническим решением к предполагаемому изобретению является оценка количественного соотношения CD4:CD8 Т-клеток в лимфатических узлах больных неходжкинскими лимфомами, в том числе ДВКЛ с помощью проточной цитометрии, проведенное французскими учеными [ Daussy C., Damotte D., Molina Th. J. at.al. CD4:CD8 T-Cell Ratio Differs Significantly in Diffuse Large B-Cell Lymphomas from Other Lymphoma Subtypes Independently from Lymph Node Localization. International trends in immunity. 2013;1(2):45-48]. Установлено, что самое низкое среднее значение соотношения CD4:CD8 Т-клеток (менее 1) характерно только для пациентов с ДВКЛ. По мнению авторов, оценка соотношения CD4:CD8 Т-клеток позволяет проводить дифференциальную диагностику между ДВКЛ и менее агрессивными неходжкинскими лимфомами.

Целью изобретения является разработка способа морфометрической оценки прогноза течения ДBКЛ по ИД_CD4+/CD8+ в лимфатических узлах.

Поставленная цель достигается тем, что после лимфаденэктомии проводят гистологическую проводку исследуемого материала, иммуногистохимический анализ на срезах лимфоузлов с антителами к CD4- и CD8- лимфоцитов микроокружения и подсчитывают их относительное количество по формулам: S₁=D₁/n x 100%, где S₁ – доля CD4⁺ Т-клеток в лимфоузле, в %, D₁ – количество CD4⁺-лимфоцитов в 10 полях зрения, n – общее количество клеток в 10 полях зрения; S₂ = D₂/n x 100%, где S₂ – доля CD8⁺ Т-клеток в лимфоузле, в %, D₂ – количество CD8⁺ Т-лимфоцитов в 10 полях зрения, n – общее количество клеток в 10 полях зрения, определяют индекс доли ИД_CD4+/CD8+ % по формуле: ИД=(S₁+S₂)/2, в результате чего при значениях ИД_CD4+/CD8+ менее 13,5% прогнозируют неблагоприятный исход заболевания, а при ИД равно или превышающем 13,5% - благоприятное течение ДВКЛ.

Основными отличиями работы французских коллег от предложенного способа являются, во-первых, то, что методом количественной оценки лимфоцитов являлась проточная цитометрия, а не морфометрический подсчет лимфоцитов в гистологических срезах; во-вторых, не проводился расчет ИД исследуемых клеток; в-третьих, не исследована взаимосвязь показателя CD4:CD8 лимфоцитов с течением ДВКЛ. Следовательно, представленный метод не позволяет оценить прогноз заболевания по соотношению CD4:CD8 Т-клеток в лимфатических узлах.

Способа морфометрической оценки прогноза течения ДВКЛ по ИД_CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов в гистологических срезах лимфоузлов не существует.

В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предполагаемого изобретения. Заявляемое изобретение разработано в лаборатории патоморфологии ФГБУН «КНИИГ и ПК ФМБА России» в соответствии с планом научно-исследовательской работы.

Способ осуществляется следующим образом.

В ретроспективное исследование включены 124 первичных пациента с морфологически и иммуногистохимически подтвержденным диагнозом ДВКЛ, установленным в соответствии с классификацией опухолей кроветворной и лимфоидной тканей ВОЗ 2008-2017 гг.. Медиана возраста - 59 лет (разброс от 21 до 82 лет). Из них 62 – мужчины, 62 – женщины. Больные наблюдались в ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России с 2014 по 2020 гг. и получали терапию 1 линии по протоколу R-CHOP. В качестве материала для исследования использовали архивные образцы тканей (парафиновые блоки) лимфоузлов, из которых приготавливали гистологические срезы толщиной 2-3 мкм на ротационном микротоме Sakura Accu-Cut SRM™ 200 (Япония). Для идентификации и визуализации CD4⁺- и CD8⁺-клеток в исследуемом материале использовали ИГХ метод. Иммунореактивность первичных антител CD4 (clone 4812, Dako, США), CD8 (clone С8/1448, Dako, США) выявляли с помощью вторичных антител, коньюгированных с пероксидазой, входящей в набор реактивов EnVISION+ («Dako», США). Постановку ИГХ реакции осуществляли по стандартной методике в соответствии с протоколом систем визуализаций «Dako». Морфометрическую оценку относительного содержания клеток микроокружения выполняли с использованием светового микроскопа «AxioScope.A1» фирмы «Carl Zeiss Microscopy GmbH» со встроенной фото- и видеокамерой с помощью программного обеспечения анализа изображений, с окулярами х10, объективом х100. Исследования проводили в 10 полях зрения для каждого образца. Исходя из полученных результатов, вычисляли относительное содержание CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток по формулам 1 и 2:

