СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОТВЕТА НА ПОЛИХИМИОТЕРАПИЮ ПЕРВОЙ ЛИНИИ ПО СХЕМЕ BEACOPP-14 БОЛЬНЫХ НОДУЛЯРНЫМ СКЛЕРОЗОМ КЛАССИЧЕСКОЙ ЛИМФОМЫ ХОДЖКИНА ПУТЕМ МОРФОМЕТРИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ОТНОСИТЕЛЬНОГО СОДЕРЖАНИЯ CD20, CD4 И CD8-ПОЗИТИВНЫХ КЛЕТОК МИКРООКРУЖЕНИЯ Российский патент 2025 года по МПК G01N33/483 G01N33/68 G01N1/30 

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования ответа на терапию первой линии больных нодулярным склерозом классической лимфомы Ходжкина (НС кЛХ) путем морфометрического подсчета в гистологических срезах лимфатических узлов относительного содержания B-клеток (CD20⁺) и суммы двух T-клеточных субпопуляций: регуляторных CD4⁺ хелперов и цитотоксических CD8⁺ лимфоцитов после иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания лимфатических узлов и последующего расчета индекса доли (ИД) CD20/(СD4+CD8).

Классическая лимфома Ходжкина – злокачественное B-клеточное лимфопролиферативное заболевание, для которого свойственны локализованная или диссеминированная пролиферация клеток лимфоретикулярной системы с поражением лимфатических узлов, а при прогрессировании – других органов и тканей. Это одно из самых распространенных лимфоидных неоплазий среди лиц молодого возраста. В 2020 году кЛХ занимала 26 место в мире среди наиболее выявляемой онкологической и гематологической патологии, закрепившись между злокачественными образованиями яичка и гипофарингеальным раком. В Российской Федерации по состоянию на 2021 год заболеваемость лимфомой Ходжкина составляла 2793 случая, из них 652 – с летальным исходом (Злокачественные новообразования в России в 2021 году (заболеваемость и смертность) / под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. – Москва: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ “НМИЦ радиологии” Минздрава России, 2022. − 252 с. – ISBN 978-5-85502-280-3). Заболевание считается потенциально излечимым при применении передовых схем лечения, однако в 10-30% случаев развиваются резистентные/рецидивирующие формы (Демина, Е.А. Лимфома Ходжкина. Клинические рекомендации / Е.А. Демина, Г.С. Тумян // Современная Онкология. – 2020. – № 22 (2). – С. 6-33. – DOI: 10.26442/18151434.2020.2.200132). Как следствие появляется необходимость выполнения аутологичной или аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (Мочкин Н.Е. Результаты лечения классической лимфомы Ходжкина, включающего высокодозную химиотерапию с трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток, в НМХЦ им. Н.И. Пирогова / Н.Е. Мочкин, В.О. Саржевский, Ю.Н. Дубинина // Клиническая онкогематология. – 2018. – Т. 11, № 3. – С. 234–240 - DOI: 10.21320/2500-2139). Все это связано с биологическим поведением опухоли, которое отличается в каждом индивидуальном случае. Для оценки характера течения болезни, расширения понимания патогенеза и поиска новых терапевтических мишеней ведутся исследования по изучению роли опухолевого микроокружения в развитии патологического процесса.

В клинической практике для оценки исхода заболевания используются различные прогностические модели, включающие возраст пациента, стадию болезни и другие основные клинико-лабораторные параметры (Медведовская, Е.Г. Клинические и биологические факторы прогноза при лимфоме Ходжкина: специальность 14.01.12 "Онкология": диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук / Медведовская Евгения Геннадьевна; ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина" Минздрава России. – Москва, 2018. – 124 с.). Однако методы не учитывают иммуноморфологические особенности опухолевого микроокружения, которые могут служить предикторами ответа на лечение и характера течения заболевания, способны повысить ценность и надежность прогностических шкал. Следовательно, имеется потребность в поиске новых критериев, позволяющих стратифицировать больных на группы риска на ранних стадиях заболевания и прогнозировать его течение.

На сегодняшний день активно изучается роль B-лимфоцитов (CD20⁺) и различных субпопуляций Т-клеток (в т.ч. CD4⁺ и CD8⁺) в опухолевом микроокружении кЛХ. На долю «внутриопухолевых» B-клеток приходится около 16% от всех клеток микроокружения, но их относительное содержание варьируется от случая к случаю. Предполагается, что уменьшение количества опухоль-ассоциированных лимфоцитов может являться важным предиктивным фактором при кЛХ (Grund J. Low B-cell content is associated with a CD73-low tumour microenvironment and unfavourable prognosis in classic Hodgkin lymphoma / J. Grund, K. Iben, S. Reinke [и др.] // Br J Haematol. – 2023. – № 201(6). – С. 1097-1102 – DOI: 10.1111/bjh.18762). Однако данные неоднозначны и противоречивы. Так, Р. Greaves с соавт. продемонстрировали, что высокая плотность нефолликулярных CD20⁺ клеток у больных кЛХ связана со снижением показателей выживаемости и неудачами лечения (Greaves P. Expression of FOXP3, CD68, and CD20 at diagnosis in the microenvironment of classical Hodgkin lymphoma is predictive of outcome / P. Greaves, A. Clear, R. Coutinho [и др.] // Journal of Clinical Oncology (JCO). – 2017. – Т. 35, № 10. – С. 1140. – DOI: 10.1200/JCO.2011.39.9881).

T-лимфоциты являются самой большой по численности популяцией иммунных клеток в опухолевом микроокружении. Их роль в патогенезе кЛХ четко определена. Тем не менее, предметом многочисленных дискуссий остается установление прогностического значения относительного числа их субпопуляций в лимфатических узлах (Opinto G. Hodgkin Lymphoma: A Special Microenvironment / G. Opinto, C. Agostinelli, S. Ciavarella [и др.] // J Clin Med. – 2021. – № 10(20). – DOI: 10.3390/jcm10204665). Высокое содержание цитотоксических CD8⁺ лимфоцитов в сыворотке крови ассоциируется с неблагоприятным течением лимфомы Ходжкина. Отмечена связь высокого количества активированных субпопуляций Т-клеток (GrB⁺, TIA-1⁺) со снижением показателей общей и беспрогрессивной выживаемости при лечении по протоколам химиотерапии I линии ABVD, однако данные неоднозначны (Hernandez O. Is an increase in CD4/CD8 T-cell ratio in lymph node fine needle aspiration helpful for diagnosing Hodgkin lymphoma? A study of 85 lymph node FNAs with increased CD4/CD8 ratio / O. Hernandez, T. Oweity, S. Ibrahim // Cytojournal. – 2005. – № 9. – DOI: 10.1186/1742-6413-2-14; Wein F. The role of T cells in the microenvironment of Hodgkin lymphoma / F. Wein, R. Küppers // Journal of Leukocyte Biology. – 2016. № 99. – С. 45-50. – DOI: 10.1189/jlb.3MR0315-136R; Tzankov A. Correlation of high numbers of intratumoral FOXP3+ regulatory T cells with improved survival in germinal center-like diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma and classical Hodgkin's lymphoma / A. Tzankov, C. Meier, P. Hirschmann [и др.] // Haematologica. – 2008. – № 93(2). – № 193-200. – DOI: 10.3324/haematol.11702). Таким образом, вышеприведенные данные свидетельствуют о перспективности оценки B- и T-клеточных популяций и анализа их соотношения при кЛХ.