S₁=D₁/n x 100%, (1)

где S₁ – доля CD4⁺ Т-клеток в лимфатическом узле, %;

D₁ – количество CD4⁺ Т-клеток в 10 полях зрения;

n – общее количество клеток в 10 полях зрения;

S₂=D₂/n x 100%, (2)

где S₂ – доля CD8⁺ Т-клеток в лимфатическом узле, %;

D₂ – количество CD8⁺ Т-клеток в 10 полях зрения;

n – общее количество клеток в 10 полях зрения.

Индекс доли (ИД) у каждого пациента определяли по формуле 3:

ИД=(S₁+S₂)/2 (3)

С помощью ROC-анализа установлено пороговое значение ИД_CD4+/CD8+, соответствующее 13,5% (р = 0,021). Данный показатель позволил стратифицировать пациентов на группы с разным течением заболевания. У 75 Больных зарегистрировано благоприятное течение ДВКЛ (ИД_CD4+/CD8+ равно или превышает 13,5%), у 49 пациентов – неблагоприятное (ИД_CD4+/CD8+ менее 13,5%).

Результаты использования заявленного способа представлены в примерах, подтверждающих его способность прогнозировать течение ДВКЛ по ИД_CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов микроокружения в гистологических срезах лимфатических узлов.

Пример 1.

Пациент Е., 45 лет, поступил в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России 2.09.2018 года. Диагноз при поступлении: ДВКЛ. Клиническая характеристика: опухоль на лбу и теменной области справа, увеличение подмышечных лимфоузлов, слабость, потливость, периодическая субфибрильная температура. Регистрирована IА стадия заболевания, группа риска по международному прогностическому индексу - промежуточная низкая. Сделан пересмотр предоставленных гистологических препаратов подчелюстных лимфоузлов и проведено ИГХ исследование материала по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определена доля CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов (S₁ и S₂ соответственно) и рассчитан ИД_CD4+/CD8+. Установленная величина S₁ получена в ходе следующего расчета: S₁= 38/190 х 100%. S₁= 20%. Величина S₂ рассчитана по формуле: S₂= 82/380 х 100%. S₂=21%. ИД составил: (20%+21%)/2=20,5%, по результатам которого предположили благоприятный прогноз ДВКЛ. В результате лечения пациенту проведен курс химиотерапии по схеме R-CHOP (6 циклов). Достигнут полный ответ на лечение, который сохраняется по настоящее время.

Пример 2.

Больная Т., 67 лет, поступила в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России 11.09.2019 года. Диагноз при поступлении: ДВКЛ. Клиническая характеристика: периодическая субфебрильная температура, обильное ночное потоотделение, увеличение паховых лимфоузлов. Установлена IIВ стадия заболевания, группа риска согласно международного прогностического индекса - промежуточная высокая. На основании пересмотра предоставленных гистологических препаратов лимфоузла и ИГХ исследования гистологических срезов верифицирован диагноз: ДВКЛ. С помощью морфометрического исследования определена доля CD4⁺ и CD8⁺-положительных клеток (S₁ и S₂ соответственно) и рассчитан ИД. Установленная величина S₁ получена в ходе следующего расчета: S₁= 56/882 х 100%. S₁=6,3%. Величина S₂ рассчитана по формуле: S₂=147/758 х 100%. S₂=19,5%. ИД_CD4+/CD8+ составил: (6,3%+19,5%)/2=12,9%. Полученное значение указывало на неблагоприятный прогноз течения заболевания. Больной проведен курс химиотерапии (26.02.2020) по стандартному протоколу R-CHOP (6 циклов), достигнут полный ответ. Однако возник ранний рецидив заболевания. Несмотря на лечение, пациентка умерла спустя 9 месяцев (23.03.21г).