Близкими техническими решениями к предлагаемому изобретению являются две работы: способ оценки индекса соотношения макрофагально-гистиоцитарной популяции клеток к сумме содержания B- и T-клеток в опухолевой ткани при раке молочной железы (Eiró N. Impact of CD68/(CD3+CD20) ratio at the invasive front of primary tumors on distant metastasis development in breast cancer / N. Eiró, I. Pidal, B. Fernandez-Garcia [и др.] // PLoS One. 2012;7(12):e52796. DOI: 10.1371/journal.pone.0052796) и оценка прогностической роли относительного содержания CD20⁺ B-клеток, CD8⁺ цитотоксических и CD4⁺ хелперных/регуляторных Т-клеток в микроокружении операбельного немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) (Giatromanolaki A. Prognostic Relevance of the Relative Presence of CD4, CD8 and CD20 Expressing Tumor Infiltrating Lymphocytes in Operable Non-small Cell Lung Cancer Patients / (A. Giatromanolaki, I. Anestopoulos, M.I. Panayiotidis, A. Mitrakas, A. Pappa, M.I. Koukourakis // Anticancer Res. 2021; 41(8):3989-3995. DOI: 10.21873/anticanres.1519). Указанные методы основаны на анализе клеток микроокружения при карциномах с применением иммуногистохимических методов, служат для оценки риска прогрессирования заболевания и выявлению показателей выживаемости. Недостатком указанных прототипов является то, что экспрессия маркеров рассчитывается полуколичественным способом без вычисления относительного числа клеток микроокружения и определения порогового их значения, вследствие чего больные не могут быть стратифицированы на группы высокого и/или низкого риска. Кроме того, указанные работы выполнены на опухолях не гемопоэтической природы.

Техническим результатом изобретения является разработка способа прогнозирования ответа на терапию первой линии больных НС кЛХ путем морфометрической оценки относительного содержания CD20, СD4 и CD8-позитивных клеток микроокружения с расчетом их ИД.

Технический результат достигается тем, что Способ прогнозирования ответа на полихимиотерапию первой линии по схеме BEACOPP-14 больных нодулярным склерозом классической лимфомы Ходжкина путем морфометрической оценки относительно содержания CD20, CD4 и CD8-позитивных клеток микроокружения, характеризующийся

подсчетом в гистологических срезах лимфатических узлов среднего относительного содержания B-клеток CD20⁺ и суммы двух T-клеточных субпопуляций, регуляторных CD4⁺ хелперов и цитотоксических CD8⁺ лимфоцитов после иммуногистохимического окрашивания лимфатических узлов по формулам

S₁=D₁/n × 100%,

где S₁ – доля СD20⁺ В-клеток микроокружения, в %;

D₁ – относительное количество СD20⁺ B-клеток в 10 полях зрения;

n – общее количество клеток в 10 полях зрения,

S₂=D₂/n × 100%,

где S₂ – доля регуляторных CD4⁺ Т-клеток микроокружения, в %;

D₂ – относительное число регуляторных CD4⁺ Т-клеток в 10 полях зрения;

n – общее количество клеток в 10 полях зрения,

S₃=D₃/n × 100%,

где S₃ – доля CD8⁺ цитотоксических Т-клеток микроокружения, в %;

D₃ – относительное количество CD8⁺ цитотоксических Т-клеток в 10 полях зрения;

n – общее количество клеток в 10 полях зрения,

и последующим расчетом индекса доли CD20, СD4 и CD8-позитивных клеток микроокружения у каждого конкретного пациента по следующей формуле

ИД = ,

и при значении ИД более или равном 0,9 прогнозируют полный ответ на полихимиотерапию первой линии по схеме BEACOPP-14, а при значении ИД менее 0,9 прогнозируют недостаточный или частичный ответ на полихимиотерапию первой линии по схеме BEACOPP-14, либо его отсутствие.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории патоморфологии ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.