Пример 3.

Пациент Ч., 56 лет. В феврале 2017 г. года установлен диагноз ДВКЛ на основании гистологического и ИГХ исследований биоптата лимфоузла в ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России. Клиническая характеристика при поступлении: периодическая субфебрильная температура, слабость. Установлена IIА стадия заболевания, группа риска согласно МПИ - низкая. Выполнена биопсия лимфоузла, проведено ИГХ-окрашивание неопластических клеток в гистологических срезах опухоли по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определена доля CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов (S₁ и S₂ соответственно) и рассчитан ИД. Установленная величина S₁ получена в ходе следующего расчета: S₁= 68/718 х 100%. S₁=9,5%. Величина S₂ рассчитана по формуле: S₂=10,5/765 х 100%. S₂=1,3%. ИД_CD4+/CD8+ составил: (9,5%+1,3%)/2=5,4%, что указывает на неблагоприятный исход ДВКЛ. После 6 курсов полихимотерапии по стандартному протоколу R-CHOP получен частичный ответ с последующей прогрессией заболевания. Спустя 4 месяца пациент умер (17.06.2017).

Заявляемое изобретение дает при использовании положительный результат, заключающийся в возможности по ИД Т-лимфоцитов микроокружения в лимфоузле прогнозировать течение ДВКЛ. При значении ИД_CD4+/CD8+ менее 13,5% прогнозируют неблагоприятное течение болезни, а при равном или более 13,5% - благоприятный исход заболевания.

Предлагаемый способ информативен, может быть использован в гематологических и патолого-анатомических отделениях, патоморфологических лабораториях в качестве дополнительного критерия при прогнозировании течения ДВКЛ.

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для морфометрической оценки прогноза течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы по индексу доли CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов микроокружения в лимфатических узлах. После лимфаденэктомии проводят гистологическую проводку исследуемого материала, иммуногистохимический анализ на срезах лимфоузлов с антителами к CD4- и CD8-лимфоцитов микроокружения и подсчитывают их относительное количество. Определяют индекс доли ИД_CD4+/CD8+. При значениях ИД_CD4+/CD8+ менее 13,5% прогнозируют неблагоприятный исход заболевания. При ИД, равном или превышающем 13,5%, прогнозируют благоприятное течение диффузной В-крупноклеточной лимфомы. Способ обеспечивает морфометрическую оценку прогноза течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы за счет определения ИД_CD4+/CD8+ в лимфатических узлах. 3 пр.

Способ морфометрической оценки прогноза течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы по индексу доли CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов микроокружения в лимфатических узлах, состоящий в том, что после лимфаденэктомии проводят гистологическую проводку исследуемого материала, иммуногистохимический анализ на срезах лимфоузлов с антителами к CD4- и CD8-лимфоцитов микроокружения и подсчитывают их относительное количество по формулам: S₁=D₁/n × 100%, где S₁ – доля CD4⁺ Т-клеток в лимфоузле в %, D₁ – количество CD4⁺-лимфоцитов в 10 полях зрения, n – общее количество клеток в 10 полях зрения; S₂=D₂/n × 100%, где S₂ – доля CD8⁺ Т-клеток в лимфоузле в %, D₂ – количество CD8⁺ Т-лимфоцитов в 10 полях зрения, n – общее количество клеток в 10 полях зрения, определяют индекс доли ИД_CD4+/CD8+ по формуле: ИД=(S₁+S₂)/2, в результате чего при значениях ИД_CD4+/CD8+ менее 13,5% прогнозируют неблагоприятный исход заболевания, а при ИД, равном или превышающем 13,5%, - благоприятное течение диффузной В-крупноклеточной лимфомы.