Способ осуществляется следующим образом:

После лимфаденэктомии у больных НС кЛХ выполняли гистологическую проводку послеоперационного материала по общепринятому способу. На срезах толщиной 3-5 мкм, приготовленных из парафиновых блоков/кассет лимфатического узла, проводили гистологическое исследование. Для идентификации и визуализации CD20⁺, CD4⁺ и CD8⁺ клеток в исследуемом материале использовали ИГХ метод окрашивания. Иммунореактивность антител CD20 (клон b26), CD4 (клон 4B12) и CD8 (клон C8/144B) выявляли с помощью вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой, входящей в набор реактивов EnVISION+ («Dako»). Постановку реакции осуществляли по стандартной методике в соответствии с протоколом систем визуализаций «Dako». Морфометрическую оценку относительного числа CD20⁺, CD4⁺ и CD8⁺ клеток опухолевого микроокружения выполняли с применением светового микроскопа «Leica DM 1000» Германия, со встроенной фото- и видеокамерой с помощью программного обеспечения анализа изображений ImageScope Color, версии М, с окулярами х10, при объективе х100. Исследования проводили в 10 полях зрения для каждого образца. Среднее относительное содержание CD20⁺, CD4⁺ и CD8⁺ клеток микроокружения в лимфатическом узле вычисляли по следующим формулам:

S₁=D₁/n × 100%,

где S₁ – доля СD20⁺ В-клеток микроокружения, %;

D₁ – относительное число СD20⁺ B-клеток в 10 полях зрения;

n – общее количество клеток в 10 полях зрения.

S₂=D₂/n × 100%,

где S₂ – доля регуляторных CD4⁺ Т-клеток микроокружения, %;

D₂ – относительное число регуляторных CD4⁺ Т-клеток в 10 полях зрения;

n – общее количество клеток в 10 полях зрения.

S₃=D₃/n × 100%,

где S₃ – доля CD8⁺ цитотоксических Т-клеток микроокружения, %;

D₃ – относительное число CD8⁺ цитотоксических Т-клеток в 10 полях зрения;

n – общее количество клеток в 10 полях зрения.

Индекс доли (ИД) у каждого пациента определяли по формуле:

ИД =

Исследования выполнены на срезах лимфатических узлов от 56 пациентов с НС кЛХ в возрасте от 20 до 73 лет (23 – мужского пола и 33 – женского). С помощью ROC-анализа установлено пороговое значение ИД клеток опухолевого микроокружения, экспрессирующих CD20⁺, CD4⁺ и CD8⁺, соответствующее 0.9. Данный показатель позволил стратифицировать пациентов в группы с разным ответом на терапию. У 30 обследованных зарегистрирован полный ответ на лечение первой линии (ИД ≥ 0.9), у 26 больных – недостаточный/частичный ответ на терапию первой линии либо его отсутствие (прогрессирование заболевания на фоне лечения), что указывает на необходимость пролонгации первоначального режима полихимиотерапии либо смену линии лечения (ИД < 0.9).

Результаты исследований представлены в примерах, подтверждающих возможность заявляемого способа прогнозировать ответ на терапию первой линии больных НС кЛХ после лимфаденэктомии по ИД CD20/(CD4+CD8) клеток в гистологических срезах лимфатических узлов.

Пример 1

Больной З., 44 лет, направлен с целью консультации с подозрением на лимфопролиферативное заболевание в клинико-диагностическое отделение ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России 12.02.2016 года. При обследовании выполнена биопсия шейного лимфатического узла. При гистологическом исследовании верифицирован диагноз: лимфома Ходжкина, гистологический подтип: нодулярный склероз (морфологический тип NS I). Клиническая характеристика: поражение шейных и внутригрудных лимфоузлов, гепатоспленомегалия. Выполнена лимфаденэктомия, без осложнений. Проведено ИГХ исследование гистологических срезов шейного лимфатического узла по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определено относительное содержание CD20⁺, CD4⁺ и CD8⁺ клеток опухолевого микроокружения (S₁, S₂ и S₃ соответственно) и рассчитан ИД. Установленная величина S₁ получена в ходе следующего расчета: S₁ =295/1213*100%. S₁=24,3%. Величина S₂ рассчитана по формуле: S₂=114/1164*100%. S₂=9,8%. Величина S₃ определена по формуле: S₃=45/1141*100%. S₃=3,9%. Индекс доли (ИД) составил: 24,3% / (9,8% + 3,9%) = 1.8.

Заключение: по результатам ИГХ исследования, морфометрического анализа и расчета, соответствующего ИД установлено, что у больного НС кЛХ прогнозируется полный ответ на терапию первой линии.

В ходе динамического наблюдения за пациентом выявленные данные подтверждены проведенной оценкой результатов лечения. Согласно современным клиническим рекомендациям, больному выполнено 6 циклов полихимиотерапии I линии по интенсивному режиму ВЕАСОРР-14 (Блеомицин, Этопозид, Доксорубицин, Циклофосфамид, Винкристин, Прокарбозин, Преднизолон). Лечение окончено в мае 2016 года. При оценке эффективности терапии и определения прогноза нодулярного склероза ЛХ использовалась шкала визуальной оценки Deauville, которая основана на сравнении интенсивности поглощения 18-фтордезоксиглюкозы (18F-ФДГ) в остаточной опухоли при выполнении позитронно-эмиссионной томографии, совмещенной с компьютерной томографией (ПЭТ/КТ) по сравнению с ее поглощением в печени и средостении. Так, пролонгация режима химиотерапии и смена линии не потребовались, достигнута ПЭТ-негативная ремиссия, которая сохраняется по настоящее время.

Пример 2

Больной Ж., 26 лет, поступил в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России 15.12.2015 года. Диагноз при поступлении: лимфома Ходжкина, гистологический подтип: нодулярный склероз (морфологический тип NS I). Клиническая характеристика: поражение лимфатических узлов шеи, средостения, забрюшинного пространства, наличие B-cимптомов (потеря веса на 13 кг, слабость, потливость, вторичный иммунодефицит с рецидивирующими бактериальными инфекциями). Выполнена лимфаденэктомия, без осложнений. С помощью ИГХ и морфометрического исследований определено содержание CD20⁺, CD4⁺ и CD8⁺ клеток опухолевого микроокружения (S₁, S₂ и S₃ соответственно) с последующим расчетом ИД. Установленная величина S₁ получена в ходе расчета: S₁ =196/1252*100%. S₁=15,6%. Величина S₂ рассчитана по формуле: S₂=167/1380*100%. S₂=12,1%. Величина S₃ определена по формуле: S₃=194/1337*100%. S₃=14,5%. Индекс доли (ИД) составил: 15,6% / (12,1% + 14,5%) = 0,6.

Заключение: по результатам ИГХ и морфометрического анализа установлено, что у больного нодулярным склерозом ЛХ прогнозируется недостаточный/частичный ответ на терапию первой линии либо его отсутствие (прогрессирование заболевания на фоне лечения), что может указывать на необходимость пролонгации первоначального режима полихимиотерапии либо смену линии лечения.

В ходе динамического наблюдения за пациентом выявленные данные подтверждены проведенной оценкой результатов лечения. Так, с декабря 2015 г. по март 2016 г. обследованный получил 6 курсов полихимиотерапии по протоколу ВЕАСОРР-14. Согласно результатам контрольного исследования (ПЭТ/КТ) сохранялась активность процесса, в связи с чем лечение продолжено. С апреля по май 2016 г. выполнено 2 курса по протоколу DНАР; в июле 2016 г. – химиотерапия по режиму DЕХАВЕАМ. В августе 2016 г. проведен курс GVD (гемцитабин, винорельбин, липосомальный пегелированный доксорубицин); с сентября по декабрь 2016 г. выполнено 6 курсов ВВ (брентуксимаб ведотин + бендомустин) с последующей аутотрансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (аутоТГСК) от 03.03.17 г. В настоящее время сохраняется ПЭТ-негативная ремиссия. Пациент находится под динамическим наблюдением гематологов.

Заявляемое изобретение дает при использовании положительный результат, заключающийся в возможности по ИД CD20/(CD4+CD8) клеток в лимфатическом узле прогнозировать ответ на первую линию терапии больных нодулярным склерозом ЛХ после лимфаденэктомии. При значении ИД более или равном 0.9 прогнозируется полный ответ на терапию первой линии, а при менее 0.9 предполагается недостаточный/частичный ответ на терапию первой линии либо его отсутствие (прогрессирование заболевания на фоне лечения), что указывает на необходимость пролонгации первоначального режима полихимиотерапии либо смену линии лечения.

Предлагаемый способ информативен, может быть использован в гематологических и патологоанатомических отделениях, патоморфологических лабораториях в качестве дополнительного критерия при прогнозировании ответа на терапию первой линии больных НС кЛХ после лимфаденэктомии.

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования ответа на полихимиотерапию первой линии по схеме BEACOPP-14 больных нодулярным склерозом классической лимфомы Ходжкина. В гистологических срезах лимфатических узлов осуществляют подсчет среднего относительного содержания CD20, CD4 и CD8-позитивных клеток после иммуногистохимического окрашивания лимфатических узлов и последующий расчет индекса доли (ИД) указанных клеток микроокружения. При значении ИД, более или равном 0,9, прогнозируют полный ответ на полихимиотерапию первой линии по схеме BEACOPP-14. При значении ИД менее 0,9 прогнозируют недостаточный или частичный ответ на полихимиотерапию первой линии по схеме BEACOPP-14 либо его отсутствие. Способ обеспечивает возможность прогнозирования ответа на терапию первой линии больных нодулярным склерозом классической лимфомы Ходжкина за счет морфометрической оценки относительного содержания CD20, СD4 и CD8-позитивных клеток микроокружения с расчетом их ИД. 2 пр.

Способ прогнозирования ответа на полихимиотерапию первой линии по схеме BEACOPP-14 больных нодулярным склерозом классической лимфомы Ходжкина путем морфометрической оценки относительного содержания CD20, CD4 и CD8-позитивных клеток микроокружения, характеризующийся

подсчетом в гистологических срезах лимфатических узлов среднего относительного содержания B-клеток CD20⁺ и суммы двух T-клеточных субпопуляций, регуляторных CD4⁺ хелперов и цитотоксических CD8⁺ лимфоцитов после иммуногистохимического окрашивания лимфатических узлов по формулам

S₁=D₁/n × 100%,

где S₁ – доля СD20⁺ В-клеток микроокружения, в %;

D₁ – относительное количество СD20⁺ B-клеток в 10 полях зрения;

n – общее количество клеток в 10 полях зрения,

S₂=D₂/n × 100%,

где S₂ – доля регуляторных CD4⁺ Т-клеток микроокружения, в %;

D₂ – относительное число регуляторных CD4⁺ Т-клеток в 10 полях зрения;

n – общее количество клеток в 10 полях зрения,

S₃=D₃/n × 100%,

где S₃ – доля CD8⁺ цитотоксических Т-клеток микроокружения, в %;

D₃ – относительное количество CD8⁺ цитотоксических Т-клеток в 10 полях зрения;

n – общее количество клеток в 10 полях зрения,

и последующим расчетом индекса доли CD20, СD4 и CD8-позитивных клеток микроокружения у каждого конкретного пациента по следующей формуле

ИД = ,

и при значении ИД более или равном 0,9 прогнозируют полный ответ на полихимиотерапию первой линии по схеме BEACOPP-14, а при значении ИД менее 0,9 прогнозируют недостаточный или частичный ответ на полихимиотерапию первой линии по схеме BEACOPP-14 либо его отсутствие.